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8.2: Isolierung oder Nachweis einer spezifischen Sequenz durch PCR - Biologie

8.2: Isolierung oder Nachweis einer spezifischen Sequenz durch PCR - Biologie


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Bestandteile der PCR-Reaktion

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine Methode der DNA-Replikation, die in einem Reagenzglas durchgeführt wird (d. h. in vitro). Hier bezieht sich „Polymerase“ auf ein DNA-Polymerase-Enzym, das aus Bakterien extrahiert und gereinigt wurde, und „Kettenreaktion“ bezieht sich auf die Fähigkeit dieser Technik, Millionen von Kopien eines DNA-Moleküls zu produzieren, indem jede neu replizierte Doppelhelix als Matrize verwendet wird, um zwei zu synthetisieren neue DNA-Doppelhelices. Die PCR ist daher eine sehr effiziente Methode zur Amplifikation von DNA.

Neben ihrer Fähigkeit, große Mengen an DNA herzustellen, gibt es eine zweite Eigenschaft der PCR, die sie äußerst nützlich macht. Denken Sie daran, dass die meisten DNA-Polymerasen nur Nukleotide an das Ende eines bestehenden DNA-Strangs hinzufügen können und daher eine Grundierung den Replikationsprozess einzuleiten. Für die PCR werden chemisch synthetisierte Primer von etwa 20 Nukleotiden verwendet. In einer idealen PCR hybridisieren Primer nur an ihre exakt komplementäre Sequenz auf dem Template-Strang (Abbildung (PageIndex{3})).

Der Experimentator kann daher genau kontrollieren, welcher Bereich einer DNA-Matrize amplifiziert wird, indem er die Sequenz der in der Reaktion verwendeten Primer kontrolliert.

Um eine PCR-Amplifikation durchzuführen, kombiniert ein Experimentator in einem kleinen, dünnwandigen Röhrchen (Abbildung (PageIndex{4})) alle notwendigen Komponenten für die DNA-Replikation, einschließlich DNA-Polymerase und nukleotidhaltige Lösungen (dATP, dCTP , dGTP, dTTP), eine DNA-Matrize, DNA-Primer, ein pH-Puffer und Ionen (z. B. Mg2+) von der Polymerase benötigt. Erfolgreiche PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von nur einem einzigen DNA-Molekül als Matrize durchgeführt, aber in der Praxis enthalten die meisten PCR-Reaktionen viele tausend Matrizenmoleküle. Die Matrizen-DNA (z. B. die gesamte genomische DNA) wurde normalerweise bereits unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken aus Zellen oder Geweben gereinigt. In manchen Situationen ist es jedoch möglich, ganze Zellen direkt in eine PCR-Reaktion zu geben, um sie als Matrize zu verwenden.

Ein wesentlicher Aspekt der PCR ist Thermocycling, d. h. die Reaktion einer Reihe genau definierter Temperaturen ausgesetzt (Abbildung (PageIndex{5})). Das Reaktionsgemisch wird zuerst auf 95 °C erhitzt. Dadurch schmelzen die Wasserstoffbrücken zwischen den Strängen der Templat-DNA-Moleküle, oder denaturieren. Dabei entstehen aus jeder Doppelhelix zwei einzelsträngige DNA-Moleküle (Abbildung (PageIndex{6})). Im nächsten Schritt (Glühen) wird die Mischung auf 45–65°C gekühlt. Die genaue Temperatur hängt von der verwendeten Primersequenz und den Zielen des Experiments ab. Dies ermöglicht die Bildung doppelsträngiger Helices zwischen komplementären DNA-Molekülen, einschließlich der Anlagerung von Primern an die Matrize. Im letzten Schritt (Verlängerung) wird die Mischung auf 72 °C erhitzt. Dies ist die Temperatur, bei der die bei der PCR verwendete bestimmte DNA-Polymerase am aktivsten ist. Während der Verlängerung wird der neue DNA-Strang ausgehend vom 3'-Ende des Primers entlang der Länge des Matrizenstrangs synthetisiert. Der gesamte PCR-Prozess ist sehr schnell, wobei jede Temperaturphase normalerweise 30 Sekunden oder weniger dauert. Jeder Zyklus von drei Temperaturen (Denaturierung, Annealing, Extension) wird normalerweise etwa 30 Mal wiederholt, wodurch die Zielregion um etwa 2 verstärkt wird30-falten. Beachten Sie aus der Abbildung, dass die meisten der neu synthetisierten Stränge in der PCR mit Sequenzen beginnen und enden, die entweder identisch oder komplementär zu den Primersequenzen sind; Obwohl einige Stränge länger sind, sind sie in einer so kleinen Minderheit, dass sie fast immer ignoriert werden können.

Abbildung (PageIndex{6}): PCR mit den drei Phasen des Thermozyklus nummeriert. Der Matrizenstrang (blau) wird aus Primern (rot) repliziert, mit neu synthetisierten Strängen in grün. Die grünen Stränge, die von zwei Primer-Bindungsstellen flankiert werden, nehmen durch aufeinanderfolgende PCR-Zyklen exponentiell zu. (Wikipedia-madprime-GFDL)

Die frühesten PCR-Reaktionen verwendeten eine Polymerase aus E coli. Da die hohe Temperatur des Denaturierungsschritts das Enzym zerstörte, musste nach jedem Zyklus neue Polymerase hinzugefügt werden. Um dies zu überwinden, identifizierten die Forscher thermostabil DNA-Polymerasen wie Taq DNA pol, von Thermus Aquaticus, ein thermophiles Bakterium, das in heißen Quellen lebt. Taq und ähnliche thermostabile Polymerasen aus anderen heißen Umgebungen können in den wiederholten Amplifikationszyklen funktionsfähig bleiben. Taq-Polymerase kann normalerweise keine Fragmente amplifizieren, die länger als etwa 3 kbp sind, aber unter einigen speziellen Bedingungen kann die PCR Fragmente bis zu ungefähr 10 kbp amplifizieren. Andere Polymerasen, entweder allein oder in Kombination mit Taq, werden verwendet, um die Länge der amplifizierten Fragmente zu erhöhen oder die Wiedergabetreue zu erhöhen.

Nach Abschluss des Thermocyclings (Amplifikation) wird in der Regel ein Aliquot der PCR-Reaktion auf ein Elektrophorese-Gel (unten beschrieben), um zu bestimmen, ob ein DNA-Fragment der erwarteten Länge erfolgreich amplifiziert wurde oder nicht. Normalerweise ist die Original-Matrizen-DNA so verdünnt, dass sie auf dem Gel nicht sichtbar ist, sondern nur das amplifizierte PCR-Produkt. Das Vorhandensein einer scharfen Bande der erwarteten Länge zeigt an, dass die PCR ihr Ziel amplifizieren konnte. Wenn der Zweck der PCR darin bestand, auf das Vorhandensein einer bestimmten Matrizensequenz zu testen, ist dies das Ende des Experiments. Ansonsten kann das verbleibende PCR-Produkt als Ausgangsmaterial für eine Vielzahl anderer Techniken wie Sequenzierung oder Klonierung verwendet werden.

Eine Anwendung der PCR: die StarLink-Affäre

Die PCR ist sehr sensitiv (d. h. sie kann sehr kleine Ausgangsmengen an DNA amplifizieren) und spezifisch (d. h. sie kann nur die Zielsequenz aus einer Mischung vieler DNA-Sequenzen amplifizieren). Dies machte die PCR zum perfekten Werkzeug, um zu testen, ob gentechnisch veränderter Mais in Verbraucherprodukten in den Supermarktregalen enthalten ist. Obwohl derzeit (2013) 85 % des Maises in den Vereinigten Staaten genetisch verändert sind und Gene enthalten, die von staatlichen Aufsichtsbehörden für den menschlichen Verzehr zugelassen wurden, zeigten Umweltgruppen bereits im Jahr 2000, dass eine genetisch veränderte Maissorte, die nur für als Tierfutter verwendet wurde, mit Mais vermischt wurde, der zur Herstellung von menschlicher Nahrung verwendet wurde, wie zum Beispiel Taco-Schalen.

Dazu kauften die Gruppen Taco-Schalen aus Geschäften in der Gegend von Washington DC, extrahierten DNA aus den Taco-Schalen und verwendeten sie als Vorlage in einer PCR-Reaktion mit Primern, die für das nicht autorisierte Gen spezifisch sind (Cry9C). Ihr Verdacht wurde bestätigt, als sie dieses PCR-Produkt auf einem Agarosegel laufen ließen und eine Bande der erwarteten Größe sahen. Der PCR-Test konnte ein transgenes Korn in einem ganzen Scheffel Mais nachweisen (1 pro 100.000). Das Unternehmen (Aventis), das das transgene Saatgut an Bauern verkaufte, musste für die Vernichtung großer Mengen Mais bezahlen und war das Ziel einer Sammelklage von wütenden Verbrauchern, die behaupteten, sie seien von den Taco-Schalen krank geworden. Zwar wurden nie legitime Schadensfälle nachgewiesen, und den Klägern wurden 9 Millionen US-Dollar zugesprochen, von denen 3 Millionen US-Dollar an die Anwaltskosten gingen und der Rest des Urteils in Form von Coupons für Taco-Schalen an die Verbraucher ging. Die Affäre hat dem Unternehmen geschadet und eine Schwäche im damaligen Umgang mit gentechnisch veränderten Pflanzen in den USA offenbart.


