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Wofür M9 steht

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Kann mir jemand sagen was M9 steht für in M9 mittel?

Ich habe versucht zu googeln, aber ich kann es immer noch nicht finden.


Maschinenbau Escherichia coli zur Methanolumwandlung

Methylotrophe Bakterien nutzen Methanol und andere reduzierte Ein-Kohlenstoff-Verbindungen als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle. Zu diesem Zweck haben diese Bakterien eine Reihe von spezialisierten Enzymen und Stoffwechselwegen entwickelt. Hier haben wir einen synthetischen Biologie-Ansatz verwendet, um eine Reihe von „Methylotropie-Genen“ auszuwählen und in Escherichia coli beyogen auf in silico Überlegungen und Flussbilanzanalysen, um die Dissimilation und Assimilation von Methanol zu ermöglichen. Wir stellten fest, dass der vielversprechendste Ansatz zur Verwendung von Methanol die Implementierung der NAD-abhängigen Methanoldehydrogenase und die Etablierung des Ribulose-Monophosphat-Zyklus durch die Expression der Gene für Hexulose-6-Phosphat-Synthase (Hps) und 6-Phospho-3- Hexuloisomerase (Phi). Um die leistungsstärksten Enzyme im heterologen Wirt zu testen, wurden eine Reihe von Enzymkandidaten aus verschiedenen Spenderorganismen ausgewählt und systematisch auf ihre in vitro und in vivo Aktivitäten in E coli. Darunter Mdh2, Hps und Phi mit Ursprung in Bacillus methanolicus erwiesen sich als am effektivsten. Markierungsexperimente mit 13 C Methanol mit E coli die Herstellung dieser Enzyme zeigte bis zu 40% Einbau von Methanol in zentrale Metaboliten. Das Vorhandensein des endogenen Glutathion-abhängigen Formaldehyd-Oxidationsweges von E coli beeinflusste die Methanolumwandlungsrate nicht nachteilig. Zusammengenommen stellen die Ergebnisse dieser Studie einen großen Fortschritt bei der Etablierung von synthetischen Methylotrophen durch Gentransfer dar.


NEU für 2014 – M-Serie der nächsten Generation

Anmerkung der Redaktion: Die folgenden Informationen stammen von der Website des Herstellers und unsere Überprüfung der Maschinen bestätigt die Informationen.

Der NEUE 2014 M9 Life Ionizer ist ein komplettes Re-Design, das ihren beliebten LIFE 9100 ersetzt. Das „M“ in der M-Serie steht für Maximum – und LIFE bedeutet es! Der neue M-9 übertrifft alle anderen Ionisatoren:

  • Alkalisches Wasser mit einem pH-Wert von bis zu 11,5
  • Höchstes antioxidatives Potenzial, das sich auf bis zu -800 ORP . einstellt
  • SMPS MAX Yield Power™ – passt auf 252 bis 504 Watt*

Der Baumartenreichtum erhöht die Kohlenstoffspeicherung des Ökosystems in subtropischen Wäldern

Waldökosysteme sind integraler Bestandteil des globalen Kohlenstoffkreislaufs, da sie über kurze Zeiträume große Mengen an C aufnehmen und abgeben (C-Fluss) oder über längere Zeiträume akkumulieren (C-Vorrat). Es bleibt jedoch Unsicherheit darüber, ob und in welche Richtung sich C-Flüsse und insbesondere C-Vorräte zwischen Wäldern mit hohem und niedrigem Artenreichtum unterscheiden können. Basierend auf einem umfassenden Datensatz aus Feldmessungen haben wir den Einfluss von Artenreichtum (3-20 Baumarten) und Bestandsalter (22-116 Jahre) auf sechs Kompartimente ober- und unterirdischer C-Vorräte und vier Komponenten getestet von C-Flüssen in subtropischen Wäldern im Südosten Chinas. In allen Waldbeständen betrug der C-Gesamtbestand 149 ± 12 Mg ha -1, wobei der Reichtum 28,5 % und das Alter 29,4 % der Variation in diesem Maß erklärt. Artenreiche Bestände wiesen höhere C-Bestände und -Flüsse auf als Bestände mit niedrigem Reichtum und zudem wiesen alte Bestände höhere C-Bestände auf als junge. Insgesamt erhöhte sich der C-Gesamtbestand für jede weitere Baumart um 6,4 %. Unsere Ergebnisse liefern umfassende Beweise für die durch Diversität vermittelte ober- und unterirdische C-Sequestrierung in artenreichen subtropischen Wäldern im Südosten Chinas. Daher sollte die Aufforstungspolitik in dieser Region und anderswo einen Wechsel vom derzeitigen Fokus auf Monokulturen hin zu Plantagen mit mehreren Arten in Betracht ziehen, um die C-Fixierung zu erhöhen und damit den Anstieg des atmosphärischen CO . zu verlangsamen2 Konzentrationen und globale Erwärmung.

Schlüsselwörter: BEF-China Kohlenstofffluss Kohlenstoffspeicher Ökosystem funktionierende immergrüne Laubwälder Waldbiodiversität.


