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Wo befindet sich die DNA während des Prozesses der RNA-Extraktion mit Trisure?

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Wo befindet sich die DNA während des hier beschriebenen Prozesses der RNA-Extraktion mit Trisure? Muss ich angesichts der Tatsache, dass DNA auch eine Nukleinsäure ist, erwarten, dass die isolierte RNA auch DNA enthält? Bioline behauptet jedoch, RNA „mit praktisch keiner genomischen DNA-Kontamination“.


Erwartungsgemäß wollen sie Ihnen nicht wirklich sagen, was TRIsure ist. Was sie sagen ist, dass DNA nach der Extraktion in der organischen oder Interphase gefunden wird, während sich RNA in die wässrige Phase verteilt. Dies ist mit ziemlicher Sicherheit eine Variante der sauren Phenolextraktion. Als Bestätigung führt das Sicherheitsdatenblatt als Bestandteile Phenol, Ammoniumthiocyanat, Guanidiniumthiocyanat, Glycerin und Zitronensäure auf.


DNA- und RNA-Aufreinigung

Die Extraktion von DNA und RNA ist eine grundlegende Methode der Molekularbiologie. Der Bedarf an hochwertiger, hochreiner Nukleinsäure ist für eine Vielzahl von Forschungs- und klinischen Anwendungen wichtig. Die Aufreinigung von Nukleinsäuren ist ein erster Schritt in vielen Arbeitsabläufen der Molekularbiologie und der Genomik.

DNA- und RNA-Proben werden oft aus Rohpräparaten gewonnen. Genomische DNA, Plasmid-DNA und Gesamt-RNA können aus einer Vielzahl von Quellen extrahiert und gereinigt werden, einschließlich Bakterien- und Säugetierzellen, Pflanzengewebe, Pilzgewebe, Säugetiergewebe, Blut, Plasma, Serum, Viren, Wangen- und Nasenabstriche, Gelmatrizen, PCRs und andere enzymatische Reaktionen. Die Isolierung von Nukleinsäure aus diesen Proben beinhaltet oft die Lyse von Zellmembranen oder die Homogenisierung der Probe, gefolgt von der Entfernung von Proteinen, Enzymen, Detergenzien, Salzen und Lipiden.

Gängige Ansätze sind:

  • Alkalische Extraktion
  • Phenol-Chloroform-Extraktion
  • Cäsiumchlorid (CsCl) Dichtegradientenzentrifugation
  • Oligo(dT)-Cellulose-Chromatographie
  • Kieselsäure-Matrize
  • Glasperlen
  • Kieselgur
  • Anionenaustauschchromatographie
  • Größenausschlusschromatographie


Die endgültige Anwendung bestimmt die beste Methode zur Reinigung. Downstream-Anwendungen umfassen PCR, qPCR, Restriktionsverdaus, Ligation, Klonierung, Genotypisierung, Genexpressionsanalyse, Next Generation Sequencing (NGS) und Northern- und Southern-Blotting.


Inhalt

Dieses Verfahren beruht auf der Phasentrennung durch Zentrifugation einer Mischung der wässrigen Probe und einer Lösung, die wassergesättigtes Phenol und Chloroform enthält, was zu einer oberen wässrigen Phase und einer unteren organischen Phase (hauptsächlich Phenol) führt. Guanidiniumthiocyanat, ein chaotropes Mittel, wird der organischen Phase zugesetzt, um die Denaturierung von Proteinen zu unterstützen (wie solche, die Nukleinsäuren stark binden oder RNA abbauen). Die Nukleinsäuren (RNA und/oder DNA) verteilen sich in die wässrige Phase, während Proteine ​​in die organische Phase übergehen. Der pH-Wert der Mischung bestimmt, welche Nukleinsäuren gereinigt werden. [4] Unter sauren Bedingungen (pH 4-6) verteilt sich die DNA in die organische Phase, während die RNA in der wässrigen Phase verbleibt. Unter neutralen Bedingungen (pH 7–8) verteilen sich sowohl DNA als auch RNA in die wässrige Phase. In einem letzten Schritt werden die Nukleinsäuren durch Fällung mit 2-Propanol aus der wässrigen Phase gewonnen. Das 2-Propanol wird dann mit Ethanol gewaschen und das Pellet kurz luftgetrocknet und in TE-Puffer oder RNAse-freiem Wasser gelöst.

Guanidiniumthiocyanat denaturiert Proteine, einschließlich RNasen, und trennt rRNA von ribosomalen Proteinen, während Phenol, Isopropanol und Wasser Lösungsmittel mit geringer Löslichkeit sind. In Gegenwart von Chloroform oder BCP (Bromchlorpropan) trennen sich diese Lösungsmittel vollständig in zwei Phasen, die an ihrer Farbe erkennbar sind: eine klare, obere wässrige Phase (enthält die Nukleinsäuren) und eine untere Phase (enthält die in Phenol gelösten Proteine ​​und die in Chloroform gelöste Lipide). Andere denaturierende Chemikalien wie 2-Mercaptoethanol und Sarcosin können ebenfalls verwendet werden. Der größte Nachteil besteht darin, dass Phenol und Chloroform sowohl gefährliche als auch unbequeme Materialien sind und die Extraktion oft mühsam ist. Daher bieten in den letzten Jahren viele Unternehmen alternative Möglichkeiten zur Isolierung von RNA an.


3 Hauptschritte bei der Extraktion von DNA

Anfangs war die DNA-Isolierung ein langer und schwieriger Prozess, bei dem große Mengen an DNA gesammelt wurden. Um DNA aus Pflanzen, Tieren und Bakterien zu extrahieren, müssen die Zellbestandteile in eine Lösung freigesetzt werden. Da die Bakterien einzellig sind und keine Knochen, Fett, Knorpel etc. enthalten, lässt sich die DNA relativ leicht extrahieren.