8.2: Isolierung oder Nachweis einer spezifischen Sequenz durch PCR - Biologie

Das Hauptziel dieser Arbeit war es, die Methoden der DNA-Isolierung in den Schimmelpilzen der Gattung . zu vergleichen Mucorales unter besonderer Berücksichtigung der Menge und Reinheit der erworbenen DNA. Die gewonnene DNA wurde dann durch spezifische Echtzeit-PCR amplifiziert.

Entwurf

Fünf DNA-Extraktionsverfahren wurden in einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse 2 in einem dafür vorgesehenen Raum mit geeigneten biologischen Sicherheitsvorkehrungen und geeigneten Entsorgungsmethoden für Bioabfälle durchgeführt. Insgesamt 6 Mucorales klinische Stämme verwendet wurden.

Ergebnisse

Im Hinblick auf Konzentration und Reinheit zeigte Methode A eine reichliche Menge an Pilz-DNA, während Methoden E eine reine Pilz-DNA mit einem R260/280 von 1,7 nahe dem Optimum von 1,8 berichten. Die DNA-Menge erreicht statistisch eine Differenz beim ANOVA-Test mit p-Wert 0,0005

Abschluss

Insgesamt war die E-Methode die effizienteste Methode bei der Extraktion von DNA aus Pilzkulturen im Vergleich zu den anderen Methoden unter Berücksichtigung von Zeit, Kosten, technischem Know-how und Instrumentierung. Die Verwendung dieses Assays wird es Forschern ermöglichen, DNA aus Pilzen schnell zu gewinnen, um sie in molekularen Assays zu verwenden


Molekulare Analyse von DNA

In diesem Unterabschnitt werden wir einige der grundlegenden Methoden skizzieren, die verwendet werden, um spezifische DNA-Fragmente zu trennen und zu visualisieren, die für einen Wissenschaftler von Interesse sind. Einige dieser Verfahren erfordern keine Kenntnis der vollständigen Sequenz des DNA-Moleküls. Vor dem Aufkommen der schnellen DNA-Sequenzierung waren diese Methoden die einzigen, die für die Arbeit mit DNA verfügbar waren, aber sie bilden immer noch das grundlegende Arsenal an Werkzeugen, die von Molekulargenetikern verwendet werden, um die Reaktionen des Körpers auf mikrobielle und andere Krankheiten zu untersuchen.

Nukleinsäure-Sondierung

DNA-Moleküle sind klein und die in ihrer Sequenz enthaltenen Informationen sind unsichtbar. Wie kann ein Forscher einen bestimmten DNA-Abschnitt isolieren oder, nachdem er ihn isoliert hat, feststellen, von welchem ​​Organismus er stammt, welche Sequenz er hat oder welche Funktion er hat? Eine Methode, um das Vorhandensein einer bestimmten DNA-Sequenz zu identifizieren, verwendet künstlich konstruierte DNA-Stücke, die als Sonden bezeichnet werden. Sonden können verwendet werden, um verschiedene Bakterienarten in der Umwelt zu identifizieren, und viele DNA-Sonden sind jetzt verfügbar, um Krankheitserreger klinisch nachzuweisen. DNA-Sonden werden beispielsweise verwendet, um die vaginalen Krankheitserreger nachzuweisen Candida albicans, Gardnerella vaginalis, und Trichomonas vaginalis.

Um eine Genombibliothek nach einem bestimmten Gen oder einer bestimmten Sequenz zu durchsuchen, müssen Forscher etwas über dieses Gen wissen. Wenn Forscher einen Teil der DNA-Sequenz für das interessierende Gen haben, können sie ein DNA-Sonde, ein einzelsträngiges DNA-Fragment, das zu einem Teil des interessierenden Gens komplementär ist und sich von anderen DNA-Sequenzen in der Probe unterscheidet. Die DNA-Sonde kann von kommerziellen Laboratorien chemisch synthetisiert werden, oder sie kann durch Klonieren, Isolieren und Denaturieren eines DNA-Fragments aus einem lebenden Organismus erzeugt werden. In jedem Fall muss die DNA-Sonde mit einem molekularen Tag oder Beacon markiert werden, wie z. B. einem radioaktiven Phosphoratom (wie es für Autoradiographie) oder ein fluoreszierender Farbstoff (wie er in fluoreszierenden vor Ort Hybridisierung oder FISH), so dass die Sonde und die DNA, an die sie bindet, zu sehen sind (Abbildung 1). Die zu untersuchende DNA-Probe muss auch denaturiert werden, um sie einzelsträngig zu machen, damit die einzelsträngige DNA-Sonde an Stellen, an denen ihre Sequenzen komplementär sind, an die einzelsträngige DNA-Probe anlagern kann. Während diese Techniken für die Diagnose wertvoll sind, kann ihre direkte Verwendung bei Sputum und anderen Körperproben aufgrund der komplexen Natur dieser Proben problematisch sein. DNA muss oft erst durch chemische Extraktionsverfahren aus Körperproben isoliert werden, bevor eine DNA-Sonde verwendet werden kann, um Krankheitserreger zu identifizieren.

Abbildung 1. DNA-Sonden können verwendet werden, um das Vorhandensein eines vermuteten Krankheitserregers in Patientenproben zu bestätigen. Dieses Diagramm veranschaulicht, wie eine DNA-Sonde verwendet werden kann, um nach einem interessierenden Gen zu suchen, das mit dem vermuteten Pathogen assoziiert ist.

Klinischer Fokus: Karni, Teil 2

Dieses Beispiel setzt Karnis Geschichte fort, die in Microbes and the Tools of Genetic Engineering begann.

Die milden, grippeähnlichen Symptome, die Karni erfährt, können durch eine Vielzahl von Infektionserregern verursacht werden. Darüber hinaus weisen mehrere nicht infektiöse Autoimmunerkrankungen wie Multiple Sklerose, systemischer Lupus erythematodes (SLE) und amyotrophe Lateralsklerose (ALS) Symptome auf, die mit Karnis frühen Symptomen übereinstimmen. Im Laufe mehrerer Wochen verschlimmerten sich jedoch Karnis Symptome. Sie verspürte Gelenkschmerzen in den Knien, Herzklopfen und eine seltsame Schlaffheit in ihren Gesichtsmuskeln. Außerdem litt sie unter einem steifen Nacken und schmerzhaften Kopfschmerzen. Widerstrebend entschied sie, dass es an der Zeit war, einen Arzt aufzusuchen.

  • Geben Karnis neue Symptome Hinweise darauf, welche Art von Infektion oder anderen medizinischen Zustand sie haben könnte?
  • Welche Tests oder Werkzeuge könnte ein Gesundheitsdienstleister verwenden, um den Erreger zu lokalisieren, der Karnis Symptome verursacht?

Wir werden später auf dieser Seite auf Karnis Beispiel zurückkommen.

Agarose-Gelelektrophorese

Es gibt eine Reihe von Situationen, in denen ein Forscher eine Sammlung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe physisch trennen möchte. Ein Forscher kann auch eine DNA-Probe mit einem Restriktionsenzym verdauen, um Fragmente zu bilden. Das resultierende Größen- und Fragmentverteilungsmuster kann oft nützliche Informationen über die Sequenz von DNA-Basen liefern, die ähnlich wie bei einem Strichcode-Scan verwendet werden können, um das Individuum oder die Spezies zu identifizieren, zu der die DNA gehört.

Gelelektrophorese ist eine Technik, die häufig verwendet wird, um biologische Moleküle basierend auf Größe und biochemischen Eigenschaften, wie Ladung und Polarität, zu trennen. Agarose-Gelelektrophorese wird häufig verwendet, um DNA (oder RNA) unterschiedlicher Größe zu trennen, die durch Restriktionsenzymverdau oder auf andere Weise wie die PCR erzeugt werden kann (Abbildung 2).

Aufgrund ihres negativ geladenen Rückgrats wird DNA stark von einer positiven Elektrode angezogen. Bei der Agarosegelelektrophorese wird das Gel in einer Pufferlösung horizontal ausgerichtet. Die Proben werden in Probenvertiefungen auf der Seite des Gels geladen, die der negativen Elektrode am nächsten liegt, und dann durch das Molekularsieb der Agarose-Matrix in Richtung der positiven Elektrode gezogen. Die Agarose-Matrix behindert die Bewegung größerer Moleküle durch das Gel, während kleinere Moleküle leichter passieren. Somit korreliert die Wanderungsstrecke umgekehrt mit der Größe des DNA-Fragments, wobei kleinere Fragmente eine längere Strecke durch das Gel zurücklegen. Die Größen von DNA-Fragmenten innerhalb einer Probe können durch Vergleich mit Fragmenten bekannter Größe in a . abgeschätzt werden DNA-Leiter laufen auch auf dem gleichen Gel. Um sehr große DNA-Fragmente wie Chromosomen oder virale Genome zu trennen, kann die Agarosegel-Elektrophorese durch periodisches Wechseln der Ausrichtung des elektrischen Felds während des Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE). In PFGE, können sich kleinere Fragmente selbst neu orientieren und etwas schneller wandern als größere Fragmente, und diese Technik kann somit dazu dienen, sehr große Fragmente zu trennen, die ansonsten während der Standard-Agarose-Gelelektrophorese zusammen wandern würden. Bei jeder dieser Elektrophoresetechniken können die Orte der DNA- oder RNA-Fragmente im Gel durch verschiedene Verfahren nachgewiesen werden. Eine gängige Methode ist das Hinzufügen Ethidiumbromid, ein Farbstoff, der sich an unspezifischen Stellen in die Nukleinsäuren einfügt und sichtbar gemacht werden kann, wenn er ultraviolettem Licht ausgesetzt wird. Andere Farbstoffe, die sicherer sind als Ethidiumbromid, ein potenzielles Karzinogen, sind jetzt verfügbar.