Materialen und Methoden

Chemikalien und Reagenzien

Alle Chemikalien und Lösungsmittel wurden von Sigma-Aldrich bezogen, sofern nicht anders angegeben. Restriktionsendonukleasen und DNA-modifizierende Enzyme stammten von New England Biolabs. DNA-Plasmid wurde unter Verwendung des GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) extrahiert. Die DNA-Sequenzierung wurde an Eurofins SAS (Ebersberg, Deutschland) vergeben.

Plasmidkonstruktion

Die Vektoren pZA23, pZA33, pZE23 und pZS23 von Expressys ® wurden verwendet, da sie durch IPTG induzierbar sind und eine aufgehellte Struktur des lacI Gen, das seine Größe reduziert (2 358 bis 3 764 bp) und sie sind modulierbar (einfacher Replikationsstartpunkt, Resistenzmarker und Vektorpromotor durch Restriktion/Ligation zu ändern). In dieser Studie wurde der Promotor PA1lac0-1 in pZA33 durch den konstitutiven Promotor proC und durch den induzierbaren Promotor P . ersetzttac, was pZA37 bzw. pZA36 erzeugt. Ebenso wurde der Promotor PA1lac0-1 von pZS23 durch proD ersetzt, der pZS28 erzeugt.

Die Genklonierung wurde unter Verwendung des NEBuilder HIFI DNA Assembly Master Mix (NEB E2621) durchgeführt. Dieses Verfahren ermöglicht es, mehrere Fragmente in einem einzigen Schritt zusammenzusetzen. Die von New England Biolabs bereitgestellte kommerzielle Mischung enthält (a) eine Exonuklease, die 3′ Einzelstrangenden erzeugt, die den Zusammenbau der Fragmente erleichtert, die eine Sequenzkomplementarität teilen (b) eine Polymerase, die die Leerstellen nach den Fragmenten ausfüllt zusammengesetzt wurden und (c) eine Ligase, die Fragmente miteinander verknüpft. Die E. coli kdsD, fsaA und aldA Gene wurden aus der Genom-DNA amplifiziert, die aus extrahiert wurde E coli K12 MG1655 durch PCR unter Verwendung der in Tabelle S1 beschriebenen Primer. Fragmente (kdsD + fsaA oder aldA) wurden dann durch HiFi-Assembly ® in zuvor linearisierte pZ mit Primern, die auf beiden Seiten des MCS hybridisierten, eingefügt. Alle Plasmide wurden durch Sequenzierung verifiziert. Die resultierenden Plasmide mit dem kdsD, fsaA und aldA Gene sind in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2. Plasmide, die in dieser Studie verwendet oder konstruiert wurden.

Stammaufbau und -transformation

Die E coli Die in dieser Arbeit verwendeten Stämme sind in Tabelle 3 aufgeführt. glcD, fucA, mgsA,pfkA, ptsG) wurde durch Transduktion unter Verwendung des Phagen P1vir hergestellt. Die Herstellung der Lysate P1vir und die Transduktionsverfahren erfolgten wie in Bremer et al. (1984) mit leichten Modifikationen. Stämme (Spenderstamm) aus der KEIO-Sammlung (Murakami et al., 2007) mit einer einzelnen Deletion und einer Kanamycin-Antibiotika-Resistenzkassette wurden (200 μl einer Übernacht-Vorkultur in LB) in 5 ml LB mit 0,2% D-Glucose und 5 mM CaCl2 30 Minuten bei 37ଌ. Dann wurden 100 μl P1vir-Lysat (~ 5 × 10 8 Phagen/ml) zu jeder Spenderkultur gegeben und bei 37ଌ 2 bis 3 h inkubiert, bis die Kultur klar und die Zellen vollständig waren lysiert (Baba et al., 2006). Die Lysate wurden durch Filtration unter Verwendung von sterilen 25-mm-Spritzenfiltern mit einer 0,2 μm-Trägermembran (Pall) gewonnen und bei 4ଌ konserviert. Um das interessierende Gen zu deletieren, wurde der Empfängerstamm mit P1vir infiziert, das die Donor-Gen-Deletionskassette mit einer Kanamycin-Resistenz trägt. Zu diesem Zweck wurde der aufnehmende Stamm zuvor in 5 ml LB-Medium bei 37ଌ kultiviert, durch Zentrifugation bei 1500 g für 10 min gesammelt und in 1,5 ml 10 mM MgSO . resuspendiert4 und 5 mM CaCl2. P1vir-Lysat, das die Gendeletionskassette des Spenderstamms trägt, wurde zu der Suspension des empfangenden Stamms gegeben (0,1 ml) und für 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Dann wurden 0,1 ml 1 M Natriumcitrat zugegeben, dann 1 ml LB, und diese Zellsuspension wurde 1 h bei 37 °C, 200 U/min inkubiert, bevor sie mit dem entsprechenden Antibiotikum auf einem festen LB-Medium ausgestrichen wurde. Kolonien wurden durch PCR gescreent, um erfolgreiche Transduktionsereignisse zu isolieren. Die Entfernung der antibiotischen Kassette erfolgte durch Transformation der Bakterienstämme mit dem pCP20-Plasmid, das die FLP-Rekombinase trägt, gefolgt von einer PCR-Überprüfung.