Im Gegensatz dazu müssen Proben von Tieren und Pflanzen oft in winzige Fragmente zermahlen werden, bevor sie fortfahren. Da Pflanzenzellen sehr starre Zellwände haben, muss der Forscher die Zellen in einem Mixer mechanisch aufbrechen oder spezielle abbauende Enzyme hinzufügen, um die Zellwandbestandteile zu verdauen.

Um DNA aus dem Schwanz einer Maus zu extrahieren, werden Enzyme hinzugefügt, um das Bindegewebe abzubauen und die Zellen zu dispergieren. Der bei weitem einfachste Weg, DNA zu gewinnen, besteht darin, sie aus Bakterien zu extrahieren. Ein paar Tropfen einer Bakterienkultur geben für die meisten Zwecke viel DNA. Erstens wird die bakterielle Zellwand leicht von Lysozym verdaut, einem Enzym, das die Peptidoglycanschicht der Zellwand abbaut.

Eine sukzessive Behandlung mit Detergens löst die Lipide der Zellmembran. Chelatbildner wie EDTA (Ethylene Diamin Tetra Acetate) werden insbesondere bei gramnegativen Bakterien auch verwendet, um die Metallionen zu entfernen, die Bestandteile der äußeren Membran miteinander verbinden. In all diesen Proben wird der Zellinhalt, einschließlich der DNA, dann in Lösung gebracht und durch weitere Stufenfolgen gereinigt.

Extraktion von DNA: Schritt 2.

Reinigung von DNA:

Zur Reinigung von DNA werden zwei allgemeine Verfahrensarten verwendet:

Das Prinzip der Zentrifugation ist wie folgt:

Die Probe wird mit hoher Geschwindigkeit geschleudert und die Zentrifugalkraft bewirkt, dass die größeren oder schwereren Komponenten am Boden des Röhrchens sedimentieren. Zum Beispiel hinterlässt die Zerstörung der Zellwand von Bacte­ria durch Lysozym und Detergenzien eine Lösung, die Fragmente der Zellwand, die klein sind, und der DNA enthält. Beim Zentrifugieren der Probe werden DNA und einige andere große Bestandteile am Boden des Röhrchens sedimentiert.

Die Fragmente der Zellwand bleiben zusammen mit vielen anderen löslichen Bestandteilen in Lösung und werden verworfen. Die sedimentierte DNA wird dann in einer geeigneten Pufferlösung wieder aufgelöst. Trotzdem ist viel Protein und RNA darin vermischt.

Diese werden in der Regel chemisch entfernt. Ein Schritt, der bei vielen DNA-Reinigungen verwendet wird, ist die Phe­nol-Extraktion. Phenol, auch bekannt als Car&Shybolic Säure, ist sehr ätzend und extrem gefährlich, weil es die Proteine, die 60 bis 70 Prozent aller Lebewesen ausmachen, auflöst und denaturiert. Folglich kann Phenol verwendet werden, um alle Proteine ​​aus einer DNA-Probe aufzulösen und zu entfernen.

Wenn Phenol zu Wasser hinzugefügt wird, vermischen sich die beiden Flüssigkeiten nicht zu einer einzigen Lösung, sondern das dichtere Phenol bildet eine separate Schicht unter dem Wasser. Beim Schütteln vermischen sich die beiden Schichten vorübergehend und Proteine ​​lösen sich in Phenol auf.

Wenn das Schütteln aufhört, trennten sich die DNA-Lösung und die phenolhaltigen Proteine ​​in zwei Schichten (Abb. 3.1). Um sicherzustellen, dass kein Phenol mit der DNA eingeschlossen wird, wird die Probe kurz zentrifugiert. Dann wird das DNA und RNA enthaltende Wasser abgesaugt und aufbewahrt. Im Allgemeinen werden mehrere aufeinanderfolgende Phenolextraktionen durchgeführt, um Proteine ​​aus DNA zu reinigen.

Es wurde eine Vielzahl neuerer Techniken entwickelt, die eine Phenolextraktion vermeiden. Die meisten davon beinhalten die Reinigung von DNA, indem sie durch eine Säule geleitet wird, die ein Harz enthält, das DNA, aber keine anderen Zellbestandteile bindet.

Die Techniken in dieser Hinsicht sind von den folgenden zwei Arten

1. Affinitätschromatographie:

Dies verwendet Kieselsäureharze. Kieselsäuren binden Nukleinsäuren schnell und spezifisch bei niedrigen pH-Werten und hohen Salzkonzentrationen. Die Nukleinsäuren werden bei höherem pH und niedriger Salzkonzentration freigesetzt.

2. Ionenaustauschchromatographie:

Ionenaustauscherharze wie Diethylamino-Ethyl-Cellulose sind positiv geladen und binden DNA über ihre negativ geladenen Phosphatgruppen. In diesem Fall erfolgt die Bindung bei niedrigen Salzkonzentrationen und die Nukleinsäuren werden durch hohe Salzkonzentrationen eluiert, die die Ionenbindung stören.

Extraktion von DNA: Schritt 3.

Entfernung unerwünschter RNA:

Spezielle Enzyme entfernen kontaminierende RNA aus einer DNA-Probe. Die Enzymbandspaltung baut RNA zu kurzen Oligonukleotiden ab, lässt aber das riesige DNA-Makromolekül unverändert. Eine Mischung aus DNA und RNA wird zuerst mit der Ribonuklease bei der optimalen Temperatur für die Enzymaktivität inkubiert.

Als nächstes wird ein gleiches Volumen Alkohol hinzugefügt. Der Alkohol präzipitiert große Makromoleküle, einschließlich langer DNA-Ketten, aus der Lösung. Die kleinen RNA-Fragmente bleiben jedoch gelöst.

