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Verfügen wir über genügend Antikörpervielfalt, um fast jedes Antigen zu überwinden?

Verfügen wir über genügend Antikörpervielfalt, um fast jedes Antigen zu überwinden?


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Ich frage mich immer, wie vielfältig unsere Antikörper sind. Haben wir genug Antikörper, um auf jede Art von Molekül zu passen? Ist es nicht einfacher, wenn unsere Antikörper wie Ton sind und durch Antigene in jede beliebige Form gebracht werden können? Warum Energie verschwenden, um so viele Arten von Antikörpern zu produzieren?

Wenn ein Krankheitserreger seine Antigene wie Antikörper unseres Körpers herstellt, werden sie (glaube ich) nie entdeckt. Was also würde unser Körper tun?


Da meine Antwort ziemlich umfangreich ist, habe ich die verschiedenen Regionen hervorgehoben, in denen ich Ihre Frage beantworte.

Einführung und grundlegende Informationen

Ich nehme an, Sie wissen, wie Antikörper hergestellt werden, aber als kurze Zusammenfassung werden sie durch VDJ-Rekombination eines begrenzten, aber immer noch recht zahlreichen Pools von Genen hergestellt, die zufällig rekombiniert werden, und dann erfolgt eine weitere Rekombination durch Hypermutation bestimmter Segmente, insbesondere in den Regionen, die Antigene identifizieren.

Was ist Hypermutation?

Hypermutation tritt auf, nachdem der ursprüngliche Antikörper hergestellt wurde, um ihn zu perfektionieren. Der gleiche Mechanismus, über den ich unten beim Formen von Antigenen spreche. Es ist genau das, was es sagt: eine hohe Mutationsrate im Vergleich zu der niedrigen Rate in Zellen normalerweise. Wenn B-Zellen aktiviert werden, weil sie ihr Antigen getroffen haben, auf das sie reagieren (verwandtes Antigen), durchlaufen sie eine somatische Hypermutation. Während die B-Zellen eine somatische Hypermutation durchlaufen, werden die Gene, die für den Antikörper kodieren, mutiert, sodass der Antikörper mit einer anderen Spezifität an sein verwandtes Antigen bindet. Wenn es besser bindet, wird die B-Zelle lebendig, wenn es nicht bindet oder es schlimmer ist, stirbt die B-Zelle.

Antigene formen

Was wir nicht tun können, ist umgekehrt. Wir können ein Antigen nicht erkennen und dann einen Antikörper dagegen herstellen, weil zum Erkennen des Antigens ein Antikörper erforderlich ist. Was wir tun können, ist, sobald wir das Antigen erkannt haben, den Antikörper so zu formen, dass er besser passt. Wir tun dies, indem B-Zellen ihre Antikörper mutieren und konkurrieren, welche besser binden. Allerdings haben B-Zellen einfach nicht das Wissen, um ein Antigen zu sehen und denken, dass ein Tyrosinrest an dieser Position perfekt ist, um meine Form in diese Konfiguration zu ändern - das ist wirklich kompliziert!

Erkennen Antikörper jedes Molekül?

Antikörper werden im Wesentlichen gegen jedes Antigen hergestellt, was, wie Sie erwähnt haben, sehr energieaufwändig ist. Tatsächlich wird angenommen, dass die Anzahl der Gene, die Antikörper bilden, die perfekte Menge ist, um uns zu schützen, ohne zu zahlreich zu sein, so dass es nicht nur zu teuer ist, sondern wir haben auch so viele verschiedene Antikörper, dass wir die Chance haben, jemals die richtige B-Zelle zu finden ist so niedrig, dass wir sterben, bevor wir es schaffen. Dies liegt an der Massenproduktion von Antikörpern. Im typischen Weg neuer Antigene muss zuerst eine T-Zelle das Antigen erkennen, dann B-Zellen, die einen Antikörper produzieren, der an das Antigen bindet (selten in der gleichen Region und möglicherweise nicht einmal ein Proteinantigen sein).

Diese beiden Absätze heben also die Einschränkungen hervor und beantworten Ihre erste Frage. Antikörper sind so vielfältig, dass wir davon ausgehen können, dass viele jeden Erreger erkennen, aber nicht jedes einzelne mögliche Antigen wird einen verwandten Antikörper haben. Vielfalt ohne so viel Vielfalt, dass sie überflüssig wird. Die zweite Einschränkung besteht darin, dass sich idealerweise keine Antikörper bilden, wenn sie sich selbst (unsere eigenen Proteine ​​usw.) erkennen, was zu Ihrer nächsten Frage führt.

Was ist, wenn ein Krankheitserreger Antigene herstellt, die wie unsere eigenen Proteine ​​aussehen?

Autoantikörper werden hergestellt, sind aber in der Regel nicht pathogen (d. h. sie verursachen keinen Schaden). Bestimmte HLA/MHC-Polymorphismen, die dazu führen, dass wir wahrscheinlich autoreaktive T-Zellen bilden, lassen uns auch autoreaktive Antikörper herstellen. Interessanterweise erhöht dies unser Risiko für Autoimmundiabetes, macht uns aber AUCH resistenter gegen eine HIV-Infektion. Dies ist praktisch am DQ8-Polymorphismus zu sehen. Dies ist ein perfektes Beispiel, um die Antwort auf Ihre zweite Frage zu veranschaulichen. Im Idealfall würden Krankheitserreger, die ähnliche Antigene wie wir besitzen, nicht nachgewiesen werden. HIV umhüllt sich zu diesem Zweck mit einer Hülle unserer eigenen Lipidmembran, und die besten neutralisierenden Antikörper sind oft selbstreaktiv und sind daher diejenigen, die nicht ausgeschieden werden konnten.

Aber selbst diese Krankheitserreger werden etwas tun oder etwas herstellen, was unsere Zellen normalerweise nicht tun. Auf diese Weise findet der Körper Krebszellen und zielt darauf ab (in gewisser Weise), sie tun Dinge, die unsere eigenen Zellen normalerweise nicht tun, wie zum Beispiel die falschen Proteine ​​​​oder falsche Mengen usw etwas, das nicht selbst ist (zytotoxische CD8/Killer-T-Zellen). Was Krankheitserreger betrifft, so stellen wir alle MHC/HLA her, was für uns einzigartig ist, und Krankheitserreger könnten es nie schaffen, einzudringen und das spezifische HLA/MHC zu produzieren, das wir tun, sodass unser Körper auch auf fehlende HLA/MHC abzielt.


Die Struktur eines Proteins hängt weitgehend davon ab, was es tun soll. Es gibt ein wenig Spielraum, aber im Wesentlichen verändern große Strukturänderungen auch die Funktion des Proteins.

Aus diesem Grund wäre es für ein Pathogen schwierig (wenn auch nicht völlig unmöglich), alle seine Oberflächenantigene erfolgreich in eine so enge Nachahmung der Wirtsantigene umzuwandeln, dass die Immunantwort des Wirts vollständig umgangen wird. Antikörper-CDRs sind extrem empfindlich, und eine Veränderung auch nur einer einzigen Aminosäure des Epitops reicht oft aus, um eine ausgewachsene Immunantwort auszulösen.

Zudem sind Antikörper nur einer von vielen Mechanismen (wenn auch ein sehr wichtiger), mit denen das Immunsystem eingedrungene Krankheitserreger erkennt und eliminiert, also auch bei Versagen des Antikörpersystems, der T-Zellen und des angeborenen Immunsystems sollen in der Regel ausreichend, um eine Immunantwort auszulösen.


Verfügen wir über genügend Antikörpervielfalt, um fast jedes Antigen zu überwinden? - Biologie

Eine Methode, die Wirkungsspezifität einzelner Antikörper im Labor auszunutzen, wurde kürzlich von Cesar Milstein und Mitarbeitern entdeckt, die es ermöglichten, auf Bestellung reine Antikörper gegen fast jede Substanz herzustellen.
Sie mussten jedoch das Problem überwinden, dass Lymphozyten nur in einem lebenden Körper überleben - sie können nicht wie andere Zellen im Labor gezüchtet werden.


Immunsystem

Eine Infektion kann als Kampf zwischen den eingedrungenen Krankheitserregern und dem Wirt angesehen werden. Unser Körper ist darauf vorbereitet, eindringende Mikroben abzuwehren, die Krankheiten verursachen können. Diese werden unsere natürlichen Abwehrkräfte genannt.

Erste Verteidigungslinie

Die erste Verteidigungslinie ist unspezifisch und zielt darauf ab, Mikroben daran zu hindern, in den Körper einzudringen. Haut und Schleimhäute wirken als physikalische Barriere, die das Eindringen von Mikroben verhindert.

Wenn die Haut geschnitten wird, bildet das Blut ein Gerinnsel, das die Wunde verschließt und das Eindringen von Mikroben verhindert.

&Kopie CNRI / Wissenschafts-Fotobibliothek Ein Blutgerinnsel

Die Oberflächen des Körpers und die Haut, das Verdauungssystem und die Nasenschleimhaut sind von einer Gemeinschaft von Mikroben bedeckt, die als normale Körperflora bezeichnet wird. Sie schützen den Wirt vor einer Infektion mit schädlicheren Mikroorganismen, indem sie als physikalische Barriere wirken. Die normale Körperflora besiedelt diese Auskleidungen, wodurch die für Krankheitserreger verfügbare Fläche zum Anheften und Ansiedeln reduziert wird. Es bedeutet auch, dass die schädlichen Mikroben mit der normalen Körperflora um Nährstoffe konkurrieren müssen. Der durchschnittliche menschliche Darm enthält etwa ein Kilo dieser guten Bakterien, was einer Tüte Zucker entspricht.

Das Atmungssystem und die Nase und die zur Lunge führenden Durchgänge sind mit Zellen ausgekleidet, die eine klebrige Flüssigkeit namens Schleim produzieren, die eindringende Mikroben und Staub einfängt. Winzige Härchen, sogenannte Flimmerhärchen, bewegen sich in einer wellenartigen Bewegung und wehen die Mikroben und Staubpartikel bis zum Rachen, wo sie entweder ausgehustet oder geniest oder geschluckt und dann mit dem Kot aus dem Körper ausgeschieden werden.

Der Körper produziert mehrere antimikrobielle Substanzen, die das Wachstum von Mikroben abtöten oder stoppen. Zum Beispiel bauen die Enzyme in Tränen und Speichel Bakterien ab. Der Magen produziert Säure, die viele der Mikroben zerstört, die mit Nahrung und Getränken in den Körper gelangen. Urin, der durch das Harnsystem fließt, spült Mikroben aus der Blase und der Harnröhre.

Zweite Verteidigungslinie

Wenn es Mikroben gelingt, in den Körper einzudringen, wird die zweite Verteidigungslinie aktiviert. Dies ist auch unspezifisch, da es jede Art von Mikrobe stoppt. Phagozyten sind eine Art von weißen Blutkörperchen, die sich durch amöboide Wirkung bewegen. Sie senden Pseudopodien aus, die es ihnen ermöglichen, eindringende Mikroben zu umgeben und zu verschlingen. Phagozyten setzen Verdauungsenzyme frei, die die eingeschlossenen Mikroben abbauen, bevor sie Schaden anrichten können. Dieser Vorgang wird Phagozytose genannt.

&Dr_Microbe / iStock kopieren Makrophagen verschlingen Tuberkulosebakterien Mycobacterium tuberculosis. Dieser Vorgang wird Phagozytose genannt.

Dritte Verteidigungslinie

Die dritte und letzte Verteidigungslinie ist die Immunantwort. Die eindringende Mikrobe oder das Pathogen wird als Antigen bezeichnet. Es wird vom Immunsystem als Bedrohung angesehen und ist in der Lage, eine Immunantwort zu stimulieren.

Antigene sind Proteine, die sich auf der Oberfläche des Erregers befinden. Antigene sind für dieses Pathogen einzigartig. Das Keuchhusten-Bakterium zum Beispiel hat auf seiner Oberfläche andere Antigene als das TB-Bakterium.

Wenn ein Antigen in den Körper gelangt, produziert das Immunsystem Antikörper dagegen. Antikörper sind immer Y-förmig. Es ist wie eine Schlacht mit der Armee (Antikörper), die den Eindringling (Antigen) abwehrt. Eine Art von weißen Blutkörperchen, die Lymphozyten genannt werden, erkennt das Antigen als fremd und produziert Antikörper, die spezifisch für dieses Antigen sind. Jeder Antikörper hat eine einzigartige Form der Bindungsstelle, die sich an die spezifische Form des Antigens bindet. Die Antikörper zerstören das Antigen (Erreger), das dann von Makrophagen verschlungen und verdaut wird.

Weiße Blutkörperchen können auch als Antitoxine bezeichnete Chemikalien produzieren, die die Toxine (Gifte) zerstören, die manche Bakterien produzieren, wenn sie in den Körper eingedrungen sind. Tetanus, Diphtherie und Scharlach sind alles Krankheiten, bei denen die Bakterien Giftstoffe absondern.

Sobald die eindringenden Mikroben zerstört wurden, wird die Immunantwort abgeschwächt.

Wenn eine Person einmal eine Krankheit hatte, fängt sie sie normalerweise wieder an, weil der Körper Gedächtniszellen produziert, die spezifisch für dieses Antigen sind. Die Gedächtniszellen erinnern sich an die Mikrobe, die die Krankheit verursacht hat, und stellen schnell den richtigen Antikörper her, wenn der Körper erneut einer Infektion ausgesetzt ist. Der Erreger wird schnell zerstört und es können keine Krankheitssymptome auftreten.

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Vorlesung 23: Immunologie 2

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Behandelten Themen: Immunologie 2

Ausbilder: Prof. Robert A. Weinberg

Vorlesung 10: Molekulare Biolo.

Vorlesung 11: Molekulare Biolo.

Vorlesung 12: Molekulare Biolo.

Vorlesung 13: Genregulation

Vorlesung 14: Protein Localiz.

Vorlesung 15: Rekombinante DNA 1

Vorlesung 16: Rekombinante DNA 2

Vorlesung 17: Rekombinante DNA 3

Vorlesung 18: Rekombinante DNA 4

Vorlesung 19: Zellzyklus/Zeichen.

Vorlesung 26: Nervensystem 1

Vorlesung 27: Nervensystem 2

Vorlesung 28: Nervensystem 3

Vorlesung 29: Stammzellen/Klon.

Vorlesung 30: Stammzellen/Klon.

Vorlesung 31: Molekularer Mediziner.

Vorlesung 32: Molekulare Evolution.

Vorlesung 33: Molekularer Mediziner.

Vorlesung 34: Polymorph des Menschen.

Vorlesung 35: Menschliche Polymorphie.

Erinnern Sie sich bitte daran, dass wir beim letzten Mal darüber gesprochen haben, dass das Immunsystem eine große Vielfalt von Antikörpermolekülen herstellt. Ein Synonym für ein Antikörpermolekül ist übrigens ein Immunglobulin.

Denken Sie daran, dass wir dieses Wort sehr kurz verwendet haben. Ein anderes Wort, das wir übrigens benutzen, war das Wort Antigen. Und ein Antigen ist ein funktioneller Begriff.

Das war ziemlich lustig. Ein Antigen ist ein funktioneller Begriff.

Ein Antigen ist ein Mittel, das eine Immunantwort hervorruft.

Und der Begriff Antigen bezieht sich nicht wirklich auf eine spezifische chemische Struktur. Es muss nicht einmal ein Protein sein. Antigen bezieht sich einfach auf eine chemische Einheit, die eine Reaktion des Immunsystems hervorruft. Wir verwenden das Wort auch nebenbei, Epitop. Und ein Epitop bezieht sich auf eine kleine Region, beispielsweise ein Protein, gegen das ein Antikörper eine Reaktivität entwickelt hat. Und wenn Sie sich an unsere Diskussion vom letzten Mal erinnern, hat ein Protein offensichtlich von einer gewissen Größe mehrere verschiedene Epitope, von denen jedes von einem bestimmten Antikörpermolekül erkannt werden kann. Und für uns, könnten wir, es tut mir leid, wenn ich diese ganze politische Diskussion in Gang gebracht habe, danke. Dankeschön. Ein Epitop ist aus der Sicht eines Proteins ein Oligopeptid.

Ein Abschnitt von Aminosäuren von vielleicht zehn, 12 oder 15 Aminosäuren bildet also ein Epitop. Und daher können Sie sich vorstellen, dass es auf der Oberfläche eines Proteins mehrere Epitope gibt.

Tatsächlich können Antikörper manchmal die inneren Teile des Proteins erkennen, da Protein manchmal denaturiert oder abgebaut werden kann. Tatsächlich werden Proteine, wie wir in Kürze diskutieren werden, auch in Oligopeptide gespalten.

Diese Oligopeptide können von jedem Teil des Proteins stammen, um das Offensichtliche zu sagen, und daher können interne Epitope vorhanden sein, die in einem Protein existieren, die normalerweise nicht durch das native Protein exponiert werden. Denken Sie daran, dass wir uns mit der Frage beschäftigten, wie das Immunsystem in der Lage ist, eine große Vielfalt von Antikörpern zu bilden, wobei Immunglobuline eine konstante Domäne gemeinsam haben.

Und die konstante Domäne wird von diesen invarianten Regionen der leichten und schweren Ketten gebildet. Wir nennen dies das Heterotetramer im Gegensatz zur variablen Domäne hier oben, die das Antigen erkennt, das ursprünglich die Produktion dieses Antikörpermoleküls ausgelöst hat.

Und das Immunsystem kann zu jedem Zeitpunkt Hunderttausende, vielleicht sogar Millionen oder Zehnmillionen verschiedener Antikörperarten herstellen, die sich durch die Antigenerkennungsstelle hier an diesem Teil des Antikörpermoleküls voneinander unterscheiden.

Und erinnern Sie sich auch daran, dass, da es sich um Proteine ​​handelt, die Antigen-erkennende Tasche selbst ein Oligopeptid ist, das sich auf irgendeine komplementäre Weise mit dem Antigen kombiniert, das ursprünglich die Synthese dieses Antikörpermoleküls provozierte.

Am Ende des letzten Mals diskutierten wir die Tatsache, dass Antikörper von B-Zellen gebildet werden, und die Tatsache, dass man bei der Erkrankung des multiplen Myeloms an einer monoklonalen Krankheit, d. h. einer sehr heterogenen Population von B-Zellen beginnen sich unkontrolliert zu vermehren.

Und jetzt bilden alle seine Nachkommen eine einzige Antikörperspezies.

Und diese einzelne Antikörperspezies besteht wiederum aus einer schweren und einer leichten Kette, deren Identität durch die Antigen-erkennende Tasche entsteht, die sie zufällig trägt. Und dies deutet auf eine Vorstellung von klonaler Expansion hin. Damit meine ich folgendes.

Stellen wir uns ein Szenario vor, in dem wir mit einem naiven Immunsystem beginnen und eine ganze Reihe verschiedener B-Zellen haben.

Und diese Serie geht hier von 1-15, aber tatsächlich könnte dies von eins bis zu einer Million gehen. Und jede dieser Antikörper-produzierenden B-Zellen oder jede dieser B-Zellen hat im Prinzip die Fähigkeit, auf ein anderes Antigen zu reagieren.

Stellen wir uns das einfach vor. Und jetzt können wir uns vorstellen, dass ein Antigen wie zum Beispiel das Poliovirus in den Körper gelangt und es von zwei verschiedenen Klonen dieser B-Zellen erkannt wird. Und wir können uns vorstellen, dass diese Erkennung als mytogenes Signal fungiert, ein wachstumsstimulierendes Signal für diese beiden speziellen Klone und B-Zellen. Es wirkt fast wie ein Wachstumsfaktor.

Aber natürlich reden wir hier nicht von Wachstumsfaktoren.

Wir sprechen von Antigenen, einschließlich Antigenen, die von einem fremden Infektionserreger in das Gewebe eingebracht werden. Daher kann die Erkennung des Antigens durch diese beiden B-Zellen danach ihre klonale Expansion hervorrufen. Damit möchte ich sagen, dass sie sich vorzugsweise zu vermehren beginnen, während alle anderen B-Zellen, die in keiner Weise auf dieses Antigen ansprechen, einfach wie Beulen auf einem Baumstamm sitzen bleiben. Und wenn es daher zu einer klonalen Expansion kommt, gibt es jetzt eine viel größere Anzahl von Zellen im Immunsystem, die in der Lage sind, den Antikörper zu produzieren, der sein provozierendes Antigen erkennt.

Denken Sie noch einmal daran, dass diese Zahl bis zu einer Million betragen kann.

Das ist nur eine große Vereinfachung. Hier verwenden wir das Wort Plasmazellen. Und in der Tat, wenn man die Nomenklatur sehr genau haben will, sind die Plasmazellen die Produkte von B-Zellen, die zu den Antikörper produzierenden Plasmazellen heranreifen.

Sie sind sehr nah an der gleichen Zelllinie, und das bedeutet für uns am Ende, dass nach einer aktiven Immunantwort die bevorzugte Expansion bestimmter Subpopulationen von B- und Plasmazellen und anderen von diejenigen, die diese Antigene nicht erkennen, sind in der gesamten Zellpopulation unterrepräsentiert.

Die grundlegende Frage, die wir uns beim letzten Mal gestellt haben, war jedoch die folgende. Wenn dies der Fall ist und jede dieser B-Zellen einen Antikörper mit einer bestimmten Reaktivität herstellt, einer bestimmten Fähigkeit, auf das eine oder andere Antigen zu reagieren, wie stellen sie so viele verschiedene Arten von Antikörpermolekülen her. Woher wissen sie, wie das geht. Wir argumentierten, dass es unplausibel ist, dass die Aminosäuresequenzen jedes Antikörpermoleküls in der Keimbahn kodiert sind. Wieso den? Nun, wenn es tatsächlich eine Million oder sogar 100 Millionen verschiedene Antikörper gibt, die vom Immunsystem hergestellt werden können, kann es natürlich nicht 100 Millionen Gene geben, von denen jedes für die Produktion eines bestimmten Antikörpermoleküls bestimmt ist. Und die Lösung dieses Rätsels hat Susumu Tonegawa bereits vor mehr als 20 Jahren ausgearbeitet, der zufällig in unserer Biologie-Abteilung ist. Und was er herausfand, war, dass die Art und Weise, wie die Antikörper produzierenden Gene organisiert sind, wirklich außergewöhnlich und ungewöhnlich ist. Hier ist die schwere Kette des Gens, und denken Sie daran, dass es ein schweres und ein leichtes Kettengen gibt.

Die Gene der schweren und leichten Kette befinden sich in unterschiedlichen Chromosomen.

Und daher befinden sich die Gene, die für die Kodierung dieser beiden Proteine, der schweren und der leichten Kette, verantwortlich sind, auf unterschiedlichen Chromosomen und kodieren von unterschiedlichen Genen.OK, was Tonegawa entdeckte, war folgendes, dass die variable Region eines Antikörpermoleküls, die sich an seinem Endterminus befindet, von kleinen DNA-Segmenten kodiert wird, die in einem sehr großen genetischen Locus, einem Immunglobulin-Locus, getragen werden. Und was beim Menschen passiert, ist Folgendes. Es gibt beim Menschen eher als bei Mäusen, diese Zahl sollte beim Menschen 100 sein, es gibt 100 verschiedene V-Segmente, die in diesem Antikörper-Locus kodiert sind. Jeder hat ungefähr die gleiche Größe, und sie befinden sich in einem großen Tandem-Array.

Ebenso gibt es beim Menschen 30 dieser Desegmente.

Die Zahlen ändern sich hier, wenn man von Maus zu Mensch wechselt, aber das ist irrelevant. Und es gibt sechs der J-Segmente. Und ein Großteil der Antigen-Erkennungskapazität, ein Großteil der variablen Region wird in der grünen und der blauen Region des Gens kodiert, und die Kodierung geschieht wie folgt.

Es gibt eine kombinatorische Art der zufälligen Fusion von V-, D- und J-Segmenten. Es gibt spezifische, hochspezialisierte Enzyme, die ein spezifisches V-Segment, ein spezifisches D-Segment und ein spezifisches J-Segment, angeblich auf stochastischer Basis, völlig zufällig auswählen und miteinander verschmelzen. Und wenn das passiert und die dazwischenliegenden DNA-Sequenzen verworfen werden, dann können wir sofort sehen, dass durch die daraus resultierende kombinatorische Mathematik die Möglichkeit besteht, 100 mal 30 zu haben, das ist 3, 00, mal sechs, das ist bereits 180.00 verschiedene Kombinationen, die den Leserahmen dieses speziellen Antikörpermoleküls kodieren. Hier habe ich gerade V23 gesagt, schätze ich, D7, J2. Aber stellen wir uns wieder vor, was ungefähr der Fall ist, dass jede dieser Kombinationen mit ungefähr gleicher Wahrscheinlichkeit fusioniert werden kann.