Tisch 3. E coli Stämme, die in dieser Arbeit verwendet und konstruiert wurden.

Die kompetenten nicht-kommerziellen Stämme wurden nach dem Protokoll von Chung et al. (1989) mit geringfügigen Modifikationen wie folgt. Eine Vorkultur wurde über Nacht in LB über Nacht hergestellt. Frische LB-Kultur wurde dann mit Zellen bei einer DO&sub2;600 von 0,1. Wenn TUN600 etwa 0,5 erreicht, wurden 2 ml Kultur gesammelt und zum resultierenden Pellet in 300 μl TSS-Puffer [2,5 %(w/v) PEG 3350, 1 M MgCl2, 5%(Vol/Vol) DMSO]. Nach 10 min auf Eis wurde das interessierende Plasmid zu der Zellsuspension gegeben, die weitere 30 min auf Eis inkubiert wurde. Diesem Schritt folgte ein Hitzeschock bei 42ଌ für 90 s. Die transformierten Zellen wurden für 10 min auf Eis gelegt, dann wurden 400 μl LB zugegeben und die Kultur wurde bei 200 U/min für 1 h bei 30°C inkubiert. Nach 2,5-minütiger Zentrifugation bei 8 000 U/min wurde das Zellpellet in 600 µbCl LB resuspendiert und 150 µbCl wurden auf festen LB-Platten mit dem entsprechenden Antibiotikum ausgestrichen.

Kulturen Bedingungen

Für molekularbiologische Techniken wurden die Bakterienstämme in LB-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakte und 5 g/l NaCl) kultiviert und 5 g/l Agar wurde für festes Medium in Petrischalen zugegeben. Für die GA-Produktion wurde das Mineralmedium M9 verwendet. Sofern nicht anders angegeben, enthielt es pro Liter: 18 g Na2 HPO 4 * 12H2O, 3 g KH2Bestellung4, 0,5 g NaCl, 2 g NH4Cl, 0,5 g MgSO 4 * 7H2O, 0,015 CaCl 2 * 2H2O, 1 ml 0,06 M FeCl3 aus einer 1000 ×-Stammlösung in konzentrierter HCl, 2 ml 10 mM Thiamin-HCl-Stammlösung, 20 g MOPS und 1 ml Spurenelementlösung (1000 ×-Lösung von 0,5 g Na2EDTA * 2H2O, 0,18 g CoCl 2 * 6H2O, 0,18 g ZnSO 4 * 7H2O, 0,4 g Na2 MoO 4 * 2H2O, 0,1 g H3BO3, 0,12 g MnSO 4 * H2O, 0,12 g CuCl2 × H2Ö). Die Kohlenstoffquelle D-Glucose, L-Arabinose oder D-Xylose wurde in einer Endkonzentration von 10 g/l zugegeben, der pH-Wert wurde mit Säure 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure (MOPS) auf 7 eingestellt und anschließend durch Filter sterilisiert 0,2 μm Membranen. Die Antibiotika Ampicillin, Kanamycin und Chloramphenicol wurden bei Bedarf in Konzentrationen von 100, 50 bzw. 25 mg/L zugegeben. Für die E coli Stämme mit defekter Transketolase-Aktivität (ΔtktA ΔtktB), wurde M9-Medium mit 500 μM L-Phenylalanin, 250 μM L-Tyrosin, 200 μM L-Tryptophan, 6 μM p-Aminobenzoat, 6 μM p-Hydroxydenzoat und 280 & #x003BCM Shikimat und Spuren von LB (20% V/V). Für die Stämme mit defekter Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase-Aktivität (ΔLückeA), wurde das M9-Medium mit 0,4 g/l Äpfelsäure vervollständigt, die mit KOH auf pH 7 eingestellt wurde. Bei Bedarf wurden dem Medium die entsprechenden Antibiotika mit 100 μg/ml für Ampicillin, 50 μg/ml für Kanamycin oder 25 μg/ml für Chloramphenicol zugesetzt. Die Bakterienkulturen wurden bei 200 U/min und 37 °C in Rotationsschüttler gegeben. Das Wachstum wurde durch Messen der Extinktion bei 600 nm mit einem Spektrophotometer (Biochrom Libra S11) überwacht.