Abbildung 2. Klicken Sie für ein größeres Bild. (a) Das Verfahren der Agarosegelelektrophorese. (b) Ein Forscher lädt Proben in ein Gel. (c) Dieses Foto zeigt einen abgeschlossenen Elektrophoreselauf auf einem Agarosegel. Die DNA-Leiter befindet sich in den Spuren 1 und 9. Sieben Proben befinden sich in den Spuren 2 bis 8. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt und unter ultraviolettem Licht fotografiert. (Credit a: Änderung der Arbeit von Magnus Manske Credit b: Änderung der Arbeit des US-Landwirtschaftsministeriums Credit c: Änderung der Arbeit von James Jacob)

Analyse des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)

Die Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme sind kurz (nur wenige Nukleotide lang), sequenzspezifische Palindrome und können im gesamten Genom gefunden werden. Somit führen Unterschiede in den DNA-Sequenzen in den Genomen von Individuen zu Unterschieden in der Verteilung von Restriktionsenzym-Erkennungsstellen, die als unterschiedliche Bandenmuster auf einem Gel nach Agarosegelelektrophorese sichtbar gemacht werden können. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) Analyse vergleicht DNA-Bandenmuster verschiedener DNA-Proben nach Restriktionsverdau (Abbildung 3).

Abbildung 3. Die RFLP-Analyse kann verwendet werden, um DNA-Sequenzen zu unterscheiden. In diesem Beispiel wird ein normales Chromosom in zwei Fragmente verdaut, während die Verdauung eines mutierten Chromosoms nur ein Fragment erzeugt. Die kleinen roten Pfeile, die auf die beiden unterschiedlichen Chromosomensegmente zeigen, zeigen die Positionen der Erkennungsstellen des Restriktionsenzyms. Nach dem Verdau und der Agarosegelelektrophorese spiegeln die Bandenmuster die Veränderung wider, indem sie den Verlust von zwei kürzeren Banden und die Zunahme einer längeren Bande zeigen. (Kredit: Änderung der Arbeit des National Center for Biotechnology Information)

RFLP-Analyse hat viele praktische Anwendungen in der Medizin und Kriminaltechnik. Epidemiologen verwenden beispielsweise RFLP-Analysen, um die Quelle bestimmter Mikroorganismen zu verfolgen und zu identifizieren, die an Ausbrüchen von Lebensmittelvergiftungen oder bestimmten Infektionskrankheiten beteiligt sind. Die RFLP-Analyse kann auch an menschlicher DNA verwendet werden, um Vererbungsmuster von Chromosomen mit abweichenden Genen zu bestimmen, einschließlich solcher, die mit erblichen Krankheiten assoziiert sind, oder um Vaterschaft.

Forensiker verwenden die RFLP-Analyse als eine Form der DNA-Fingerabdruck-Methode, das für die Analyse von DNA von Tatorten, Verdächtigen und Opfern nützlich ist. DNA-Proben werden gesammelt, die Anzahl der Kopien der Proben-DNA-Moleküle wird erhöht mit PCRund dann einem Restriktionsenzymverdau und einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, um spezifische Bandenmuster zu erzeugen. Durch den Vergleich der Streifenmuster von am Tatort entnommenen Proben mit denen von Verdächtigen oder Opfern können Ermittler definitiv feststellen, ob am Tatort gesammelte DNA-Beweise von Verdächtigen oder Opfern zurückgelassen wurden.

Southern Blots und Modifikationen

Mehrere molekulare Techniken nutzen Sequenzkomplementarität und Hybridisierung zwischen Nukleinsäuren einer Probe und DNA-Sonden. Typischerweise ist die Sondierung von Nukleinsäureproben innerhalb eines Gels nicht erfolgreich, da die Probennukleinsäuren innerhalb des Gels ausdiffundieren, wenn die DNA-Sonde in ein Gel eindringt. Daher werden üblicherweise Blotting-Techniken verwendet, um Nukleinsäuren auf eine dünne, positiv geladene Membran aus Nitrozellulose oder Nylon zu übertragen. In dem Südlicher Fleck Technik, entwickelt von Sir Edwin Süd 1975 werden DNA-Fragmente innerhalb einer Probe zunächst durch Agarosegelelektrophorese getrennt und dann durch Kapillarwirkung auf eine Membran übertragen (Abbildung 4). Die DNA-Fragmente, die an die Oberfläche der Membran binden, werden dann einer spezifischen einzelsträngigen DNA-Sonde ausgesetzt, die mit einem radioaktiven oder fluoreszierenden markiert ist Molekulares Leuchtfeuer bei der Erkennung zu helfen. Southern-Blots können verwendet werden, um das Vorhandensein bestimmter DNA-Sequenzen in einer gegebenen DNA-Probe nachzuweisen. Sobald die Ziel-DNA innerhalb der Membran sichtbar gemacht wurde, können die Forscher den Teil der Membran ausschneiden, der das Fragment enthält, um das interessierende DNA-Fragment zu gewinnen.

Figur 4.Bei der Southern-Blot-Technik werden DNA-Fragmente zuerst durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, dann durch Kapillarwirkung auf eine Nylonmembran übertragen, die dann mit einer DNA-Sonde getränkt wird, die mit einem Molecular Beacon markiert ist, um eine einfache Visualisierung zu ermöglichen.

Variationen des Southern-Blots – Dot-Blot, Slot-Blot und Spot-Blot – beinhalten keine Elektrophorese, sondern konzentrieren stattdessen DNA aus einer Probe an einer kleinen Stelle auf einer Membran. Nach der Hybridisierung mit einer DNA-Sonde wird die detektierte Signalintensität gemessen, wodurch der Forscher die Menge der in der Probe vorhandenen Ziel-DNA abschätzen kann.

EIN Kolonie-Blot ist eine weitere Variation des Southern-Blots, bei der Kolonien, die verschiedene Klone in einer genomischen Bibliothek repräsentieren, auf eine Membran übertragen werden, indem die Membran auf die Kulturplatte gedrückt wird. Die Zellen auf der Membran werden lysiert und die Membran kann dann sondiert werden, um zu bestimmen, welche Kolonien innerhalb einer genomischen Bibliothek das Zielgen beherbergen. Da die Kolonien auf der Platte noch wachsen, können die interessierenden Zellen von der Platte isoliert werden.

In dem Nordfleck, einer anderen Variante des Southern-Blots, wird RNA (nicht DNA) auf der Membran immobilisiert und sondiert. Northern Blots werden typischerweise verwendet, um die Menge an mRNA nachzuweisen, die durch Genexpression in einer Gewebe- oder Organismusprobe hergestellt wird.

Microarray-Analyse

Eine andere Technik, die von der Hybridisierung zwischen komplementären Nukleinsäuresequenzen profitiert, heißt Microarray-Analyse. Die Microarray-Analyse ist nützlich für den Vergleich von Genexpressionsmustern zwischen verschiedenen Zelltypen – zum Beispiel mit einem Virus infizierte Zellen mit nicht infizierten Zellen oder Krebszellen mit gesunden Zellen (Abbildung 5).

Typischerweise wird DNA oder cDNA aus einer experimentellen Probe neben bekannten DNA-Sequenzen auf einem Glasobjektträger aufgebracht. Jeder Objektträger kann mehr als 30.000 verschiedene DNA-Fragmenttypen aufnehmen. Einzelne DNA-Fragmente (die die gesamte Genombibliothek eines Organismus umfassen) oder cDNA Fragmente (entsprechend dem vollständigen Komplement der exprimierten Gene eines Organismus) können einzeln auf einem Glasobjektträger aufgetupft werden.

Nach dem Ablegen auf dem Objektträger kann genomische DNA oder mRNA zum Vergleich aus den beiden Proben isoliert werden. Wenn mRNA isoliert wird, wird sie unter Verwendung von reverser Transkriptase in cDNA revers transkribiert. Dann werden die beiden Proben genomischer DNA oder cDNA mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen (typischerweise rot und grün) markiert. Die markierten genomischen DNA-Proben werden dann in gleichen Mengen kombiniert, auf den Microarray-Chip gegeben und an komplementäre Spots auf dem Microarray hybridisieren gelassen.

Die Hybridisierung von genomischen DNA-Probenmolekülen kann durch Messen der Fluoreszenzintensität an bestimmten Stellen auf dem Mikroarray überwacht werden. Unterschiede in der Höhe von Hybridisierung zwischen den Proben leicht beobachtet werden. Wenn nur die Nukleinsäuren einer Probe an einen bestimmten Punkt auf dem Mikroarray hybridisieren, erscheint dieser Punkt entweder grün oder rot. Wenn jedoch die Nukleinsäuren beider Proben hybridisieren, erscheint der Fleck aufgrund der Kombination der roten und grünen Farbstoffe gelb.

Obwohl die Microarray-Technologie einen ganzheitlichen Vergleich zwischen zwei Proben in kurzer Zeit ermöglicht, erfordert sie hoch entwickelte (und teure) Detektionsgeräte und Analysesoftware. Aus Kostengründen ist diese Technologie in der Regel auf Forschungsumgebungen beschränkt. Forscher haben Microarray-Analysen verwendet, um zu untersuchen, wie die Genexpression in Organismen beeinflusst wird, die mit Bakterien oder Viren infiziert oder bestimmten chemischen Behandlungen unterzogen wurden.