Es sollte beachtet werden, dass die Alkoholbehandlung nicht sehr spezifisch ist und die meisten großen Kohlenhydrate und viele Proteine ​​sowie intakte Makromoleküle sowohl von DNA als auch RNA ausfällen wird. Daher kann die Alkoholpräzipitation erst verwendet werden, nachdem diese Komponenten durch Zentrifugation und Phenolextraktion aus der DNA entfernt wurden.

Anschließend wird die DNA am Boden des Röhrchens durch Zentrifugation sedimentiert und die überstehende Lösung mit den RNA-Fragmenten verworfen (Abb. 3.2). Das winzige DNA-Pellet am Boden des Röhrchens ist oft kaum sichtbar. Dennoch enthält es Milliarden von DNA-Molekülen, ausreichend für die meisten Untersuchungen.


Aufreinigung von RNA mit TRIzol (TRI-Reagenz)

Die TRIzol-Solubilisierung und -Extraktion ist ein relativ kürzlich entwickeltes allgemeines Verfahren zur Deproteinisierung von RNA. Dieses Verfahren ist besonders vorteilhaft in Situationen, in denen Zellen oder Gewebe mit endogenen RNasen angereichert sind oder wenn die Trennung von zytoplasmatischer RNA von nuklearer RNA nicht praktikabel ist. TRIzol (oder TRI-Reagenz) ist eine einphasige Lösung von Phenol und Guanidiniumisothiocyanat, die gleichzeitig biologisches Material solubilisiert und Protein denaturiert. Nach der Solubilisierung verursacht die Zugabe von Chloroform eine Phasentrennung (ähnlich wie die Extraktion mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol), wobei Protein in die organische Phase extrahiert wird, DNA an der Grenzfläche aufgelöst wird und RNA in der wässrigen Phase verbleibt. Daher können RNA, DNA und Protein aus einer einzigen Probe gereinigt werden (daher der Name TRIzol). Die TRIzol-Extraktion ist auch eine effektive Methode zur Isolierung kleiner RNAs wie microRNAs, piwi-assoziierter RNAs oder endogener, kleiner interferierender RNAs. TRIzol ist jedoch teuer und RNA-Pellets können schwer zu resuspendieren. Daher wird die Verwendung von TRIzol nicht empfohlen, wenn eine regelmäßige Phenolextraktion sinnvoll ist.


NGS-Workflow-Schritte

Der Sequenzierungsworkflow der nächsten Generation umfasst drei grundlegende Schritte: Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung und Datenanalyse. Lernen Sie die Grundlagen der einzelnen Schritte kennen und erfahren Sie, wie Sie Ihren NGS-Workflow planen.

Vorbereitung auf den NGS-Workflow

Isolieren und reinigen Sie Ihre Nukleinsäure, bevor Sie mit dem Sequenzierungsworkflow der nächsten Generation beginnen. Einige DNA-Extraktionsmethoden können Inhibitoren einführen, die die enzymatischen Reaktionen, die im NGS-Workflow auftreten, negativ beeinflussen können. Verwenden Sie für beste Ergebnisse ein Extraktionsprotokoll, das für Ihren Probentyp optimiert ist. Konvertieren Sie für RNA-Sequenzierungsexperimente RNA durch reverse Transkription in cDNA.

Nach der Extraktion erfordern die meisten NGS-Workflows einen QC-Schritt. Wir empfehlen die Verwendung von UV-Spektrophotometrie für die Reinheitsbewertung und fluorometrische Methoden für die Nukleinsäurequantifizierung.

Schritt 1 im NGS-Workflow: Bibliotheksvorbereitung

Die Bibliotheksvorbereitung ist entscheidend für den Erfolg Ihres NGS-Workflows. Dieser Schritt bereitet DNA- oder RNA-Proben so vor, dass sie mit einem Sequenzer kompatibel sind. Sequenzierungsbibliotheken werden typischerweise erstellt, indem DNA fragmentiert und an beiden Enden spezialisierte Adapter hinzugefügt werden. Im Illumina-Sequenzierungsworkflow enthalten diese Adapter komplementäre Sequenzen, die es den DNA-Fragmenten ermöglichen, an die Fließzelle zu binden. Fragmente können dann amplifiziert und gereinigt werden.

Um Ressourcen zu sparen, können mehrere Bibliotheken zusammengelegt und im selben Lauf sequenziert werden – ein Vorgang, der als Multiplexing bezeichnet wird. Während der Adapterligation werden jeder Bibliothek eindeutige Indexsequenzen oder „Barcodes“ hinzugefügt. Diese Barcodes werden verwendet, um bei der Datenanalyse zwischen den Bibliotheken zu unterscheiden.

Ressourcen zur Bibliotheksvorbereitung

Hier finden Sie Anleitungen zur Bibliotheksquantifizierung und Qualitätskontrolle.

Erfahren Sie, wie Sie bei der Reinigung von DNA/RNA Kontaminationen vermeiden.

Schritt 2 im NGS-Workflow: Sequenzierung

Während des Sequenzierungsschritts des NGS-Workflows werden Bibliotheken auf eine Fließzelle geladen und auf dem Sequenzer platziert. Die Cluster von DNA-Fragmenten werden in einem Prozess namens Cluster-Generierung amplifiziert, was zu Millionen von Kopien einzelsträngiger DNA führt. Bei den meisten Illumina-Sequenzierungsinstrumenten erfolgt das Clustering automatisch.

In einem Prozess, der als Sequenzierung durch Synthese (SBS) bezeichnet wird, binden chemisch modifizierte Nukleotide durch natürliche Komplementarität an den DNA-Matrizenstrang. Jedes Nukleotid enthält ein fluoreszierendes Tag und einen reversiblen Terminator, der den Einbau der nächsten Base blockiert. Das Fluoreszenzsignal zeigt an, welches Nukleotid hinzugefügt wurde, und der Terminator wird gespalten, damit die nächste Base binden kann.