Enzymproduktion, Reinigung und Assays

Die kdsD, fsaA, und aldA Gene wurden unter Verwendung von Primern in Tabelle S1 amplifiziert und in den Expressionsvektor pET28a (Novagen) kloniert. Die E coli Stamm BL21 (DE3), der mit dem Plasmid, das diese Gene trägt, transformiert war, wurde aus einer Vorkultur in LB-Kanamycin (50 mg/l) in 200 ml LB-Kanamycin bei 600 nm (DO600) von 0,1 bei 16ଌ in einem Rotationsschüttler bei 200 U/min. Wenn TUN600 0,6𠄰,8 erreichte, wurde die Expression des interessierenden Proteins durch Zugabe von IPTG bei 1 mM Endkonzentration 1 mM IPTG induziert. Nach 16 h bei 16ଌ wurde die Kultur durch Zentrifugation bei 4.800 U/min für 15 min bei 4ଌ gesammelt. Das Zellpellet wurde in 1,5 ml Waschpuffer (50 mM HEPES, pH 7,5, 0,3 M NaCl) resuspendiert und viermal (jeweils 30 s) bei 30% Leistung auf Eis beschallt. Die HIS-markierten Proteine ​​wurden unter Verwendung von Kobaltharz gemäß dem im kommerziellen Kit (Clontech) beschriebenen Protokoll gereinigt. Die Reinigung des Proteins wurde durch SDS-PAGE-Elektrophorese verifiziert und die Proteinkonzentration wurde nach der Bradford-Methode gemessen (Bradford, 1976)

Enzymassays wurden in einem Tris-Cl, 100 mM pH 7,5/10 mM MgCl&sub2;2 Puffer bei 37ଌ. Sofern nicht anders angegeben, wurde die KdsD-Aktivität in einem gekoppelten Assay in Gegenwart von 3 mM NAD + und 5 mM D-Ribu-5P mit jeweils 10 μg/ml von FsaA und AldA gemessen. FSA wurde durch Koppeln von GAP, das durch Spaltung von 3 mM Ara5P hergestellt wurde, mit der Oxidation von 0,2 mM NADH bei 340 nm in Gegenwart von 1 U/ml Trioseisomerase und Glycerin-3-P-Dehydrogenase gemessen. AldA wurde im gleichen Puffer durch Reduktion von NAD + (3 mM) bei 340 nm in Gegenwart von 5 mM Glykolaldehyd gemessen.

Analytische Methoden

Extrazelluläre Metaboliten wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einem Ultimate 3000-Chromatographen (Dionex, Sunnyvale, USA) bestimmt. Das HPLC-System war ausgestattet mit einer Kationenaustauschersäule (Aminex, HPX87H 300 × 7,8 mm, 9 μm, BioRad), einem automatischen Injektor (WPS-3000RS, Dionex), einem IR-Detektor (RID 10A, Shimadzu) und ein UV-Detektor (SPD-20A, Shimadzu). Das Probeninjektionsvolumen betrug 20 μL, und die Verbindungen wurden in einer Aminex HPX-87H-Säule getrennt, die durch eine Micro-Guard Cation H-Vorsäule (BioRad, USA) geschützt war. Die Trennung wurde bei 35ଌ mit 1,25 mM H . durchgeführt2SO4 bei 0.5 mL min 𢄡 als mobile Phase. Alle Proben wurden zentrifugiert (2 min bei 10.000 g) und spritzenfiltriert (0,2 μm) und der resultierende Überstand bis zur Analyse bei �ଌ aufbewahrt.

Genom-Scale-Modellierung und Flussbilanzanalyse

Die iJO1366 Genom-Skala E coli Modell (Orth et al., 2011) wurde angepasst, um die GA-Produktion über den Glycoptimus-Weg zu simulieren. Vor allem ein modifizierter fsaA Reaktion wurde dem Modell hinzugefügt, um die Umwandlung von Arabinose-5P in Glycerinaldehyd-3P und Glykolaldehyd zu ermöglichen. Sparsame Flussbilanzanalysen (pFBA) wurden unter Verwendung der OptFlux-Software (Rocha et al., 2010) unter Verwendung von entweder D-Glucose, L-Arabinose oder D-Xylose als Kohlenstoffquelle durchgeführt. Für jede Simulation wurde die Aufnahmerate der Kohlenstoffquelle willkürlich auf 10 mmol festgelegt. g CDW - 1 .h 𢄡 . Die nicht wachstumsbedingte Erhaltung wurde auf 3,15 mmol . eingestelltATP. g CDW - 1 .h 𢄡 , und Reaktionen, die am Elektronentransportsystem beteiligt sind, wurden darauf beschränkt, ein realistisches P/O-Verhältnis zu simulieren, wie zuvor beschrieben (Orth et al., 2011). pFBA-Simulationen wurden unter Verwendung des GA-Exports als Zielfunktion zur Maximierung durchgeführt.

Statistische Methoden

Statistische Analysen wurden in Microsoft Excel ® mit dem Analysis ToolPak-Paket durchgeführt. Ein zweischwänziger ungepaarter T-Test sollte verwendet werden, um Fluoreszenzinduktionsniveaus zu vergleichen, bei denen ein Alpha-Niveau von P < 0,05 wurde für Signifikanz gesetzt.


Informationen zum Autor

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Yuxin Chen, Yuanyuan Huang.