Was anschließend passiert, ist, dass diese Sequenz der variablen Region, die durch Fusion gebildet wurde, dann das Transkript ist, das von dem stammt, das an die konstante Region, die zum C-Terminus hin liegt, gespleißt wird. Wenn wir hier also über die V-, D- und J-Segmente sprechen, sprechen wir über die Segmente, die diesen Teil kodieren. Hier ist dieser Teil des Antikörpermoleküls.

Denken Sie daran, dass wir von hier an über konstante Regionssegmente sprechen, die von diesen kombinatorischen Fusionen nicht betroffen sind.

Und im Overhead, den ich Ihnen gerade gezeigt habe, habe ich gerade darüber gesprochen, wie das Gen für die schwere Kette neu angeordnet ist. Und was sich daraus ergibt, ist folgendes. Dies ist nur eine weitere Version von dem, was ich Ihnen gerade gezeigt habe, bei der die V-, D- und J-Segmente zufällig miteinander verschmolzen werden, wodurch ein V-, D-, J-Fusionsding entsteht, das dann durch Spleißen mit der konstanten Region verschmolzen wird, die hier heißt C sub-mu.

Aus Gründen, warum es Sub-mu heißt, werde ich es gleich erwähnen.

Und das ist die eigentliche Boten-RNA, die dann ins Zytoplasma gelangt. Und was wir uns jetzt vorstellen können, ist folgendes: Wenn das Immunsystem zum ersten Mal beginnt, verschmilzt es zufällig ganze Reihen von V-, D- und J-Segmenten und alle möglichen Kombinationen. Das gleiche passiert sowohl in der schweren Kette als auch in der leichten Kette, obwohl die leichte Kette etwas einfacher ist. Aber das ist für uns konzeptionell irrelevant. Und dann haben wir am Ende Hunderte von Millionen unterschiedlicher V-Zellen, von denen jede eine andere Kombination von schweren und leichten Ketten aufweist, denn bedenken Sie, dass die Gene der leichten Kette auch kombinatorisch neu angeordnet werden.

Sie werden auch verschmolzen. Und deshalb können wir 180, 00 verschiedene schwere Ketten haben, und ich vergesse die genaue Zahl für die Anzahl der leichten Ketten. Es ist etwas weniger, aber wir können diese beiden Kombinationen miteinander multiplizieren, denn bedenken Sie, dass das Gen, das die schwere Kette hier in seiner variablen Region codiert, und das Gen, das die leichte Kette in seiner variablen Region codiert, auf separaten Chromosomen organisiert sind. Und sie sind miteinander verschmolzen. Diese Segmente sind zufällig miteinander verschmolzen. Die Gesamtzahl der Antikörpermoleküle, die wir herstellen können, beträgt also 180. 00 verschiedene Arten davon.

Und ich habe nur einen Fehler gemacht, als ich die Gesamtzahl davon kenne, die gemacht werden kann, obwohl wir es in Kürze herausfinden könnten, wenn es wirklich wichtig wäre. Aber auch hier geht die Zahl in die Tausende.

Und daher ist die Gesamtzahl der verschiedenen Antikörpermoleküle, die man auf dieser Grundlage herstellen kann, insgesamt dies.

Habe ich richtig gerechnet, 60 mal 30, 18.000. Es ist 18.00 Uhr. Es gibt also 18.000 verschiedene davon, die hergestellt werden können, und die Anzahl davon liegt meiner Meinung nach eher bei 10.000.

Ich vergesse, aber multipliziert, nennen wir es kurz 10.000.

Das ist nicht die richtige Zahl. Davon gibt es 10.000 verschiedene, und 18.00 davon können hergestellt werden.

Multiplizieren Sie sie miteinander, und Sie erhalten die Gesamtzahl der Kombinationen von Antikörpermolekülen, die es herstellen könnte, da die Antigen-Erkennungsstelle hier kooperativ, kollaborativ von der schweren und der leichten Kette geschaffen wird. Sie hatten eine Frage?

Das Gen wird also umgeordnet, und wenn die Umlagerung auftritt, wird ein V-Segment mit einem D-Segment fusioniert, wird mit einem J-Segment fusioniert.

Und alle fremden Segmente, die sich dazwischen befinden, wurden aus dem Chromosom entfernt. Dies führt mich zu einem zweiten Punkt, den ich ansprechen wollte, und zwar darin, dass wir es hier mit einem Prozess der somatischen Mutation zu tun haben.

Wir haben beim letzten Mal oder vorletzten Mal darüber gesprochen, dass somatische Mutation im Allgemeinen ein Prozess ist, der zu Krebs führen kann, d. h. die Mutation von Keimbahngenen, die auf die eine oder andere Weise durch zufällige Mutationsprozesse korrumpiert sind. Aber hier spreche ich von einem somatischen Mutationsprozess, der stark gelenkt und organisiert ist und sich darauf konzentriert, eine Reihe neu angeordneter Gene zu erzeugen, die dann als Vorlage für die Produktion eines Antikörpermoleküls dienen können. Schauen wir uns das hier also noch einmal an. Hier sage ich Ihnen, es gibt viele V-Gene. Es gibt viele D-Gene und viele J-Gene. Und das ist die embryonale DNA. Nachdem große Segmente des Immunglobulin-Locus deletiert sind, werden die überlebenden V-, D- und J-Segmente in der DNA direkt miteinander fusioniert. Und wenn das passiert, kann die resultierende B-Zell-DNA transkribiert werden und durch Spleißen eine mRNA erzeugen, in der die Region zwischen der J-Kette und der konstanten Regionskette, hier C genannt, weiter deletiert wird.

Jede Boten-RNA hat also ein V-, ein D- und ein J-Segment zusammen mit einem konstanten Regionssegment. Es gibt noch andere Prozesse, die weiter diversifizieren, wie viele verschiedene variable Bereiche kodiert werden können.

Einer von ihnen ist der folgende. Es stellt sich heraus, dass der Prozess, durch den die V- und D- und die D- und J-Gene miteinander verschmolzen werden, diese Segmente miteinander verschmolzen, ein bisschen nachlässig ist.

Und deshalb findet manchmal die Fusion statt, wodurch eine Sequenz von Nukleotiden erzeugt wird, die ein Nonsense-Codon enthält. Manchmal wird ein kohärenter Leserahmen erzeugt, der dort noch eine andere Art von Aminosäuresequenz erzeugt. Und daher ist dies kein hochgeordneter Prozess in dem Sinne, dass diese Mikroarchitektur der Punkte mit dem V und dem D und dem D und dem J verschmolzen ist, ein bisschen chaotisch ist. Dadurch entsteht eine noch weitere Randomisierung der Nukleotidsequenz. Und schließlich, sobald dieses Gen erzeugt wurde, gibt es einen Prozess, der Hypermutation genannt wird, bei dem durch Mechanismen, die nicht gut verstanden werden, die Nukleotidsequenz dieser Region tatsächlich weiter verändert wird.

Es wird durch bestimmte Enzyme mutiert. Zum Beispiel gibt es ein Enzym namens Cytidin-Deaminase, das die Amingruppe von den Cytidinen in dieser Region entfernt und dadurch die Cs in dieser kodierenden Region effektiv mehr in eine T-Kodierungskapazität umwandelt.

Dies geschieht somatisch, und ich spreche hier wieder von einer weiteren Dimension der Diversifikation.

Eine der Dimensionen Diversifikation ist zunächst einmal, dass sich die V- und die J-Kette unabhängig, zufällig und stochastisch neu anordnen. Zweitens ist das Zusammenfügen der Segmente etwas schlampig. Und drittens gibt es somatische Hypermutation. Es gibt ein Enzym wie dieses, das tatsächlich ein aktiv mutagenes Enzym ist, das mit einigen der Cs in diesem Teil des Gens herumspielt und dadurch die Kodierungsfähigkeit des Immunglobulin-Gens, das von der Zelle kodiert wird, weiter diversifiziert. Und das bedeutet Folgendes: Wenn wir uns dieses Schema hier vorstellen, bei dem jede dieser B-Zellen erkennt, dass es sich um ein anderes Antigen handelt, können zunächst 100 Millionen verschiedene B-Zell-Klone erzeugt werden, die jeweils die Folge einer anderen zufälligen Mutation sind. Das geschieht früh in der Entwicklung des Immunsystems. Danach sind dort bestimmte selektive Prozesse im Spiel. Ein wichtiger selektiver Prozess ist die Eliminierung von B-Zellen, denen es nicht gelungen ist, gut umgeordnete Antikörpermoleküle herzustellen. Was meine ich damit?

Ich habe dir gesagt, wie schlampig die V, D, J-Verbindung ist. Und daher könnten viele dieser Verknüpfungen Leserahmen erzeugen, die mit Stopcodons in der Mitte inkohärent sind. Daher werden diejenigen Zellen eliminiert, die zufällig Antikörpermoleküle erzeugt haben, die stark mutiert und eindeutig strukturell defekt sind. Eine Voraussetzung für das Überleben dieser B-Zellen in der frühen Entwicklung des Immunsystems ist also, dass sie gelernt haben, funktionelle Schwer- und Leichtketten herzustellen.

Wenn sie es nicht tun, werden sie sofort ausgelöscht. Sie werden eliminiert.

Eine weitere sehr wichtige Voraussetzung für das Überleben ist, dass diese B-Zellen keine Antikörper bilden, die mit körpereigenen Antigenen reagieren. Was meine ich damit?

Nun, eines der Wunder des Immunsystems ist folgendes, dass es fremde Antigene erkennen kann, die von außen in den Körper eingebracht werden, darunter zum Beispiel die Epitope auf der Oberfläche von Polio-Viruspartikeln. Es kann viele verschiedene Viren, Oberflächenantigene auf der Oberfläche von Bakterien, Pilze und alle Arten anderer Infektionserreger erkennen.

Aber wichtig ist, dass das Immunsystem auch Hunderte von Millionen verschiedener Epitope der Proteine ​​sieht, die endogen vorhanden sind, native Proteine ​​in unseren Geweben. A priori sind die nativen Proteine, unsere sogenannten Eigenproteine, perfekt geeignet, um als Antigene zu fungieren.

Und doch entwickelt das Immunsystem selten eine starke Reaktivität gegen sie. Somit hat das Immunsystem die Fähigkeit, Selbst gegenüber Nicht-Selbst zu erkennen. Was meine ich mit Selbst versus Nicht-Selbst?

Self sind körpereigene native Proteine, die prinzipiell antigenisch sind. Nicht-Zelle sind fremde Eindringlinge, die seltsame Epitope in die Zelle bringen.

Und was passiert, ist, dass B-Zellen, die Antikörper produzieren, die native Proteine ​​​​in unserem Gewebe erkennen, bei guter Funktion schnell in der Entwicklung des Immunsystems eliminiert werden.

Was passiert, wenn diese Eliminierung nicht ordnungsgemäß erfolgt?

Wenn es nicht auftritt, hat man den Prozess einer Autoimmunerkrankung.

Und es gibt mehrere Autoimmunerkrankungen.

Typ-1-Diabetes, ein früh einsetzender Diabetes tritt auf, wenn das Immunsystem Antigene erkennt, die in den Inselzellen der Bauchspeicheldrüse vorhanden sind, die Insulin produzieren. Rheumatoide Arthritis, von der ein Großteil der älteren Menschen betroffen ist, tritt auf, wenn das Immunsystem Antigene erkennt, die normalerweise im Knorpel unserer Gelenke vorhanden sind. Lupus tritt auf, wenn es sich um eine Autoimmunerkrankung namens Lupus handelt, die oft tödlich ist, wenn das Immunsystem Proteine ​​​​in vielen verschiedenen Geweben erkennt.

Und wieder kommt es in all diesen Fällen zu einem Zusammenbruch der Mechanismen der Immuntoleranz. Und was meine ich mit Toleranz? Ich meine die Mechanismen, durch die das Immunsystem native Antigene toleriert, aber umgekehrt gegenüber fremden Antigenen intolerant ist.

Das Wort intolerant wird in der Immunologie nicht verwendet, aber ich verwende es hier nur zur Erklärung. Immuntoleranz ist daher ein sehr wichtiger Bereich der aktuellen immunologischen Forschung.

Wir verstehen nicht wirklich, warum wir nicht viel mehr Autoimmunerkrankungen haben als wir. Und nebenbei sind nur zwei oder drei der häufigsten Arten von Autoimmunerkrankungen aufgeführt, bei denen die Mechanismen, die normalerweise eine Immuntoleranz garantieren, versagt haben.

Daher überleben diese B-Zellen diejenigen, die funktionelle Antikörper bilden, und solche, deren Antikörper keine Selbstantigene erkennen. Sie dürfen überleben, und wieder einmal stellen wir uns vor, dass diejenigen, die zufällig Antikörper herstellen, die bestimmte fremde Antigene erkennen, eine klonale Expansion erfahren oder genießen. Während der Entwicklung der Immunantwort kommt es durch Hypermutation zu einer weiteren Diversifizierung der Antigen-erkennenden Domäne des Proteins.

Und so können Nachkommen dieser ursprünglich entwickelten Zellen, die begonnen haben, sich zu vermehren, weil sie einen Antikörper bilden, Antikörpermoleküle entwickeln, die noch stärker an das Antigen binden können. Es könnte sein, dass diese Antikörper-produzierenden Zellen anfangs Antikörpermoleküle produzieren, die sich gut an das Antigen binden, aber nicht wirklich eifrig. Begierig bedeutet wirklich eng. Und das ist genug, um ihre klonale Expansion in Gang zu bringen, aber während des Prozesses der klonalen Expansion erzeugt diese Hypermutation weitere Varianten dieser Zellen, mutiert ihre Antikörper produzierenden Gene weiter, sodass einige der Nachkommen dieser Zellen Antikörpermoleküle produzieren, die sogar binden enger und spezifischer an das provozierende Antigen. Und wenn das passiert, wird die Qualität der Antikörper nach und nach verbessert.

Nun klar, die somatische Hypermutation ist wieder eine zufällige Hypermutation. Und die Zellklone, in denen die Hypermutation weniger wirksame Antikörper erzeugt hat, werden nicht in ihrer Proliferation stimuliert. Die Proliferation jener Klone von Zellen, deren Antikörper immer fester bindende Antikörper bilden, wird vorzugsweise in ihrer Proliferation stimuliert.

Und als Konsequenz werden sie jetzt diejenigen sein, die bevorzugt werden, um die Plasmazellen zu produzieren, die große Mengen an Antikörpermolekülen produzieren. Wir haben jetzt also diesen sehr ungewöhnlichen und sehr interessanten Weg, mit dem B-Zellen und Plasmazellen eine große Vielfalt an Antikörpermolekülen herstellen können. Eines der interessanten Dinge ist nun tatsächlich die Tatsache, dass diese konstante Region eine von einer Vielzahl unterschiedlicher konstanter Regionen enthält. Anfangs, wenn man die erste Immunantwort hervorruft, erzeugt die erste Immunantwort, wie wir bereits sagten, eine konstante Region, die CM genannt wird, und ich hatte heute Morgen den richtigen Overhead. Ah, hier ist es.

So werden die Gene tatsächlich neu angeordnet.

Hier ist das neu angeordnete V, D und J, und hier ist der Spleiß zum konstanten Bereich. Und nachgelagert sind eine ganze Reihe von konstanten Regionssegmenten. Was ist der erste: CM.

Davon habe ich dir schon mal erzählt. Danach C Sub Delta, C Sub Gamma-3, Gamma-1, Gamma-2, Gamma-8 und so weiter.

Und daher kann das anfängliche Ereignis ein ig-mu, ein IgM-Antikörpermolekül, erzeugen. Die mu-Region erzeugt ein IgM.

Später, wenn sich die Immunantwort weiter entwickelt, kann dieses mu-Segment deletiert werden. Und jetzt kann der Spleiß zu einer Delta- oder Gammaänderung erfolgen. Wenn die dazwischenliegende konstante Region geändert wird, können Sie daher ein sogenanntes IgG erhalten.

Ein IgG ist ein Immunglobulin, das produziert wird, wenn diese Antigen-erkennende Region aufgrund der Deletion dieser dazwischenliegenden konstanten Regionssegmente bis hierher oder hierher gespleißt wird. Was ist der Zweck des sogenannten Klassenwechsels? Denn das sind verschiedene Klassen von Antikörpern, weil sie unterschiedliche Funktionen haben. Beachten Sie, dass dieser Klassenwechsel keine Auswirkung auf die Antigen-erkennende Stelle des Antikörpermoleküls hat. Vielmehr beeinflusst es die konstante Region des Antikörpermoleküls. Nun, wie funktioniert das? Das ursprünglich hergestellte Antikörpermolekül ist, wie ich Ihnen sagte, IgM. Und tatsächlich, wenn Sie sich die Struktur von IgM ansehen, sieht es so aus. Hier ist, sagen wir, eine B-Zelle, und das IgM-Molekül wird tatsächlich nicht wie ein lösliches Antikörpermolekül in den extrazellulären Raum sezerniert. So sieht IgM sehr schematisch aus IgM hat unsere Standard-Antigenerkennungsstelle, aber IgM ist in die Plasmamembran der B-Zelle eingebettet, genau wie ein Wachstumsfaktorrezeptor in die Plasmamembran einer B-Zelle eingebettet ist. Aber denken Sie daran, dass ich gerade gesagt habe, dass dieses IgM-Molekül hier oben eine Antigen-erkennende Domäne hat, genau wie wir es zuvor beschrieben haben. Die Antigenerkennung wird also nicht davon beeinflusst, ob wir hier ein IgM-Molekül haben.

Nur die Lage des Antikörpermoleküls und wie ich gleich zeigen werde, wird die Funktion dieses Antikörpermoleküls durch dieses IgM beeinflusst.

Später reifen die Nachkommen dieser B-Zelle zu denen heran, die IgG-Moleküle in das Plasma absondern.

Also, hier ist eine Reifung, die im Gange ist. Aber schau mal hier.

Auch hier sind die Antigen-erkennenden Domänen dieses IgG von dieser Umwandlung nicht betroffen. Hier bindet die konstante Region das Antikörpermolekül an die Plasmamembran.

Hier sind die Antigen-Erkennungsstellen.

Nach dieser Reifung haben die sekretierten IgG-Moleküle, die in die Lösung gehen, identische Antigen-Erkennungsstellen, aber jetzt sind sie lösliche Proteine. Nun, Sie werden sagen, warum macht das Immunsystem das?

Und es geht zurück zu einem Overhead, den ich Ihnen vor wenigen Augenblicken gezeigt habe, in dem ein Puzzle implizit durch das Bild auf dem Overhead erstellt wurde.

Und hier ist es. Schauen wir uns das einen Moment an.

Welches Detail wird nun in diesem Schema erklärt? Welches Detail wird jetzt erklärt? Ich habe Ihnen gesagt, dass B-Zellen durch bestimmte Antigene stimuliert werden können. Stellen wir uns vor, dass jede dieser B-Zellen nur sekretierte Antikörper produziert, OK, anstatt Zelloberflächen-Antikörper zu produzieren, weil der Zelloberflächen-Antikörper, der in diesem Schema hergestellt wird, tatsächlich die IgM-Moleküle sind. Nehmen wir an, diese B-Zelle hier macht ein Antigen. Ich zeichne es einfach, da das Antigen einen Antikörper gegen dieses Antigen herstellt und Antikörper dagegen absondert. Und ich würde einfach argumentieren, dass die B-Zelle, die gute Antikörper produziert, bevorzugt wird. Es hat seine Verbreitung stimuliert, nicht wahr? Darüber haben wir gesprochen.

Aber wenn diese B-Zelle ihren gesamten Antikörper ins Plasma schickt, woher soll sie dann wissen, dass sie einen guten Antikörper produziert?

Dies ist nicht möglich, da die gesamte Antigenerkennung durch den sezernierten Antikörper erfolgt. Was passiert also mit den IgM-Molekülen? Das erste dabei produzierte Antikörpermolekül ist IgM.

Und es bleibt an die Plasmamembran der B-Zelle gebunden.

Es ist ein Transmembranprotein und funktioniert ähnlich wie ein Wachstumsfaktorrezeptor. Das heißt, wenn das Antigen hier ausbindet, werden Signale in die Zelle eingestrahlt, die die Proliferation dieser Zelle induzieren.

Und nun können diese Zellen, die auf ihrer Oberfläche die Antigen-erkennenden IgM-Moleküle produzieren, ihre Proliferation stimulieren.

Das löst hier das Rätsel, das durch dieses Schema entsteht.

Wenn all diese B-Zellen nur solche sekretierten Antikörper produzieren würden, dann gäbe es keine Möglichkeit, ihre Vermehrung zu fördern, weil es keine Möglichkeit gäbe, dieser B-Zelle zu sagen, dass Sie etwas Gutes tun. Machen Sie mehr von diesen Antikörpermolekülen. Hier ist die Antigenerkennungsfähigkeit in die Plasmamembran eingebettet. Und wenn ein Antigen dieses bindet, organisiert sich das IgM-Molekül so, dass nun wachstumsstimulierende Signale in die Zelle gesendet werden, die diese Zelle dazu bringen, sich zu vermehren, wodurch mehr IgM-haltige Zellen produziert werden, die weiter zur Vermehrung stimuliert werden. Und schließlich, nachdem dies eine Weile gedauert hat, kommt es zu einem Klassenwechsel, der die IgM-Region der Genkettenregion deletiert und eine Umwandlung in IgG bewirkt. Auch hier ändert die Umwandlung von hier nach hier nichts an der Antigen-Erkennungsfähigkeit dieser beiden Antikörper. Es macht nur ein Zelloberflächen-Transmembranprotein oder ein sezerniertes Protein. (Pause) Nein, die VDJ-Wahl findet im Nukleus statt. Es ist eine Fusion verschiedener DNA-Segmente, und wenn es transkribiert wird, wird dieses fusionierte VDJ nun an ein Segment mit konstanter Region gespleißt.

Die Wahl von VDJ ist eine Fusion von DNA-Segmenten. Es passiert in chromosomaler DNA. Dadurch werden alle nicht verwendeten Segmente gelöscht. Alles, was im Immunglobulin-Locus einer B-Zelle übrigbleibt, ist also ein DNA-Segment, das V codiert, fusioniert mit einem DNA-Segment, das D codiert, fusioniert mit einem DNA-Segment, das J codiert.

Jetzt haben Sie also ein neues somatisch mutiertes Immunglobulin-Gen, damit es keine Restverwirrung darüber gibt. Sie sehen also die Eleganz dieses klassenwechselnden Dings.

Jetzt gibt es noch andere konstante Regionssegmente, die für andere Zwecke verwendet werden. Bei Allergien kommt es beispielsweise zu einer Aktivierung der igE-Antikörper.

Wenn Sie im Dickdarm Antikörper produziert haben, wird igA mehr dafür verwendet. Daher werden verschiedene dieser konstanten Regionen für verschiedene immunologische Anwendungen verwendet.

Das IgM-Molekül wird hier, wie gesagt, nur verwendet, um der B-Zelle zu sagen, dass es gut funktioniert, indem es die richtige Art von Antigen-Erkennungsstelle herstellt. Das eigentliche Geschäft bei der Herstellung von Antikörpern ist die Produktion löslicher Antikörper, der Immunglobuline oder der Gammaglobuline, da die überwiegende Mehrheit der im Blutplasma zirkulierenden Antikörper tatsächlich IgGs sind. Die IgMs sind, wie dies impliziert, eigentlich nur weitgehend an die Oberfläche der Zellen gebunden. Dies ist also wirklich ein außergewöhnlicher, eleganter Weg, um im Wesentlichen Hunderte von Millionen verschiedener Antigen-erkennender Domänen zu erzeugen, die jeweils kollaborativ zwischen einer schweren und einer leichten Kette erzeugt werden. Und sobald diese Antigen-erkennenden Domänen durch Veränderungen in der DNA-Struktur geschaffen wurden, können sie für verschiedene immunologische Anwendungen verwendet werden, indem sie die B-Zell-Proliferation vorantreiben, lösliche Antikörper sezernieren, die zur Neutralisierung von Viruspartikeln im Blut verwendet werden, oder wenn sie hyperaktiv sind um allergische Reaktionen oder Immunität in bestimmten Darmregionen zu erzeugen und so weiter.

Dieser Klassenwechsel ändert also nichts an der Antigenerkennungsfähigkeit. Es verändert nur die Nutzung der bereits entwickelten VDJ-Segmente und ihrer Antigen-Erkennungsfähigkeit durch Zellen des Immunsystems.

Nun, eine Sache, die durch all dies nicht wirklich klar ist, ist, wie sich all dies auf zellulärer Ebene entwickelt, denn was ich bisher gesprochen habe, ist die Humerusimmunität. Nun, wir reden über jemanden, der einen guten Sinn für Humor hat. Aber die eigentliche ursprüngliche Bedeutung des Wortes Humor im Lateinischen waren Flüssigkeiten, die durch Ihren Körper strömten und für Ihre unterschiedlichen Stimmungszustände verantwortlich waren.