Abbildung 5. (a) Die Schritte der Mikroarray-Analyse werden veranschaulicht. Hier werden Genexpressionsmuster zwischen Krebszellen und gesunden Zellen verglichen. (b) Microarray-Informationen können als Heatmap ausgedrückt werden. Gene werden auf der linken Seite gezeigt, verschiedene Proben werden unten gezeigt. Gene, die nur in Krebszellen exprimiert werden, werden in unterschiedlichen Rottönen gezeigt Gene, die nur in normalen Zellen exprimiert werden, werden in unterschiedlichen Grüntönen gezeigt. Gene, die sowohl in Krebszellen als auch in normalen Zellen exprimiert werden, sind gelb dargestellt.

Denk darüber nach

  • Woraus besteht eine DNA-Sonde?
  • Warum wird nach der Gelelektrophorese eines DNA-Verdaus ein Southern-Blot verwendet?

8.2: Isolierung oder Nachweis einer spezifischen Sequenz durch PCR - Biologie

Ohne Zweifel ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) heute die wichtigste Technik im Bereich der Molekularbiologie. Was die PCR technisch leistet, lässt sich sehr einfach beschreiben – sie ermöglicht die schnelle und unbegrenzte Amplifikation spezifischer Nukleinsäuresequenzen, die in sehr geringen Konzentrationen in sehr komplexen Mischungen vorliegen können. Innerhalb von weniger als einem Jahrzehnt nach seiner anfänglichen Entwicklung wurde es zu einem kritischen Werkzeug für alle praktizierenden Molekularbiologen und hat dazu beigetragen, die Molekularbiologie in die Praxis vieler anderer Gebiete der biomedizinischen Wissenschaften und darüber hinaus zu bringen. Die Gründe sind vielfältig. Erstens bietet die PCR die ultimative Sensitivität – einzelne DNA-Moleküle können nachgewiesen und auf ihren Sequenzgehalt analysiert werden (Li et al., 1988, Arnheim et al., 1990). Zweitens bietet es die ultimative Auflösung – alle Polymorphismen, von einzelnen Basenänderungen bis hin zu großen Umlagerungen, können durch einen geeigneten PCR-basierten Assay unterschieden werden. Drittens ist es extrem schnell – für viele Anwendungen ist es möglich, innerhalb eines einzigen Arbeitstages von Rohgewebeproben zu Ergebnissen zu gelangen. Schließlich ist die Technik ein Mittel der Demokratie — sobald die Sequenzen des Oligonukleotidpaares, die eine bestimmte PCR-Reaktion definieren, veröffentlicht sind, kann jeder, der das Geld zum Kauf der Oligonukleotide hat, dieselbe Reaktion an Proben seiner oder ihrer Wahl reproduzieren dies steht im Gegensatz zu RFLP-Analysen, bei denen Forscher oft auf die Großzügigkeit anderer angewiesen sind, um Klone zur Verwendung als Sonden bereitzustellen. Zu den Prinzipien und Anwendungen der Technik wurden zahlreiche Bücher und Tausende von Zeitschriftenartikeln veröffentlicht [Erlich (1989) und Innis et al. (1990) sind zwei frühe Beispiele].

Obwohl die Anwendungen der PCR so vielfältig sind wie die Labore, in denen die Technik praktiziert wird, konzentriert sich dieser Abschnitt ausschließlich auf sechs allgemeine Anwendungen, die für den Nachweis und die Typisierung genetischer Variationen in der Maus relevant sind. Vier dieser Anwendungen basieren auf der PCR-Amplifikation bestimmter Loci, die zuvor auf Sequenzebene charakterisiert wurden. In diesen Fällen müssen Primerpaare möglichst spezifisch für den jeweiligen Locus gewählt werden, um artefaktische PCR-Produkte zu vermeiden. Computerprogramme sind verfügbar, um das Primerdesign zu unterstützen (Lowe et al., 1990 Dietrich et al., 1992), aber eine manuelle Inspektion ist normalerweise ausreichend. Man muss vorsichtig sein, um Selbstkomplementarität innerhalb eines Primers und das Vorhandensein komplementärer Sequenzen zwischen den beiden Primern zu vermeiden. Außerdem sollten potenzielle Primer unter Verwendung eines Sequenzvergleichsprogramms gescreent werden, um Homologie mit den stark wiederholten Elementen B1, B2 und L1 zu vermeiden (siehe Abschnitt 5.4). Die Primerlänge sollte mindestens 20 Basen betragen, der G:C-Gehalt sollte mindestens 50% betragen und die Schmelztemperatur sollte mindestens 60°C betragen.

Selbst wenn all diese Bedingungen eingehalten werden, ist es immer noch möglich herauszufinden, dass ein bestimmtes Primerpaar nicht richtig funktioniert, um einen spezifischen Locus zu einem reproduzierbaren Produkt zu amplifizieren, das klar von artefaktischen Hintergrundbanden unterschieden werden kann. Es gibt verschiedene Ansätze, um solche Probleme zu beseitigen (Erlich, 1989, Innis et al., 1990), aber wenn alles andere fehlschlägt, sollte man einen oder beide Primer durch Alternativen ersetzen, die von anderen benachbarten flankierenden Sequenzen abgeleitet sind, die ebenfalls passen die oben aufgeführten Regeln.

8.3.1 Restriktionsstellen-Polymorphismen

8.3.1.1 Übersicht

Schnelle, hocheffiziente PCR-basierte Assays können entwickelt werden, um alle RFLPs zu erkennen – die zuvor durch Southern-Blot-Analyse definiert wurden –, solange die Natur des RFLP verstanden wird und Sequenzinformationen, die die eigentliche polymorphe Stelle flankieren, verfügbar sind. Ein Paar von PCR-Primern, die diese Stelle flankieren, kann dann gemäß den gerade beschriebenen Regeln synthetisiert und auf ihre Fähigkeit getestet werden, ein spezifisches Produkt zu amplifizieren, das durch Gelelektrophorese leicht als Ethidiumbromid-gefärbte Bande identifiziert werden kann.

Bei der einfachsten und gebräuchlichsten Art von RFLP, die in Abbildung 8.6 dargestellt ist, resultiert der Polymorphismus aus einem einzelnen Nukleotidunterschied, der eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym in einer Allelform bereitstellt und in der anderen nicht. Ein Polymorphismus dieser Art kann schnell nachgewiesen werden, indem (1) die Region um die polymorphe Stelle jeder Probe amplifiziert wird, (2) das amplifizierte Material für eine kurze Verdauungsdauer dem geeigneten Restriktionsenzym ausgesetzt wird und (3) das unverdaute PCR-Produkt unterschieden wird aus den kleineren verdauten Fragmenten durch Gelelektrophorese. Durch die Wahl von Primern, die relativ äquidistant und ausreichend weit von der polymorphen Stelle entfernt sind, können allelische Formen auf Agarose- oder Polyacrylamidgelen leicht aufgelöst werden, wie in Abbildung 8.6 dargestellt.

Dieses PCR-basierte Protokoll liefert Ergebnisse viel schneller und ist viel einfacher durchzuführen als die Southern-Blot-Alternative, die Blotting, Sondenmarkierung, Hybridisierung und Autoradiographie erfordert. Da der mit der PCR verbundene Hauptaufwand in der anfänglichen Sequenzierung des Locus und der Synthese von PCR-Primern liegt, ist sie auch in allen Fällen weniger kostspielig, in denen erwartet wird, eine große Anzahl von Proben für den jeweiligen fraglichen Locus zu typisieren.

Selbst RFLPs, die durch komplexere Mutationsereignisse verursacht werden, können durch PCR analysiert werden. Abbildung 8.7 veranschaulicht die Logik hinter der Entwicklung von PCR-Strategien zum Nachweis von Deletionen, Insertionen, Inversionen und Translokationen. Die einzige Voraussetzung ist die Kenntnis der Sequenzen, die die mit jedem bestimmten genetischen Ereignis verbundenen Bruchpunkte umgeben.

8.3.1.2 Ń'-unübersetzte Regionen als Kartierungsressource

Eine wichtige Quelle für die Identifizierung neuer Restriktionsstellen-Polymorphismen, die durch PCR typisiert werden können, sind die 3'-untranslatierten (3'-UT) Regionen von Transkripten. Diese Regionen unterliegen nicht denselben selektiven Beschränkungen wie kodierende Sequenzen und sind häufig genauso polymorph wie zufällige nicht transkribierte genomische Regionen. 3'-UT-Regionen sind jedoch direkte Marker für die 3'-Enden von Genen. Sie werden normalerweise nicht durch Introns unterbrochen und sind zwischen verschiedenen Mitgliedern einer Genfamilie oft ausreichend divergent, um eine ortsspezifische Analyse zu ermöglichen.

