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A6. Extreme Bindungsaffinitäten - Biologie


Eine unglaublich enge Bindungswechselwirkung wurde kürzlich für die Bindung von Cu1+ an das CueR-Protein aus . berichtet E coli. Cu1+-Ionen werden in Zellen normalerweise in einer sehr niedrigen Konzentration gehalten, um eine Toxizität zu verhindern. Einige Enzyme benötigen jedoch Cu. Freie Kupferionen müssen in der Zelle vorhanden sein, um die Bindung an geeignete Stellen in Proteinen zu ermöglichen. Wie werden diese konkurrierenden Anliegen in der Zelle reguliert? Die Cu-Gesamtkonzentration in E. coli beträgt etwa 10 µM (10.000 nM), was bei der geringen Größe des Bakteriums etwa 10.000 Kupferionen pro Zelle entspricht.

Zellen haben viele Mechanismen entwickelt, um Cu-Ionen zu kontrollieren und zu liefern. Kupferionen können durch Kupferchaperone (Analoga der Chaperonproteine, die die Proteinfaltung steuern) an Zielproteine ​​abgegeben werden. CueR in E. Coli scheint die kupferinduzierte Expression von Genen zu regulieren, die an der Kupferbiochemie beteiligt sind (einschließlich eines Enzyms, das Cu1+ zu Cu2+ oxidiert, das weniger toxisch ist). Ein bestimmtes Gen, das hochreguliert wird, ist copA. CueR erhöht die Transkription von copA in Gegenwart von Cu-, Ag- und Au-Ionen (Münzmetall). Changelaet al. einen In-vitro-Assay entwickelt, der das Ausmaß der Expression von CueR-regulierten Genen unter einer Vielzahl von Ionentypen und Konzentrationen bestimmt. In dem Assay wurde gereinigtes CueR zu einem Genkonstrukt hinzugefügt, das den Promotor (ein DNA-Abschnitt unmittelbar stromaufwärts einer Genstartstelle, an der die RNA-Polymerase bindet) für copA enthielt. Anfänglich fanden sie heraus, dass die Transkription selbst in Gegenwart eines Liganden, Glutathion, immer aktiv war, der Cu1+ stark bindet und den Gehalt an freiem Cu1+ sehr niedrig halten sollte. Sie wechselten zu einem noch enger bindenden Cu1+-Koordinator, Cyanid (CN-), um die freien Cu1+-Werte auf noch niedrigere Werte zu reduzieren. Extrem hohe Konzentrationen von CN- (millimolar) stoppten die Transkriptionsaktivierung, aber wenn zusätzliches Cu1+ hinzugefügt wurde, folgte eine Aktivierung, was darauf hindeutet, dass die Kupferbindung an das Protein reversibel war. Bei 1 mM CN- erhöhte sich die Transkription durch Zugabe von Kupferionen bis zu einer GESAMT-Cu1+-Konzentration von 60 μm. Unter diesen Bedingungen waren die Konzentrationen an freiem Cu1+ viel geringer. In Anbetracht der verwendeten CN- Konzentrationen trat eine halbmaximale Aktivierung bei einer GESAMT-Cu1+-Konzentration von 0.7 μM auf. Eine ähnliche Aktivierung wurde von Ag1+ und Au1+ beobachtet, jedoch nicht von Zn- und Hg-Ionen, was die Spezifität für einwertige Kationen gegenüber zweiwertigen Kationen zeigt.