Wenn Sie also depressiv waren oder gerade eine nationale Wahl stattfand, würden schwarze Flüssigkeiten, schwarzer Humor durch Ihr Blut fließen. Und wenn Sie gut gelaunt waren, floss noch andere Stimmung durch Ihr Blut.

Und das führt durch diese Etymologie zum Begriff der humeralen Immunität, also der löslichen Immunität, also der Produktion löslicher Antikörpermoleküle.

Aber ich werde Ihnen sagen, dass es einen zweiten Arm des Immunsystems gibt, der ebenso wichtig ist, und das heißt zelluläre Immunität.

Und, um es kurz zu machen, und wir werden es am Montag kurz ausarbeiten. Zelluläre Immunität wird größtenteils erzeugt, wenn Sie eine Art Immunzelle haben, die als Zelle bezeichnet wird und nicht die B-Zellen, von denen wir bisher gesprochen haben, die dazu in der Lage sind, und diese zelluläre Immunität ist unter anderem zytotoxisch.

Und es kann eine zweite Zelle hier erkennen. Hier ist eine zweite Zelle.

Dies ist ihre Zielzelle, da die zweite Zielzelle auf ihrer Oberfläche bestimmte Antigene präsentiert. Antigene werden also auf der Oberfläche der Zielzelle präsentiert. Ich habe sie hier nur als kleine blaue Striche angegeben. Und die T-Zelle ist hier in der Lage, diese Antigene auf der Oberfläche dieser Zelle zu erkennen und diese Zelle durch eine Reihe interessanter Mechanismen abzutöten. Dies beinhaltet nicht das Eingreifen von löslichen Antikörpermolekülen. Wir sprechen hier davon, dass eine Zelle eine andere erkennt, und es stellt sich heraus, dass dies für die antivirale Abwehr sehr wichtig ist. Ich habe Ihnen einen Weg erklärt, wie antivirale Abwehrkräfte erreicht werden. Lösliche Antikörpermoleküle werden wie IgGs in das Blutplasma sezerniert. Sie erkennen ein Epitop auf der Oberfläche eines Viruspartikels. Sie leuchten auf das Epitop auf der Oberfläche des Viruspartikels und neutralisieren das Viruspartikel. Und das ist sehr wichtig.

Wir haben in unserer Diskussion über das Poliovirus damit begonnen.

Aber auch das erweist sich als sehr wichtig. Warum ist es wichtig?

Aus folgendem Grund: Wenn diese Zelle, sagen wir, diese Zelle ist von innen mit dem Poliovirus infiziert.

Es stellt sich interessanterweise heraus, dass die Zelle eine Möglichkeit hat, Poliovirus-Polypeptide und virale Polypeptide zu verarbeiten und sie auf der Zelloberfläche zu präsentieren. Mit anderen Worten, die Zelle kann einige Poliovirus-Proteine ​​zerkauen, sie nach außen bringen und der Außenwelt mitteilen, dass dies die Arten von Proteinen sind, die gerade in mir hergestellt werden.

Sie, das Immunsystem, können nicht wirklich durch die Plasmamembran schauen, also werde ich Ihnen sagen, was in mir vorgeht.

Während wir hier sprechen, werden Poliovirus-Proteine ​​hergestellt.

Auf der Außenseite der Zelle werden diese angezeigt, obwohl die Replikation des Poliovirus ausschließlich innerhalb der Zelle stattfindet.

Eine zytotoxische T-Zelle kann hier diese Antigene auf der Oberfläche der mit Poliovirus infizierten Zelle erkennen und fortfahren, die Zelle abzutöten.

Warum ist das interessant oder wichtig? Denn die zytotoxische Zelle tötet die virusinfizierte Zelle, während die Virusinfektion noch in vollem Gange ist. Daher wird durch das Abtöten der virusinfizierten Zelle der gesamte Bioreplikationszyklus abgebrochen, da das Virus nicht genug Zeit hat, sich in der infizierten Zelle zu replizieren oder zu vermehren, bevor es passiert. Es wird präventiv von der zytotoxischen T-Zelle abgetötet. Und tatsächlich ist dieser Weg, Virusinfektionen aus unserem Körper zu eliminieren, genauso wichtig und oft wichtiger als die Neutralisierung von löslichen Viruspartikeln in unserem Plasma.

Und all das führt dazu, dass wir uns zunehmend auf die Mechanismen konzentrieren, durch die Antigene erkannt und verarbeitet werden, damit das Immunsystem beginnen kann, darauf zu reagieren. Ich möchte also jetzt darauf eingehen, auf die Aspekte, in denen wir die zellulären Arme des Immunsystems betrachten. Das Wichtigste bei der Immunantwort ist zunächst, dass, sagen wir, Poliovirus-Partikel von bestimmten phagozytischen Zellen des Immunsystems erkannt und verdaut werden. Was ist eine phagozytische Zelle: eine Zelle, die andere Dinge verschlingen kann. Eine bekannte phagozytische Zelle ist also ein Makrophage. Und dort sieht man den Begriff Fresszelle, Makrophage. Phagos bedeutet, zu zerkauen oder zu schlucken, also könnten Makrophagen ein Partikel wie dieses sehen, das dieses Partikel umgibt, und dann dieses Partikel verinnerlichen und verdauen, sagen wir ein Poliovirus-Partikel. Makrophagen könnten ein Poliovirus-Partikel umhüllen und es internalisieren.

Es könnte dasselbe mit einem Bakterium tun. Hier verwenden wir als Abkürzung für Makrophage this.

Das sind also Makrophagen. Es gibt noch andere, noch wichtigere phagozytische Zellen des Immunsystems, die als dendritische Zellen bezeichnet werden. Nun verschlingen diese Zellen alles, was um sie herum passiert. Es ist ihnen egal.

Sie sind promiskuitive Kanal-, Rinnen-Troller. Was auch immer in der Nähe ist, sie werden alles verschlingen, was gerade in der Nähe ist.

Sie werden es in sich hineinstecken, und jetzt machen sie etwas wirklich Interessantes. Die dendritischen Zellen, die Makrophagen, die phagozytischen Zellen, sie verdauen die internalisierten Partikel nicht bis hinunter zu Aminosäuren. Sie verdauen die Viruspartikel zu Oligopeptiden.

Normalerweise, wenn 10, 12, 14 Aminosäuren lang: sehr wichtig.

Sie bilden also keine Aminosäuren. Sie stellen Oligopeptide her. Warum machen sie diese Verdauung? Denn diese Zellen sind Exhibitionisten und wollen dem Rest der Welt zeigen, was sie gerade geschluckt haben. Es ist ihnen wirklich wichtig.

Stelle dir das vor. Also, was tun sie?

Sie nehmen diese Oligopeptide, die sie gerade internalisiert haben, und bringen sie über Moleküle, die MHC-Klasse 2 genannt werden, auf die Zelloberfläche. MHC-Klasse 2 heißt diese Moleküle, und das sind Zelloberflächenrezeptoren. Und diese MHT C Klasse 2-Moleküle enthalten ein Oligopeptid, das gerade durch die proteolytische Spaltung eines internalisierten infektiösen Agens produziert wurde, sagen wir. Und so hat der Makrophage viele dieser MHC-Klasse-2-Moleküle auf seiner Oberfläche und zeigt der Außenwelt, was er gerade an diesen Oligopeptiden eingefangen hat.

Und diese Oligopeptide haben übrigens ungefähr die Größe eines Epitops. Daher ist dieser Makrophage einfach so aufgeregt.

Es ist wie ein kleines Kind, das gerade etwas gefunden hat, das so aufgeregt ist, der Welt zu zeigen, was es gerade gefunden und verschlungen und verarbeitet hat. Und hier drüben ist eine Klasse von Zellen, die T-Helferzellen genannt werden. Und die T-Helferzellen sind an sich schon interessant, oder? Die T-Helferzellen haben sich durch einen Mechanismus entwickelt, der der Evolution der B-Zellen ähnlich und parallel ist. Folglich gibt es viele verschiedene Arten von T-Helferzellen. Jedes, also TH-1, TH-2, TH-3, von denen jedes auf seiner Oberfläche einen T-Zell-Rezeptor aufweist.

Welche Art von T-Zell-Rezeptor zeigt es? Ein T-Zell-Rezeptor, der genau die gleiche Art von Reifen durchlaufen hat, die die Antikörpergene durchlaufen haben. Das heißt, jede T-Zelle exprimiert auf ihrer Oberfläche einen Antigen-erkennenden Rezeptor, genau wie das IgM-Molekül, außer dass er von T-Zellen hergestellt wird und durch diese stochastischen Prozesse der Fusion von DNA-Segmenten erzeugt wird. Jede dieser T-Zellen, und es gibt Millionen von ihnen, hat also einen anderen T-Zell-Rezeptor mit einer anderen Antigen-Erkennungsfähigkeit.

Und das passiert im Immunsystem.

Stellen wir uns vor, wie ich jedes Jahr sage, dass wir uns in einem Basar des Nahen Ostens befinden, und dieser Basar des Nahen Ostens, hier sind alle Geschäfte an den Seiten dieses langen Basars. Es wird manchmal Shuk oder Suk genannt.

Und hier werden wir einen Makrophagen oder eine dendritische Zelle haben, die sich durch den Basar bewegt. Vor den Läden hängen eine ganze Reihe von T-Helferzellen.

Das Geschäft läuft langsam, also hängen all diese T-Helferzellen nur vorne herum, und wie es in dieser Region nicht üblich ist, lassen Sie uns so tun, als wären alle T-Helferzellen Mädchen, nur so zum Teufel. Es macht keinen Unterschied. Und jede dieser T-Helferzellen weist einen eigenen T-Zell-Rezeptor auf, der durch stochastische Mechanismen entstanden ist und ein anderes Oligopeptid erkennt.

Und hier haben wir jetzt die Makrophagen, die wie ein Verkäufer durchkommen, ein Straßenverkäufer, der sagt: Schaut mal Mädels, seht euch das Epitop an, das ich gerade verschlungen und produziert habe. Ist es nicht großartig? Und es verwendet seine MHC-Klasse-2-Moleküle, um die Epitope wie Hände zu präsentieren. Es peitscht sie aus wie ein Straßenverkäufer, und es läuft durch diesen Basar, und jede der T-Helferzellen, sie versammeln sich am Straßenrand, und die meisten sagen, sieh dir diesen Tropfen an.

Schau dir den Müll an, den er uns heute verkauft. Ich bin total desinteressiert.

Er war letzte Woche auch mit einem anderen Trottel hier.

Hoffen wir, dass er schnell verschwindet. Und währenddessen versucht der Makrophage oder die dendritische Zelle sehr ängstlich, jemanden zu finden, der auch nur die geringste Zuneigung oder Respekt für ihn hat.

Und das geht noch lange so.

Und schließlich findet der Makrophage hier eine T-Helferzelle.

Hier ist also die T-Helferzelle, und es stellt sich heraus, dass die T-Helferzelle zufällig auf ihrer Oberfläche einen T-Zell-Rezeptor hat, der das Epitop erkennt, mit dem der Makrophage hausiert.

Also, hier ist der Makrophage. Makrophage hat auf seiner Oberfläche dieses Oligopeptid, das von den MHC-Klasse-2-Händen gehalten wird. Also, hier ist das Peptid.

Und dieser T-Zell-Rezeptor, den ich TCR abkürzen werde, erkennt stark an das Epitop, das von den Makrophagen ausgepeitscht wird.

Und das ist, ich sage Ihnen ehrlich gesagt, Liebe auf den ersten Blick.

Sie sagt, oh, ich kann es nicht glauben. Sie verkaufen ein Epitop, das ich zufällig liebe. Das ist sehr spannend.

Und all die anderen T-Helferzellen sagen, oh mein Gott, was sieht sie in ihm? Und sie ist ganz aufgeregt, weil es eine direkte Komplementarität gibt. Tatsächlich erkennt der T-Zell-Rezeptor nicht nur das Epitop, sondern auch die umgebenden Aminosäuren in den Fingern des MHC-Klasse-2-Moleküls.

Es ist diese Konstellation von Dingen, die vom T-Zell-Rezeptor erkannt wird und diesen T-Zell-Rezeptor so richtig erregt.

Und was macht sie? Wir können nicht über alles reden, denn das ist höfliche Gesellschaft. Aber am wichtigsten für das, was sie tut, ist, dass sie sich wie verrückt zu vermehren beginnt. Nun, wissen Sie, Zellen haben ein begrenztes Repertoire an Verhaltensroutinen.

Das nächste Mal werden wir herausfinden, wie dies zu einer Immunantwort führt.


Zielen auf lösliche Antigene mit Antikörpern, die Antigen bei saurem pH-Wert freisetzen

Immunkomplexe aus polyklonalen Antikörpern und einem löslichen Antigen, die während einer typischen Immunantwort gebildet werden, werden normalerweise von phagozytären Zellen abgebaut. Abhängig vom Verhältnis von Antigen zu Antikörper können die Komplexe wie ein lösliches Gitter oder wie große unlösliche Partikel sein, die in filtrierenden Geweben abgelagert werden, z. Nieren. Immunkomplexe werden auch durch therapeutische monoklonale Antikörper und deren Targets gebildet. Ein typischer monoklonaler Antikörper kann zwei Antigenmoleküle gleichzeitig binden. Ein gitterartiger Komplex kann durch einen monoklonalen Antikörper nur gebildet werden, wenn das Antigen mindestens zwei vom Antikörper erkannte Epitope umfasst. Die in diesem Abschnitt beschriebenen Ziele sind monomere lösliche Proteine, daher sind ihre Komplexe mit therapeutischen Antikörpern klein und löslich.

In vivo führt die Gabe von Antikörpern zeitweise zu einer antikörpervermittelten Antigenakkumulation bzw. Antikörperpufferung [17, 18]. Obwohl dieses Phänomen für mehrere klinisch relevante Antigene real ist, ist es in seinem Kontext begrenzt [19]. Die Konzentration eines Antigens in einer extrazellulären Flüssigkeit hängt vom Gleichgewicht zwischen der Antigenproduktion und seiner Entfernung durch Endozytose und lysosomalen Abbau ab. Die Verabreichung eines spezifischen Antikörpers kann die Halbwertszeit eines Antigens erheblich verlängern, indem es in einem Antigen-Antikörper-Komplex eingeschlossen wird, der von FcRn in Endosomen recycelt wird. Um dieses Problem anzugehen, haben Igawa et al. entwickelten Antikörper, die pH-responsive sind und gebundenes Antigen in angesäuerten Endosomen freisetzen (Abb. 1) [20].

Ein konventioneller Antikörper mit (sub)nanomolarer Affinität bindet normalerweise ein Antigen und bleibt lange Zeit mit dem Antigen komplexiert. Dieser Effekt resultiert aus einem gesuchten Mechanismus für eine niedrige Dissoziationsrate während der Entwicklung von Biotherapeutika. Im Gegensatz zu herkömmlichen Antikörpern sind die von Igawa et al. kann bei der Internalisierung in Endosomen Antigen freisetzen. Die Antikörper arbeiten in Zyklen von Antigenbindung – Endozytose – Antigenfreisetzung – Recycling in die extrazelluläre Flüssigkeit – binden das Antigen wieder und werden als Recycling-Antikörper bezeichnet [14] (Abb. 1).

Das Recycling von Antikörpern kann weiter verbessert werden, indem ihre Internalisierungsrate erhöht wird, indem ihre Affinitäten zu einem Zellmembranprotein, z. B. FcRn [21] oder FcγR2b [22], erhöht werden. Recycling-Antikörper mit erhöhten Internalisierungsraten werden als Sweeping-Antikörper bezeichnet [14]. Neben der pH-abhängigen variablen Region umfassten gut charakterisierte Beispiele für Sweeping-Antikörper eine modifizierte Fc-Region, die eine Bindung an die Zellmembran ermöglicht [21, 22]. Wir erwarten auch, dass die umfassende Aktivität und erhöhte Internalisierung eines Antikörpers durch die Konstruktion eines multispezifischen Moleküls erreicht werden kann, das mit einer variablen Region ausgestattet ist, die einen der zwischen Plasmamembran und Endosomen rezyklierten Rezeptoren erkennt, z. B. Insulinrezeptor, Asialoglykoproteinrezeptor, High-Mannose-Rezeptor, Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor oder Transferrin-Rezeptor.

Die Sicherheit und Wirksamkeit der Sweeping-Antikörper wurde in klinischen Studien mit Antikörpern gegen Komplementkomponente 5 (C5) nachgewiesen [23,24,25]. C5 wird durch die C5-Konvertase während der Komplementaktivierungskaskade in zwei Proteine ​​gespalten: C5a – ein Chemoattraktant für Leukozyten und C5b, das an der Bildung des membranangreifenden Komplexes beteiligt ist. Der Komplex dringt in eine Zellmembran ein, was zu seiner Zerstörung und Zelllyse führt. Bei einigen seltenen Erkrankungen, z. B. bei der paroxysmalen nächtlichen Hämoglobinurie oder dem atypischen hämolytisch-urämischen Syndrom, wird C5 unkontrolliert aktiviert. Eculizumab – ein monoklonaler Anti-C5-Antikörper, der bei den seltenen komplementabhängigen Erkrankungen zum Standard wurde, blockiert die C5-Spaltung. Die C5-Konzentration im menschlichen Serum kann mehr als 100 ug/ml erreichen [26]. Um C5 effizient zu bekämpfen, müssen daher sehr hohe Dosen von Eculizumab verabreicht werden. Gemäß den Verschreibungsinformationen überschreitet die empfohlene Dosis von Eculizumab für erwachsene Patienten alle zwei Wochen 1000 mg. Zum Vergleich: Eine Dosis von Adalimumab, einem Anti-Tumor-Nekrose-Faktor-Antikörper, der z. B. bei der Behandlung von rheumatoider Arthritis verwendet wird, beträgt etwa 40 mg pro Woche. Eine hohe und häufige intravenöse Verabreichung von Eculizumab erhöht die Therapiekosten und verringert den Patientenkomfort.

Die Entwicklung des Eculizumab-Antikörpers mit einer umfassenden Aktivität löste die oben diskutierten Herausforderungen im Zusammenhang mit dieser Therapie. Die Einführung von Histidin-Substitutionen in seine CDRs ermöglichte eine pH-responsive Antigenbindung, was zu einer verbesserten C5-Clearance und einer verlängerten Halbwertszeit des Antikörpers führte. Darüber hinaus verstärkten zusätzliche Mutationen in der Fc-Region die Bindung des Antikörpers an FcRn [27]. Der generierte Antikörper ALXN1210 (Ravulizumab) wurde in klinischen Studien evaluiert und von der FDA zugelassen [28].

Ein weiterer Anti-C5-Sweep-Antikörper SKY59, eine humanisierte und gentechnisch veränderte Version eines monoklonalen Kaninchen-Antikörpers auf pH-Reaktionsfähigkeit [29], wurde in präklinischen Tiermodellen [30] und in einer klinischen Phase-I/II-Studie [24, 31] analysiert. SKY59 zeigte eine lang anhaltende Neutralisation von C5 und konnte die von Eculizumab nicht erkannte C5-Variante Arg885His hemmen [30].

Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte die Anwendung von Recycling- und Kehrantikörpern zur Entfernung von Toxinen. Die Aktivität konventioneller und pH-responsiver Varianten eines Antikörpers gegen Staphylokokken-Enterotoxin B (SEB)-Superantigen in einem Mausmodell wurden verglichen [32]. Obwohl alle analysierten Antikörper das Toxin neutralisierten und die Zytokinproduktion reduzierten, eliminierten die pH-responsiven Moleküle das Toxin signifikant schneller als die herkömmlichen Moleküle. Theoretisch können durch das Recycling und das Kehren von Antikörpern Antigene aus dem Kreislauf entfernt werden, auch wenn sie sie in In-vitro-Assays nicht neutralisieren. Somit können sie als wirksame Antitoxine verwendet werden, wenn kein neutralisierender Antikörper verfügbar ist.

Das Recycling und das Austragen von Antikörpern können auch auf weitgehend abgeschiedene Antigene abzielen. Bogenet al. haben kürzlich einen pH-responsiven bispezifischen Antikörper entwickelt, der auf zwei entscheidende Tumormarker CEACAM-5 und CEACAM-6 abzielt [33,34,35]. Dieses einzigartige Molekül bindet CEACAM-5 pH-abhängig und CEACAM-6 pH-unabhängig. Das Vorhandensein von ausgeschiedenem CEACAM-5 im Blutkreislauf behindert die Wirksamkeit der Anti-CEACAM-5-Antikörpertherapie. Die Verabreichung von pH-abhängigen Anti-CEACAM-5-Antikörpern verringert die Konzentration des Antigens im Serum und ermöglicht folglich ein besseres Targeting von CEACAM-5-positiven Tumoren. Der von Bogen et al. wurde noch nicht im Tiermodell getestet.

Sweeping-Antikörper ermöglichen eine bessere Antigen-Clearance, oder zumindest unterdrücken sie die Antigen-Akkumulation, wie durch das Targeting des löslichen C5-Antigens und des ersten bispezifischen Antikörpers mit mutmaßlicher Recycling-Modalität, der sich noch in der Entwicklung befindet, gezeigt wurde. Der Nutzen des Recyclings oder des Sweepens von Antikörpern könnte im Fall des Targetings auf die Tumormikroumgebung (TME) begrenzt sein. Ein niedriger pH-Wert innerhalb von TME verhindert die Bindung eines Antigens an die variablen Regionen, die konstruiert wurden, um es in angesäuerten Endosomen freizusetzen. Daher werden im nächsten Abschnitt weitere Strategien zum Targeting von Antigenen innerhalb von TME weiter diskutiert.


Methoden

Mäuse und Zelllinien

Weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 6–8 Wochen wurden von Japan SLC (Sizuoka, Japan) bezogen. Pmel-1-TCR-transgene Mäuse, die das H-2D b -beschränkte Epitop EGSRNQDWL von gp100 (gp100 25–33) erkennen, wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) 22 bezogen. Der Stamm ist auch homozygot für das T-Lymphozyten-spezifische Thy1a (Thy1.1)-Allel. IFNγ Venus Reportermäuse wurden bereits beschrieben 23 . Alle Mäuse wurden in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung gehalten. Der Vorschlag zur Verwendung von Tieren und die Versuchsprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der University of Tokyo (ID: P15-122) überprüft und genehmigt, und alle Tierverfahren wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt. B16F10 ist eine gp100 + spontane Melanomzelllinie der Maus, die freundlicherweise von Dr. N. Restifo (National Cancer Institute, MD) zur Verfügung gestellt wurde. B16F10-Zellen wurden mit der verkürzten Form des menschlichen Nervenwachstumsfaktor-Rezeptors mit niedriger Affinität (ΔhLNGFR/hCD271) 7 transduziert. Diese Zellen wurden in Kulturmedium bestehend aus DMEM (Wako Pure Chemical, Osaka, Japan) mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (SAFC Biosciences, Lenexa, KS, USA), 100 µg/ml Streptomycin und 100 U/ml Penicillin . gehalten (Wako Pure Chemical).

Tumormodelle

C57BL/6-Mäuse oder IFNγ-Venus-Mäuse wurden mit 5 × 10 5 hLNGFR/B16F10-Zellen subkutan inokuliert. Damit wir antigenspezifische CD8 + T-Zell-Antworten direkt visualisieren können Ex-vivowurde die Häufigkeit von gp100-spezifischen CTL-Vorläufern durch intravenöse Injektion von 5,0 × 10 4 CD90.1 + CD8 + pmel-1 TCR Tg T-Zellen am Tag vor der Tumorinokulation erhöht. An den Tagen 5 und 9 nach der Tumorinokulation erhielten die Mäuse intraperitoneale Injektionen von 200 µg Anti-PD-1 (Klon RMP1-14), Anti-CTLA-4 (Klon 9H10), Anti-4-1BB (Klon 3H3), Anti- CD4-(Klon GK1.5)-mAbs oder eine Kombination von Anti-PD-1- und Anti-4-1BB-mAb. Anti-4-1BB mAb wurde freundlicherweise von Dr. Mittler (Emory Vaccine Center, GA) zur Verfügung gestellt. Andere mAbs für in vivo Verwendung wurden von BioXcell (West Labanon, NH, USA) bezogen. Das Tumorwachstum wurde alle 2 bis 3 Tage verblindet mit Messschiebern überwacht und wurde unabhängig mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt. Das Tumorvolumen wurde nach der Formel π/6 × L . berechnet1L2H, wobei L1 ist der lange Durchmesser, L2 der kurze Durchmesser ist und H die Höhe des Tumors ist.