Nach dem Lesen des Vorwärts-DNA-Strangs werden die Reads weggewaschen und der Vorgang wiederholt sich für den Rückwärtsstrang. Diese Methode wird Paired-End-Sequenzierung genannt.

Sequenzierung durch Synthesetechnologie

Schritt 3 im NGS-Workflow: Datenanalyse

Nach der Sequenzierung identifiziert die Gerätesoftware Nukleotide (ein Vorgang, der als Basenaufruf bezeichnet wird) und die vorhergesagte Genauigkeit dieser Basenaufrufe. Während der Datenanalyse können Sie Ihre Sequenzierungsdaten in ein Standardanalysetool importieren oder eine eigene Pipeline einrichten.

Heute können Sie mit intuitiven Datenanalyse-Apps NGS-Daten ohne Bioinformatik-Schulung oder zusätzliches Laborpersonal analysieren. Diese Tools bieten Sequenzabgleich, Variantenaufruf, Datenvisualisierung oder Interpretation.

Erfahren Sie mehr über Datenanalyse

Starten Sie Ihren NGS-Workflow

Sie möchten schneller starten? Wenden Sie sich über unseren Workflow Design and Evaluation Service an Experten für experimentelles Design.* Wir helfen Ihnen, einen für Sie passenden NGS-Workflow zu entwerfen, Ihre Proben zu verarbeiten und Ihren ersten NGS-Datensatz zu generieren.

*Nicht verfügbar in den Ländern Asien und Südpazifik.

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Mikrobielle Sequenzierung des gesamten Genoms

Die mikrobielle Sequenzierung des gesamten Genoms kann verwendet werden, um Krankheitserreger zu identifizieren, Genome zu vergleichen und antimikrobielle Resistenzen zu analysieren. Unser vorgestellter NGS-Workflow für diese Anwendung beschreibt die empfohlenen Schritte. Der gesamte Workflow verläuft von der DNA zu den Daten in weniger als 24 Stunden.

DNA-Isolierung

Verwenden Sie ein Extraktionskit, um DNA aus mikrobiellen Kolonien zu isolieren, ohne Inhibitoren einzuführen. Wir empfehlen die Verwendung von Glasperlen. Beurteilen Sie die Reinheit mit UV-Spektrophotometrie und quantifizieren Sie DNA mit fluorometrischen Methoden.

Bibliotheksvorbereitung

Bereiten und quantifizieren Sie Bibliotheken gemäß dem im Illumina DNA Prep Guide aufgeführten Protokoll. Sie können auch eine optionale Bibliotheksqualitätsprüfung mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer oder Advanced Analytical Fragment Analyzer durchführen. Du brauchst:

2,5 Stunden
Geschätzter DNA-Input: 1–500 ng

Sequenzierung

Sequenzbibliotheken in einem 2 × 150 bp-Lauf nach dem im iSeq 100-Systemhandbuch aufgeführten Protokoll. Du brauchst:

19,5 Stunden
Geschätzte Ausgabe: 1,2 Gb pro 2 × 150 bp-Lauf
Proben pro Lauf: 4–5 Proben unter Annahme von 5 Mb bei 50-facher Abdeckung

Datenanalyse

Analysieren Sie Daten mit der BWA Aligner-App und visualisieren Sie Daten mit der Integrative Genomics Viewer-App in BaseSpace Sequence Hub. Du brauchst:


Abstrakt

Nukleinsäurematerial von ausreichender Qualität ist entscheidend für eine erfolgreiche High-Throughput-Sequencing (HTS)-Analyse. DNA und RNA, die aus archiviertem FFPE-Material isoliert wurden, werden häufig abgebaut und sind aufgrund chemischer Schäden, die während der Fixierung eingeführt wurden, nicht leicht amplifizierbar. Um optimale Nukleinsäure-Extraktionskits zu identifizieren, wurden DNA- und RNA-Quantität, Qualität und Leistung in HTS-Anwendungen bewertet. DNA und RNA wurden aus fünf Sarkom-Archivierungs-FFPE-Blöcken unter Verwendung von acht Extraktionsprotokollen aus sieben Kits von drei verschiedenen kommerziellen Anbietern isoliert. Für die DNA-Extraktion lieferte das truXTRAC FFPE DNA-Kit von Covaris höhere Ausbeuten und besser amplifizierbare DNA, aber alle Protokolle lieferten vergleichbare HTS-Bibliotheksausbeuten unter Verwendung von Agilent SureSelect XT und schnitten beim Aufruf von Downstream-Varianten gut ab. Für die RNA-Extraktion ergaben alle Protokolle vergleichbare Ausbeuten und amplifizierbare RNA. Für den Nachweis von Fusionsgenen mit dem Archer FusionPlex Sarcoma Assay zeigten das truXTRAC FFPE RNA-Kit von Covaris und das Agencourt FormaPure-Kit von Beckman Coulter jedoch den höchsten Prozentsatz an einzigartigen Read-Paaren, was eine höhere Komplexität der HTS-Daten und eine häufigere Erkennung rezidivierender Fusionen ermöglicht Gene. Die simultane DNA- und RNA-Extraktion mit truXTRAC lieferte ähnliche Ergebnisse wie einzelne Protokolle. Diese Ergebnisse zeigen, dass, obwohl in den meisten Fällen erfolgreiche HTS-Bibliotheken erzeugt werden konnten, die verschiedenen Protokolle eine variable Menge und Qualität für die FFPE-Nukleinsäureextraktion ergaben. Die Auswahl des optimalen Verfahrens ist sehr wertvoll und kann zu Ergebnissen in grenzwertigen Proben führen.