Mitgliedschaften

Institut für Evolutionsbiologie und Umweltwissenschaften, Universität Zürich, Zürich, Schweiz

Yuxin Chen, Yuanyuan Huang, Pascal A. Niklaus & Nadia Castro-Izaguirre

Key Laboratory of the Coastal and Wetland Ecosystems (Bildungsministerium), College of the Environment & Ecology, Xiamen University, Xiamen, China

School of Life Sciences/State Key Laboratory of Biocontrol, Sun Yat-sen University, Guangzhou, China

Department für Physiologische Diversität, Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung (UFZ), Leipzig, Deutschland

Deutsches Zentrum für integrative Biodiversitätsforschung (iDiv) Halle—Jena—Leipzig, Leipzig, Deutschland

Adam Thomas Clark & ​​Helge Bruelheide

Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Halle (Saale), Deutschland

State Key Laboratory of Vegetation and Environmental Change, Institut für Botanik, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Peking, China

Geographisches Institut, Universität Zürich, Zürich, Schweiz

Institut für Ökologie, College of Urban and Environmental Sciences, Peking University, Peking, China

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Beiträge

Y. C. und B. S. die Studie konzipiert. Y. C. und A.T.C. das Analyseverfahren entwickelt. Y. C. führte die Analysen mit Beiträgen von Y.H. und B. S. H.B., N.C.-I., Y.C., K.M., Y.H., P.A.N. und B. S. zur Datenerhebung beigetragen. Alle Autoren diskutierten die Analyseergebnisse und halfen beim Schreiben des Papiers.

Korrespondierender Autor


Diskussion

Zu verstehen, wie die nanoskalige Struktur biologischer Systeme mit der Funktion zusammenhängt, ist ein herausforderndes, fortlaufendes Streben. Eine Schwierigkeit besteht darin, dass nur wenige Sonden Strukturen dieser Größenordnung direkt abfragen können: Elektronen, Röntgenstrahlen und Neutronen. Elektronen haben in der Zellbiologie die breiteste Anwendung gefunden, und EM bleibt das leistungsstärkste Werkzeug zur Untersuchung der zellulären Ultrastruktur. In Bezug auf die B. subtilis Membran lieferte eine Kryo-EM-Studie von geschnittenen, durch Gefrieren ersetzten Zellen ein eindrucksvolles Bild der Zellarchitektur, einschließlich der Zellwand.[56] Die Struktur der Plasmamembran war jedoch nicht genau bestimmt, und ihre Dicke wurde auf 66 ± 8 geschätzt, ein überraschend großer Wert. Unsere Ergebnisse ergänzen dieses EM-Bild der Zellhülle durch eine hochauflösende Bestimmung der hydrophoben Dicke, die unter physiologischen Bedingungen erhalten wurde.

Röntgen- und Neutronenstreuung wurden häufig zur Untersuchung der Struktur von Modellmembranen verwendet, die aus definierten Lipidgemischen[3–5,28,29,46] oder natürlichen Lipidextrakten bestehen.[6–12] Röntgenstreuung wurde ebenfalls Kürzlich für die Ex-vivo-Untersuchung von Zellmembranen verwendet,[6] aber seine Anwendung auf intakte Zellen wird durch das Problem der Hintergrundstreuung durch Wasser und Biomoleküle erschwert. Neutronenstreuung bietet in einzigartiger Weise eine Lösung für das Hintergrundproblem in Form einer isotopischen Kontrastvariation. Wir haben hier gezeigt, dass die in-vivo-Kontrastvariation durch metabolische Markierung die Streuung aus dem komplexen zellulären Milieu effektiv unterdrücken kann, während spezifische interessierende Merkmale hervorgehoben werden, selbst wenn sie von Nebenkomponenten wie Lipiden (ca. 1% der zellulären Nassmasse) stammen. Darüber hinaus eignen sich die für Streuexperimente verwendeten kalten Neutronen aufgrund ihrer geringen kinetischen Energie (<0.025 eV) und ihres nichtionisierenden Charakters gut für Studien an lebenden Zellen – im Gegensatz zu hochenergetischen Röntgen- und Elektronenstrahlen (>5.000 eV).

Frühere Anwendungen der Neutronenstreuung in vivo beruhten nur auf dem externen Lösungsmittelkontrast, der in einigen Fällen ausreichte, um Bragg-Streuung von Wiederholungsstrukturen in Thylakoidmembranen[57,58] und Mitochondrien zu beobachten.[59] Diese Studien haben keine Membranstruktur an sich offenbart, aber Informationen über die Anordnung dicht gepackter Membranen geliefert. Durch die Erzeugung von internem Kontrast, d. h. durch die differenzielle Markierung spezifischer zellulärer Komponenten, haben wir erstmals hochauflösende ultrastrukturelle Messungen an einer einzigen Membran ermöglicht. In dieser Arbeit haben wir die Leistungsfähigkeit eines chemisch-biologiebasierten Ansatzes demonstriert, um selektiven internen Kontrast zu erzeugen und dadurch hochauflösende Messungen der in vivo-Membrandicke zu ermöglichen.