Zellpräparation und Durchflusszytometrie

Tumorinfiltrierende Zellen wurden unter Verwendung eines Tumordissoziationskits (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, USA) nach Herstellerangaben präpariert. Kurz gesagt, Tumoren wurden zu den angegebenen Zeitpunkten von Mäusen geerntet, in Stücke geschnitten und in sanfte MACS-C-Röhrchen, die eine Enzymmischung (Miltenyi) enthielten, überführt und durch ein 70-μm-Zellsieb (Fisher Scientific, Hampton, NH) geleitet, um . zu erhalten tumorinfiltrierende Zellen. Zellen aus drainierenden LNs, nicht-drainierenden LNs und Milzen jeder Gruppe (5 Mäuse) wurden gepoolt und analysiert. Um tote Zellen zu eliminieren, wurden die Präparate mit Zombie Yellow (BioLegend, San Diego, CA) gefärbt. Die Zellen wurden dann mit Fc-Block (Anti-CD16/32-Klon 2.4G2 BioXcell) vorbehandelt, mit Antikörpern gefärbt und auf einem Gallios TM -Durchflusszytometer (Beckman-Coulter, Brea, CA) analysiert. Die folgenden mAbs wurden von BioLegend bezogen und für die Durchflusszytometrie verwendet: PE-konjugiertes Anti-CD4, Anti-PD-L1, PerCP/Cy5.5-konjugiertes Anti-CD45, Anti-LNGFR, AlexaFluor 647-konjugiertes Anti-CD90.1 , Alexa Fluor 700-konjugiertes Anti-CD3, Pacific Blue-konjugiertes Anti-CD8. Die Daten wurden mit der FlowJo-Software (Version 10 FlowJo LLC, Ashland, OR) analysiert. Die Gesamtzahl der Zellen wurde aus einer FACS-basierten Zellzählung von Einzelzellsuspensionen geschätzt. Flowcount-Kügelchen (Beckman-Coulter) wurden zu den Zellproben zugegeben und die Zellzahlen wurden durch die folgende Gleichung berechnet: lebensfähige Zellen × Gesamtkügelchen/gezählte Kügelchen.

TCR-Repertoireanalyse

Gewebe wurden in TRIzol (Ambion, Carlsbad, CA) homogenisiert. RNA wurde aus jeder Probe unter Verwendung des RNeasy Mini-Kits (QIAGEN, Hilden, Deutschland) extrahiert und Menge und Reinheit mit der Agilent 2200 TapeStation (Agilent Technologies, Palo Alto) gemessen. Gesamt-RNA wurde mit Superscript III reverser Transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA) in komplementäre DNA (cDNA) umgewandelt. Als nächstes wurden TCR-Gene unter Verwendung von Adapterligation-vermittelter PCR 24 amplifiziert. Hochdurchsatz-Sequenzierung wurde unter Verwendung der Illumina Miseq Paired-End-Plattform (2 × 300 bp) (Illumina, San Diego, CA) durchgeführt. Die Zuordnung von TRBV- und TRBJ-Segmenten in TCR-Genen erfolgte auf Basis der internationalen Datenbank ImMunoGeneTics Information System® (IMGT) (http://www.imgt.org). Die Datenverarbeitung, Zuweisung und Datenaggregation wurden automatisch unter Verwendung einer Repertoireanalysesoftware durchgeführt, die ursprünglich von unserer Gruppe (Repertoire Genesis, Osaka, Japan) entwickelt wurde. Ein einzigartiger Sequenz-Read wurde als ein Sequenz-Read definiert, der keine Identität in TRBV, TRBJ und der abgeleiteten Aminosäuresequenz von CDR3 mit den anderen Sequenz-Reads aufwies. Die Kopienanzahl identischer einzigartiger Sequenzlesevorgänge wurde automatisch von der RG-Software in jeder Probe gezählt und dann in der Reihenfolge der Kopiennummer geordnet. Die Gesamt-Read-Counts wurden durch die Menge der zugeführten mRNA (Read-Count/μg) angepasst. Die prozentuale Häufigkeit des Auftretens von Sequenzlesevorgängen mit TRBV- und TRBJ-Genen in den Gesamtsequenzlesevorgängen wurde berechnet.

Histologie

Die Gewebe wurden in 10% neutralem Formalin (Muto Pure Chemicals, Tokio, Japan) fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten (3 mm) und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Bilder wurden unter Verwendung des Mikroskops BZ-9000 (KEYENCE, Osaka, Japan) erhalten.

Biochemischer Test

Der Anstieg der Alanintransferase (ALT)-Konzentration im Serum, die ein Indikator für Leberschäden ist, wurde auf einem Fuji DRY-CHEM 5500 V (Fuji Medical Systems, Tokio, Japan) 25 gemessen. Die Serumglucosekonzentration wurde mit einem automatischen Biochemie-Analysegerät HITACHI 7180 (HITACHI, Tokio, Japan) gemessen.

Statistische Analyse

Statistische Analysen wurden mit der JMP-Software Version 11.0.0 durchgeführt. (SAS Institute Inc., Cary, NC). Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD gezeigt. Der Dunnett-Test oder der Steel-Test wurden für mehrere Vergleiche zwischen einer Kontrollgruppe und Behandlungsgruppen verwendet.