Zitat: Kresse SH, Namløs HM, Lorenz S, Berner J-M, Myklebost O, Bjerkehagen B, et al. (2018)Bewertung kommerzieller DNA- und RNA-Extraktionsmethoden für die Hochdurchsatzsequenzierung von FFPE-Proben. PLoS ONE 13(5): e0197456. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0197456

Editor: Ruslan Kalendar, Universität Helsinki, FINNLAND

Empfangen: 2. August 2017 Akzeptiert: 2. Mai 2018 Veröffentlicht: 17. Mai 2018

Urheberrechte ©: © 2018 Kresse et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium gestattet, sofern der ursprüngliche Autor und die Quelle angegeben werden.

Datenverfügbarkeit: Daten sind aufgrund ethischer und rechtlicher Beschränkungen aufgrund der Richtlinie 95/46/EG des Europäischen Parlaments und des Rates vom 24. Oktober 1995 zum Schutz natürlicher Personen bei der Verarbeitung personenbezogener Daten und zum freien Verkehr nicht verfügbar solcher Daten. Die Bestimmungen über personenbezogene Daten § 7-12 Der Datenschutzbeauftragte hat die Daten gemäß den oben genannten Gesetzen aus Datenschutz- und ethischen Gründen nicht der Öffentlichkeit zugänglich gemacht. Falls erforderlich, können Vorkehrungen für die Einsichtnahme der Daten getroffen werden, solange die Daten unter der Kontrolle des Krankenhauses stehen, da das Universitätskrankenhaus Oslo die Verantwortung des Datenverantwortlichen trägt. Fragen zur Datenverfügbarkeit können sowohl an den Datenschutzbeauftragten unter [email protected] als auch an den korrespondierenden Autor unter [email protected] gerichtet werden.

Finanzierung: Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse der Norwegischen Krebsgesellschaft (PR-2007-0163) an Leonardo A. Meza-Zepeda, Norges Forskningsråd (221580) an Ola Myklebost und das Gentherapieprogramm des Universitätskrankenhauses Oslo an Leonardo A. Meza-Zepeda . unterstützt . Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.


Praktische Anwendung der Phenol/Chloroform-Extraktion

Es gibt zwar viel mehr Methoden zur Reinigung Ihrer RNA oder DNA als früher, aber manchmal ist die Phenol-/Chloroform-Extraktion immer noch der beste Weg. Hier werde ich einige der praktischen Aspekte der Verwendung dieser Technik diskutieren.

Nick hat das Thema Phenol/Chloroform-Extraktion in einem früheren Artikel vorgestellt und dabei einige der Ideen angesprochen, wie die organische Extraktion Proteine ​​aus einer wässrigen Lösung entfernt. Kurz gesagt bestehen Proteine ​​sowohl aus hydrophoben als auch aus hydrophilen Resten und erreichen durch Proteinfaltung einen Kompromiss mit Wasser, um löslich zu bleiben. Wenn ihnen jedoch die Möglichkeit gegeben wird, in eine Umgebung überzugehen, die sowohl polare als auch unpolare Reste (dh Phenol oder Phenol/Chloroform) ohne Kompromisse aufnehmen kann (dh –-Faltung), wechseln sie glücklich dazu Phase. Die stärker polaren Moleküle, wie Kohlenhydrate und Nukleinsäuren, sind in der wässrigen Phase „glücklicher“ (mit einigen unten aufgeführten Ausnahmen) und verbleiben dort. Nun zum Nötigsten.

Phenol versus Phenol/Chloroform versus Chloroform
Eine der häufigsten Fragen, die mir bei der Schulung gestellt wird, ist die Unterschiede zwischen den verschiedenen organischen Phasen, die bei der Extraktion verwendet werden. Hier ist die Aufschlüsselung, so gut ich sie verstehe.

Phenol – Worüber wir hier eigentlich sprechen, ist puffergesättigtes Phenol, das aus einer Lösung besteht, die tatsächlich zu etwa 72% Phenol, 28% Wasser besteht. Da Phenol eine schwache Säure ist, wurden die von uns verwendeten Lösungen mit Puffer äquilibriert, um den pH-Wert auf ein bestimmtes Ziel zu bringen – entweder sauer für die RNA-Aufreinigung oder leicht alkalisch für die DNA-Aufreinigung. Zusätzlich zu einer bestimmten Menge Wasser, die sich im Phenol auflöst, gibt es eine bestimmte Menge Phenol, die sich in Wasser auflöst – beim Äquilibrieren enthält die wässrige Phase etwa 7% Phenol. Es wird angenommen, dass dies bei der Extraktion hilft, da dieses gelöste Phenol hilft, Proteine ​​zu denaturieren, während sie sich noch in der wässrigen Lösung befinden. Puffergesättigtes Phenol hat eine nur geringfügig höhere Dichte als Wasser.

Phenol/Chloroform – Dies ist eine Mischung aus puffergesättigtem Phenol und Chloroform, normalerweise nahe 1:1 für die DNA-Reinigung mit anderen Verhältnissen, die manchmal für die RNA-Reinigung verwendet werden. Isoamylalkohol wird manchmal als Antischaummittel verwendet, wird jedoch im Allgemeinen als inerter und optionaler Zusatz angesehen. Diese Lösung wird aus mehreren Gründen häufig anstelle von puffergesättigtem Phenol verwendet. Wie ich oben erwähnt habe, ist die Dichte von puffergesättigtem Phenol nur wenig höher als die von Wasser. Wenn Ihre wässrige Phase also genügend Salz oder andere gelöste Stoffe enthält, die ihre Dichte erhöhen würden, könnte es während der Extraktion zu einer Phasenumkehrung kommen, bei der sich Ihre wässrige Phase unter dem Phenol befindet und nicht darüber. Chloroform ist deutlich dichter als Wasser, daher erhöht die Zugabe zur organischen Phase die Gesamtdichte dieser Phase und hilft, eine Phaseninversion zu verhindern.