Fast alle cDNA-Bibliotheken werden aus cDNA-Molekülen konstruiert, die durch Priming von dem am 3'-Ende der mRNA vorhandenen Poly(A)-Schwanz initiiert wurden. Für alle aus diesen Bibliotheken erhaltenen Klone ist es einfach, Sequenzinformationen für einige hundert Basenpaare der 3'-UT-Region direkt neben dem Poly(A)-Schwanz zu erhalten. Diese Sequenzinformationen können verwendet werden, um ein Paar von PCR-Primern zu entwerfen, die wiederum verwendet werden können, um dieselbe Region aus einem anderen Stamm oder einer anderen Mäuseart zu amplifizieren und zu sequenzieren, wie z M. Spretus oder M. m. Castaneus. In einem Vergleich von 2.312 bp, die in 3'-UT-Regionen vorhanden sind, die von 22 zufälligen Maus-cDNA-Klonen abgeleitet sind, fanden Takahashi und Ko (1993) eine Gesamtpolymorphismusrate von einer Änderung pro 92 bp. Diese einzelnen Basenänderungen übersetzten in neun der 22 analysierten Klone in Restriktionsstellen-Polymorphismen. Mit bereits vorhandenen Primern liefern diese neu identifizierten Polymorphismen PCR-Marker für die direkte Kartierung entsprechender Gene, die in ihren kodierenden Regionen nicht unterscheidbar sind.

8.3.2 Nachweis allelischer Veränderungen, die durch einzelne Basenpaare definiert sind

8.3.2.1 Hybridisierung und einzelne Basenpaaränderungen

Obwohl der PCR-Nachweis von RFLPs eine Verbesserung gegenüber dem Southern-Blot-Nachweis darstellt, liegt der wahre Vorteil der PCR in seiner nahezu universellen Fähigkeit, Allele zu unterscheiden, die sich durch einzelne Basenänderungen unterscheiden, selbst wenn sie keine bekannte Restriktionsstelle erzeugen oder zerstören. Tatsächlich werden die meisten zufälligen Basenpaaränderungen vom Nicht-RFLP-Typ sein, und vor dem Aufkommen der PCR gab es kein effizientes Mittel, mit dem diese Allele in einer großen Anzahl von Proben leicht verfolgt werden könnten. Diese Einschränkung führte ursprünglich zur Entwicklung des PCR-Protokolls (Saiki et al., 1986).

Die Unfähigkeit, Veränderungen einzelner Basen auf Southern-Blots nachzuweisen, war eine Folge sowohl theoretischer Beschränkungen, die dem Hybridisierungsverfahren innewohnen, als auch praktischer Beschränkungen in der Empfindlichkeit von Nukleinsäuresonden und der Eliminierung von Hintergrundrauschen. Bei der Southern-Blot-Analyse ist die Sensitivität, mit der Zielsequenzen innerhalb einer definierten Probe nachgewiesen werden können, direkt proportional zur Länge der Sonde. Beispielsweise hybridisiert eine 1-kb-Sonde mit der zehnfachen Menge an Zielsequenz als eine 100-bp-Sonde (mit der gleichen spezifischen Aktivität), und dies führt zu einem zehnfach stärkeren Signal. Aus diesem Grund ist es immer am besten, die längsten Sonden für traditionelle Southern-Blot-Studien sowie für andere Protokolle wie z vor Ort Hybridisierung. Die Signalstärke ist nicht nur wichtig, um die für die autoradiographische Belichtung erforderliche Zeit zu verkürzen, sondern auch um die Detektion über dem Hintergrund-"Rauschen" zu ermöglichen, das jedem Hybridisierungsexperiment innewohnt. Wenn die Bedingungen nicht optimal sind, sinkt das Signal-Rausch-Verhältnis unter 1,0, wenn die Sondengröße unter 100-200 bp reduziert wird.

Die einzigen Kräfte, die die beiden Stränge einer DNA-Doppelhelix zusammenhalten, sind die doppelten oder dreifachen Wasserstoffbrücken, die in jedem Basenpaar vorhanden sind. Einzelne Wasserstoffbrückenbindungen sind sehr schwach, und nur wenn sie in großer Zahl addiert werden, hat die Doppelhelix eine ausreichende Stabilität, um eine Aufspaltung durch normale thermische Fluktuationen zu vermeiden. So spielt bei DNA-Molekülen mit einer Größe im Bereich von wenigen Basenpaaren bis zu einem kritischen Wert von ㅪ bp die Länge selbst eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung, ob die Helix intakt bleibt oder auseinanderfällt. Sobald diese obere Grenze jedoch überschritten ist, ist die Länge kein Faktor mehr für die thermische Stabilität. Tatsächlich gibt es nur ein kleines Fenster — ㅂ bis 40 bp —, über das es möglich ist, eine differenzielle Hybridisierung von Sonde an Ziel basierend auf Unterschieden in der Hybridlänge zu erhalten.

Aber wie könnte die Länge einen Unterschied bei der Allelerkennung machen, wenn sowohl die Ziel- als auch die Sondenlänge konstant gehalten werden? Die Antwort ist, dass die Wirksam Länge eines Hybrids wird bestimmt durch die am längsten DNA-Strecke, die keine Fehlpaarungen enthält. Wenn also eine Sonde von 21 Basen Länge an ein Target hybridisiert, das sich an einer einzigen Base direkt in der Mitte der Sequenz unterscheidet, beträgt die effektive Länge der gebildeten Hybride nur 10 bp. Da ein 10 bp-Hybrid deutlich weniger stabil ist als ein 21 bp-Hybrid, ist es einfach, Hybridisierungsbedingungen (im Wesentlichen durch Wahl der richtigen Temperatur) so zu konzipieren, dass das perfekte Hybrid intakt bleibt, während das unvollkommene Hybrid dies nicht tut. Im Gegensatz dazu unterscheidet sich die thermische Stabilität eines 50 bp-Hybrids nicht ausreichend von der thermischen Stabilität eines 100 bp-Hybrids (mit äquivalenter Sequenzzusammensetzung), um einen Nachweis durch differentielle Hybridisierung zu ermöglichen.

So war 1985 der Nachweis einzelner Basenunterschiede durch differentielle Southern-Blot-Hybridisierung aufgrund von zwei gegenläufigen Problemen nicht möglich. Erstens lieferten nur sehr kurze Sonden – Oligonukleotide mit weniger als 50 Basen – einen ausreichend großen Unterschied, um leicht nachgewiesen zu werden. Jedoch waren nur mit viel längeren Sonden — von mehreren hundert Basen oder mehr — die Signalstärke und das Signal-Rausch-Verhältnis ausreichend, um einen spezifischen Nachweis der Zielsequenz in jeder allelischen Form innerhalb des hochkomplexen Mausgenoms zu ermöglichen. Wie konnte man diese Sackgasse durchbrechen?

Die Antwort war natürlich, sich auf die Zielsequenzen statt auf die Sonden- oder Hybridisierungsbedingungen zu konzentrieren. Die PCR stellte ein Mittel bereit, um die absolute Menge der Zielsequenz sowie das Verhältnis von Ziel zu Nicht-Ziel um praktisch unbegrenzte Größenordnungen zu erhöhen. Dies führt wiederum zu einem proportionalen Anstieg der potentiellen Signalstärke, was wiederum die Verwendung kurzer Oligonukleotide für die Hybridisierung ermöglicht und was wiederum den Nachweis einzelner Basenunterschiede in einem einfachen Plus/Minus-Assay ermöglicht.

8.3.2.2 Allelspezifische Oligonukleotide

Sobald alternative Allele sequenziert wurden und ein einzelner Basenpaarwechsel zwischen den beiden identifiziert wurde, wird es möglich, ein PCR-Protokoll zu entwerfen, das es erlaubt, ihre Trennung zu verfolgen (Farr, 1991). Zuerst werden PCR-Primer identifiziert, die eine spezifische Amplifikation einer Region ermöglichen, die die variante Nukleotidstelle umfasst (für diese Anwendung ist die Länge des Produkts nicht kritisch und kann irgendwo zwischen 150 und 400 bp lang sein). Als nächstes werden zwei Allel-spezifische Oligonukleotide (ASOs) hergestellt, bei denen die Nukleotidvariante so nah wie möglich am Zentrum liegt, wenn man andere Faktoren berücksichtigt, die oben in Abschnitt 8.3 beschrieben sind. Die ideale ASO-Länge beträgt 19-21 Basen – kurz genug, um eine differenzielle Hybridisierung basierend auf einem einzelnen Basenwechsel zu ermöglichen, und lang genug, um eine hohe Wahrscheinlichkeit der Locus-Spezifität bereitzustellen. Die beiden ASOs werden mit definierten Proben verwendet, um eine Temperatur zu bestimmen, bei der eine positive Hybridisierung mit Ziel-DNA erhalten wird, die das richtige Allel enthält, aber nicht mit Ziel-DNA, die nur das alternative Allel enthält.

Typischerweise wird eine Probe genomischer DNA einer PCR-Amplifikation mit den Locus-spezifischen Primern unterzogen, Aliquots des amplifizierten Materials werden in zwei "Punkte" getüpfelt und jede wird mit markierten Formen von jedem der beiden ASOs sondiert. Die Hybridisierung an einem Punkt, aber nicht am anderen weist auf eine Homozygote für dieses Allel hin, während die Hybridisierung an beiden Punkten auf eine Heterozygote hinweist, die beide Allele trägt.