Teil 2: Ungewöhnliche Antikörperfragmente: Die Camelid-Nanobodies

00:00:0724 Mein Name ist Hidde Ploegh.
00:00:0824 Ich bin Senior Investigator am Boston Children's Hospital im Programm für Zelluläre und Molekulare Medizin.
00:00:1519 Und in diesem Teil meiner Präsentation werde ich einige neuere Arbeiten besprechen, die beschreiben
00:00:2205 Versuche, ungewöhnliche Eigenschaften von Antikörpern zu nutzen, die von Kameliden produziert werden.
00:00:3001 Warum sollte das interessant sein?
00:00:3407 Das sind die Tiere, mit denen wir arbeiten.
00:00:3606 Das sind zwei junge Alpakas, Bryson und Sanchez.
00:00:4011 Und der Grund, warum diese Tiere meine Aufmerksamkeit auf sich gezogen haben, war ein Vortrag, der
00:00:4507 Ich habe teilgenommen, in dem ich falsch der falschen Sektion zugeordnet wurde.
00:00:4813 Und es ist das erste Mal, dass ich von den ungewöhnlichen Eigenschaften von Antikörpern höre, die von Kameliden hergestellt werden.
00:00:5322 und dazu gehören Alpakas, Lamas, Guanakos, Vikunjas, Kamele, Dromedare --
00:01:0005 alle Kameliden teilten diese einzigartige Funktion.
00:01:0401 Worüber ich spreche, ist die Tatsache, dass im Gegensatz zu den typischen Säugetierarten, die einzigartig
00:01:0905 produzieren Antikörper, die aus schweren Ketten und leichten Ketten bestehen, Kameliden produzieren auch,
00:01:1501 zusätzlich zu den traditionellen Formen, nur schwere Kettenantikörper.
00:01:1816 Und das ist von Bedeutung, denn für viele Anwendungen die Größe eines Antikörpers in voller Größe
00:01:2520 ist mit einigen der von uns gesuchten Anwendungen nicht kompatibel.
00:01:3002 Und aus diesem Grund versuchen wir, intakte Antikörpermoleküle auf die minimale Einheit zu schrumpfen
00:01:3517, die Antigene erkennen können.
00:01:3724 Wie ich in der vorherigen Präsentation besprochen habe, kann dies durch proteolytische Verdauung erfolgen.
00:01:4411 Mit Papain können wir sogenannte Fab-Fragmente herstellen, die aus den variablen Regionen bestehen
00:01:4905 der schweren Kette und der leichten Kette bzw. einer ihrer konstanten Domänen.
00:01:5405 Diese behalten die Antigenbindungseigenschaften bei, aber es erfordert erhebliche Anstrengungen, um
00:01:5903 produzieren sie richtig.
00:02:0123 Ihr Freund, der Molekularbiologe, kann Ihnen helfen, diese Fab-Fragmente noch weiter zu verkleinern,
00:02:0610 um sogenannte Single-Chain-Fv-Fragmente zu erzeugen, in denen die variablen Regionen von
00:02:1111 die schwere Kette und die leichte Kette sind durch einen Linker verbunden.
00:02:1428 Das Problem, das bei der Expression dieser einkettigen Fv-Fragmente oft auftritt, ist, dass
00:02:2012 sie haben nicht den sekretorischen Weg einer eukaryotischen Zelle durchlaufen, und folglich
00:02:2507 Sie neigen dazu, anfällig für Aggregationen zu sein und erfordern möglicherweise eine beträchtliche Optimierung, bevor Sie am Ende enden
00:02:3013 mit einem stabilen Produkt.
00:02:3302 Die von den Kameliden hergestellten Antikörper nur für schwere Ketten haben keine derartigen Nachteile, weil
00:02:3805 Sie können das Erkennungsmodul nur auf die variable Region der schweren Kette verkleinern.
00:02:4220 Und im Gegensatz zu den herkömmlichen Antikörpern sind alle Strukturmerkmale erforderlich
00:02:4814 zur spezifischen Antigenerkennung sind in die variablen Regionen der schweren Kette eingebettet.
00:02:5409 Diese Fragmente werden VHH-Fragmente genannt und werden allgemein auch als Nanobodies bezeichnet.
00:03:0106 Zu den Eigenschaften, die diese Nanokörper ungewöhnlich attraktiv machen, gehört die Tatsache, dass
00:03:0706 Sie können in Bakterien in hoher Ausbeute produziert werden.
00:03:1012 Viele von ihnen benötigen weder Glykosylierung noch Disulfidbindungen für Stabilität.
00:03:1413 Und ihre geringe Größe ermöglicht Anwendungen, für die sogar Single-Chain-Fvs geeignet wären
00:03:1927 der Aufgabe gewachsen.
00:03:2115 Also, wie stellen wir diese einkettigen Fragmente der variablen Region her?
00:03:2615 Wir praktizieren die sogenannte Multiplex-Immunisierung, ein schickes Wort für bis zu zwei Dutzend
00:03:3112 verschiedene Antigene in ein Tier.
00:03:3327 Und nach wiederholtem Boosten des Tieres, um Antikörper mit hoher Affinität zu erreichen, isolieren wir
00:03:3925 Lymphozyten aus peripherem Blut.
00:03:4204 Und die Verwendung von Primern, die entwickelt wurden, um die variablen Regionen von einzigartig zu amplifizieren
00:03:4624 Wenn diese Antikörper nur aus schweren Ketten bestehen, können wir eine unsterbliche Sammlung dieser VHH-Sequenzen erstellen.
00:03:5503 Wie erkennt man interessierende VHH-Sequenzen?
00:03:5904 Dies geschieht durch Klonen in einen Phagen-Display-Vektor, wo man Phagen auswählen kann, die exprimieren,
00:04:0703 als Fusion des P3-Proteins, der Phagenhülle, eines Nanobody oder VHH-Fragments.
00:04:1306 Und indem man eine sogenannte Panning-Reaktion durchführt, indem man Antigen auf einem festen Träger immobilisiert,
00:04:1816 können wir diese Phagenpartikel abrufen, die den interessierenden Nanokörper exprimieren,
00:04:2406 spezifisch für das Antigen, mit dem wir die Platte beschichtet haben.
00:04:2805 Auch wenn wir mit Tieren beginnen, die mit zwei Dutzend verschiedenen Antigenen immunisiert wurden,
00:04:3208 Wenn wir sie einzeln auf diesen Antigen-beschichteten Platten durchmustern, erhalten wir Nanokörper von
00:04:3812 definierte und einzigartige Spezifität, die wir dann in hoher Ausbeute in Bakterien produzieren können.
00:04:4411 Dies ist die konventionelle Methode zum Screening dieser sogenannten Nanobodies.
00:04:4828 Aber wir haben auch die Tatsache berücksichtigt, dass diese Nanokörper weder Glykosylierung benötigen
00:04:5417 noch Disulfidbrücken, die ihre Expression in der reduzierenden Umgebung des Zytosols ermöglichen.
00:05:0006 Und dies hat es uns ermöglicht, funktionale Screens durchzuführen, um Nanokörper auszuwählen, die
00:05:0511 Störreaktionen im Zytoplasma von, in meinem Beispiel, einer Säugerzelle.
00:05:1024 Lassen Sie mich Ihnen ein Beispiel geben.
00:05:1210 Unter Ausnutzung der Tatsache, dass diese Nanobodies oft weder Glykosylierung noch Disulfidbindungen benötigen,
00:05:1818 haben wir ein Screening-Verfahren entwickelt, das auf der zytoplasmatischen Expression dieser Nanokörper beruht
00:05:2509, um eine Virusinfektion zu verhindern.
00:05:2820 In diesem speziellen Fall haben wir ein Tier genommen und es mit einem gestörten Influenzavirus immunisiert
00:05:3403 und das vesikuläre Stomatitis-Virus, abgekürzt als IAV bzw. VSV, auf den folgenden Folien.
00:05:4211 Und nach der Immunisierung und nach der Extraktion der RNA, anstatt die PCR-Produkte zu klonen
00:05:4727 in einen Phagen-Display-Vektor, wie in der vorherigen Folie gezeigt, klonen wir diese
00:05:5228 amplifizierte Produkte in einem lentiviralen Vektor, so dass die Expression des Nanobody unter Kontrolle ist
00:05:5806 eines Doxycyclin-induzierbaren Promotors.
00:06:0114 Zellen, die mit einem lentiviralen Vektor transduziert wurden, produzieren den Nanobody nur, wenn
00:06:0600 richtig Doxycyclin ausgesetzt.
00:06:0802 Wir transduzieren also eine Sammlung von Säugetierzellen mit diesen lentiviralen Vektoren, sodass
00:06:1409 Im Durchschnitt erhält jede Zelle ein einzelnes antivirales Konstrukt.
00:06:1825 Bei Induktion mit Doxycyclin produziert diese Zelle den entsprechenden Nanokörper
00:06:2313 in seinem Zytoplasma, und wir können diesen Nanokörper dann auf seine funktionellen Eigenschaften testen.
00:06:2818 Indem wir die Transduktanzen als ganze Sammlung einer tödlichen Herausforderung aussetzen
00:06:3319 -- in diesem Fall eine lytische Dosis entweder des Influenzavirus oder des vesikulären Stomatitisvirus -- wir können auswählen
00:06:3915 für Überlebende, die zugrunde liegende Logik ist, dass jeder Nanokörper, der einen Aspekt von behindert,
00:06:4420 wird der Virus-Replikationszyklus dieser Zelle einen Wachstumsvorteil verleihen.
00:06:4924 Wir können dann die Überlebenden nehmen und die VHH- oder Nanobody-Sequenzen retten und dann
00:06:5506 validieren Sie sie auf unabhängige Weise.
00:06:5722 Dies ist also ein Beispiel für einen solchen Bildschirm, bei dem wir einzelne Nanokörper-produzierende Klone getestet haben
00:07:0605 in Abwesenheit und Anwesenheit von Doxycyclin-Induktion.
00:07:0911 Sie sehen zwei Balken für jede analysierte Zelllinie.
00:07:1312 Die offenen Balken zeigen die Situation ohne Doxycyclin-Induktion an, und wir
00:07:1911 den infizierten Zustand auf unabhängige Weise überwachen.
00:07:2122 Und wie die offenen Balken zeigen, auf der ganzen Linie ohne Doxycyclin-Induktion,
00:07:2627 jede dieser Transduktionen. Transduktanten ist vollständig mit Influenzaviren infiziert.
00:07:3221 Aber wie die durchgezogenen Balken zeigen, gibt es zahlreiche Klone, in diesem Fall ausgewählt als
00:07:3723 Schutz vor Influenza-Infektionen. Infektion, die die Fähigkeit des Virus drastisch reduzierte
00:07:4227 zu replizieren.
00:07:4328 Wenn wir dieselben Klone als Reaktion auf eine Infektion mit dem vesikulären Stomatitis-Virus testen,
00:07:4900 Klone, die vollständig gegen das Influenzavirus geschützt sind, reagieren nicht auf eine Infektion
00:07:5602 mit VSV überhaupt.
00:07:5711 Es spielt keine Rolle, ob wir die Expression des Nanokörpers induzieren
00:08:0014 Die Infektion mit dem irrelevanten Virus verläuft normal.
00:08:0326 Wir können das umgekehrte Experiment durchführen, indem wir nach Klonen selektieren, die die VSV-Replikation behindern.
00:08:0905 und diese wiederum lassen die Replikation des Influenzavirus un. unberührt.
00:08:1404 Nun, eine der reizvollen Eigenschaften von Nanobodies, und dies ist einer der Gründe, warum Strukturbiologen
00:08:2005 an ihnen warm geworden ist, ist die Tatsache, dass sie oft als Kristallisationsbegleiter dienen.
00:08:2524 Das bedeutet, dass bei Proteinen, die oft schwer zu kristallisieren sind, die Aufnahme von
00:08:3020 ein Nanokörper mit der entsprechenden Spezifität erleichtert die Kristallisation.
00:08:3501 Das hat natürlich den enormen Vorteil, mit atomarer Auflösung zu identifizieren
00:08:4003 genau das Epitop, an das der betreffende Nanokörper bindet.
00:08:4401 Und das haben Florian Schmidt und Leo Hanke gemacht, zwei Studenten und Postdocs in meinem Labor.
00:08:5027 Gemeinsam lösten sie die Kristallstruktur von, in diesem Fall, dem Ziel der Anti-Influenza
00:08:5814 Nanokörper, die die Replikation im Komplex mit einem repräsentativen Nanokörper behindern.
00:09:0603 In Rot und Orange sind die verantwortlichen Sequenzen im Grippe-Nukleoprotein angegeben
00:09:1308 für die Interaktion mit RNA -- weil das Influenzavirus ein negativsträngiges RNA-Virus ist --
00:09:1900 und in Gold das nukleare Lokalisierungssignal.
00:09:2204 Und dieses Experiment zeigt, dass der Nanobody an einen Bereich des NP-Proteins bindet
00:09:2704 zuvor nicht als funktionell wichtig impliziert.
00:09:3017 In diesem Sinne bietet uns dieser Nanokörper einen neuen Angriffswinkel
00:09:3600 über den Lebenszyklus des Virus.
00:09:3701 Nun, wenn man fragt, durch welchen molekularen Mechanismus könnte dieser Nanokörper möglicherweise die Virusreplikation behindern?,
00:09:4409 haben wir eine Struktur verwendet, die für das virale Ribonukleoprotein-Partikel veröffentlicht wurde.
00:09:5009 Dies ist eine virale RNA im Komplex mit Nukleoprotein.
00:09:5413 Die Analogie könnte eine Histon-Bindung an DNA sein.
00:09:5726 Und wir fanden heraus, dass der Nanobody, wenn er an das Nukleoprotein gebunden ist, die
00:10:0304 Kernlokalisierungssignal auf einer benachbarten NP-Untereinheit und behindert somit den Import des Virus
00:10:1027 Ribonukleoproteinpartikel in den Zellkern, was für die Replikation der Grippe essentiell ist.
00:10:1713 Ähnliche Experimente wurden für die VSV-hemmenden Nanokörper durchgeführt.
00:10:2114 Und in diesem speziellen Fall haben wir wieder festgestellt, dass der Nanobody an das N-Protein bindet,
00:10:2713, was das konzeptionelle Äquivalent des NP-Proteins im Influenzavirus ist.
00:10:3212 Das N-Protein komplexiert RNA, hier kaum sichtbar, da dieses rote Material dazwischen gefunden wurde
00:10:3806 die beiden Lappen des N-Proteins.
00:10:4019 Das N-Protein bildet einen dekameren Ring.
00:10:4404 Und in der Kristallstruktur gelöst nach dem Komplex zwischen dem N-Protein und dem Nanobody,
00:10:5004 finden wir das Vorhandensein von zwei solchen dekamerischen Ringen, von denen jede Untereinheit gekrönt ist von
00:10:5502 ein einzelner Nanokörper als Teil der Kristallstruktur.
00:10:5816 Wir haben also 40 Untereinheiten zur asymmetrischen Einheit.
00:11:0202 Und dies ist eine der größten Proteinstrukturen, zu der mein Labor beigetragen hat.
00:11:0508 Dies wurde zusammen mit Tom Schwartz vom MIT gemacht.
00:11:1002 Wenn wir jetzt fragen, würde uns diese spezielle Struktur helfen, genau zu verstehen, wie der Nanokörper
00:11:1603 behindert die Virusreplikation?, lautet die Antwort ja.
00:11:1908 Es stellt sich heraus, dass der Nanobody an ein Segment des N-Proteins bindet, an das sich auch bindet
00:11:2408 der Polymerase-Cofaktor P.
00:11:2709 Damit das VSV-Genom repliziert werden kann,
00:11:2928 muss die Polymerase mit Cofaktor P interagieren, damit diese Reaktion ablaufen kann.
00:11:3514 Und wie wir beobachtet haben, konkurriert der Nanobody um die Bindung mit diesem P-Protein, also angemessen
00:11:4018 erklärt, warum es die Virusreplikation hemmt.
00:11:4418 Und was auf dieser Folie nicht gezeigt wird, ist die Tatsache, dass wenn wir jetzt Viren in der Gegenwart anbauen
00:11:4900 dieses speziellen Nanokörpers können wir leicht nach Fluchtvarianten auswählen, die nicht mehr vorhanden sind
00:11:5404 sind anfällig für die Hemmung durch diesen Nanokörper.
00:11:5714 Und wie zu erwarten ist, werden die Mutationen, die diese Escape-Varianten ausmachen, genau zugeordnet
00:12:0214 an die Stelle, an die der Nanokörper bindet, ohne die Bindung von Cofaktor P zu beeinträchtigen.
00:12:0808 Wir haben hier also einen vollständigen Zyklus, in dem wir ein Tier mit einem antigenen Präparat immunisieren können,
00:12:1506 Führen Sie einen phänotypischen Screen durch, identifizieren Sie das bei atomarer Auflösung erkannte Epitop,
00:12:2023 und verwenden Sie dann ein biologisches In-vivo-Experiment, um diese Schlussfolgerungen zu validieren, indem Sie
00:12:2517 für Escape-Varianten.
00:12:2817 Ein zweites Beispiel, das die Fähigkeit von Nanokörpern ausnutzt, im Zytoplasma zu funktionieren
00:12:3420 einer Säugetierzelle betrifft Nanokörper, die wir gegen die Komponente hergestellt haben
00:12:3926 einer hochkomplexen Struktur, die wir als Inflammasom bezeichnen.
00:12:4314 Und ohne unnötig ins Detail zu gehen, Inflammasomen sind supramolekulare Aggregate
00:12:4906 für einen bestimmten Aspekt der angeborenen Immunität erforderlich.
00:12:5225 Wenn ein Inflammasom eine mikrobielle Komponente wahrnimmt, oligomerisiert es und nutzt es
00:13:0009 eine Reihe von Adaptern, um dann riesige Mengen eines Enzyms namens Pro-Caspase-1 zu rekrutieren.
00:13:0615 Sobald dieses Inflammasom richtig zusammengesetzt ist, führt es zur Aktivierung von Pro-Caspase-1,
00:13:1306 und dies wiederum ermöglicht die Umwandlung eines Zytokins namens Pro-IL-1 in sein aktives Gegenstück,
00:13:1926 IL-1.
00:13:2026 Dies ist ein Schlüsselaspekt der Entzündung.
00:13:2322 Es stellt sich heraus, dass Inflammasomen in vielen molekularen Manifestationen vorkommen, von denen zwei
00:13:2904 werden hier angezeigt.
00:13:3004 Links das NLRP3-Inflammasom, bestehend aus leucinreichen Wiederholungen
00:13:3506 -- das sind diese sich wiederholenden Strukturen, die oben gezeigt werden
00:13:3828 eine Pyrindomäne, über die es den Adapter ASC . rekrutiert
00:13:4218 und das ASC-Protein selbst hat noch eine weitere Protein-Protein-Interaktionsdomäne namens
00:13:4612 eine Caspase-Aktivierungs- und Rekrutierungsdomäne, über die, wie der Name schon sagt,
00:13:5104 Caspase wird rekrutiert.
00:13:5321 Diese Inflammasomen kommen in vielen verschiedenen Geschmacksrichtungen vor.
00:13:5608 Ein zweiter, nicht der einzige, der existiert, ist der NAI.
00:14:0205 NAIP- oder NLRC4-Inflammasom, wobei die Beteiligung des ASC-Adapters diskutiert wurde.
00:14:1222 Also haben wir Nanokörper gegen das ASC-Protein gezüchtet und festgestellt, dass diese Antikörper tatsächlich
00:14:2017 verhindern die ordnungsgemäße Freisetzung von Interleukin-1, was darauf hindeutet, dass wir tatsächlich einen hemmenden Antikörper hatten.
00:14:2806 und wieder, indem die Tatsache ausgenutzt wird, dass Nanokörper als Kristallisationsbegleiter dienen,
00:14:3404 wir hatten das Glück, genau bestimmen zu können, wie sich dieser spezielle Nanobody bindet
00:14:3823 seine Gegenstruktur, die CARD-Domäne des ASC-Proteins.
00:14:4304 Bemerkenswert in diesem speziellen Fall ist, dass der Nanobody an sein Ziel bindet
00:14:4808 nicht über die komplementaritätsbestimmende Region 3, die meistens den Schlüsselbeitrag leistet
00:14:5307 zur Antigenbindung, aber mit einem sehr wichtigen Beitrag von CDR2 zur Vermittlung spezifischer Interaktionen
00:14:5923 mit der CARD-Domäne.
00:15:0106 Und dies wurde in Zusammenarbeit mit Hao Wu vom Boston Children's Hospital durchgeführt.
00:15:0608 Nun, mit einem Nanobody, der an dieses ASC-Protein bindet, können wir eine Vielzahl von
00:15:1322 verschiedene Experimente.
00:15:1505 Und ein solches Experiment beinhaltet die Konstruktion eines Sensors, der über die Montage berichten könnte
00:15:2112 von Inflammasom-Monomeren und ASC-Monomeren in die Polymerstrukturen, die eine Voraussetzung sind
00:15:2718 zur Aktivierung.
00:15:3006 Durch die erstmalige Fusion unseres für ASC spezifischen Nanokörpers mit grün fluoreszierendem Protein
00:15:3722 können wir uns die Verteilung dieses ASC-Proteins in natürlicher Häufigkeit ansehen.
00:15:4122 Eine der Komplikationen der Inflammasom-Studie ist die Überexpression einzelner Komponenten
00:15:4725 kann zu Kunst führen. artefaktische und vorzeitige Aktivierung.
00:15:5113 Und wir würden gerne wissen, wie das Verhalten dieser Komponenten aussieht
00:15:5526 unter Bedingungen der natürlichen Fülle.
00:15:5803 In diesem speziellen Fall haben wir also eine monozytische menschliche Zelllinie genommen, die die NLRP3-Aktivierung aufrechterhalten kann.
00:16:0625 stellten wir den Reporter vor, der aus dem ASC-spezifischen Nanobody besteht, der mit GFP verschmolzen ist.
00:16:1215 und in Ermangelung einer offensichtlichen Stimulation suchten wir nach der Verteilung des ASC-Proteins
00:16:1720 aufgrund der Tatsache, dass unser Nanobody-GFP-Fusionskonstrukt darauf abzielt.
00:16:2306 Und was man ohne offenkundige Aktivierung sieht, ist diese diffuse Verteilung
00:16:2817 des ASC-Proteins.
00:16:3016 Wenn wir diese Zellen jetzt Entzündungsauslösern aussetzen, können wir anfangen zu sehen
00:16:3509 die Initiierung der Polymerisation.
00:16:3620 Wir sehen die Bildung dieser Filamente.
00:16:3928 Der Zusammenbau des Inflammasoms ist nicht abgeschlossen, was erklärt
00:16:4412 die hemmende Wirkung dieses speziellen Nanokörpers, aber es gibt Ihnen ein Beispiel dafür, wie wir das können
00:16:4914 verwenden Nanokörper, um in lebenden Zellen über Phänomene zu berichten, die sonst sehr schwierig wären
00:16:5610 zum Lernen.
00:16:5821 Eine weitere wichtige Anwendung, die uns schon seit langem interessiert, ist die Nutzung
00:17:0302 Einzeldomänen-Antikörperfragmente oder Nanobodies für Bildgebungszwecke.
00:17:0718 Wenn Sie ein Reagenz vom Antikörpertyp für die Bildgebung entwickeln möchten, muss es erfüllen
00:17:1123 eine bestimmte Reihe von Kriterien.
00:17:1408 Es muss etikettiert werden, damit wir das etikettierte Produkt erkennen können.
00:17:1728 Es muss schnell aus dem Verkehr gezogen werden, um das richtige Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen.
00:17:2323 Und es muss eine angemessene Gewebedurchdringung erreichen.
00:17:2616 Und hier wird seine geringe Größe zum entscheidenden Unterscheidungsmerkmal im Vergleich
00:17:3113 mit Antikörpern in voller Größe.
00:17:3400 Antikörper in voller Größe haben eine Molekülmasse von etwa 150 KiloDalton.
00:17:3824 Die Nanokörperfragmente, mit denen wir arbeiten, sind ungefähr ein Zehntel der Größe.
00:17:4216 Und das erklärt ihre überlegene Gewebedurchdringung, ihre beschleunigte Clearance
00:17:4707 aus dem Verkehr gezogen, und daher dachten wir, dies wären ideale Mittel für Bildgebungszwecke.
00:17:5204 Um nun ein Antikörperfragment oder irgendein Protein zu markieren, möchten Sie
00:17:5820 Kollateralschäden vermeiden.
00:18:0120 Die meisten der gebräuchlichen chemischen Kennzeichnungsverfahren bergen das Risiko der Veränderung
00:18:0717 von Resten, die für die Funktion dieses Proteins wichtig sind.
00:18:1000 Daher möchten wir bei der Entwicklung unserer Bildgebungsmittel die Einführung von . vermeiden
00:18:1517 jede chemische Schädigung des interessierenden Proteins.
00:18:1822 Um das zu erreichen, verwenden wir eine sogenannte Sortase-Reaktion.
00:18:2410 Das Sortase-Enzym ist eine Transacylase, die eine kurze Peptidsequenz erkennt
00:18:3107 am oder nahe dem C-Terminus eines beliebigen Zielproteins von Interesse.
00:18:3528 Es ist im Wesentlichen eine Thiol-Protease, die zwischen Threonin und Glycin spaltet.
00:18:4020 in Einzelbuchstaben-Code in dieser Folie angegeben, um ein kovalentes Thioacyl-Enzym-Zwischenprodukt zu ergeben,
00:18:4711 unten links angezeigt, hier.
00:18:4827 Jetzt stellen wir ex vivo ein kurzes synthetisches Peptid zur Verfügung, das minimal aus einem einzigen Glycin besteht
00:18:5712 – idealerweise zwei, drei oder mehr – an die man so ziemlich jede interessante Nutzlast anbringen kann,
00:19:0318 hier als Sonde bezeichnet.
00:19:0514 Diese synthetischen Peptide dienen als eingehende Nukleophile, die dieses Thioacylenzym angreifen
00:19:1015 Mittelstufe.
00:19:1123 Und es führt zur Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Zielprotein, das Sie haben
00:19:1617 modifiziert mit dieser LPXT(G)n-Sequenz in perfekter Peptidbindung mit der Sonde,
00:19:2413 über diese Oligoglycin-Strecke verbunden.
00:19:2626 Dies ist also eine Methode, die sich für die Modifikation von so ziemlich jedem interessierenden Protein eignet.
00:19:3200, wenn richtig optimiert.
00:19:3418 Nun, die Arten von Nutzlasten, die man an Proteine ​​anhängen kann, sind nur durch das begrenzt, was
00:19:4024 dein Freund, die Chemikalie. die Chemiker produzieren können.
00:19:4405 In diesem Beispiel habe ich einige der Dinge angegeben, die wir erfolgreich anbringen konnten
00:19:4900 mit dieser Sortase-Reaktion.
00:19:5105 Es beinhaltet die ortsspezifische Biotinylierung, die ortsspezifische und quantitative Anlagerung
00:19:5619 von Fluorophoren, Ausführung von Protein-Protein-Fusionen, Anheftung von DNA-Molekülen und,
00:20:0300 als relevant für das, was ich im Folgenden zu sagen habe, die Anlagerung von Radioisotopen.
00:20:0926 Wichtig hierbei ist, dass die Reaktion ortsspezifisch verläuft und
00:20:1503 nahezu stöchiometrisch, was es für Protein-Engineering-Zwecke sehr attraktiv macht.
00:20:2023 Damit wir Nanokörper gegen interessierende Oberflächenproteine ​​für bildgebende Zwecke verwenden können,
00:20:2924 wir müssen ein Etikett anbringen, mit dem wir sie erkennen können.
00:20:3321 Und ohne. ohne auf die Physik einzugehen, haben wir uns für die Positronen-Emissions-Tomographie interessiert.
00:20:3908 Dies ist eine Methode, die in der Klinik verwendet werden kann, um stoffwechselaktive von inaktiven Zellen zu diagnostizieren.
00:20:4501 Es ist eine nicht-invasive Methode.
00:20:4702 Aber es. es verwendet radioaktive Isotope, die manchmal schwierig zu handhaben sind.
00:20:5205 Ohne auf die chemischen Details einzugehen, haben wir Verfahren entwickelt, um diese Isotope zu fixieren
00:20:5625 geeignet für PET-Imaging zu unseren Nanobodies unter Verwendung der Sortase-Reaktion.
00:21:0120 Auf der linken Seite sehen Sie eine unangenehme Chemie, die zur Bildung einer F-18-markierten Verbindung führt.
00:21:0926 Fluor 18 ist das für die PET-Bildgebung geeignete Isotop.
00:21:1312 Rechts sehen Sie den Workstream für unsere sortase-katalysierte Reaktion zu installieren
00:21:1727 eine chemische Einheit, die es jetzt erlaubt. ermöglicht es uns, beides unter streng nativen Bedingungen zu kombinieren,
00:21:2400, ohne dem interessierenden Protein einen Kollateralschaden zuzufügen.
00:21:2800 So können wir Nanokörper für die Bildgebung durch Positronen-Emissions-Tomographie vorbereiten.
00:21:3327 Und was in diesem kleinen Einschub hier gezeigt wird, ist eine Maus, die wir mit einem Antikörper abgebildet haben
00:21:3800 gegen Klasse-II-MHC-Produkte.
00:21:4102 Dies sind Moleküle, die auf antigenpräsentierenden Zellen gefunden werden.
00:21:4328 In diesem Fall haben wir es mit einer tumortragenden Maus zu tun, bei der das Vorhandensein von Antigen-präsentierenden Zellen
00:21:4920 im Tumor kann mit dieser nicht-invasiven Bildgebungsmethode visualisiert werden.
00:21:5618 Wir waren auch besonders daran interessiert, Immunantworten abzubilden. nicht-invasiv.
00:22:0305 Ich habe darauf hingewiesen, dass T-Lymphozyten aufgrund dieser Antigen-spezifischen Antigene erkennen
00:22:0918 Rezeptor, der MHC-Produkte erkennt, die mit dem entsprechenden Peptid komplexiert sind, aber die Reaktivität
00:22:1606 dieser T-Zellen können mon. überwachen. kann durch den Ausdruck moduliert werden
00:22:2106 sogenannte kostimulatorische oder Checkpoint-Moleküle.
00:22:2321 Und das kann entweder stimulierend oder hemmend sein.
00:22:2610 Und damit wir uns Immunreaktionen nicht-invasiv abbilden können, konzentrieren wir uns auf
00:22:3121 diese kostimulatorischen oder Checkpoint-Moleküle wurden zu einem interessanten Punkt.
00:22:3711 Das ist umso wichtiger, wenn wir jetzt wissen, dass diese Checkpoint-Moleküle wichtig sind
00:22:4219 Ziele für die Immuntherapie von Krebs.
00:22:4612 Diese Folie stammt aus der Arbeit von Jim Allison, der dies zeigte, indem er einen dieser Kontrollpunkte blockierte
00:22:5120 Moleküle konnte man eine bemerkenswerte Verbesserung der Antitumorantwort erreichen.
00:22:5801 In diesem Fall sehen Sie, was mit dem Tumorwachstum passiert, gemessen als Tumordurchmesser.
00:23:0328 Wenn Sie ohne Behandlung einen Antikörper verabreichen, der diese regulatorische Interaktion nicht behindert,
00:23:1211 keine Wirkung auf das Tumorwachstum.
00:23:1418 Aber wenn Sie ein Checkpoint-Molekül blockieren, das T-Zellen von hemmt
00:23:1926 angemessene Spezifität, die bloße Blockierung dieses inhibitorischen Moleküls führt zu einer signifikanten Verbesserung
00:23:2526 in der Antitumorantwort.
00:23:2720 Nun, das war in der Klinik sehr erfolgreich, Heilungen wurden erreicht, aber nur
00:23:3319 ein Bruchteil der Patienten spricht auf eine solche Behandlung an und es ist sehr wichtig zu wissen
00:23:3806 warum manche Menschen auf eine Therapie ansprechen und andere nicht.
00:23:4212 Und wir denken, dass die Fähigkeit, Immunantworten nicht-invasiv abzubilden, uns helfen könnte
00:23:4701 gibt einige Antworten auf diese Frage.
00:23:5003 Neben dem CTLA-4-Protein, das im Mittelpunkt der Arbeit im Allison-Labor stand,
00:23:5510 viel Arbeit hat sich seitdem auf andere Nummern der Checkpoint-Familie konzentriert,
00:24:0112 insbesondere das PD-L1-Protein.
00:24:0302 Lassen Sie mich dieses Beispiel durchgehen.
00:24:0517 Wir haben hier einen T-Lymphozyten, der über seinen T-Zell-Rezeptor eine Antigen-präsentierende Zelle angreift
00:24:1108 für ein Antigen.
00:24:1226 Aber wenn diese Antigen-präsentierende Zelle auch PD-L1 exprimiert, greift sie eine Gegenstruktur ein
00:24:1908 auf die T-Zelle, die dieser T-Zelle nun ein hemmendes Signal verleiht, was sie unfähig macht,
00:24:2505 übt seine üblichen Funktionen aus, sei es die Zytokinproduktion oder eine lytische Funktion.
00:24:3018 Wenn man Antikörper hat, die entweder PD-1 oder PD-L1 blockieren, kann eine solche Hemmung gelindert werden.
00:24:3711 Und genau wie das Anti-CLTA-4-Beispiel, von dem ich Ihnen die Grafik gezeigt habe, blockiert PD-1 oder PD-L1
00:24:4317 hat eine signifikante Antitumorwirkung gezeigt.
00:24:4800 Also haben wir Nanobodies gegen PD-L1 entwickelt.
00:24:5305 Und wir können zeigen, dass das B16-Melanom, ein häufig verwendetes Mausmodell des Melanoms,
00:24:5909 exprimiert das PD-L1-Protein.
00:25:0213 Was Sie hier sehen, sind Mäuse, denen ein radioaktiv markiertes Fragment eines Nanokörpers injiziert wurde, der . erkennt
00:25:0728 PD-L1.
00:25:0922 Diese Mäuse auf ihrer linken Schulter tragen einen Tumor.
00:25:1315 Und das Vorhandensein des PD-L1-Proteins auf dem Tumor kann durch diese nicht-invasive Methode eindeutig nachgewiesen werden
00:25:1922 Bildgebungsverfahren.
00:25:2110 Wir verwenden immer genetische Kontrollen, um die Spezifität der Markierungsreaktionen abzuleiten, die wir sehen.
00:25:2717 Rechts sehen Sie eine PD-L1-Knockout-Maus, die mit demselben Tumor geimpft wurde.
00:25:3220 Und obwohl etwas schwächer, können wir auch in dieser Einstellung das PD-L1-Signal noch erkennen.
00:25:3817 Die Schlussfolgerung aus diesem Experiment ist, dass PD-L1-Positivität in der Tumormikroumgebung
00:25:4405 ist das Nettoergebnis der Expression dieses Proteins auf eindringenden Zellen hämatopoetischen Ursprungs,
00:25:5028 sowie durch Expression von PD-L1 durch den Tumor selbst.
00:25:5504 Es ist also möglich, ein radioaktives Fluorisotop, F-18, für Markierungszwecke zu verwenden,
00:26:0222 seine kurze Halbwertszeit von 110 Minuten bringt Einschränkungen mit sich.
00:26:0628 Aus diesem Grund haben wir glücklicherweise Zugang zu anderen Isotopen, die PET-kompatibel sind,
00:26:1107 wie Zirkonium-89.
00:26:1317 Und wir haben auch die chemischen Mittel, diese ortsspezifisch zu installieren.
00:26:1805 In Tafel A geben wir die chemische Struktur des Chelators an, der für die spezifische Bindung erforderlich ist
00:26:2501 Zirkonium-89.
00:26:2700 Und genauso wie wir Sortase verwenden, um F-18 zu installieren, haben wir eine Chemie, die
00:26:3121 ermöglicht es uns, diese mit Zirkonium markierten Verbindungen zu installieren.
00:26:3522 Die untere Hälfte dieser Folie veranschaulicht den grundlegenden enzymatischen Ansatz, den wir verfolgen
00:26:4020 dieses Zirkonium anbringen.
00:26:4219 Wieder verwenden wir eine Sortase-Reaktion, um die in Panel A angegebene Struktur zu installieren.
00:26:4727 Und wir haben die zusätzliche Möglichkeit, diese Strukturen durch die Installation noch weiter zu modifizieren
00:26:5402 von Polyethylenglykol, zum Beispiel, um das hydrophob-hydrophile Gleichgewicht von zu beeinflussen
00:26:5916 das Endprodukt.
00:27:0018 Hier sehen Sie also ein Experiment, bei dem wir einen Nanobody genommen haben, der CD8 erkennt.
00:27:0626 Dies ist die Glykoprotein-Marker-Diagnostik von zytotoxischen T-Lymphozyten.
00:27:1018 Und ganz links sieht man das erste Ergebnis mit einem Nanobody, der einfach mit Zirkonium-89 beschriftet ist.
00:27:1810 Die beiden massiven Strukturen unten sind die Nieren und die Blase.
00:27:2226 Und dieser spezielle Nanokörper neigt, wenn er markiert ist, dazu, sich in den Ausscheidungsorganen zu konzentrieren.
00:27:2807 mit nur sehr schwacher Markierung in der Thymusdrüse, den Lymphknoten
00:27:3127 -- genau dort, wo Sie es erwarten würden.
00:27:3420 Aber jetzt werden PEG-Räume von 5, 10 und 20 Kilodalton hinzugefügt, wodurch die Hydrophilie verbessert wird
00:27:4303 des Markierungsmittels sehen wir eine massive Reduzierung dieser Aufnahme in die Ausscheidungsorgane.
00:27:4917 Und wir beginnen mit großer Klarheit die lymphoiden Strukturen dieser Nanokörper zu sehen
00:27:5319 wurden in erster Linie für die Erkennung entwickelt.
00:27:5528 Wieder verwenden wir eine genetische Kontrolle.
00:27:5900 Ganz rechts sieht man eine Maus, der aufgrund der Tatsache alle Lymphozyten fehlen
00:28:0413, dass es genau an dem Ort mutiert ist, der für die VDJ-Umordnung verantwortlich ist.
00:28:1018 Und die in diesem Panel so deutlich sichtbaren lymphoiden Strukturen fehlen in der
00:28:1620 RAG-Knockout, bei dem Lymphozyten vollständig fehlen.
00:28:1928 Mit diesem Werkzeug in der Hand können wir also endlich damit beginnen, zytotoxische T-Lymphozyten abzubilden
00:28:2504 und stellen Sie die Frage, können wir den Einstrom von Killer-T-Zellen in die Tumormikroumgebung nachweisen?
00:28:3211 Diese Folie zeigt eine Maus, die mit einer Bauchspeicheldrüsentumorzelllinie geimpft wurde.
00:28:3810 Und an seiner linken Flanke kann man den Tumor deutlich erkennen, da CD8-Lymphozyten
00:28:4515 infiltrieren und zeigen, dass wir diese Art von nicht-invasivem Bild tatsächlich verwenden können. Bildgebung
00:28:5108, um das Verhalten von T-Lymphozyten in lebenden Mäusen zu verfolgen.
00:28:5418 Und das wirklich Wichtige an dieser Art von Experiment ist die Tatsache, dass wir nicht mehr
00:28:5816 müssen das Tier töten, um zu untersuchen, was darin vorgeht.
00:29:0223 Typischerweise Immunologen, damit sie auf Lymphorgane oder Lymphozyten zugreifen können
00:29:0908, die sich im Tumor befinden, müssen die Maus töten, die interessierenden Organe herausschneiden,
00:29:1417 und zählen und charakterisieren Sie dann die vorhandenen Lymphozyten.
00:29:1810 Mit dieser nicht-invasiven Bildgebungsmethode, wenn auch in bescheidener Auflösung, können wir jetzt verfolgen
00:29:2313 ein Tier im Laufe der Zeit und beobachten Sie, wie sich die Immunantwort entfaltet.
00:29:2713 Das ist also unsere berühmte Spinnmaus.
00:29:3018 Und wieder ist der Tumor an der rechten Flanke deutlich zu sehen.
00:29:3511 Tatsächlich sehen Sie auch, dass diese Punkte die Lymphknoten darstellen.
00:29:4024 Und Lymphknoten, die sich in unmittelbarer Nähe des Tumors befinden, werden intensiver markiert
00:29:4600 als Lymphknoten. Lymphknoten auf der anderen Seite, im Einklang mit dem Handel mit Lymphozyten
00:29:5018 zwischen diesen verschiedenen lymphoiden Organen.
00:29:5226 Also, wie können wir diese Informationen verwenden, um eine der Fragen zu beantworten, die ich zuvor gestellt habe?
00:29:5905 Warum reagieren bestimmte Tumore auf Checkpoint-blockierende Antikörper,
00:30:0318 wie Anti-CTLA-4 oder Anti-PD-1/PL-L1 und andere nicht?
00:30:0903 Können wir diese spezielle Bildgebungsmethode verwenden, um etwas Licht ins Dunkel zu bringen?
00:30:1321 diese spezielle Einstellung?
00:30:1514 Das ist also eine komplizierte Folie, aber das Konzept ist sehr einfach.
00:30:2027 Wir verwenden unser B16-Melanommodell in einer Umgebung, in der einige der Tiere fortfahren werden
00:30:2703 bis zum ausgewachsenen Tumorwachstum und andere reagieren auf die Kontrolle des Tumors als Reaktion auf
00:30:3322 Checkpoint-blockierende Antikörper.
00:30:3624 In diesem Fall verwenden wir also Anti-CTLA-4-Antikörper, also Antikörper in voller Größe, als Therapeutikum.
00:30:4301 Und wir stellen uns einfach in der Tumor-Mikroumgebung vor, was mit den CD8-T-Lymphozyten passiert
00:30:4802 die man vor Ort findet.
00:30:4922 Und wir finden eine sehr starke Korrelation zwischen der Verteilung dieser CD8-T-Zellen
00:30:5603 und die Fähigkeit eines Tieres, den Tumor zu kontrollieren.
00:30:5906 Wenn wir eine monofokale Verteilung von T-Lymphozyten sehen, geht dies mit einer Verringerung der Tumorgröße einher
00:31:0520 und verbessertes Überleben der Tiere.
00:31:0824 Bei Tieren, die nicht auf die Checkpoint-Blockade reagieren und bei denen die Tumoren wachsen,
00:31:1310 wir sehen diese heterodispersere Verteilung von CD8-T-Zellen, und dies wird zu einem Prädiktor,
00:31:1822, wenn Sie so wollen, über das Ergebnis des letzten Experiments.
00:31:2319 Dies wurde in Zusammenarbeit mit dem Labor von Bob Weinberg in einem Brustkrebsmodell validiert
00:31:2711 wobei es zwei Varianten gibt.
00:31:3010 Eine ist eine epitheliale Variante, die immunogen ist und als Reaktion auf eine Checkpoint-Blockade leicht kontrolliert werden kann.
00:31:3610 und es gibt eine mesenchymale Variante, die weniger differenziert ist, sehr aggressiv,
00:31:4101 und reagiert schlecht auf Checkpoint-Blockade.
00:31:4404 Wenn wir uns jetzt Tiere beider Arten vorstellen. Sie sehen ein Beispiel für die mesenchymale Variante,
00:31:4909 schlecht kontrolliert durch Checkpoint-Blockade. Tumore wachsen weiter und die Tiere
00:31:5406 überleben nicht.
00:31:5510 Unten sehen Sie die epitheliale Variante, eine monofokale Verteilung von CD8-T-Zellen,
00:32:0204 ausgezeichnete Reaktion auf Checkpoint-blockierende Antikörper, und daher denken wir, dass diese Methode für die
00:32:0620 Das erste Mal beginnt, etwas Licht ins Dunkel zu bringen, was in der Tumor-Mikroumgebung passiert.
00:32:1024 Wir haben einen langen Weg vor uns und es gibt eine lange Liste von Oberflächenmolekülen, die wir abbilden möchten.
00:32:1618 Wir müssen viel über verschiedene Aspekte der Immunantwort wissen.
00:32:2015 Aber es wird wichtig sein, diese Dinge am lebenden Versuchstier zu messen
00:32:2519 und letztendlich vielleicht in der Klinik.
00:32:2725 Das vorangegangene Segment hat also unsere Bemühungen gezeigt, einen bestimmten Aspekt der adaptiven Immunität abzubilden,
00:32:3417, insbesondere CD8-T-Zellen.
00:32:3711 Aber wie ich schon sagte, ist die Verteidigung des Wirts ein integriertes System, das nicht nur die adaptive Immunität umfasst
00:32:4409 aber auch angeborene Immunität.
00:32:4525 Und zukünftige Bemühungen konzentrieren sich darauf, diese angeborenen Immunantworten nicht-invasiv abzubilden
00:32:5118 ebenfalls.
00:32:5218 Ich denke, Entzündungen haben einen Schlüsselaspekt, der von diesem Ansatz profitieren würde.
00:32:5712 Die von uns verwendeten Nanobodies haben einige charakteristische Vorteile:
00:33:0028 ihre geringe Größe macht die Bildgebung möglich
00:33:0320 einfache Herstellung in E. coli ist ein Plus
00:33:0613 die Tatsache, dass sie weder Glykosylierung noch Disulfidbindungen erfordern, ermöglicht es uns, sie auszudrücken
00:33:1201 im Zytoplasma von Säugetierzellen und verwenden sie, um phänotypische Screens durchzuführen, wie ich gezeigt habe
00:33:1900 schließlich macht es ihre geringe Größe möglich, die Sortase-Reaktion auszunutzen, um
00:33:2403 installiere so ziemlich alles. jede beliebige Entität, ohne dem Nanokörper selbst Schaden zuzufügen,
00:33:2903 und das ist die Methode, die wir angewendet haben, um Nanokörper für die Bildgebung geeignet zu machen durch
00:33:3506 Positronen-Emissions-Tomographie.
00:33:3725 Lassen Sie mich abschließend die Personen anerkennen, die diese Arbeit geleistet haben.
00:33:4123 Die Virenarbeit, die ich zusammengefasst habe, wurde von Florian Schmidt, einem Postdoc,
00:33:4709 und Leo Hanke, ein Doktorand.
00:33:5017 Die Nanobody-Plattform wurde von Jessica Ingram gegründet, derzeit an der Fakultät von Dana-Farber.
00:33:5611 Die Radiochemie wurde von Mohammed Rashidian durchgeführt.
00:33:5910 Und die Tumorimmunologie-Experimente wurden mit sehr viel Input durchgeführt
00:34:0406 und Teilnahme von Mike Dougan.
00:34:0705 Ich habe erwähnt, dass wir mit Bob Weinberg an unseren Brustkrebsmodellen zusammenarbeiten,
00:34:1113 Hao Wu über das Inflammasom,
00:34:1424 Steve Almo als Proteinquelle bei uns. mit welchem
00:34:1703 können wir Alpakas immunisieren und erhalten die Antikörper, mit denen wir arbeiten.
00:34:2107 Vielen Dank.