Darüber hinaus trägt das Chloroform (und einige sagen Isoamylalkohol) dazu bei, die Interphase zu reduzieren – die unscharfe Grenze zwischen den beiden Phasen, die von Molekülen bevölkert wird, die sich nicht entscheiden können, wohin sie wollen. Dies können teilweise denaturierte Proteine, DNA (abhängig vom pH-Wert) und/oder teilweise denaturierte DNA-bindende Proteine ​​sein, die noch an der DNA haften, und es ist eine echte Qual. Wenn Sie beim Entfernen der wässrigen Phase einen Teil dieses Materials abpipettieren, verringern Sie die Reinheit Ihrer Probe. Wenn Sie beim Pipettieren zu schüchtern sind, schadet das Ihrer Ausbeute. Wenn du mein Glück hast, dann sitzt darin das, was du am meisten behalten wolltest. Das Hinzufügen von Chloroform zur Mischung hilft, dies zu reduzieren. (Aber ich habe eine noch bessere Lösung für dieses Problem, von der ich Ihnen weiter unten erzählen werde.)

Chloroform – Dies wird normalerweise nach Phenol- oder Phenol/Chloroform-Extraktionen verwendet. Während reines Chloroform für die Proteinextraktion nicht so gut funktioniert wie die oben genannten organischen Lösungen, eignet es sich gut für die Extraktion von Phenol aus wässrigen Lösungen. Denken Sie daran, als ich sagte, dass die wässrige Phase enthalten

7% Phenol nach Äquilibrierung? Erinnern Sie sich auch daran, als ich sagte, dass Phenol gerne Proteine ​​denaturiert? Wenn Sie das Phenol in Ihrer jetzt proteinfreien Nukleinsäurelösung nicht loswerden (oder zumindest stark reduzieren), könnte es Sie erneut heimsuchen, indem es Enzyme, mit denen Sie die DNA oder RNA behandeln, teilweise oder vollständig hemmt Leitung. Mit einem schönen Chloroform-Haus präsentiert, trennt sich das Phenol jedoch von Ihren Nukleinsäuren. Chloroform selbst ist in Wasser etwa 10x weniger löslich als Phenol (

0,8%) und ist für Proteine ​​weniger denaturierend. Mir wurde auch vor langer Zeit gesagt, dass es früher weniger wahrscheinlich ist als Phenol, während der Ethanolfällung mit DNA zu pelletieren, aber ich kann keinen Hinweis finden, der diesen Punkt untermauert.

Ether – Dies kann auch verwendet werden, um Phenol wieder aus der wässrigen Phase zu extrahieren. Aufgrund des explosiven Potenzials von Äther und der Tendenz von Biologie-Typen, Bunsenbrenner und Schlagstöcke in ihren Labors zu haben, wurde es jedoch weitgehend durch Chloroform ersetzt.

Nicht so hübsch in Pink
Ein Hinweis zur Vorsicht: Verwenden Sie Ihr Phenol oder Phenol/Chloroform nicht, wenn die Lösung rosa wird. Die Oxidation des Phenols erzeugt eine rosa/braune Verbindung, und diese Verbindung führt zu einem Einschneiden Ihrer DNA und einem Abbau Ihrer RNA. Die meisten handelsüblichen Phenollösungen enthalten ein Antioxidans, um diese Oxidation zu hemmen, und bei einem sauren pH-Wert gepuffertes Phenol scheint oxidationsbeständig zu sein, aber es ist keine schlechte Idee, einen Teil des puffergesättigten Phenols (aus der braunen Flasche, die es enthält) zu entfernen wahrscheinlich hereingekommen sind) in eine durchsichtige Flasche oder ein durchsichtiges Röhrchen, um es zu überprüfen, bevor Sie mit der Extraktion beginnen.

Der pH-Wert ist wichtig – viel
Gelegentlich führt jemand eine Phenolextraktion durch und gewinnt keine DNA in der Probe. Wenn Ihnen oder jemandem in Ihrem Labor dies passiert, sollte Ihre erste Frage lauten: "Welches Phenol haben Sie verwendet?" Labore, die sowohl DNA- als auch RNA-Arbeiten durchführen, werden wahrscheinlich sowohl saure als auch basische gepufferte Phenollösungen haben, oder jemand kauft eine neue Flasche Phenol, ohne auf den pH-Wert zu achten. Die Extraktion von DNA enthaltenden Proben mit saurem Phenol führt zur Denaturierung der DNA, und sobald sie denaturiert ist, verteilt sich die DNA in die organische Phase. Dies ist ein Schlüsselmerkmal vieler RNA-Reinigungsprotokolle und einer der Gründe, warum mit saurem Puffer gesättigtes Phenol verwendet wird.

Nun, manchmal scheitern die DNA-Phenol-Extraktionen eines Labors (keine Rückgewinnung der DNA danach) und der pH-Wert des Phenols wird in Frage gestellt. Wenn Sie sich an dieser Stelle befinden, können Sie Ihr pH-Meter nicht einfach hineintauchen und kein pH-Papier verwenden, da der pH-Indikator auf dem Papier in wässrigen Lösungen charakterisiert wurde. Die Methode, die ich verwendet habe, besteht darin, 1 ml des puffergesättigten Phenols mit 9 ml 45%igem Methanol zu verdünnen, zu mischen und dann den pH-Wert mit einem Standard-pH-Meter zu messen. Der sicherste Weg, den pH-Wert einzustellen, besteht darin, die wässrige Phase auf der Phenollösung durch ein frisches Aliquot von . zu ersetzen

100 mM gepuffertes Wasser (normalerweise Tris pH 7,9 für DNA-Arbeiten), die Phasen gut mischen und dann die Flasche absetzen lassen, bis die Phasen wieder gut getrennt sind. Dann erneut pH-Wert.