Unser In-vivo-Kontrastvariationsansatz bietet auch ein neues Werkzeug zur Untersuchung der lateralen Membranstruktur in lebenden Zellen. Neutronenbasierte Strukturmethoden bieten deutliche Vorteile, da sie die nanoskopische Lipidstruktur direkt wiedergeben, ohne dass Modelle oder extrinsische Sonden erforderlich sind. Hinweise auf eine ungleichmäßige Durchmischung[60,61] innerhalb der Plasmamembran tauchten zeitgleich mit dem 1972 vorgeschlagenen bahnbrechenden Fluid-Mosaik-Modell auf,[16] das Konzept der Membrandomänen etablierte sich Mitte der 1970er Jahre,[62] und das Lipid-Raft Hypothese wurde 1997 formalisiert.[21] Dennoch blieb die Existenz von Lipiddomänen umstritten,[63] und da angenommen wird, dass sie sowohl vorübergehend als auch kleiner als die Beugungsgrenze des Lichts (200 nm) sind, entzogen sie sich der Beobachtung durch konventionelle mikroskopische Techniken. Kürzlich wurde jedoch ultraauflösende Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um diffusionsbeschränkte Inseln im Bereich von 20 nm in der Plasmamembran von Nierenepithelzellen von Ratten zu identifizieren.[6] Unsere Beobachtung der Lipidsegregation in vergleichbarer Größenordnung in der Plasmamembran von B. subtilis stimmt mit der Existenz analoger Lipiddomänen in Bakterien überein und unterstützt die Vorstellung, dass nanoskopische Lipidaggregate ein integrales Merkmal biologischer Membranen sind.

Die kritische Barriere, die die Anwendung hochauflösender Neutronenstreutechniken in vivo verhindert hat, war das Fehlen eines Mittels, um einen internen Kontrast zu erzeugen. In dieser Arbeit haben wir die Barriere überwunden und gezeigt, dass B. subtilis ist ein ideales in vivo-Modellsystem für die Anwendung von Neutronenkontrastvariationsstrategien. Durch spezifische Wachstumsbedingungen und ausgewählte Genotypen konnten wir den zellulären Kontrast global abschwächen und den Kontrast präzise wieder in die Membran einbringen. Mit der Fähigkeit, sowohl die chemischen als auch die isotopischen Eigenschaften der Membranlipide zu kontrollieren, konnten wir sowohl die transversale als auch die laterale Membranstruktur untersuchen. Der gleiche allgemeine Ansatz zum selektiven Kontrast kann potenziell auf andere Biomoleküle und Modellorganismen für Anwendungen außerhalb der Membranarena ausgedehnt werden. Die in-vivo-Experimentalplattform kann unmittelbar dazu verwendet werden, die Reaktion der Plasmamembran auf eine Vielzahl von physikalischen, chemischen, genetischen und Umweltreizen zu untersuchen. Wir gehen davon aus, dass sich diese Fähigkeit daher in vielen Bereichen als wertvoll erweisen wird, beispielsweise bei der Entwicklung von Antibiotika, der Herstellung von Biokraftstoffen, der Funktion von Membranproteinen und dem Verständnis des Zusammenspiels zwischen Membran, Zytoskelett und Zellwand bei der Schaffung einer schützenden, anpassungsfähigen, multifunktionalen Schnittstelle.


LB Medien

LB ist das am häufigsten verwendete Medium zur Züchtung von rekombinanten Escherichia coli (E coli). LB media wurde von Giuseppe Bertani aufgrund seiner Forschungen zur Lysogenese als „Lysogenie-Brühe“ bezeichnet. LB wird häufig fälschlicherweise als Luria-Bertani-Medien, Luria Broth oder Lennox Broth bezeichnet. LB-Medien werden auch verwendet, um eine Vielzahl anderer fakultativer Organismen zu kultivieren.

Komponenten von LB Media

Ein Grund, warum LB häufig verwendet wird, ist die einfache Herstellung mit nur wenigen Zutaten, Trypton, Hefeextrakt und Natriumchlorid (NaCl). Trypton, eine Mischung von Peptiden, die durch die Verdauung von Casein mit dem Pankreasenzym Trypsin erzeugt wird, liefert Stickstoff und Kohlenstoff. Hefeextrakt liefert Vitamine (einschließlich B-Vitamine) und einige Spurenelemente. NaCl liefert Natriumionen für den Transport und das osmotische Gleichgewicht. E coli abgeleitet vom Stamm K-12, einem der am häufigsten verwendeten Elternstämme von E coli die heute in der Molekularbiologie verwendet werden, haben einen Mangel an B-Vitamin-Produktion.