  • Teil 1: Immunologie: Grundlagen der Antikörpervielfalt

Affinitätsreifung: Highlights in der Anwendung von in vitro Strategien zur gerichteten Evolution von Antikörpern

Denice T. Y. Chan, Maria A. T. Groves Affinity Reifung: Highlights in der Anwendung von in vitro Strategien für die gerichtete Evolution von Antikörpern. Emerg Top Life Science 2021 ETLS20200331. doi: https://doi.org/10.1042/ETLS20200331

Die Affinitätsreifung ist eine Schlüsseltechnik im Protein-Engineering, die verwendet wird, um die Affinität und Bindungsinteraktionen zu verbessern in vitro, ein Prozess, der häufig erforderlich ist, um das therapeutische Potenzial von Antikörpern auszuschöpfen. Es gibt viele verfügbare Display-Technologien und im Laufe der Jahre entwickelte Reifungsverfahren, die bei der Herstellung therapeutischer Antikörper von entscheidender Bedeutung waren. Aufgrund der inhärenten Beschränkungen der Anzeigekapazität dieser Technologien ist die Unterbringung umfangreicher und komplexer Bibliotheksaufbauten jedoch immer noch eine Herausforderung. In diesem Artikel diskutieren wir unsere jüngsten Bemühungen um die Affinitätsreifung einer schwierigen Antikörperlinie mit einem unvoreingenommenen Ansatz, der darauf abzielte, einen größeren Sequenzraum durch die Anwendung von DNA-Rekombinations- und Shuffling-Techniken über die gesamte Antikörperregion und Selektionen mittels Ribosomen-Display zu erkunden . Wir beleuchten auch die Hauptmerkmale verschiedener Display-Technologien und Diversifikationsmethoden und diskutieren die Strategien, die von verschiedenen Gruppen als Reaktion auf unterschiedliche Herausforderungen entwickelt wurden. Besonderes Augenmerk wird auf Beispiele gelegt, die auf die Erweiterung der Sequenz-, Struktur- oder experimentellen Vielfalt durch unterschiedliche Mittel und Ansätze abzielen. Hier stellen wir unsere Perspektiven zu diesen Methoden und die Überlegungen zur Entwicklung effektiver Strategien für die gerichtete Evolution von Antikörpern dar.

Antikörper sind eine immer wichtiger werdende Klasse von therapeutischen Molekülen. In den letzten Jahrzehnten haben wir einen enormen Anstieg der Zahl von Antikörper-Medikamenten beobachtet, die für den klinischen Einsatz in fast allen Krankheitsbereichen zugelassen wurden, da wir gelernt haben, ihre einzigartigen Eigenschaften zu nutzen, um unterschiedliche therapeutische Bedürfnisse zu befriedigen [1,2]. Es gibt viele Möglichkeiten, Antikörper zu erzeugen in vivo und in vitro, wobei die häufigsten Immunisierung und Phagen-Display sind, aber die aus diesen Verfahren isolierten Antikörper erfordern oft zusätzliche Schritte, um ihre Affinitäten und/oder arzneimittelähnlichen Eigenschaften zu verbessern, um die in einer therapeutischen Umgebung erforderliche Wirksamkeit zu erreichen. In vitro Affinitätsreifung beinhaltet normalerweise eine Diversifizierung der Antikörper-Basensequenz, gefolgt von stringenten Selektionen, um Binder mit höherer Affinität zu isolieren, ein Prozess der gerichteten Evolution, ähnlich der somatischen Hypermutation, die natürlicherweise in Säugetier-B-Zellen auftritt [3]. Bei einer großen Auswahl an verfügbaren Technologien gibt es unzählige Wege der Affinitätsreifung, aber wie entscheidet man sich für einen Ansatz?

In einem kürzlich veröffentlichten Bericht haben wir die Verwendung eines unvoreingenommenen Ansatzes zur Affinitätsreifung zur Optimierung eines inhibitorischen Antikörpers beschrieben, der spezifisch für Arginase 2 (ARG2) ist [4]. Die Prämisse des Projekts bestand darin, ein Therapeutikum zu entwickeln, das das von Krebszellen sezernierte extrazelluläre ARG2 neutralisiert, von dem angenommen wird, dass es eine immunsuppressive Reaktion durch den Abbau von Arginin vermittelt [5]. Dabei sind eine hochaffine Bindung und eine starke Hemmwirkung wesentliche Eigenschaften für das Therapeutikum, das sich ideal für einen Antikörperansatz eignet. Aus den naiven Phagen-Display-Bibliotheken von AstraZeneca [6] wurde erstmals ein Antikörperkandidat isoliert, der in einem enzymatischen Assay eine spezifische Bindung an humanes ARG2 und eine inhibitorische Aktivität zeigte in vitro [7]. Dieser Antikörper wurde dann einem umfassenden Affinitätsreifungsprozess unterzogen, bei dem jede der sechs komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) zur Diversifizierung gezielt und parallel durch Selektionen genommen wurde. Überraschenderweise wurde eine geringe Verbesserung der Antikörperaffinität oder -potenz erhalten. Darüber hinaus war auch ein zufälliger, fehleranfälliger Mutagenese-Ansatz erfolglos, was darauf hindeutet, dass es sich um einen schwer affinitätsreifen Antikörper handelte.

Angesichts ihrer Unwirksamkeit dachten wir, dass die verfolgten Ansätze, die sich jeweils nur auf kleine Regionen des Antikörpers konzentrierten, möglicherweise nicht ausreichten, um nennenswerte Verbesserungen dieser Antikörperlinie zu erzielen. Inspiration aus dem somatischen Rekombinationsprozess in vivo, in dem modulare Segmente von Immunglobulindomänen neu angeordnet werden, um ein vielfältiges Repertoire zu erzeugen, verwendeten wir Antikörperketten-Shuffling [8-10] und einen Staggered-Extension-Prozess (StEP) [11,12], um Mutationen aus allen sechs CDRs zu rekombinieren (Abbildung 1). Diese Rekombination schuf eine neue kombinatorische Diversität und produzierte Antikörpervarianten mit Mutationen, die die Länge des Antikörperkonstrukts unvoreingenommen überspannen. Für die Auswahl dieser Bibliotheken wurde das Ribosomen-Display verwendet, da es in der Lage ist, so unterschiedliche Bibliotheksaufbauten anzuzeigen. Kandidaten mit den am stärksten verbesserten Eigenschaften wurden identifiziert und anschließend über eine Pool-Reifungstechnik verfeinert, um weitere Affinitätsgewinne zu erzielen. Dies führte zu einer Reihe von Antikörpern mit hoher Affinität, mit über 50-fachen Verbesserungen der Affinität und Wirksamkeit, die in den endgültigen Ableitungen geschätzt wurden.

Überblick über den Affinitätsreifungsprozess bei der Optimierung eines ARG2-hemmenden Antikörpers.

Das Antikörperkonstrukt im Single-Chain Variable Fragment (scFv)-Format wurde in einem umfassenden Affinitätsreifungsprozess diversifiziert und rekombiniert. Mutationen, die von allen sechs CDRs abgetastet wurden, wurden rekombiniert und auf unverzerrte Weise über Chain-Shuffling und StEP-Rekombination gemischt und unter Verwendung von Ribosomen-Display selektiert. Die am stärksten verbesserten Leads wurden dann gepoolt und durch fehleranfällige PCR diversifiziert, die zufällige Mutationen über die Länge des Konstrukts einführte. Die aus diesen Selektionen resultierenden Antikörper weisen eine hohe Anzahl von Mutationen auf, die über die Länge der Konstrukte und über verschiedene CDRs verstreut sind.

Das Antikörperkonstrukt im Single-Chain Variable Fragment (scFv)-Format wurde in einem umfassenden Affinitätsreifungsprozess diversifiziert und rekombiniert. Mutationen, die von allen sechs CDRs abgetastet wurden, wurden rekombiniert und auf unverzerrte Weise über Chain-Shuffling und StEP-Rekombination gemischt und unter Verwendung von Ribosomen-Display selektiert. Die am stärksten verbesserten Leads wurden dann gepoolt und durch fehleranfällige PCR diversifiziert, die zufällige Mutationen über die Länge des Konstrukts einführte. Die resultierenden Antikörper aus diesen Selektionen weisen eine hohe Anzahl von Mutationen auf, die über die Länge der Konstrukte und über verschiedene CDRs verstreut sind.

Der Sequenz- und Strukturvergleich der parentalen und affinitätsgereiften Antikörper zeigte, dass der Antikörper während des Affinitätsreifungsprozesses einige sehr umfangreiche Veränderungen durchgemacht hat [4]. Erhebliche Mutationen in mehreren Regionen des Antikörpers wurden in eine große Epitopverschiebung übersetzt, die eine Vergrößerung des Grenzflächenbereichs und der Formkomplementarität zum Antigen ermöglichte, während die Schlüsselkontakte eines hydrophoben Spalts erhalten blieben, der für seinen Hemmmechanismus essentiell ist [7]. Im Wesentlichen haben diese Veränderungen es dem Antikörper ermöglicht, sich in eine Position umzuorientieren, die eine überlegene Bindung ermöglicht, ohne den beobachteten Wirkungsmechanismus zu ändern, und schien damit einige anfängliche Einschränkungen des Elternteils überwunden zu haben. Tatsächlich gibt es Hinweise auf eine signifikant negative Kooperativität im Bindungsmodus des Elternantikörpers an trimeres ARG2, die nach der Affinitätsreifung passend aufgelöst wurde. Es war unwahrscheinlich, dass solche Probleme durch kleine oder gezielte Änderungen gelöst werden konnten, weshalb die Standardmethoden möglicherweise unwirksam waren. Im Gegensatz dazu boten die mehrfachen Änderungen, die gleichzeitig auf den Antikörper angewendet wurden, ausreichend Spielraum, um einen größeren Bereich des kombinatorischen Raums zu erkunden, um den Beschränkungen des Elternantikörpers zu entgehen und eine verbesserte Bindungslösung bereitzustellen.

Es ist außergewöhnlich, wie sich eine solche Lösung durch Auswahlen präsentiert hätte, noch hätten wir dies vorhersagen oder entwerfen können. Basierend auf den Strukturdaten hätten wir möglicherweise versucht, die Bindungswechselwirkungen an oder um die Schlüsselkontakte des hydrophoben Spalts zu verbessern, was unproduktiv oder kontraproduktiv gewesen wäre. Tatsächlich legten unsere Ergebnisse nahe, dass Mutationen zu CDRH3 des Antikörpers, die einen großen Teil des hydrophoben Spalts bildeten, nicht toleriert wurden und während der Selektionen der unverzerrten Rekombinationsbibliotheken schnell eliminiert wurden. Es gibt Hinweise darauf, dass geeignete Regionen für die Affinitätsreifung oft nicht an Schlüsselkontakten beteiligt sind, sondern an Positionen liegen, die indirekte Effekte bieten oder neue neue Interaktionen mit seinem Antigen etablieren [13–15]. Darüber hinaus können verbesserte Affinitäten aus mehreren unterschiedlichen Mechanismen resultieren, die oft unvorhersehbar sind [15–17]. In vitro Auswahlmöglichkeiten bieten eine Möglichkeit, die große Anzahl von Bindungsmöglichkeiten zu prüfen, mit dem Potenzial, die beste verfügbare Bindungslösung zu finden, ohne vorherige Annahmen oder Diktate zu erfordern.

Angesichts seiner Nützlichkeit ist es wichtig, dass Anstrengungen unternommen werden, um die am besten geeignete Affinitätsreifungsstrategie für jede gegebene Anwendung zu finden. Abbildung 2 zeigt ein Diagramm, das verschiedene Merkmale und Überlegungen bei der Verwendung verschiedener Technologien hervorhebt. Im Allgemeinen besteht ein Hauptziel der Affinitätsreifung darin, die Sequenzdiversität des ursprünglichen Bibliotheksrepertoires zu maximieren, da dies in eine höhere strukturelle Diversität von welche überlegenen Bindemittel ausgewählt werden können. Allerdings sind wir oft durch die Darstellungskapazität der eingesetzten Technik limitiert. Methoden mit zellulärem Bedarf, wie Phagen- und Hefe-Display, haben aufgrund von Einschränkungen in der Transformationseffizienz eine geringere Displaygröße (typischerweise 10 8 –10 9 ). Es ist nicht möglich, jede Mutation an jeder Position gleichzeitig abzutasten, was eine theoretische Kapazität von 10 78 für ∼ 60 Positionsvarianten über sechs CDRs erfordern würde. Neben dem üblichen Kompromiss, Mutationen auf bestimmte CDRs zu beschränken, gibt es Berichte über alternative Strategien, um dieses Hindernis zu überwinden. Pinne et. al. erkannten, dass Kombinationen von Mutationen aus verschiedenen CDRs in einem frühen Stadium wichtig sind [13]. Um frühe rekombinatorische Veränderungen zu berücksichtigen, verwendeten sie Alanin-Scanning, um die permissiven Stellen für die Mutagenese einzugrenzen, bevor sie Bibliotheken mit eingeschränkten Aminosäurevarianten basierend auf der natürlichen CDR-Diversität erzeugten. In ähnlicher Weise beschränkt die „Look-Through-Mutagenese“-Methode die Anzahl der Aminosäurevarianten auf neun repräsentative Reste basierend auf der Seitenkettenchemie, was die gleichzeitige Mutation von Positionen in bis zu drei CDRs ermöglicht [24]. Basierend auf Analysen des Aminosäureverbrauchs haben Gonzalez-Munoz et al. [25] wählten aus großen Datensätzen von affinitätsgereiften Antikörpern eine Untergruppe von sieben Aminosäurevarianten aus, die typischerweise überpräsentiert waren. Dieser maßgeschneiderte Diversifizierungsansatz ermöglichte es ihnen, mit weniger Bibliotheksaufbauten mehr Positionsbereiche abzudecken, bei vergleichbarer Effektivität wie bei der vollständigen Aminosäurerandomisierung.


Der Antikörper-Rächer und die Suche nach einer COVID-19-Heilung

Der langjährige Mitarbeiter Kyle Dickman ist ehemaliger Redakteur bei Außen. Er ist der Autor von Am brennenden Rand und lebt mit seiner Frau Turin und seinen beiden Kindern in Los Alamos, New Mexico.

Impfstoffe werden immer schneller eingeführt, aber wir brauchen auch wirksame Behandlungen, denn neue Coronavirus-Fälle werden in den kommenden Jahren weltweit Realität sein. Betreten Sie Jacob Glanville, einen eigenwilligen Immunologen aus San Francisco, der glaubt, einen beispiellosen Weg zur Heilung gefunden zu haben.

Seit den frühen Tagen der Pandemie verkündet Jacob Glanville, ein 40-jähriger Skateboard-Immunologe mit einer silbernen Zunge und einem Händchen für Eigenwerbung, dass er die weltweit beste COVID-19-Behandlung entwickeln würde. Nur wenige Konkurrenten glaubten ihm. Die meisten haben nur gespottet. Aber Glanville, damals Chief Executive Officer eines winzigen Unternehmens namens Distributed Bio in San Francisco, hat bedeutende Fortschritte gemacht und erfolgreich einen Antikörper entwickelt, der das Coronavirus in Hamstern neutralisiert, ein Tiermodell für den Menschen. Er liegt weit hinter den Pharmagiganten Regeneron und Eli Lilly, von denen beide im November 2020 die FDA-Zulassung für antikörperbasierte Behandlungen erhielten, aber seine Arbeit ist immer noch wichtig. Mit insgesamt 9 Millionen US-Dollar, die bisher investiert wurden, haben seine Entdeckungen nur einen Bruchteil dessen gekostet, was die großen Firmen für ihre Forschung ausgegeben haben. Er sagt, dass seine Behandlung gut funktionieren und erschwinglicher sein wird - denken Sie, dass die Dosis 900 US-Dollar pro Dosis beträgt, anstatt der 2.000 US-Dollar, die Regeneron verlangt. &bdquoIch habe das beste Therapeutikum&rdquo erhalten&rdquo Glanville sagte mir kürzlich und wiederholte eine Linie, die er seit April 2019 häufig verwendet.

Angesichts der FDA-Zulassung des ersten Impfstoffs am 11. Dezember 2020 fragen Sie sich vielleicht, warum Sie sich für Glanville oder sein Medikament interessieren sollten. Dies liegt daran, dass allein Impfstoffe die Pandemie beenden konnten. Das gilt besonders in den USA, wo so viele Menschen ihre Freiheit, krank zu werden, als Grundrecht ansehen. Die erschreckende Wahrheit ist, dass es derzeit praktisch unmöglich ist, weltweit genug Menschen zu impfen, um COVID-19 zu besiegen. Und so wird das tödliche Virus wahrscheinlich wie bei der Grippe unter uns bleiben und jedes Jahr Ausbrüche verursachen. Sie sollten sich um Glanville kümmern, zusammen mit den vielen anderen Arzneimittelherstellern, die ihre Kreationen immer noch vorantreiben, denn die Chancen stehen gut, dass die bisher besten COVID-19-Behandlungen verfügbar sind. Wenn Glanville Recht hat, könnte er viele Leben auf der ganzen Welt retten.

Der langjährige Mitarbeiter Kyle Dickman ist ehemaliger Redakteur bei Außen. Er ist der Autor von Am brennenden Rand und lebt mit seiner Frau Turin und seinen beiden Kindern in Los Alamos, New Mexico.

Um zu verstehen, wie ein sich erholender Hacker aus Mittelamerika eine COVID-19-Behandlung gestartet hat, ist es am besten, im Januar 2020 zu beginnen, als Glanville sich mit den Ellbogen in eine Konferenz in Arlington, Virginia, drängte, die von Immunologen und Virusjägern überfüllt war, die anfingen, besorgt auszusehen . Auf der Bühne erzählte Dr. Anthony Fauci, der inzwischen berühmte Direktor des Nationalen Instituts für Allergien und Infektionskrankheiten, dem Raum von einem gruseligen neuen Coronavirus, das sich auf die Migration aus Wuhan, China, und Hopscotch rund um den Globus vorbereitet. Dies war der Moment, in dem sich Glanville sein ganzes Leben lang vorbereitet hatte. Er begegnete ihm mit Eifer und Energie. Bevor Fauci zu Ende gesprochen hatte, wusste Glanville, dass er an dem Rennen teilnehmen würde, um eine Behandlung für diese Krankheit zu finden.

Auf seinem Telefon rief er BioRxiv (ausgesprochen &ldquobio archive&rdquo) auf, einen Online-Server, der seit dem Auftauchen des Virus etwa 100.000 COVID-19-Forschungsarbeiten veröffentlicht hat, und er fand zwei frühe Studien, die seine Vermutung bestätigten. Einer stellte fest, dass das Virus, das COVID-19 verursacht, ein enger Verwandter ist, das SARS verursacht, das hochansteckende Coronavirus, das zwischen 2002 und 2003 mehr als 700 Menschen tötete. Das andere waren etwa fünf verschiedene Antikörper, die das SARS-verursachende Virus neutralisierten . Am nächsten Tag nutzte Glanville sein Wissen während eines Treffens mit der DARPA, der hochmodernen Gruppe des Verteidigungsministeriums, die die Erforschung von Infektionskrankheiten finanziert. &bdquoWir haben die Technologie, um diesen alten Antikörper so anzupassen, dass er einen neuen Virus trifft&ldquo sagte Glanville gegenüber DARPA-Beamten in einem schwach beleuchteten Konferenzraum. &bdquoDas kann niemand sonst, und das ist das, was wir jeden Tag tun!&rdquo

Die Leute von DARPA nickten höflich. Später taten dies auch Vertreter des anderen großen Finanzierungsarms für Infektionskrankheiten der Bundesregierung, der Biomedical Advancement Research and Development Authority, die Teil des Gesundheitsministeriums ist. Glanville hat nichts. Antikörper sind nur eine Medikamentenklasse unter vielen, die von Immunsuppressiva über Rekonvaleszenzplasma bis hin zu antiviralen Medikamenten reichen und die Forscher und die Regierung als mögliche Behandlungen für das neuartige Coronavirus untersuchten. Verständlicherweise gingen die Milliarden, die in die schnelle Forschung investiert wurden, an die relativ wenigen riesigen Pharmaunternehmen, die nachweislich kurzfristig wirksame Medikamente produzierten: Johnson und Johnson, Pfizer und Regeneron darunter. &bdquoMein Gefühl war, scheiß drauf“, sagt Glanville über diesen frühen Rückschlag. &bdquoWir sind flink. Wir können uns schneller bewegen als alle anderen. Das Geld würde später kommen.&rdquo

Ich traf Glanville zum ersten Mal 2018, als ich eine Geschichte für berichtete Außen über seine Bemühungen, Antikörper zu verwenden, um ein Gegengift zu entwickeln, das Bisse von vielen verschiedenen Arten von Giftschlangen behandelt. Zurückhaltend für jemanden, der so ehrgeizig und intelligent ist wie er, führte mich Glanville in ein Kava-Restaurant im Mission District von San Francisco. Während wir erdigen Tee aus Holzbechern tranken, erklärte er, wie wichtig Kodierung, Geometrie und Wahrscheinlichkeit bei der Entwicklung eines universellen Grippeimpfstoffs waren, seinem Leidenschaftsprojekt.

Glanville hatte schon damals den Ruf, bei komplexen immunologischen Problemen eigentümliche Ansätze zu verfolgen. (Er bevorzugt &ldquoinnovativ&rdquo als eigenartig, stimmt aber zu, dass es &ldquoscrappy&rdquo ist , einem unterbeschäftigten Lastwagenfahrer aus Milwaukee, der sich seit 20 Jahren absichtlich von den tödlichsten Schlangen der Welt beißen lässt. Glanville war fasziniert von Antikörpern. Nicht danach, woher sie kamen, sondern wie gut sie Krankheiten abwehren konnten.