Mischen Sie Ihre Phasen
Phenol/Chloroform-Extraktionen sind erstaunlich effizient – ​​weniger als 1% des durchschnittlichen Proteins verbleibt in der wässrigen Phase, nachdem die erste Extraktion das Gleichgewicht erreicht hat. Der Trick besteht natürlich darin, die Extraktion ins Gleichgewicht zu bringen. Je mehr Oberfläche zwischen den beiden Phasen vorhanden ist, desto schneller geschieht dies, und diese Oberfläche ist umso größer, desto feiner die Emulsion, die Sie erstellt haben. Dies kann durch einige Minuten langes Vortexen der Phasen erreicht werden, wie es viele Protokolle erfordern, aber nicht alle Proben können gevortext werden. Wenn Sie sehr große DNA wie genomische DNA reinigen, müssen Sie Ihre Probe möglicherweise viel schonender mischen und daher jede Extraktion viel länger durchführen. Befolgen Sie an diesem Punkt also Ihr Protokoll und seien Sie sehr vorsichtig, wenn Sie versuchen, diesen Schritt zu reduzieren.

Auswirkungen von Denaturierung und Verdauung
Einige Protokolle verlangen eine Proteindenaturierung und möglicherweise eine Verdauung mit Protinase K vor der Extraktion. Beide dieser Schritte sind Versuche, die Materialmenge, die in der Zwischenphase eingeschlossen ist, zu reduzieren und daher die Ausbeute an gewonnener DNA oder RNA zu verbessern. Ich habe nie einen negativen Effekt der Denaturierung der Proteine ​​mit SDS vor der Extraktion gesehen. Andererseits könnte die Verdauung des Proteins die Reinheit der gewonnenen Nukleinsäure verringern. Während die Verteilung ganzer Proteine ​​in die organische Phase fast garantiert ist, haben nicht alle diese Peptide, sobald das Protein in kleine Peptide verdaut ist, den gleichen chemischen „Charakter“ des gesamten Proteins, und jedes hat seine eigene Partitionsnummer. Abhängig von Ihrer nachgeschalteten Anwendung kann es keine Rolle spielen, ob Sie einige Peptide in Ihrer Nukleinsäure haben, aber es ist formal möglich, dass diese Verunreinigungen Ihre zukünftige Quantifizierung der Probe beeinträchtigen könnten. Ich habe jedoch einen besseren Weg gefunden, die gefürchtete Interphase zu beseitigen…

Phasenlock-Gel®
Dies ist eines der Dinge, die in 50 % der Labors zu sein scheinen, aber weniger als 10 % der Leute, mit denen ich gesprochen habe, wissen, was es ist oder wie es funktioniert. Das habe ich an einem kritischen Punkt meiner Recherchen entdeckt und meine Doktorarbeit gerettet. Kurz gesagt, Phase-Lock-Gel ist ein klebriges, vasolinartiges Gel mit einer etwas höheren Dichte als Wasser. Wenn Sie Ihre Extraktion darüber in ein Zentrifugenröhrchen geben und dann zentrifugieren, sammelt sich das Phase Lock Gel zwischen der wässrigen und der organischen Phase, trennt die beiden und verhindert die Bildung der DNA/RNA-hungrigen Interphase.

Eine Suche im Internet ergab keine Bilder von diesem Prozess, die ich für gut genug hielt, also habe ich einige meiner eigenen gemacht. In dieser kleinen Demonstration ersetzt roter Farbstoff unsere kostbare Nukleinsäure und blauer Farbstoff ersetzt Protein.

A) Das Phase Lock Gel® pelletiert in den Boden eines 1,5 ml Eppendorf-Röhrchens.
B) Nach Zugabe von Phenol/Chloroform und der wässrigen Phase komplett mit Faux-DNA (rot) und Faux-Protein (blau) in der wässrigen Phase.
C) Nach leichtem Schütteln für 5 Minuten.
D) Nach Zentrifugation. Beachten Sie, dass das Gel jetzt die organische Phase von der wässrigen Phase trennt.
E) Nach einer zweiten Zugabe von Phenol/Chloroform und leichtem Schütteln für 5 Minuten.
F) Nach der zweiten Zentrifugation. Die Faux-DNA könnte nun mit Chloroform extrahiert werden (im gleichen Röhrchen, wenn der Platz es erlaubt), um das restliche Phenol zu entfernen.

Wie Sie sehen, bildet das Gel eine stabile Trennwand zwischen den beiden Phasen, und wenn Sie die Probe ein zweites Mal extrahieren möchten und noch Platz im Röhrchen ist, können Sie dies tun, indem Sie zwei oder mehr dasselbe Röhrchen verwenden ohne Kompromisse bei der Probenreinheit. Sie können die beiden Phasen nicht in einem Röhrchen mit diesem Reagenz vortexen, aber Sie können in einem separaten Röhrchen abstimmen, dann die Probe mit dem Gel in das Röhrchen geben und zentrifugieren. Sie haben dieses Gel in zwei verschiedenen Geschmacksrichtungen – eine für normale Proben (leicht) und eine andere für Proben mit hoher Dichte, wie Lösungen mit hohen Salz- oder Proteinkonzentrationen (schwer).

Die Verwendung von SDS zur Denaturierung der Proteine ​​in meiner Probe vor der Extraktion und die anschließende Verwendung von Phase Lock Gel® zur Trennung der Phasen hat mir konsistent DNA-Proben mit 260/280-Verhältnissen von 1,8 und einer Wiederfindung von mehr als 98% geliefert. Ernsthaft tolle Sachen.

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Jetzt von Ihnen zu hören: Was sind Ihre Tricks und Tipps für eine perfekte Proteinextraktion?