Die Stärke dieses Protokolls zur Allelerkennung liegt in seiner Einfachheit. Der Wegfall des Gellaufs spart sowohl Zeit als auch eine einfache Automatisierung. Mit großen Mengen an Zielsequenz wird es möglich, nicht-radioaktive Markierungsprotokolle zu verwenden, die sicherer sind und eine Langzeitlagerung markierter Sonden ermöglichen (Helmuth, 1990, Levenson und Chang, 1990). Es gibt jedoch Fallstricke, die es zu beachten gilt. Erstens können einige Varianten aufgrund von Problemen, die der Sequenz, die die Stelle des Basenwechsels umgibt, inhärent sind, gegenüber einer reproduzierbaren PCR-Analyse refraktär sein. Zweitens unterliegen Plus/Minus-Assays jeglicher Art dem Problem falsch-negativer Ergebnisse. (Man kann vor der Hybridisierung immer einen Gellaufschritt einfügen, um sicher zu sein, dass amplifiziertes Material tatsächlich in dem zu analysierenden Aliquot vorhanden ist.) Schließlich besteht bei der Analyse von Mäusen, die von etwas anderem als einer definierten Kreuzung abgeleitet wurden, immer das Risiko, dass es wird ein drittes neues Allel geben, das von keiner der beiden für die Analyse entwickelten ASOs nachgewiesen werden kann. Ein für ein solches neues Allel heterozygotes Tier (zusammen mit einem der beiden bekannten Allele) könnte fälschlicherweise als homozygot für das eine bekannte vorhandene Allel charakterisiert werden, da das Protokoll nicht quantitativ ist. Trotzdem bleibt das PCR/ASO-Protokoll trotz dieser Fallstricke ein nützliches Werkzeug für die genetische Analyse.

8.3.2.3 Der Oligonukleotid-Ligationsassay

Ein alternatives Protokoll zum Nachweis gut definierter Allele, die sich durch einzelne Basenänderungen unterscheiden, wurde von Hood und seinen Kollegen entwickelt (Landegren et al., 1988 Landegren et al., 1990). Diese Methode, die als Oligonukleotid-Ligationsassay (OLA) oder Ligase-vermittelter Gennachweis bezeichnet wird, basiert auf der Voraussetzung für eine korrekte Basenpaarung am 3'-Ende eines Oligonukleotids sowie am 5'-Ende eines benachbarten Oligonukleotids vor der Ligase kann eine kovalente Phosphodiesterbindung bilden. Der konzeptionelle Rahmen hinter dem Protokoll ist in Abbildung 8.8 dargestellt. Zuerst wird die potentielle Zielsequenz durch PCR amplifiziert. Die nächste Hybridisierung wird gleichzeitig mit zwei Oligonukleotiden durchgeführt, die komplementär zu einander benachbarten Sequenzen sind und die Nukleotidvariante direkt flankieren. Die Variantenbase selbst ist entweder komplementär oder nicht komplementär zur am weitesten 3'-Base des ersten allelspezifischen Oligonukleotids. Dieses ASO wird im Voraus mit einer angehängten Biotin-Einheit modifiziert, aber nicht anderweitig gekennzeichnet. Das zweite Oligonukleotid, das radioaktiv oder nicht-isotopisch markiert ist, erstreckt sich über eine benachbarte Sequenz, die beiden zu analysierenden Allelen gemeinsam ist. Ligase ist auch in der Reaktion vorhanden, und wenn beide Oligonukleotide perfekt mit der Zielsequenz übereinstimmen, wird die Ligase eine kovalente Bindung zwischen ihnen herstellen. Wenn an der Verbindungsstelle eine Fehlpaarung auftritt, werden die beiden Oligonukleotide nicht ligiert werden. Biotinyliertes Material kann unter Verwendung einer Streptavidin-Matrix leicht und absolut von nicht-biotinyliertem Material getrennt werden, und die resultierende Probe kann dann auf das Vorhandensein der mit dem zweiten Oligonukleotid assoziierten Markierung getestet werden.

Die Verwendung des Ligase-vermittelten Nachweisprotokolls als Ersatz für das im vorherigen Abschnitt beschriebene PCR/Hybridisierungsprotokoll bietet zwei Hauptvorteile. Erstens ist die Wahrscheinlichkeit eines falsch positiven Ergebnisses aufgrund des OLA-Protokolls im Wesentlichen null. Zweitens ist das OLA-Protokoll sehr gut automatisierbar. Wie bei allen Plus/Minus-Assays sind jedoch geeignete Kontrollen entscheidend, um die Möglichkeit falscher Negative auszuschließen.

8.3.2.4 Die Ligase-Kettenreaktion

Durch Kombinieren von OLA zusammen mit der exponentiellen Amplifikationsstrategie der PCR wurde eine neue Technik entwickelt, die als Ligasekettenreaktion oder LCR bezeichnet wird (Barany, 1991, Weiss, 1991). Wie OLA basiert der Nachweis von Nukleotidunterschieden mit dem LCR-Protokoll auf der Anforderung einer perfekten Paarung an den beiden Stellen, die den Bruch zwischen zwei Oligonukleotiden flankieren, damit die Ligase eine Phosphodiesterbindung zwischen ihnen bilden kann, wie in Abbildung 8.8 dargestellt. Der Unterschied besteht darin, dass im LCR-Protokoll vier Oligonukleotide verwendet werden, die den Regionen entsprechen, die die polymorphe Stelle auf . flankieren beide Stränge des Ziel-DNA-Moleküls. Darin liegt der Mechanismus der Verstärkung. Wenn die Zielsequenz eine Übereinstimmung liefert, werden beide Sätze flankierender Oligonukleotide ligiert. Nach der Denaturierung kann jedes der neu erzeugten Oligonukleotide doppelter Länge nun als Matrize für einen neuen Satz von Oligonukleotiden fungieren, um Basenpaare zu bilden und zu ligieren. Somit verläuft die LCR durch Annealing-Runden in Gegenwart einer hitzestabilen Ligase, gefolgt von Denaturierung und dann erneutem Annealing. Der einzige Unterschied im Thermocycler-Muster von dem für die PCR verwendeten ist die Eliminierung des Elongationsschritts. Am Ende des Prozesses können die Produkte der LCR auf die gleiche Weise wie für OLA leicht nachgewiesen werden, wie in Abbildung 8.8 gezeigt. Im Gegensatz dazu erfordert der Nachweis polymorpher Stellen mit PCR ein Nachfolgeprotokoll – entweder Hybridisierung an ein allelspezifisches Oligonukleotid oder Restriktionsverdau gefolgt von Gelelektrophorese.

Der wesentliche Unterschied zwischen LCR und dem ursprünglichen OLA-Protokoll ist die Sensitivität: LCR benötigt weit weniger Ausgangsmaterial, da das Produkt während des Protokolls amplifiziert wird. Die Vorteile des LCR-Protokolls gegenüber der PCR sind vielfältig. Erstens erzeugt LCR wie OLA keine falsch positiven Ergebnisse. Zweitens, da das Produkt von LCR ohne weitere Nachweisschemata direkt untersucht werden kann, ist das Verfahren einer Automatisierung viel zugänglicher und ist viel wahrscheinlicher quantitativ. Der Nachteil der LCR besteht darin, dass mit ihr nur Einzelbasensubstitutionen nachgewiesen werden können, die zuvor durch Sequenzanalyse charakterisiert wurden.

8.3.3 Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (SSCP)

8.3.3.1 Historischer Hintergrund

Es gibt viele Umstände, in denen es am nützlichsten ist, Gene — im Gegensatz zu anonymen Sequenzen — direkt in experimentellen Kreuzungen verfolgen zu können. Es wurden bereits verschiedene Ansätze beschrieben, die jedoch alle ihre Grenzen haben. Gen-assoziierte RFLPs werden zwischen verschiedenen Spezies nachgewiesen — M. Spretus und traditionelle Inzucht M. musculus Stämme, zum Beispiel — in einer vernünftigen Häufigkeit, sind aber bei Inzuchten viel schwieriger zu finden M. musculus belastet sich selbst. Um einen der von Allel-spezifischen Oligonukleotiden abhängigen Ansätze zu verwenden, ist es zunächst erforderlich, den betreffenden Locus aus verschiedenen Mäusestämmen zu sequenzieren, Basenpaarvarianten zu identifizieren, die ASOs sowie andere Locus-spezifische Primer zu synthetisieren, ihre Spezifität und optimieren die Reaktionsbedingungen für jeden Locus. Und zu diesem Zeitpunkt hat man nur noch ein Protokoll zur Unterscheidung zweier Allelzustände.

Das perfekte Protokoll eines Genetikers zum Nachweis und zur Analyse von Polymorphismen an jedem Ort würde die folgenden Kriterien erfüllen. Erstens würde es den Nachweis aller Basenpaarvarianten in einer DNA-Region als multiple Allele ermöglichen. Zweitens würde es keine vorherige Sequenzinformation von jedem Allel erfordern. Drittens wäre die Synthese von ASOs nicht erforderlich. Viertens würde das Assay-Protokoll selbst keine spezielle Ausrüstung oder spezielle Fähigkeiten erfordern, die über die in einem Standardlabor für Molekularbiologie hinausgehenden hinausgehen. Schließlich wäre der Assay schnell und die Ergebnisse wären leicht reproduzierbar.

All diese Kriterien wurden zu einem guten Grad mit einem einfachen Protokoll erfüllt, das sich die Tatsache zunutze macht, dass sogar einzelne Nukleotidänderungen die dreidimensionale Gleichgewichtskonformation verändern können, die Einzelstränge bei niedrigen Temperaturen annehmen wird (Orita et al., 1989a). Wenn eine DNA-Probe bei hoher Temperatur denaturiert und dann schnell auf Eis gelegt wird, wird die Neubildung von DNA-Hybriden gehemmt. Stattdessen kollabiert jeder einzelne Strang in einer sogenannten zufälligen Spule auf sich selbst. Tatsächlich ist jetzt klar, dass jeder Einzelstrang basierend auf dem niedrigsten freien Energiezustand eine am meisten bevorzugte Konformation einnimmt. Vermutlich ist der bevorzugte Zustand einer, in dem eine große Anzahl von Basen miteinander Wasserstoffbrückenbindungen eingehen können. Selbst eine einzige Nukleotidänderung könnte den zuvor am meisten begünstigten Zustand unterbrechen und einen anderen begünstigen, der, wenn er ausreichend unterschiedlich ist, mit einer veränderten Mobilität auf einem Gel ablaufen würde. Verschiedene allelische Zustände eines Locus, die mit diesem Protokoll nachgewiesen werden, werden als . bezeichnet einzelsträngige Konformationspolymorphismen (SSCPs) (Beier et al., 1992 Beier, 1993).