Glanville wuchs außerhalb eines Maya-Dorfes am Lago de Atitlán in Guatemala auf. Als Kind zeigte er einen nervenaufreibenden Intellekt, kochte Nitroglycerin in der Familienbadewanne und absolvierte mit 11 Jahren alle verfügbaren Mathematikkurse an der High School. Sein Vater betrieb ein Hotel und ein Restaurant, und seine Mutter, eine Künstlerin, war die Tochter des Wissenschaftlers, der die Entwicklung von Boostern leitete, die die ersten NASA-Raketen ins All schickten.

Sie sollten sich um Glanville kümmern, zusammen mit den vielen anderen Arzneimittelherstellern, die ihre Kreationen immer noch vorantreiben, denn die Chancen stehen gut, dass die bisher besten COVID-19-Behandlungen verfügbar sind. Wenn Glanville Recht hat, könnte er viele Leben auf der ganzen Welt retten.

In seinen späten Teenagerjahren, während er Molekular- und Zellbiologie an der University of California in Berkeley studierte, hackte Glanville sich in die Computer von Freunden ein und zog die Arten von Streichen, die man von einem Teenager in einer Studentenverbindung erwartet. Er war ein guter Schüler, aber kein besonders konzentrierter. Während des Sommers zwischen seinem ersten und zweiten Studienjahr wurde Glanville mit einem Messer ausgeraubt, als er einen Vulkan in der Nähe seines Familienhauses bestieg. Der Angreifer schlug ihn mit der Seite einer Machetenklinge zu Boden, was ihm eine tiefe Wunde und ein bleibendes psychisches Trauma zufügte. Er schwänzte das nächste Jahr der Schule und begann, als er nach Berkeley zurückkehrte, mit neuem Fokus zu studieren. Die Immunologie faszinierte ihn und er begann bald, Programme zu schreiben, die im Wesentlichen das Immunsystem hackten. Pfizer stellte ihn 2008 kurz nach dem College ein. Zu diesem Zeitpunkt hatten die jüngsten Fortschritte in der Genwissenschaft die Antikörperforschung zu einer neuen und profitablen Reife gebracht. Glanvilles Job bestand darin, herauszufinden, wie man Antikörper mit Antigenen abgleichen kann, das schicke Wort für alle Bakterien, Viren oder Toxine, die unser Körper durch die Produktion von Antikörpern bekämpft.

Antikörper wurden 1890 entdeckt, und Arzneimittelforscher betrachteten sie lange Zeit als immunologische Wunderwaffe. Um den Vorteil der Zellen gegenüber anderen Medikamenten zu beschreiben, verwendet Glanville regelmäßig eine Analogie. Stellen Sie sich eine Drohne vor, die am Himmel summt, sagt er. Plötzlich taucht ein Falke von oben herab und holt ihn heraus. Die Drohne und der Falke sind beides Maschinen, aber Glanville weist darauf hin, dass &ldquoone radikal besser gebaut wurde als die anderen.&rdquo In diesem Beispiel sind Antikörper die überlegene Maschine: der Falke.

Nach etwa 200 Millionen Jahren Evolution verwenden alle terrestrischen Wirbeltiere und alle Säugetierarten immer noch Antikörper als ihre primäre immunologische Abwehr. Die Herausforderung für die Menschheit bestand darin, herauszufinden, wie man das Geschenk der Natur nutzen und verbessern kann. Seit dem Durchbruch der Arzneimittelentwickler im Jahr 1986, als das erste Medikament mit monoklonalen Antikörpern auf den Markt kam, haben Gesundheitsbehörden 100 oder mehr für die Verwendung in den USA und der Europäischen Union zugelassen. Im Jahr 2015 erwirtschaftete das Antikörper-Engineering einen Jahresumsatz von 125 Milliarden US-Dollar. Sechs Jahre später ist es sicherlich noch viel mehr.

&bdquoDie Wissenschaft baut auf der Tatsache auf, dass das Leben diese sehr eleganten und einfachen Regeln hat, die bestimmen, wie es funktioniert&ldquo, sagt Glanville. &bdquoWir &rsquonutzen, wie erstaunlich rational das Leben ist.&rdquo

Im menschlichen Körper funktionieren Antikörper wie ein persönliches Sicherheitsteam, das niemals schläft. Wenn ein neuartiges Antigen eine Person infiziert, erweckt das Immunsystem seine B-Zellen und die Zellen, die für die Sekretion von Antikörpern verantwortlich sind.

Aber der Körper druckt einfach ein Allheilmittel, wenn doch, werden wir nie krank. Es muss lernen. Dazu stellt das Immunsystem Millionen verschiedener Versionen von Antikörpern her und sieht, was kleben bleibt. Das tun zunächst die wenigsten. Aber wenn ein Antikörper ein Antigen trifft und daran klebt ist gefunden, beginnen die B-Zellen, ihr erfolgreiches Design zu verbessern, indem sie jeweils eine Aminosäure verändern. Die Teile des Antikörpers, die gut funktionieren, behält die Natur. Die Teile, die anziehen, verändert sich die Natur. &bdquoEvolution im Blutkreislauf&rdquo nennt es Glanville. &bdquoUnser Immunsystem ist eine schnelle Evolutionsmaschine. Nur so können wir Krankheitserreger bekämpfen, die sich jede halbe Stunde entwickeln können.&rdquo

Schließlich, wenn das Immunsystem seine Arbeit beendet hat, wimmelt der Blutkreislauf von einer Armee von Antikörpern, die in der Lage sind, mit großer Spezifität die Teile des Antigens zu blockieren, die an unsere Zellen binden und uns krank machen. Erst dann blinkt die Virusinfektion.

Während Glanville noch bei Pfizer war, isolierte er Antikörper von 654 Spendern und sammelte ihre Zellen in einem einzigen Reagenzglas, das mit einer Lösung aus kaltem Glycerin gefüllt war. Letztendlich sammelte er 32 Milliarden verschiedene Antikörper, was seiner Ansicht nach eine grobe Annäherung an die gesamte Palette möglicher Antikörper war, die unser Immunsystem produzieren kann. (Das war eine große Abweichung. Fünfzehn Jahre später enthält Glanvilles Bibliothek 76 Milliarden Antikörper und wird bald mehr als 100 Milliarden enthalten.) Andere hatten zuvor solche &ldquolibraries&rdquo erstellt. Tatsächlich brachte George P. Smith und Gregory P. Winter Mitte der 1980er Jahre eine Entdeckung, die zur Schaffung solcher Antikörper-Repositorien führte, den Nobelpreis für Medizin 2018 ein. Glanville, der Computerfreak, beschleunigte das Scannen dieser Antikörper auf potenzielle Spuren von Medikamenten.

Um ein paar siegreiche Exemplare in Milliarden-Mitglieder-Antikörperbibliotheken zu finden, wird wiederholt eine Konzentration eines Antigens in eine Pipettenmulde &mdasha Glasschale mit Dutzenden von Flüssigkeitsbehältern &mdash, die von Antikörpern wimmelt, getröpfelt und dann diejenigen aufgesammelt, die davon angezogen werden. Diese Technik wird als Panning bezeichnet und ist sowohl sehr effektiv als auch sehr zeitaufwendig. Antikörper haben die Form von Zellgraten und haften oft an zufälligen Zellen oder Teilen des Antigens, die nichts tun, um es tatsächlich zu neutralisieren. Während der ersten Panning-Runden können sich Milliarden von Antikörpern an hohe Konzentrationen eines Antigens anlagern. Aber während das Panning fortschreitet, senken die Forscher die Konzentrationen des hinzugefügten Antigens, während sie die Wells mit erfolgreichen Antikörpern aus der vorherigen Runde füllen. Schließlich, nach vielen Runden des Pannings, bleibt das „gold&rdquo übrig: einige tausend Antikörper, von denen jeder eine fast magnetische Anziehungskraft auf das Antigen besitzt, was darauf hindeutet, dass die Antikörper kennt etwas über die Eindringlinge. Diese Antikörper haben die besten Chancen, als Medikamente nützlich zu sein.

Glanville beschleunigte den Schwenkprozess mit Mathematik. Alle möglichen Variationen von Antikörpern existieren in einem Spektrum. Jede Zelle ist einzigartig, aber sie unterscheidet sich auch nur geringfügig von ihren Nachbarn. Durch das Schreiben eines Algorithmus, der die Form des wahrscheinlich nützlichsten Antikörpers identifizierte, verkleinerte Glanville den Suchpool. Math sagt, dass unser Gewinner-Antikörper wahrscheinlich eine von hundert Millionen Variationen zwischen Antikörper X und Antikörper Y ist, ging die Begründung. Da schauen wir zuerst.

Dank der Arbeit von Glanville und anderen wurde der Suchprozess innerhalb von 20 Jahren nach dem Aufkommen von Antikörperbibliotheken viel schneller und etwas, das ein Jahr dauern konnte, konnte jetzt in einer Woche erledigt werden. Diese Veränderungen fielen mit dem Beginn der genetischen Revolution zusammen, und die Forscher von Antikörper-Medikamenten begannen, sich auch Fähigkeiten und Techniken aus diesem Bereich auszuleihen. Heute besteht das Rennen nicht nur darin, die beste Version eines Antikörpers der Natur zu finden. Es geht auch darum, wer sie genetisch so verändern kann, dass sie besser funktionieren.

Nach der Isolierung eines vielversprechenden Antikörpers beginnen Arzneimittelforscher mit der Feinabstimmung ihres Produkts, indem sie viele leicht optimierte Versionen züchten. Zum einen könnten sie einen Teil eines Antikörpers abschneiden, von dem angenommen wird, dass er eine immunologische Reaktion auslöst. Auf der anderen Seite könnten sie Mutationen hinzufügen, die die Verfolgung des Antikörpers erleichtern, ihm eine längere Halbwertszeit im Immunsystem verleihen oder ihn in einer Spritze anstelle einer Infusion liefern lassen. Jeder entwickelte Antikörper wird in Petrischalen getestet. Die Antikörper mit der besten Leistung gehen in lebende Tiere. Wenn sie diese Hürde nehmen, bekommen Kranke die Behandlungen. Und sollte eine dieser unvollkommenen Mischungen aus Natur und genetischer Versorgung bei tatsächlichen Patienten nur leichte oder akzeptable Nebenwirkungen verursachen, während sie ihre Aufgabe im Körper erfüllen, erteilt die FDA eine Zulassung für die Verwendung. Das Scheitern kann jederzeit passieren: Trotz aller Vorteile von Gentechnik-Full-Service-Läden wie Glanville bleiben die Erfolgsaussichten von Arzneimittelforschern nadelfein im Heuhaufen. Nur eines von 5.000 verschreibungspflichtigen Medikamenten in der Entwicklung kommt tatsächlich auf den Markt. Bei Antikörper-Medikamenten liegt es näher bei 2 Prozent der Konkurrenten.

Wie jeder auf diesem Gebiet war Glanville zuversichtlich, dass er die Chancen schlagen konnte, und die Grippearbeit wurde zu seinem Lebensinhalt. &bdquoIch war überzeugt, dass eine postpathogene Existenz möglich ist“ sagt er. &bdquoWir müssen nicht mehr mit Infektionskrankheiten leben.&rdquo

Nicht lange nach dem Aufbau einer Antikörperbibliothek für Pfizer übernahm Glanville seine Algorithmen und Antikörperbibliothekskonzepte und gründete Distributed Bio. Anfangs machte das Unternehmen nur Auftragsjobs, bei denen große Firmen Glanville ein Drogenziel gaben und ihn die Antikörper finden ließen, die darauf trafen. Das Ziel war jedoch immer, Distributed Bio als Sprungbrett für den Aufbau eines therapeutischen Arzneimittelunternehmens zu nutzen. Im klassischen Silicon Valley-Stil stellte er sich ein profitables Unternehmen mit einer Art Robin-Hood-Ethik vor: Sein Betrieb würde von den Reichen entwickelte Technologien nutzen, um Medikamente für die Armen erschwinglich zu machen. Sein Unternehmen würde den Gewinn priorisieren, aber stattdessen vernachlässigte Krankheiten und Krankheiten wie Schlangenbisse behandeln und eine riesige Menge an Heilmitteln gegen Krankheiten wie Grippe und COVID-19 für alle verfügbar machen. &bdquoTreuhandverpflichtungen stehen im Widerspruch zur Lösung globaler Krisen&rdquo, sagt Glanville. &ldquoGesundheitsfürsorge ist ein Menschenrecht.&rdquo

Stellen Sie sich eine Drohne vor, die am Himmel summt, sagt er. Plötzlich taucht ein Falke von oben herab und holt ihn heraus. Die Drohne und der Falke sind beides Maschinen, aber Glanville weist darauf hin, dass &ldquoone radikal besser gebaut wurde als die anderen.&rdquo In diesem Beispiel sind Antikörper die überlegene Maschine: der Falke.

In den ersten sechs Jahren stärkte Glanville die Vermögenswerte und das technologische Know-how von Distributed Bio, indem er sich auf lukrative Auftragsarbeit konzentrierte und an Projekten mit sieben der zehn führenden Pharmaunternehmen zusammenarbeitete. Sie geben ihm ein Antigen oder ein zelluläres Ziel. Er findet einen Antikörper, der ihn trifft. Die großen Unternehmen würden diesen Antikörper dann zu einem Medikament entwickeln oder für eine Handvoll anderer gesundheitsbezogener Forschungszwecke verwenden, für die Designerzellen verwendet werden können. Die Gewinne, die Glanville erwirtschaftet hat, wurden in neue Technologien gesteckt, die Distributed Bio zu einem Unternehmen mit einem Wert von über 100 Millionen US-Dollar machten. Inzwischen hat Glanville seinen Ph.D. aus Stanford und war bemerkenswert produktiv. Er schrieb weiterhin wissenschaftliche Arbeiten und platzierte mehr als 30 in führenden wissenschaftlichen Zeitschriften wie Natur, während gleichzeitig Patentanmeldungen für neun neue Technologien im Zusammenhang mit der Entdeckung von Antikörpern eingereicht und wettbewerbsfähige Zuschüsse von der Gates Foundation und den National Institutes of Health gewonnen wurden. Dabei arbeitete er bewusst daran, sich als Arzneimittelentwickler neu zu positionieren. Ein Teil dieser Bemühungen war das Branding: Glanville wurde in mehreren nationalen Publikationen und in einer Netflix-Serie vom Januar 2020 vorgestellt. Pandemie: Wie man einen Ausbruch verhindert, die &ldquot;die Helden an vorderster Front&rdquo porträtierte, um die nächste globale Epidemie zu stoppen. Der Dokumentarfilm, der Glanvilles Konzept einer post-pathogenen Existenz erläuterte, wurde während der Woche der BioThreats-Konferenz in Virginia uraufgeführt.

Was Glanville jedoch war, war ein Arzneimittelentwickler. &bdquoEr&rsquo ist sehr, sehr gut in dem, was er tut. Er stellt das Rohmaterial her, das der erste Schritt zur Herstellung eines Antikörper-Medikaments ist“, sagt ein Wissenschaftler, mit dem ich gesprochen habe und der anonym bleiben möchte. &bdquoWas er noch nicht getan hat, ist die Herstellung von Antikörper-Medikamenten. Er weiß immer noch, was er weiß.&rdquo Dieser Arzneimittelentwickler, der nachweislich Produkte auf den Markt gebracht hat, sagt Glanvilles Erwartung, mit einem einzigen Moon-Shot-Pharmakon an die Spitze der Pharmaindustrie aufsteigen zu können, ist naiv, wie ein Weltklasse-Sprinter, der erwartet, seinen ersten Marathon zu gewinnen. &bdquoWürden Sie wetten, dass sie konkurrenzfähig sein könnten?&rdquo, sagt sie.

Als die Suche nach einer COVID-19-Behandlung begann, verfolgte Glanville seine Vision mit einem charakteristisch beharrlichen Ansatz. &bdquoJake rief einfach immer wieder an&rdquo, erinnert sich Jack Wang, der führende Virenentwickler von Distributed Bio. &ldquoSchließlich antwortete ich und er begann mich mit all diesen interessanten Ideen zu bombardieren.&ldquo

Es war der Nachmittag des 30. Januar 2020, und Wang, der seinen Doktor in Immunologie und Biophysik abgebrochen hat.in Yale und wurde von Glanville eingestellt, war erst seit drei Monaten bei Distributed Bio. Glanville kontaktierte ihn sofort nach seinem erfolglosen Treffen mit der DARPA. &bdquoEr wollte, dass ich die SARS-Antikörper umgestalte, um COVID zu treffen&rdquo, erinnert sich Wang. &bdquoJa, es war ein wenig überwältigend.&rdquo

Bis Ende Januar beschränkte sich der Ausbruch hauptsächlich auf Asien, mit nur wenigen bestätigten Fällen in Europa und weniger als zehn in den USA war noch in Panik. Angesichts dessen, was vor ihm lag, war der 26-jährige Wang offen skeptisch, dass eine winzige Firma in der Lage sein würde, einen Antikörper zur Bekämpfung eines aufkommenden Pandemievirus zu entwickeln. &bdquoIch &bleibe im Allgemeinen pessimistisch&ldquo, sagt er, &ldquoaber das schien für viel größere Unternehmen Arbeit zu sein.&rdquo

Er stürzte sich trotzdem hinein. Bald überprüfte Wang die Baupläne von fünf Antikörpern, die andere Forschungsgruppen als einen „potentiellen therapeutischen Wert&rdquo gegen Coronaviren identifiziert hatten. Zwei wurden aus Serum gewonnen, das von Patienten gespendet wurde, die sich 2002 mit SARS infiziert hatten und überlebten. Ein dritter stammte von einer SARS-infizierten Ratte. Ein vierter war ein Antikörper aus dem Jahr 2007, den ein chinesisches Team im Januar gefunden hatte, der schwach traf und das so genannte SARS-CoV-2&ndashbetter, das heute als COVID-19-Erreger bekannt ist, nicht neutralisierte. Schließlich bereitete Glanville seine 76-Milliarden-Antikörper-Sammlung vor, um nach einem gesucht zu werden, der an CoV-2 andocken würde. Keiner dieser Antikörper funktionierte sehr gut. Aber der Blick auf die gemeinsamen Regionen, in denen die Antikörper das Virus trafen, half als Karte für die Entwicklung von Glanvilles neuer Kreation.

Um zu beginnen, wandten sich Wang und Glanville an ein Computerprogramm, das die Aminosäuresequenzen in den Viren und Antikörpern als kristalline Strukturformen darstellte, um zu modellieren, wie die Proteine ​​im wirklichen Leben aussehen. Individuell ist jede Aminosäure ein winzig kleiner Streifen aus verbundenen Molekülen, die gebogen, geknickt oder geschleift sind. Auf einem Bildschirm zusammengequetscht, sahen die Ansammlungen, aus denen das Virus und die Antikörper gebildet wurden, aus wie „Bad-Hair-Days“: pastellfarbene Aminosäuren, die aus einem klar definierten Zellkern herausragten.

Die Männer wollten auf dem Bildschirm sehen, wie die Antikörper an das Virus andocken. Wenn sie das sehen könnten, könnten sie vielleicht den Ansatz der Natur beim Design von Coronavirus-neutralisierenden Antikörpern verstehen. Und vielleicht würde ein Bild der Antikörper- und Virusbindung Hinweise darauf geben, wie sie die Aminosäuren mischen könnten, um ihr eigenes Design zu verbessern.

Nach ein paar Minuten digitaler Rotation der verschiedenen Formen zeigte sich ein Muster: Die Antikörper trafen alle das Virus auf derselben Spitze der Coronavirus-Kronen. (Corona bedeutet „Krone.&rdquo) Es machte evolutionär Sinn. Die SARS- und COVID-19-verursachenden Viren haben beide Zellschlösser des Menschen an derselben Stelle und auf fast dieselbe Weise geknackt. Dieser kleine Zellknoten war der Schlüssel für die Viren. Jetzt mussten sie einen Antikörper entwickeln, um ihn zu blockieren.

Wir sind viel Glück und einem Team von schnell denkenden Experten für öffentliche Gesundheit zu Dank verpflichtet, den SARS-Ausbruch 2003 in Toronto gestoppt zu haben, wo die Epidemie endete, bevor sie wie COVID-19 ausbrach. SARS, eine hochansteckende Atemwegserkrankung, erkrankte weltweit 8.098 Menschen und tötete etwa 800.

Sobald das Virus jedoch unter den Menschen verpuffte, verschwand es oder wurde weniger gefährlich. Es zog sich einfach zurück in die Reservoir-Art, aus der es gekommen war, oder auf eine andere Art vollständig. Fledermäuse tragen sicherlich auch das Virus Palmenzibetkatzen oder Schuppentiere. In den warmen Körpern infektiöser Wirte hat sich der Organismus ständig weiterentwickelt. Es war nur eine Frage der Zeit, bis eine neue Bedrohung wie CoV-2 bekannt wurde.

Genetische Beweise deuten darauf hin, dass CoV-2 ausgebrochen ist, nachdem das Virus, das SARS verursacht hat, sich mit einem Mitglied der Coronavirus-Familie getroffen hat. Wahrscheinlich tauschten die beiden Viren ihre Gene aus, während sie im warmen Körper eines tierischen Wirts trieben. In wissenschaftlicher Hinsicht haben sie wahrscheinlich &ldquorekombiniert&rdquo ein Protein gegen ein anderes ausgetauscht und eine neue und fremde Nachkommenschaft geschaffen, ein Vorgang, der passieren kann, wenn sich Viren derselben Familie im selben Wirt treffen. Evolution ist keine Einbahnstraße, und Rekombination führt meistens zu Viren, die weniger fit. Das ist diesmal passiert. Stattdessen produzierte CoV Generationen von rekombinierten Viren später einen Nachkommen, der nahezu perfekt mit dem Menschen übereinstimmte.

Genetisch sind die Viren, die SARS und COVID-19 verursachen, zu 80 Prozent identisch, und der COVID-Bug war erfolgreich, wo der SARS-Bug aufgrund einer noch unbekannten Untergruppe genetischer Mutationen versagte. Die meisten von uns kennen mittlerweile die bunten, pelzig aussehenden mikroskopischen Bilder von CoV-2. Stellen Sie sich die blumigen roten Dinger vor, die das Virus schmücken, und zoomen Sie dann heran. Jeder Spike ist eigentlich eine Ansammlung elegant angeordneter Proteine, die wie eine Krone aussehen. Und jede Spitze auf dieser Krone ist der Schlüssel, mit dem das Virus ein ganz bestimmtes Schloss für ganz bestimmte menschliche und tierische Zellen öffnet. Die Mutationen, die die weltweite Verbreitung von COVID-19 antreiben, sind dort aufgetreten.

Ein typischer menschlicher Körper enthält etwa 37,2 Billionen Zellen. Durch einen Prozess, der wie ein biologisches Spiel von Tetris, Nahrung wird verdaut, Finger tippen und Augen kreuzen sich, wenn zwei oder mehr dieser kompliziert geformten Moleküle ihre perfekte Übereinstimmung treffen und eine Kaskade zellulärer Reaktionen auslösen. Die Stellen, an denen sich Zellen verbinden, werden Rezeptoren genannt, und die extreme Spezifität von Rezeptoren ist das Tor, das reguliert, welche Proteine ​​hineinkommen und welche nicht.

Nur eines von 5.000 verschreibungspflichtigen Medikamenten in der Entwicklung kommt tatsächlich auf den Markt. Bei Antikörper-Medikamenten liegt es näher bei 2 Prozent der Konkurrenten.

Rezeptoren bringen (und beenden) Leben, indem sie das Zelluniversum ordnen. Viren sabotieren unsere fein abgestimmte molekulare Maschinerie, indem sie die Proteine, aus denen sie bestehen, in Formen verdrehen, die perfekt zu unseren Rezeptoren passen, und dann die Zelle entführen und sie anweisen, weitere Kopien des Virus zu erstellen. Nach etwa drei bis vier Milliarden Jahren auf der Erde sind Viren so erfolgreich geworden, dass sie alle anderen Lebensformen zusammengenommen übertreffen. Aus gutem Grund werden sie als die erfolgreichsten Bewohner der Biosphäre bezeichnet.

Das Virus, das COVID-19 verursacht, kann sich besser verbinden als die meisten anderen. Wenn Viren mit dem richtigen zellulären Rezeptor ineinandergreifen, verbreiten sich die meisten, indem sie die Zellmaschinerie entführen und innerhalb weniger Stunden 1.000 bis 10.000 Kopien ihrer selbst drucken – manchmal sogar 100.000.

Wie das Virus, das SARS verursacht, verbreitet sich CoV-2 am leichtesten, wenn es Zellen trifft, die mit einem Rezeptor namens ACE-2 ausgestattet sind. Diese Zellen sind überall im Körper zu finden. Nach dem SARS-Ausbruch im Jahr 2002 begannen die Forscher, nach Kolonien von Zellen zu suchen, die reich an ACE-2-Rezeptoren waren, und fanden sie in den Blutgefäßen, dem unteren Darm, den Nieren und dem Herzen.