Historischer Hintergrund von LB

LB ist ein nährstoffreiches Medium, das seit den 1950er Jahren zur Kultivierung von Enterobacteriaceae und für Bakteriophagen-Plaque-Assays verwendet wird. LB ermöglicht bei vielen Arten ein schnelles Wachstum mit guten Wachstumserträgen. 1951 entwickelte Giuseppe Bertani LB, um die Plaquebildung bei a . zu optimieren Shigella Indikatorstamm von Enterobacteriaceae. Heutzutage ist LB-Medium das gebräuchlichste Medium für das Wachstum rekombinanter Stämme von E coli. Es gibt drei gängige Formulierungen von LB: LB Miller, LB Lennox und LB Luria. Alle werden manchmal als LB bezeichnet, obwohl die LB Miller-Formulierung die übliche oder Standardformulierung von LB ist. Die alternativen Formulierungen von LB variieren in der NaCl-Konzentration (Tabelle 1).

Tabelle 1. Formulierungen von LB.

Zutaten % Lurie (g/l) Lennox (g/l) Müller (g/l)
Trypton 1.0% 10 10 10
Hefeextrakt 0.5% 5 5 5
Natriumchlorid (NaCl) 0,05, 0,5 oder 1,0% 0.5 5 10

Die Verwirrung um den Namen LB ist angesichts der Geschichte von Bertani, Luria und Lennox verständlich. Giuseppe Bertani war Mitglied des Luria-Labors an der Indiana University, als er LB-Medien formulierte. Ed Lennox war auch Mitglied des Luria-Labors und arbeitete mit Bertani an einigen der frühen Lysogenie-Experimente unter Verwendung von Shigella. Salvador Luria veröffentlichte 1955 eine Arbeit, in der er die ursprüngliche Formulierung von Bertani kopierte und LB aufgrund seiner wissenschaftlichen Statur manchmal fälschlicherweise Luria zugeschrieben wird und daher auch fälschlicherweise als Luria Broth bezeichnet werden kann. Die ursprüngliche Bertani-Formulierung bestand aus 1,0 % Bacto-Trypton (10,0 g/l), 0,5 % Hefeextrakt (5,0 g/l), 1,0 % NaCl (10,0 g/l), 0,1 % Glucose (1,0 g/l) pH auf 7,0 eingestellt mit 1 N NaOH. Glucose wurde nach dem Autoklavieren zugegeben. Im Laufe der Zeit ist die Zugabe von Glucose bei allen LB-Formulierungen weggefallen. Der Name Miller kommt von der Formulierung im Buch Experimente in der Molekularbiologie von Jeffery Miller, veröffentlicht 1972, das keine Glukose enthält. Die ursprüngliche und gebräuchlichste Formulierung von LB, Miller, enthält 1,0% NaCl. 1955 untersuchte Ed Lennox die Mechanismen der DNA-Synthese unter Verwendung von Stämmen von E coli empfindlich auf osmotischen Stress entwickelten eine Formulierung von LB, die die Hälfte des Salzes der ursprünglichen Formulierung enthielt, d. h. 0,5% NaCl. Diese Formulierung wird als LB Lennox bezeichnet. Heute wird LB Lennox für den Anbau von E coli bei Verwendung von salzempfindlichen Antibiotika wie Blasticidin, Puromycin und Zeocin. Eine dritte Formulierung von LB, die die geringste Salzmenge enthält, wird als LB Luria bezeichnet. Diese Formulierung enthält 0,05% NaCl. LB Luria wird verwendet, um Meeresorganismen zu isolieren, wie z Vibrio cholerae.

Wachstumsmechanismen bei LB

LB-Medien wurden ursprünglich für das Wachstum von Bakterien bei geringer Dichte entwickelt. Es wird geschätzt, dass das exponentielle Wachstum, eine Phase des stationären Wachstums, endet, wenn die OD600 (optische Dichte bei 600 nm) liegt zwischen 0,6 und 1,0. Es ist bekannt, dass das Wachstum von E coli bei LB hört normalerweise auf, wenn die OD600 erreicht unter normalen Wachstumsbedingungen etwa 2,0, entsprechend etwa 0,6 mg E coli (Trockengewicht) pro ml. Im Jahr 2007 führten D’Ari und Kollegen eine umfassende Studie zu den Wachstumsmerkmalen bei LB durch, wobei sie sich insbesondere der Physiologie von E coli K-12, einer der heute am häufigsten verwendeten Stämme in der Molekularbiologie. Sie zeigten, dass im LB Miller gewachsene K-12-Zellen mit einer endgültigen OD600 von 0,6 – 1,0 befinden sich nicht immer im gleichen physiologischen Zustand. D’Ari und Mitarbeiter bestätigten frühere Beobachtungen des diauxischen Wachstums (Wachstum in zwei Phasen) bei LB und stellten fest, dass das exponentielle Wachstum bei . stoppte

OD600 0,3, viel früher als allgemein angenommen. Es ist bekannt, dass E coli ist bekannt, dass sie ein schlechtes Wachstum aufweisen, wenn der pH-Wert 9,0 überschreitet, und es ist nicht ungewöhnlich, dass sich LB-Medien auf einen pH-Wert nahe 9,0 ändern. Wenn D’Ari und Mitarbeiter jedoch den pH-Wert von LB anpassten, hatte dies keinen Einfluss auf die Wachstumskurve, während bei Zugabe von Glukose zum Medium die Kulturen auf OD . wachsen konnten600 6.49. Dies deutet darauf hin, dass das Wachstum von E coli in LB ist kohlenstoffbegrenzt. Wie bereits erwähnt, enthielt die ursprüngliche Formulierung von LB von Bertani 0,1% Glucose. Diese Forschung zeigt, dass LB zwar ein gutes Medium für routinemäßiges Wachstum ist, es jedoch nicht für physiologische Studien verwendet werden sollte, bei denen Reproduzierbarkeit und ein längerer Zeitraum exponentiellen Wachstums erforderlich sind.