8.3.3.2 Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese

Die Entwicklung des SSCP-Protokolls war das Ergebnis einer früheren Technik, die den Nachweis einzelner Basenänderungen in genomischer DNA durch Elektrophorese durch einen zunehmenden Denaturierungsmittelgradienten ermöglichte (Fischer und Lerman, 1983). Diese Technik wird denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) genannt. Kleine Sequenzänderungen haben dramatische Auswirkungen auf den Punkt im Denaturierungsgradienten, an dem sich bestimmte doppelsträngige genomische Restriktionsfragmente in Einzelstränge aufspalten würden. Mit der Anbringung einer "GC-Klemme" —, bestehend aus einer Reihe fest verbundener G:C-Basenpaare, konnte das DNA-Fragment mit einer Doppelhelix in der an den offenen Einzelsträngen befestigten Klemmregion zusammengehalten werden im geschmolzenen Bereich vorhanden. Dieses zweiphasige Molekül wäre sehr resistent gegen eine weitere Migration im Gel und würde im Wesentlichen halt in seiner Spur. Zwei allelische Formen eines genomischen Fragments, die sich nur durch ein einziges Basenpaar unterscheiden, würden diesen Übergang an verschiedenen Denaturierungspunkten durchlaufen, und dies würde als unterschiedliche Migrationsdistanzen in dem denaturierenden Gradientengel beobachtet werden. Im ursprünglichen Protokoll wurden verschiedene Allelformen direkt innerhalb der gesamten genomischen DNA nach Southern-Blotting und Hybridisierung an eine Locus-spezifische Sonde nachgewiesen. Zum Zeitpunkt der Entwicklung von DGGE gab es keine anderen Mittel zum Nachweis von Basenpaaränderungen, die die Restriktionsstellen nicht veränderten, und somit erweiterte DGGE den Polymorphismushorizont. Leider erfordert DGGE die Verwendung von speziell angefertigten Geräten und ist auf routinemäßiger Basis mühsam.

In den letzten Jahren wurde das DGGE-Protokoll zur Verwendung in Verbindung mit PCR als Mittel zum anfänglichen Nachweis von Allelvarianten unter Proben modifiziert, die von verschiedenen Individuen innerhalb einer Population gewonnen wurden (Sheffield et al., 1989). Die differentielle Migration von PCR-Produkten kann direkt in Gelen mit Ethidiumbromid-Färbung nachgewiesen werden, und varianten Allele können zur Sequenzanalyse aus dem Gel ausgeschnitten werden. Der Hauptvorteil der Verwendung von DGGE besteht darin, dass fast alle Substitutionen einzelner Basen nachgewiesen werden können (Myers et al., 1985). Somit ist es ideal für die Situation, in der man nach seltenen varianten Allelen unter Individuen innerhalb einer Population suchen möchte, ohne die Notwendigkeit einer Sequenzierung durch alle Wildtyp-Allele, die in den meisten Proben vorhanden sind. Dennoch lässt sich DGGE nicht leicht skalieren und ist daher nicht die Methode der Wahl, wenn auch ein anderes weniger arbeitsintensives Protokoll zum Nachweis allelischer Varianten verwendet werden kann. In vielen Fällen ist SSCP das bessere Protokoll.

8.3.3.2 Das SSCP-Protokoll und seine Empfindlichkeit

Einer der Hauptvorteile des neuen SSCP-Erkennungsprotokolls, das von Orita et al. (1989a 1989b) ist seine Einfachheit. In seiner Grundform werden PCR-Produkte einfach bei 94 ° denaturiert, auf Eistemperatur gekühlt, um die Hybridbildung zu verhindern, und dann auf nicht denaturierenden Standard-Polyacrylamidgelen elektrophoretisiert.

Die beiden Stränge des PCR-Produkts laufen normalerweise mit sehr unterschiedlichen Mobilitäten, und Basenänderungen können die Mobilität jedes Strangs weiter verändern. Was nach Standardanalyse ein einzelnes PCR-Produkt zu sein scheint, kann sich daher auf einem SSCP-Gel in vier verschiedene Banden aufspalten, wenn die ursprüngliche DNA-Probe heterozygot für Basenänderungen war, die die Mobilität beider Stränge veränderten.

Verschiedene Studien haben Paare von PCR-Produkten analysiert, von denen bekannt ist, dass sie sich durch Substitutionen einzelner Basen unterscheiden, um eine Schätzung der Fraktion zu erhalten, die durch das SSCP-Protokoll unterschieden werden kann. In einer solchen Studie waren 80 % von 228 varianten PCR-Produkten unterscheidbar (Sheffield et al., 1993). In einer anderen Studie lag die Nachweisrate bei 80-90% (Michaud et al., 1992). Wenn dieser letzte Satz von Proben jedoch unter drei verschiedenen elektrophoretischen Bedingungen analysiert wurde, betrug die Nachweisrate erstaunliche 100 %.

8.3.3.3 Ein leistungsfähiges Werkzeug zum Nachweis von Polymorphismen bei klassischen Inzuchtstämmen

Wenn eine SSCP-Analyse an einem Satz von PCR-Produkten durchgeführt wurde, die entweder aus den 3'-untranslatierten oder intronischen Regionen von 30 zufälligen Mausgenen amplifiziert wurden, zeigten 43% Polymorphismus in einem Vergleich der klassischen Inzuchtstämme B6 und DBA und 86% zeigten Polymorphismus zwischen B6 und M. Spretus (Beier et al., 1992). Die Rate, mit der SSCP-Polymorphismen zwischen B6 und DBA entdeckt werden, ist viel höher als die bei der RFLP-Analyse beobachtete und liegt im gleichen Bereich wie die Polymorphismus-Frequenzen, die für Mikrosatelliten beobachtet wurden, die in Abschnitt 8.3.6 beschrieben werden.

Der SSCP-Ansatz bietet gegenüber anderen Systemen zum Nachweis von Polymorphismen eine Reihe von Vorteilen: (1) SSCP ist potenziell auf alle einzigartigen Sequenzen anwendbar, sowohl innerhalb von Genen als auch in nicht-genen Regionen (2) PCR-Primer können direkt aus cDNA-Sequenzen entworfen werden und (3) Wenn eine amplifizierte Region keinen Polymorphismus zeigt, kann man sich immer stromaufwärts oder stromabwärts zu einer anderen bewegen. Es ist jedoch immer noch wahrscheinlich, dass Mikrosatelliten — die in Abschnitt 8.3.6 beschrieben — eine größere Anzahl verschiedener Allele aufweisen, was sie für einfache Fingerprinting-Ansätze nützlicher macht. Zusammen bieten SSCP und Mikrosatellitenanalyse ein leistungsstarkes Paar von PCR-basierten Werkzeugen für die klassische Kopplungsanalyse mit rekombinanten Panels, die sowohl aus intra- als auch interspezifischen Kreuzungen abgeleitet wurden.

8.3.4 Zufällige Amplifikation polymorpher DNA

Bei allen bisher beschriebenen PCR-Protokollen besteht ein absolutes Erfordernis für bereits vorhandene Sequenzinformationen, um die Primer zu entwerfen, von denen die spezifische Amplifikation abhängt. 1990 demonstrierten zwei Gruppen, dass einzelne kurze zufällige Oligonukleotide beliebiger Sequenz verwendet werden können, um die Amplifikation genomischer Sequenzen auf reproduzierbare und polymorphe Weise zu primen (Welsh und McClelland, 1990, Welsh et al., 1991 Williams et al., 1990). Dieses Protokoll wird als zufällige Amplifikation polymorpher DNA (RAPD) bezeichnet. Das Prinzip hinter dem Protokoll ist wie folgt. Kurze Oligonukleotide mit zufälliger Sequenz werden zufällig zu zahlreichen Sequenzen innerhalb des Genoms komplementär sein. Liegen zwei komplementäre Sequenzen auf gegenüberliegenden Strängen einer genomischen Region in der richtigen Orientierung und in einem ausreichenden Abstand voneinander vor, kann die DNA zwischen ihnen durch PCR amplifiziert werden. Jedes amplifizierte Fragment wird unabhängig von allen anderen sein und wird wahrscheinlich auch eine andere Länge haben, wenn nur wenige genug Banden amplifiziert werden, alle werden durch Gelelektrophorese voneinander auflösbar sein. Unterschiedliche Oligonukleotide werden völlig unterschiedliche Sätze von Loci amplifizieren.

RAPD-Polymorphismen resultieren aus der Tatsache, dass eine Primerhybridisierungsstelle in einem Genom, die an a Einzel Nukleotid in einem zweiten Genom kann zur Eliminierung eines spezifischen Amplifikationsprodukts aus diesem zweiten Genom führen, wie in Abbildung 8.9 dargestellt. Wenn beispielsweise der verwendete Zufallsprimer eine Länge von 10 Basen hat, wird jedes PCR-Produkt durch 20 Basen (10 im Primer-Target an jedem Ende) definiert, die alle für polymorphe Veränderungen anfällig sind. 60 Der resultierende Polymorphismus wird als di-allelisches +/-System erkannt.