Die Tatsache, dass das Virus Zellen im ganzen Körper trifft, erklärt die Vielfalt der Symptome, die es verursacht, einschließlich Erbrechen, Durchfall und Nieren- oder Herzversagen. Es kann auch einige der anderen Symptome erklären, die dieses seltsame Virus so mysteriös machen. Der Verlust des Geruchssinns oder andere neurologische Symptome, die weithin dokumentiert sind, Halluzinationen oder Delirium, zum Beispiel, legen nahe, dass das Virus über einen nicht identifizierten Hintertürrezeptor im Gehirn auftreffen und sich im Gehirn vermehren könnte. Es ist auch bemerkenswert, dass Viren die meisten Symptome direkt verursachen. Unsere Immunantwort erzeugt Symptome, um Infektionen loszuwerden, was erklärt, warum Medikamente wie Steroide, die die Immunantwort verstärken oder unterdrücken, so häufig zur Behandlung von Virusinfektionen eingesetzt werden.

Das Virus CoV-2 verdankt seinen Erfolg einigen Tricks. Einer ist, dass das Virus jeden krank macht. Es kann von asymptomatischen Patienten übertragen werden und könnte sogar ein "negatives serielles Fenster" haben, was bedeutet, dass neu infizierte Personen Symptome vor der Person zeigen können, die ihnen die Krankheit gegeben hat. Auch wichtig: Die kritische Fundgrube an ACE-2-ausgestatteten Zellen, die es so gerne mag, findet man in den oberen Atemwegen &ndash im Kehlkopf, im Rachen, in der Nasenhöhle &mdassund in der Lunge. Dort befinden sich die Rezeptoren auf Zellen, die Surfactant bilden, einen rutschigen Film, der für die Atmung entscheidend ist.

Als CoV-2 zum ersten Mal irgendwo im ländlichen China eine Person infizierte, war der neue Fehler viel klebriger am ACE-2-Rezeptor. Für das Virus ist es schwer, sich einen besseren evolutionären Schritt vorzustellen. Für einen Menschen ist es schwer vorstellbar, dass es schlimmer sein könnte. Husten, und das Virus schwebt an einem Fallschirm aus aerosolisiertem Speichel aus dem Körper, wo es drei Stunden lang schweben und möglicherweise infektiös bleiben kann. Einatmen, und das Virus landet zwischen fruchtbaren Zellen.

Mitte März hatte COVID-19 San Francisco gesperrt. Zwei Tage später erhielt Glanville von der Stadt die Erlaubnis für sein Team, weiterhin in ihren Laboren zusammenzuarbeiten. Distributed Bio hat alle anderen Projekte mit Ausnahme der Suche nach einer COVID-19-Behandlung gestoppt.

Eines Morgens, nicht lange danach, fuhr Wang zum Büro über die Bay Bridge, das unheimlich leer war. Zu diesem Zeitpunkt hatten er und Shahrad Daraeikia, ein Antikörper-Ingenieur, der auch dem COVID-Projekt zugeteilt war, einen Monat lang 12-Stunden-Tage gearbeitet. Die Herstellung des Antikörpers erforderte es, drei Komponenten festzunageln: den Teil des Virus, der an die Zelle bindet, den Teil der Zelle, an den das Virus bindet, und die Antikörper selbst. Wang und sein Team lieferten nach mehreren Wochen die ersten beiden Stücke. Es dauerte etwas länger, bis Daraeikia die Antikörper hergestellt hatte.

Antikörper sind Y-förmig und heften sich wie Lego-Teile über Stifte an ihren Spitzen an ein Antigen. Jeder Arm des Y hat drei Zapfenpaare, für insgesamt 12 Zapfen pro Antikörper-&mdashan-Array, die kollektiv als komplementäre Bindungsregion (CBR) bezeichnet werden. Sobald das Immunsystem die beste Antikörperklasse aus den fünf identifiziert hat, die unser Körper herstellt, beginnt es, die Stifte zu optimieren, indem es die Aminosäuren an ihren Spitzen mischt. Im Shop konzentrierten sich Glanville und Daraeikia auf CBRs. Es gibt, wie Glanville erklärte, „zu den 84 verschiedenen möglichen Kombinationen&rdquo von ihnen&ndash, die„eine Eins mit 84 Nullen dahinter sind &ldquor, die ungefähr der Anzahl der bekannten Atome im Universum entspricht.&rdquo

&bdquoDer Trick bestand darin, den mathematischen Sweet Spot zu treffen&ldquo, sagt Glanville. Wie bei Pfizer nutzte er Mathematik, um die Zahl der vielversprechenden Antikörper auf überschaubare 12 Milliarden zu reduzieren. Dieses Mal konzentrierte er sich auf Antikörperkombinationen, die in der Natur vorkommen, und auf solche, die den ursprünglichen fünf SARS-neutralisierenden Antikörpern am ähnlichsten waren. &ldquoWir wollten alle Variationen untersuchen, die in endlichen Räumen existieren können.&rdquo

Nachdem sie diesen Raum definiert hatten, war es Daraeikias Aufgabe, ihn mit möglichen Antikörpern zu füllen. Obwohl die Arzneimittelentwicklung eine Mischung aus biologischen Werkzeugen und Supercomputern verwendet, verwendete Daraeikia Microsoft Excel.

&bdquoJa, irgendwie elend&ldquo, sagt er. Aber in diesem einen schmerzhaften Fall, in dem Geschwindigkeit im Vordergrund stand, war Excel zufällig schneller, als wenn der Coder von Distributed Bios ein neues Programm schreiben würde. In jede Zeile einer Kalkulationstabelle schrieb Daraeikia aus 6 bis 14 Buchstaben bestehende Aminosäuresequenzen, die jede CBR an jeder Spitze der Antikörperkandidaten definieren. Dann änderte er Buchstabe für Buchstabe manuell eine Aminosäure in jeder Sequenz, die 30 Stunden dauerte. &bdquoWenn es ein Ja an der ersten Position des ersten Antikörpers ändere ich ihn in an F,&rdquo, sagt er. &ldquoGehen Sie zum nächsten und machen Sie dasselbe. Dann gehe ich durch und ändere jeweils zwei Buchstaben. Es brennt ein Loch durch deine Augen.&rdquo

Nachdem sie die genetischen Codes für Hunderte von möglichen CBR-Kombinationen von Hand geschrieben hatte, bestellte Daraeikia 400 DNA-Schnipsel bei Integrated DNA Technologies, einem Life-Science-Unternehmen in Coralville, Iowa, und lud sie in ein Programm namens Tumblr. Anschließend infundierten sie Hunderte Millionen zusätzlicher Antikörper von mehr als 100 gesunden menschlichen Spendern, um so viele mögliche Kombinationen von CBRs wie möglich zu berücksichtigen. Das Tumblr-Gerät knackte den Antigen-Code, indem es DNA-Kombinationen mischte, die schnell alle Kombinationen von CBRs erforschten, die zu seinen Schlössern passen. Mit den Anweisungen der Tabellenkalkulation von Daraeikia wuchs die Tumblr-Maschine 12 Milliarden verschiedene Antikörper. Irgendwo in einem der Hunderte von Pipettenschächten, die sie mit manipulierten Antikörperteilen gefüllt hatten, befand sich eine Sequenz, die eine Krankheit heilen konnte, die auf dem Weg war, 2,54 Millionen Menschen zu töten, Tendenz steigend.

Daraeikia, Wang und ihre Kollegen beendeten die letzten Tests am 30. März. An diesem Morgen zog Wang einen Laborkittel und eine N95-Maske an und züchtete jeden einzelnen Antikörper, indem er die DNA auf winzige Bakteriophagen-Flecken tröpfelte, einen Organismus, der wie der 3D-Drucker der Natur , schafft die physische Manifestation der DNA-Anweisungen. Dann magnetisierte er die Teile des Virus, die an den ACE-2-Rezeptor gebunden waren, und zog sie durch die Antikörpersuppe. Indem er einen Magneten über die Petrischale baumeln ließ, trennte Wang die Antikörper, die das Virus angriffen, von den Antikörpern, die den Panning-Prozess durchführten. Dabei isolierte er immer wieder mit immer kleineren Mengen von Teilen des CoV-2-Spikes die Antikörper, die mit der höchsten Affinität an das Virus banden.

Während dieser Arbeit war Glanville bei seiner zehn Monate alten Tochter zu Hause. Irgendwann gegen 15 Uhr begann sein Handy zu vibrieren. Wang und Daraeikia schickten ihm eine Flut von Texten.

&bdquoEs war so etwas wie ein Schiff, das in die Dunkelheit segelte&ldquo erinnert sich Glanville. &bdquoDas war der Moment, als wir das Ufer sahen. Wir waren wie, OK, wir ficken dort. Wir haben ein Medikament.&rdquo

Kurz darauf schlug ihm die kalte Realität der Medikamentenentwicklung ins Gesicht. Er brauchte etwa 30 Millionen Dollar, um genügend Antikörper herzustellen, um klinische Studien zu bestehen, und dann weitere 86 Millionen Dollar, um die Studien selbst zu bezahlen. &bdquoIch fing an, alle Regierungsebenen wegen der Finanzierung zu belästigen&ldquo, sagt er. Er bekam weniger als 1 Prozent von dem, was er brauchte, also appellierte er an die Öffentlichkeit und startete eine Kickstarter-Seite, die etwa 200.000 US-Dollar einbrachte. Als klarer wurde, dass seine Konkurrenten ihn überholten, wurde Glanville von der Redaktion von eingeladen Natur Biotechnologie sich einem Gremium von Koryphäen anzuschließen, das die Herausforderungen diskutiert, denen monoklonale Antikörper bei der Eindämmung der Pandemie gegenüberstehen. Er tippte auf die Hand, dass er dachte, dass die Antikörper seiner Konkurrenten, die bald zugelassen werden sollen, im klinischen Umfeld versagen könnten, weil sie eine Immunreaktion auslösten, was genau das war, was sie taten. Er argumentierte auch für seine Arbeit und erklärte, wie er sein Medikament so konzipiert hat, dass es für das Immunsystem schwerer zu erkennen ist. Inzwischen machte er im Fernsehen die Runde. Fox Business hat eine Geschichte über Glanvilles potenzielle Heilung gemacht. MSNBC folgte. Dann Yahoo. CNBC. Guten Morgen Amerika. Dr. Phil. Eine Nachrichtensendung in der Türkei. In Australien, Indien, Neuseeland. In jedem Interview wiederholte Glanville die gleiche Zeile: Bis September 2020 würde seine Heilung bei den Patienten ankommen. Offensichtlich ist das nicht passiert.

Um sich daran zu erinnern, dass eilige Arbeit Konsequenzen haben kann, hängt die anonyme Virologin, die ich interviewt habe, ein Zitat von Richard Feynman, dem Nobelpreisträger und Physiker, an ihrer Bürowand. Als Lektion in der Medikamentenentwicklung erzählt sie oft die Geschichte von Feynmans verheerenden Schlussfolgerungen über die Explosion des Space Shuttles im Jahr 1986 Herausforderer. Es wurde während einer Untersuchung zur Katastrophe eingestellt. Während einer berühmten Befragung über die gefährliche Kluft zwischen der Vorsicht der NASA-Ingenieure und dem Ehrgeiz des Managements der Agentur nahm Feynman einen O-Ring heraus, den die Ingenieure vor dem Start als ein Teil identifiziert hatten, das insbesondere bei Minusgraden katastrophal versagen könnte. Er ließ es in Eiswasser fallen und das Teil versagte. &bdquoFür eine erfolgreiche Technologie muss die Realität über der Öffentlichkeitsarbeit stattfinden“, sagte Feynman. &ldquoDenn Mutter Natur kann&rsquot getäuscht werden.&rdquo

&bdquoDaten sind König&rdquo, sagt der Virologe und wiederholt damit Feynman. &bdquoIn meinem Bereich wird ein Medikament entweder wirken oder&rsquo nicht.&rdquo

Grundsätzlich ist sie der Meinung, dass Glanville, der noch keine Ergebnisse seiner Coronavirus-Forschung in einer großen wissenschaftlichen Publikation veröffentlicht hat, die Bedeutung der Entdeckung von Antikörpern, die CoV-2 in einem Gericht oder einem Hamster neutralisieren können, überbewertet hat, obwohl ihm dies gelungen ist beide. In Experimenten mit Hamstern reduzierten die Antikörper von Glanville die Viruslast bei Nagern, die das Medikament zur Behandlung erhielten, um 97 Prozent und sogar noch mehr, wenn sie prophylaktisch verabreicht wurden. Der Virologe sagt, dass dies ein guter Anfang ist, aber es zeigt immer noch die Fähigkeit, das Virus bei Menschen zu neutralisieren verabreicht werden sollte, ob sich der Antikörper tatsächlich in die Körperteile verteilt, die das Virus beherbergen, und ob das Medikament überhaupt hergestellt werden kann.

&bdquoDas ist das Problem mit der Biologie&rdquo, sagt der Virologe. &bdquoEs wird immer komplizierter, je tiefer man in die Medikamentenentwicklung vordringt.&rdquo Zwischen der Entdeckung eines Antikörpers, sogar eines potenten, und der Entwicklung eines tatsächlichen Medikaments gibt es eine Reihe von Herstellungs- und Sicherheitshürden, die aufgrund des Fachwissens und Geld, das benötigt wird, um sie zu navigieren, sind riesige Pharmaunternehmen besser gerüstet, um sie zu löschen. Obwohl Glanvilles Team Forscher mit Erfahrung darin umfasst, Antikörper von der Entdeckung bis zum Markt zu führen, muss er die Bürokratie der Arzneimittelzulassung im Handumdrehen lernen. Sein öffentlicher Optimismus, argumentiert der Virologe, könnte für Branchenfremde gefährlich und sogar grausam irreführend sein.

Glanville gehört jetzt zu einem überfüllten Feld von Forschern, die versuchen, die Wirksamkeit von Antikörpern gegen COVID-19 zu verbessern. Bis Ende 2020 gab es mindestens 21 weitere monoklonale Antikörper in irgendeiner Form von klinischen Studien, darunter fünf, die in Phase drei an die Tür der FDA-Zulassung klopften. Und nachdem Glanville den gemischten Erfolg des führenden Antikörper-Medikamentenherstellers gesehen hatte, beschloss er, nicht mehr zu versuchen, den Spitzenreitern nachzueifern. Regeneron, das Multimilliarden-Dollar-Unternehmen, dessen antikörperbasiertes Medikament Ende November von der FDA für den Notfall zugelassen wurde, hat alle richtigen Schritte unternommen, aber sein Medikament ist weit von der wirksamen Heilung entfernt, die es sich erhofft hatte. Bevor die FDA ihre endgültige Zulassung erteilte, deuteten erste Ergebnisse darauf hin, dass es sehr erfolgreich sein könnte. Aus diesem Grund gaben die Ärzte Präsident Trump eine experimentelle Version davon, der behauptete, dass es ihn geheilt habe, obwohl es keinen wissenschaftlichen Weg gibt, dies zu wissen, da er mehrere Behandlungen gleichzeitig erhielt.

Was hat deutlich wird, dass Regenerons Cocktail, wie Eli Lillys Medikament Bamlanivimab, nur gegen mildere Fälle von COVID-19 gut wirkt.Diese Medikamente werden von Krankenhäusern häufig verwendet, da selbst massive Dosen der intravenös verabreichten Antikörper wenig zu ihrer Wiederbelebung beitragen, wenn Menschen schwer erkranken. Antikörper zielen nur auf das Virus ab, und sobald eine Infektion etabliert ist, gibt es einfach zu viel Virus, als dass die verabreichten Antikörper sie kontrollieren könnten, und sie können nichts tun, um die Symptome zu unterdrücken, die letztendlich zum Tod führen. Diese Tatsache sowie Probleme im Zusammenhang mit Lagerung und Kosten erklären, warum viele in der Branche ihre Hoffnungen, COVID-19 zu zähmen, nicht mehr auf Antikörper setzen.

Dass Glanvilles Konkurrenten große Erfolge erzielt haben, mag für ihn ein guter Grund sein, sein Projekt aufzugeben. So auch, dass sich bis Mitte des Winters keine Agenturen oder privaten Investoren gemeldet hatten, um seine Bemühungen zu finanzieren, obwohl fast ein ganzes Jahr lang anhaltende, erschöpfende und letztendlich deflationäre Lobbyarbeit betrieben wurde. Glanville schätzte, dass er sich Anfang März mit fast einem Dutzend Regierungsbehörden traf, die die COVID-Forschung finanzierten, von der Armee und der Marine bis hin zur Operation Warp Speed. Die Gates Foundation lehnte ihn ab. So auch eine Handvoll anderer Stiftungen, die viel Geld verdienen. Er sammelte nur 9 Millionen Dollar, kaum genug, um seine Antikörper durch Tierversuche zu bekommen. Die Herausforderung scheint seine Entschlossenheit nur gefestigt zu haben. Die Realität, sagt er, treibe ihn voran. &bdquoSehr selten in der Geschichte der Krankheitserreger haben wir weltweit genug Menschen geimpft, um sie zu eliminieren“ sagt er (Pocken sind das einzige Beispiel). &ldquoCOVID wird bleiben.&rdquo

Als CoV-2 zum ersten Mal irgendwo im ländlichen China eine Person infizierte, war der neue Fehler viel klebriger am ACE-2-Rezeptor. Für das Virus ist es schwer, sich einen besseren evolutionären Schritt vorzustellen. Für einen Menschen ist es schwer vorstellbar, dass es schlimmer sein könnte.

Glanville behauptet, sein Antikörper sei eine Antwort. Sein Verkaufsargument ist so überzeugend wie eh und je: ein Antikörper, der stark genug ist, dass die Dosen kleiner sein können und in einer Spritze verabreicht werden können, anstatt eine IV, die so konstruiert ist, dass sie weniger Nebenwirkungen bei der Reaktion des Immunsystems verursacht als die seiner Konkurrenten und weil er auf a Teil des Virus, der sich verändert hat, obwohl die menschliche Pandemie in Brasilien, Südafrika und England neue Virusmutationen hervorgebracht hat, die gegen neue Varianten wirksam sind. Getreu seinem Robin-Hood-Stil möchte Glanville auch, dass seine Droge weit verbreitet und relativ günstig ist. Er hat eine Art Walmart-Vertriebsmethode für sein Medikament entwickelt, ein Modell, bei dem die Massenproduktion den Preis niedrig hält. Anstelle von 2.000 US-Dollar pro Dosis werden es 800 US-Dollar, vielleicht 900 US-Dollar sein, aber sicherlich "weniger als die Kosten für ein iPhone", sagt er. (Glanville ist mit seinem pharmazeutischen Goodwill nicht allein. AstraZeneca versucht, seinen Impfstoff für 4 US-Dollar pro Dosis zu verkaufen.) Die Kosteneinsparungen für Glanville sind geringere Gemeinkosten und 30 Mitarbeiter gegenüber 30.000 bei einem Unternehmen wie Eli Lilly und ein neuartiger Herstellungsansatz. Glanville ließ ein Team von Praktikanten mehr als 500 Unternehmen auf der ganzen Welt mit Bioreaktoren identifizieren, die in der Lage sind, seine Antikörper herzustellen. Anstatt wie die großen Konzerne Medikamente über hauseigene Bioreaktoren oder Subunternehmer zu restriktiven Konditionen zu kochen, sieht sein Plan vor, dass viele Hände leichte Arbeit machen. Durch die Erhöhung des Angebots wird Glanville den Bedarf decken und die Kosten senken.

Der Virologe, der darum bat, anonym zu bleiben, ist unerschütterlich skeptisch, dass dies so ablaufen wird, wie Glanville es will, insbesondere wenn so viele Forscher auf dem Weg oder weit vor ihm liegen. &bdquoSkeptisch ist die sichere Sache&rdquo sagte Glanville über ihre Einstellung. &bdquoDie Chancen stehen gut, dass wir scheitern.&rdquo

Und das schien sein Antikörper-Schicksal zu sein. Aber dann, Anfang Februar, bekam Glanville ein paar gute Neuigkeiten. Er weigerte sich, sie unerwartet zu nennen. Das erste war das Natur Biotechnologie, eine angesehene Zeitschrift auf seinem Gebiet, erklärte sich bereit, seine Arbeit zum Coronavirus zu veröffentlichen. Ende Februar kaufte Merck Pandion für 1,9 Milliarden US-Dollar. Die Bedeutung für Glanville bestand darin, dass Pandion seine patentierten Technologien für einen Teil seiner Arzneimittelentdeckungsarbeit einsetzte. Die Ankündigung zeigt, dass die von ihm entwickelten Antikörper einen klinischen Wert haben. Am aufregendsten für ihn ist, dass er eine Vereinbarung mit einer Bundesbehörde abschließt, deren Namen er gewonnen hat, bis der Deal abgeschlossen ist, die seine Phase-1-Forschung finanzieren wird.

Ob sein Antikörper zu einem Medikament wird oder nicht, im Rennen um eine COVID-19-Behandlung wurde für Glanville geklärt, warum er in dieses Geschäft eingestiegen ist und um Menschen zu helfen. Zu diesem Zweck verkauften er und seine Partner in der ersten Januarwoche Distributed Bio für mehr als 100 Millionen US-Dollar an ein viel größeres Pharmaunternehmen namens Charles River Labs. Seitdem hat er eine neue Firma namens Centivax gegründet, die sich ausschließlich auf die Herstellung von therapeutischen Medikamenten und Impfstoffen und die Vermarktung der von ihm bereits entwickelten Medikamente konzentrieren wird. &bdquoDie Zeit ist nahe&ldquo, sagt er. &bdquoDiese Arbeit braucht die bestmögliche Version von mir.&rdquo Als solcher hörte er mit 40 auf zu trinken und fing an, jeden Tag im Meer zu schwimmen. Um gerade genug von der veränderten Realität zu bekommen, die er braucht, um bei Verstand zu bleiben, raucht er täglich drei Zigarren auf seinem Dachbüro, schaut auf den Ozean und überlegt, wo der nächste böse Käfer auftauchen könnte.


Nutzung der Rekombination in einzelnen Bakterien, um große Phagen-Antikörperbibliotheken herzustellen

Die Schaffung großer Phagen-Antikörperbibliotheken ist zu einem wichtigen Ziel bei der Auswahl von Antikörpern gegen jedes Antigen geworden. Hier beschreiben wir eine Methode, um Bibliotheken so groß zu machen, dass die gesamte Vielfalt mit herkömmlicher Phagentechnologie nicht zugänglich ist. Dies beinhaltet die Erzeugung einer primären Phagen-scFv-Bibliothek in einem Phagemid-Vektor, der zwei nichthomologe lox-Stellen enthält. Im Gegensatz zum aktuellen Dogma fanden wir, dass die Infektion von Cre-Rekombinase-exprimierenden Bakterien durch eine solche Primärbibliothek bei einer hohen Infektionsmultiplizität zum Eintritt vieler verschiedener Phagemide in die Zelle führt. Der Austausch von Vh- und Vl-Genen zwischen solchen Phagemiden erzeugt viele neue Vh/Vl-Kombinationen, die alle funktionell sind. Auf der Grundlage der beobachteten Rekombination wird berechnet, dass die Bibliothek eine Diversität von 3 × 10 11 aufweist. Eine mit dieser Methode erstellte Bibliothek wurde durch die Selektion von hochaffinen Antikörpern gegen eine Vielzahl unterschiedlicher Proteinantigene validiert.


Angriffsstrategien

Verschiedene Arten von eindringenden Mikroorganismen werden auf unterschiedliche Weise angegriffen und zerstört.

Einige Mikroorganismen werden direkt von Zellen erkannt, aufgenommen und zerstört, die diese Eindringlinge (Phagozyten) aufnehmen, wie Neutrophile und Makrophagen.

Allerdings können Fresszellen bestimmte Bakterien nicht direkt erkennen, da die Bakterien in einer Kapsel eingeschlossen sind. In diesen Fällen müssen B-Zellen den Fresszellen bei der Erkennung helfen. B-Zellen produzieren Antikörper gegen die Antigene in der Kapsel der Bakterien. Die Antikörper heften sich an die Kapsel. Die Fresszelle kann die Bakterien dann erkennen.

Einige Mikroorganismen können nicht vollständig eliminiert werden. Zur Abwehr dieser Mikroorganismen baut das Immunsystem eine Mauer um sie herum. Die Wand wird gebildet, wenn Fresszellen, insbesondere Makrophagen, aneinander haften. Die Wand um die Mikroorganismen wird Granulom genannt. Einige auf diese Weise eingesperrte Bakterien können unbegrenzt im Körper überleben. Wenn das Immunsystem geschwächt ist (sogar 50 oder 60 Jahre später), können die Wände des Granuloms bröckeln und die Bakterien können sich vermehren, was zu Symptomen führt.


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