LB und Auswahl

Es gibt eine Reihe von Zusatzstoffen, die dem LB-Medium zur Identifizierung oder Selektion einer Population von Organismen zugesetzt werden können. Antibiotika werden häufig dem LB-Medium zugesetzt, um auf Zellen zu selektieren, die so konstruiert wurden, dass sie gegen ein oder mehrere Antibiotika resistent sind. X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) oder Bluo-Gal (halogeniertes Indolyl-β-galactosid) können dem LB-Medium für ein blau-weißes Screening zur Insertion der Sequenz in hinzugefügt werden eine multiple Klonierungsstelle (MCS) in einem Plasmid, das das α-Fragment des β-Galactosidase-Gens enthält. Um die Expression von Genen zu induzieren, die durch den lac-Promotor kontrolliert werden, wird dem Medium das nicht metabolisierbare Lactose-Analogon IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid) zugesetzt. In Bakterien, in denen keine Sequenz in das Plasmid eingefügt ist, sind MCS-Kolonien blau, da die X-Gal oder Bluo-Gal durch β-Galactosidase gespalten wird, um 5-Brom-4-chlor-indoxyl zu bilden. Bei Plasmiden mit Insertion gibt es keine funktionelle β-Galactosidase und die Kolonien bleiben weiß.


Die Störung des Mutualismus durch eine invasive Ameise reduziert die Kohlenstofffixierung für eine grundlegende ostafrikanische Ameisenpflanze

Invasive Ameisen formen Ansammlungen und Interaktionen einheimischer Arten, aber ihr Einfluss auf grundlegende ökologische Prozesse ist kaum verstanden. In Ostafrika, Pheidole megacephala Ameisen sind in monodominante Bestände des Ameisenbaums eingedrungen Akazie Drepanolobium, heimische Ameisenverteidiger ausrotten und Bäume anfällig für Schäden an der Baumkrone durch Pflanzenfresser von Wirbeltieren machen. Wir haben Experimente und Beobachtungen verwendet, um die direkten und interaktiven Auswirkungen von invasiven Ameisen und großen Pflanzenfressern auf zu quantifizieren A. drepanolobium Photosynthese über einen Zeitraum von 2 Jahren. Bäume, die 5 Jahre lang befallen waren, zeigten während der wichtigsten Wachstumsperioden eine um 69 % niedrigere Ganzbaum-Photosynthese, was auf die Interaktion zwischen invasiven Ameisen und Pflanzenfressern von Wirbeltieren zurückzuführen ist, die zu einem Rückgang der Photosynthese auf Blatt- und Kronendachebene führten. Wir untersuchten auch Bäume kurz vor und nach der Invasion und stellten fest, dass die jüngste Invasion nur geringfügige Veränderungen in der Blattphysiologie verursachte. Unsere Ergebnisse von einzelnen Bäumen werden wahrscheinlich skalieren und zeigen das Potenzial invasiver Arten, die Kohlenstofffixierung auf Ökosystemebene und andere biogeochemische Kreisläufe zu verändern.


Diese Autoren haben zu gleichen Teilen beigetragen: Fernanda Pinheiro, Omar Warsi.

Mitgliedschaften

Institut für Biologische Physik, Universität zu Köln, Köln, Deutschland

Fernanda Pinheiro & Michael Lässig

Institut für Medizinische Biochemie und Mikrobiologie, Universität Uppsala, Uppsala, Schweden

Omar Warsi & Dan I. Andersson

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Beiträge

Alle Autoren waren an der Untersuchung, dem Schreiben des Originalentwurfs, der Überprüfung und der Bearbeitung des endgültigen Manuskripts beteiligt.

Korrespondierende Autoren


Danksagung

Wir danken J. R. Luque-Ortega für die Hilfe bei den Experimenten zur Sauerstoffaufnahme. Wir danken M. Abrahams, M. Mo und S. Burning für die kritische Durchsicht des Manuskripts. JN dankt T. Conrad für Ihre Hilfe während des Aufenthalts in San Diego und E. Díaz und M.A. Prieto für ihre wertvolle Hilfe und Anregungen bei der Stoffwechselrekonstruktion. JN ist die Empfängerin eines I3P Predoctoral Fellowship vom Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) und der Aufenthalt von JN in San Diego wurde durch ein kurzfristiges I3P-Stipendium unterstützt.


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