In Kenntnis des pKa von HCN, der Stabilitätskonstanten für Cu1+:CN--Komplexe und der CN--Konzentrationen stellten Changela et al. eine Reihe von in FREIem Cu1+ gepufferten Lösungen her, die von 10-18 bis 10-23 M (pH 8.0) reichten. (Zum Beispiel der Logarithmus der Bindungskonstanten β, logβ, für die

[ce{Cu^{1+} + 2CN- <=> [Cu(CN)2]^{-}}]

ist 21.7. Probleme wie dieses mit verknüpftem Gleichgewicht haben Sie gelöst, wenn Sie analytische Chemie verwendet haben.) Die freie Cu1+-Konzentration bei halbmaximaler Aktivierung der Gen-Reporter-Transkription, ein Maß für die Dissoziationskonstante Kd, betrug ungefähr 1 x 10-21 M (zeptomolar )! Nehmen wir nun an, dass das Volumen des Inhalts einer E. coli-Zelle 1,5 x 10-15 L beträgt. Wenn nur ein Ion von Cu1+ in der Zelle wäre, hätte es eine Konzentration von 10-9 M. Die Werte deuten darauf hin, dass es keine freien Cu1+-Ionen in der Zelle sind und dass nur 1 Cu+1-Ion in der Zelle ausreicht, um seine Bindung an CueR und die anschließende transkriptionelle Aktivierung von copA sicherzustellen.

Jmol: Aktualisierte Cu(I)-Form von E. coli Cuer, einem Kupferausflussregulator Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

Es ist überlebenswichtig, dass Bakterienzellen das richtige Metall zu den Metalloproteinen bekommen. Eine aktuelle Übersicht von Waldron und Robinson zeigt, wie. Die Zelle verfügt über viele Mechanismen, um spezifische Bindungsstellen einzuschränken, damit Metalle zu den richtigen Proteinen gelangen können. Darüber hinaus muss die natürliche Stabilitätsordnung von Übergangsmetallkomplexen beim Verständnis der Metallaffinitäten berücksichtigt werden. Diese Stabilität wird durch die Irving-William-Reihe gegeben, die unten gezeigt wird (zusammen mit Metallionen der Gruppe 2A). Der Trend entspricht der Größe des Kations (vom größten zum kleinsten):

Mn2+ < Fe2+ < Co2+ < Ni2+ < Cu2+ > Zn2+ (dichteste Bindung)

  • Die Fähigkeit eines Proteins, seine Form bei der Ligandenbindung zu ändern, ermöglicht die Bindung verschiedener Metalle. Cyanobakterien haben beispielsweise einen hohen Bedarf an Kupfer und Mangan. Man lässt Mangan zuerst binden und dann wird das Protein gefaltet und Mangan wird im Protein eingeschlossen. Dieses sehr instabile Metall kann jetzt nicht durch Kupfer ersetzt werden, das normalerweise Mn2+ um den Standort verdrängen würde.
  • Metalltransporter helfen dabei, zu regulieren, wie viele Ionen jedes Metalls sich in der Zelle befinden. Metallsensoren stehen unter der Kontrolle dieser Metalltransporter und regulieren die Genexpression. Sobald ein bestimmtes Metall eine ausreichende Konzentration für die Bindung aufweist, zielen die Metallsensoren auf mRNA ab, um bestimmte Gene zu unterdrücken und die Transkription zu stoppen
  • Für den Export des Metalls kann auch ein weiteres Enzym aktiviert werden. Durch Begrenzung der Konzentrationen der konkurrierenden Metalle bleiben schwächere Metallbindungsstellen verfügbar
  • Metallsensoren können auch dazu beitragen, zu regulieren, welches Protein einige Metalle verwenden, basierend auf dem, was verfügbar ist. Zum Beispiel schaltet E. coli den Stoffwechsel um, um die Anzahl der eisenbedürftigen Proteine ​​zu minimieren, die exprimiert werden, wenn Eisen weniger reichlich vorhanden ist
  • Metalle werden auf mehreren Wegen zugeführt (falls ein bestimmtes Enzym nicht vorhanden ist) und werden durch viele Ligandenaustauschreaktionen zum richtigen Protein „transportiert“.
  • Bestimmte Enzyme binden spezifische Metalle, die bevorzugte Konformationsänderungen verursachen. Wenn also ein Metall auftaucht, das fester bindet, aber vom Enzym nicht bevorzugt wird, löst es das Enzym nicht aus, da es auf andere Weise bindet


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