Lab-on-a-Chip-Technologie und ihre Anwendungen

Burak Yılmaz , Fazilet Yılmaz , in Omics-Technologien und Bio-Engineering , 2018

8.1.1.2 PCR, qPCR und molekulare Detektion auf LOC-Geräten

Nach der DNA-Extraktion ist die häufigste Analyse die PCR (Polymerase Chain Reaction). PCR hat viele Anwendungen, die direkt und indirekt wie Sequenzierungstechniken sind. Eine der direkten PCR-Anwendungen ist offensichtlich die Amplifikation von DNA-Sequenzen, die dazu beiträgt, geringe DNA-Mengen nachweisbar zu machen (z. B. zum Nachweis von Krankheitserregern, wie Bakterien oder Viren).

Die Bedeutung der PCR in der Genomanalyse beeinflusst die Entwicklung zahlreicher LOC-Geräte für die PCR. Miniaturization of volume and the high surface to volume ratio leads rapid thermal transfer for rapid and integrated PCR. PCR also requires a post-analysis so that amplicons’ size detection carried out by electrophoresis have been made to integrate PCR and electrophoresis on-chip ( Timothée, 2015a ).

Originally electrophoresis is done by using gels, mainly made using agarose (for longer DNA) and polyacrylamide (for shorter DNA). With the advent of LOCs, DNA electrophoresis was one the first molecular processes that could be integrated on a chip ( Curtis Saunders et al., 2013 ). This miniaturization enabled to increase even more the process time to realize electrophoresis, reduce reagent consumption, and assemble on a chip other DNA process steps as mentioned before ( Fig. 8.1 ).

Figure 8.1 . PCR microfluidic system.

qPCR is another technique that was adapted to LOC devices that present the advantage to be faster (automated detection during PCR), more sensitive, and sustainable.

As an example, using ultra-fast pressure controller and fluorescence reader and based on the ultra-fast temperature control, ultra-fast qPCR microfluidic system had been developed by Elvesys system for the molecular detection of diseases like Anthrax and Ebola in less than 8 minutes with a detection efficiency identical to commercial systems that are 7–15 times slower ( Ramalingam et al., 2010 ).

Another emerged field is digital microfluidics that deals with emulsion and droplets within LOC devices.

Ultra-low amount of DNA can be captured within Tröpfchen, and limits can be increased with one copy number detection within LOC droplet qPCR ( Beer et al., 2007 ) ( Fig. 8.2 ).

Figure 8.2 . LOC droplet qPCR.


Methode¶

  • Sterilisieren Sie mit Bleach einen Trockenreagenzspatel und einen kleinen Magnetrührstab.
  • Bereiten Sie eine 5-10 Gew.-% Aufschlämmung von Chelex100 Harz (Biorad Teil 143-3832,100-200 mesh Chelex, Natriumform) und UV-sterilisiertem HPLC-Wasser vor. Am effektivsten geht das, indem man ein 50 ml steriles Falkenröhrchen nimmt, auf eine Waage in ein kleines Becherglas legt und die Waage auf Null stellt. Dann 5 Gramm Chelex hinzufügen und mit Wasser bis zur 50ml-Marke auffüllen.

Präzision ist nicht entscheidend. Sterile Technik ist.

  • Legen Sie den sterilen Rührstab in das Röhrchen und stellen Sie ihn auf den Magnetrührer. Chelex setzt sich schnell ab. Wenn die Aufschlämmung nicht gut gemischt ist, können Ihre Konzentrationen und Ergebnisse variieren. Halten Sie die Aufschlämmung gut gemischt, aliquotieren Sie 300-500 Mikroliter in 0,6 oder 1,6 ml Eppendorf-Röhrchen (wiederum steril) und verschließen Sie sie sofort. Wenn Sie Zugang zu einer Laminar-Flow-Haube haben, ist dies ein guter Ort, um all dies zu tun. Wischen Sie die Waage und den Rührer vor der Verwendung mit einer 10 %igen Bleichlösung ab und/oder UV-sterilisieren.
  • Heizblock einschalten. Auf 95 °C einstellen. Löcher mit Wasser füllen.

  • Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette (zum Sterilisieren mehrmals über dem Alkoholbrenner flammen) ein kleines Stück Gewebe von Ihrer Probe. Dieses Gewebestück sollte groß genug sein, um sichtbar zu sein, aber nicht so groß, dass es leicht sichtbar ist. Stellen Sie sich vor, Sie schneiden einen 0,2-mm-Abschnitt einer Standardklammer. Das ist reichlich groß. Zu viel Gewebe kann Ihre Reaktionen hemmen.

Zange zwischen den Proben sterilisieren.

  • Wenn Sie fertig sind, machen Sie eine negative Chelex-Kontrolle, indem Sie Ihre sterilisierte Pinzette in ein Röhrchen mit Chelex-Aufschlämmung tauchen.
  • Vortex-Probe und Chelex-Aufschlämmung für 10-15 Sekunden.

Stellen Sie sicher, dass die Deckel fest eingerastet sind, bevor Sie beginnen.

* Die Blocktemperatur kann bei diesem Schritt leicht sinken. Dieser Abfall ist normal. Überprüfen Sie die Röhrchen während der Inkubation, um sicherzustellen, dass die Deckel nicht abgefallen sind. *

Seien Sie vorsichtig, da Dampf den Deckel vom Zentrifugenröhrchen lösen kann. Halten Sie die Deckel nach unten.

Überstand nur für PCR-Reaktionen verwenden. Chlex-Perle deaktiviert Taq!

Diese Methode basiert mit Genehmigung auf einem Originalprotokoll, das hier verfügbar ist.


Schau das Video: RNA isolation troubleshooting Part 1: RNA degradation (August 2022).