Geht man von der Annahme aus, dass eine vollständige Komplementarität zwischen Primer und Target für eine effiziente Amplifikation erforderlich ist, wird es möglich, eine allgemeine Gleichung abzuleiten, um die ungefähre Zahl vorherzusagen, EIN, von amplifizierten Banden, die als PCR-Produkte eines komplexen Genoms erwartet werden C die mit einem einzigen Oligomer der Länge geprimt ist n. 61 Für amplifizierte Fragmente von 2 kb oder kleiner 62 lautet die Gleichung:

Nehmen wir 2x10 9 als Schätzwert für die Komplexität des Einzelkopie-Anteils des Mausgenoms (siehe Abschnitt 5.1.2) und lösen wir Gleichung 8.1 für Primerlängen, die von 8 bis 11 variieren n = 8, die vorhergesagte Anzahl von PCR-Produkten beträgt 18.626 — viel zu viele, um sie durch irgendeine Art von Gelanalyse aufzulösen. Mit n = 9, die Gleichung sagt 116 PCR-Produkte voraus, was immer noch eine zu hohe Zahl ist. Mit n = 10, die Vorhersage beträgt 7,2 Produkte und bei einem 11-mer beträgt die Vorhersage 0,45 Produkte. Somit wäre die Verwendung von zufälligen 10-meren am geeignetsten, um eine maximale Anzahl von leicht auflösbaren Banden aus dem Mausgenom zu erhalten.

Optimierungen des vollständigen RAPD-Protokolls von den Parametern, nach denen Primersequenzen ausgewählt werden, bis hin zu den für die PCR verwendeten Bedingungen wurden veröffentlicht (Williams et al., 1990, Nadeau et al., 1992). Es ist tatsächlich möglich, mehrere PCR-Produkte mit Primern zu erhalten, die länger als 10mer sind, wenn entspannte Reaktionsbedingungen verwendet werden, um eine Amplifikation von fehlgepaarten Zielsequenzen zu ermöglichen. Tatsächlich hat eine Gruppe vorgeschlagen, dass 12-14-mer-Primer optimal sind (Nadeau et al., 1992). Es ist auch möglich, die vorhergesagte Anzahl von Produkten um einen einfachen Faktor von drei zu erhöhen, indem zwei nicht verwandte Zufallsprimer derselben Länge in jede PCR-Reaktion aufgenommen werden. In jedem Fall, in dem die Zahl der sichtbaren PCR-Produkte über 12-20 liegt, wäre es jedoch erforderlich, Polyacrylamid-Gele anstelle von Agarosegelen zu verwenden, um jede Bande klar aufzulösen, so dass der Kompromiss für die Detektion von mehr loci ist eine zeitaufwendigere Analyse. Am Ende das Protokoll, das am wenigsten Zeit zum Tippen benötigt pro Ort ist diejenige, die gewählt werden sollte. Da sich verschiedene Labore oft mit unterschiedlichen Techniken auszeichnen, sollten die optimalen Bedingungen für die RAPD-Analyse in jedem Labor unabhängig bestimmt werden.

Eine umfassende RAPD-Analyse der beiden am besten charakterisierten Inzuchtstämme — B6 und DBA — wurde mit 481 unabhängigen 10-meren durchgeführt, die einzeln in PCR-Reaktionen verwendet wurden (Woodward et al., 1992). Es wurden durchschnittlich 5,8 PCR-Produkte pro Reaktion beobachtet, was sich nicht sehr von dem aus Gleichung 8.1 vorhergesagten unterscheidet. In einem direkten Stammvergleich wurden 95 reproduzierbare Unterschiede zwischen B6 und DBA unter dem vollständigen Satz von 2.900 detektierten diskreten Banden beobachtet. Unter der Annahme, dass jeder Polymorphismus aus einer einzelnen Nukleotidänderung in einem der beiden Primer-Targets resultiert und alle diese Änderungen nachweisbar sind, wird es möglich, den durchschnittlichen Sequenzunterschied zwischen diesen beiden Stämmen bei 1,6 Änderungen pro 1.000 Nukleotide zu berechnen. Dieser geringe Polymorphismus ist nicht unerwartet, wenn man bedenkt, dass alle klassischen Inzuchtstämme einen hohen Verwandtschaftsgrad aufweisen (siehe Abschnitt 2.3.4).

Die Verwendung von RAPD als Methode zum Nachweis von Polymorphismen zwischen B6 und DBA scheint eher ineffizient zu sein — im Durchschnitt wurde nur ein Polymorphismus von fünf durchgeführten Primerreaktionen nachgewiesen. Ein zweiter negativer Faktor ist, dass alle RAPD-Polymorphismen binäre +/-Systeme sind. Somit kann, wie oben für RFLPs diskutiert, ein zwischen einem Paar von Stämmen nachgewiesener Polymorphismus nicht für ein anderes Paar von Stämmen verwendet werden. Außerdem ist es nicht möglich, Tiere, die an irgendeinem Locus heterozygot sind, von solchen zu unterscheiden, die für das Allel "+" homozygot sind. Somit wäre im Durchschnitt nur die Hälfte der zwischen zwei Stämmen nachgewiesenen RAPD-Polymorphismen bei den Nachkommen einer Rückkreuzung auf einen Elternteil kartierbar, und mit einem Interkreuz-Kartierungssystem ist der RAPD-Ansatz sogar noch eingeschränkter (siehe Abschnitt 9.4.3).

Dennoch gibt es viele Merkmale, die für die Nützlichkeit des RAPD-Ansatzes sprechen. An erster Stelle steht die relative Geschwindigkeit und Leichtigkeit, mit der Ergebnisse erhalten werden können — es ist kein Blotting oder eine radioaktive Hybridisierung erforderlich, und eine vollständige Analyse von Anfang bis Ende kann innerhalb eines einzigen Arbeitstages durchgeführt werden, im Gegensatz zu RFLP- oder Minisatelliten-Studien . Im Gegensatz zu allen anderen PCR-basierten Protokollen sind RAPD-Primer nicht von den Ergebnissen kostspieliger Klonierungs- und Sequenzierungsstudien abhängig, und sobald sie erhalten sind, sind die Hauptkosten pro Probe die für die PCR verwendete DNA-Polymerase. Somit kann das RAPD-Protokoll selbst bei Vergleichen von Inzuchtstämmen im Vergleich zu anderen Techniken zur Erzeugung zufälliger DNA-Marker auf lange Sicht effizienter sein. Außerdem kann die Klonierung von RAPD-Fragmenten nach der einfachen Gewinnung von Ethidiumbromid-detektierten Banden schnell erreicht werden.Klonierte RAPD-Loci haben gegenüber Minisatelliten und Mikrosatelliten einen Vorteil darin, dass RAPD-Loci keine repetitiven Sequenzen enthalten müssen und die meisten nicht enthalten werden.

Wie bei traditionellen RFLP-Loci ist das Interspezies-Niveau des RAPD-Polymorphismus viel höher als bei den traditionellen Inzuchtstämmen. Die Daten von Serikawa et al. (1992) weisen auf eine fünffache Zunahme der Anzahl polymorpher Banden hin, die bei Vergleichen zwischen M. Spretus und traditionellen Laborstämmen entspricht diese Zunahme der bekannten Zunahme der genetischen Vielfalt. Somit wird die RAPD-Technologie für die Markerentwicklung in Kreuzungen, die einen Elternteil enthalten, der nicht von einem der traditionellen Inzuchtstämme stammt, noch effizienter sein.

Wie bei der Minisatellitenanalyse kann das RAPD-Protokoll genomische Fingerabdrücke liefern, die gleichzeitig über das Genom verteilte Loci scannen. In einer Analyse von 32 repräsentativen Inzuchtstämmen, die im Jackson Laboratory gepflegt wurden, definierten Nadeau und Kollegen (1992) 29 einzigartige Stamm-Fingerabdrücke unter Verwendung von nur sechs Primern. Somit scheint RAPD ein effizientes und einfaches Mittel bereitzustellen, um die genetische Reinheit von Inzuchtlinien kontinuierlich zu überwachen.

Schließlich sollte erwähnt werden, dass das RAPD-Protokoll zwar eine nützliche und wichtige Ergänzung des Arsenals an verfügbaren Werkzeugen für die genetische Analyse der Maus ist, aber für genetische Studien anderer Arten, einschließlich Tiere und Pflanzen, von weitaus größerer Bedeutung ist , die auf DNA-Ebene nicht gut charakterisiert sind. Für diese anderen Spezies kann die RAPD-Technologie eine einzigartige Methode zur schnellen Entwicklung genetischer Marker und Karten bereitstellen, noch bevor DNA-Bibliotheken und Klone verfügbar sind.

8.3.5 Eingestreute repetitive Sequenz-PCR

Das Prinzip hinter dem RAPD-Ansatz besteht darin, dass Oligonukleotide mit einer im Wesentlichen zufälligen Sequenz an zufälligen Positionen im Genom (der Maus und jeder anderen Spezies) in einer mathematisch vorbestimmbaren Häufigkeit vorhanden sind. Somit kann man durch Auswahl von Oligonukleotiden einer geeigneten Größe und durch Ausführen von PCR-Amplifikationsreaktionen unter den geeigneten Bedingungen die Anzahl der unabhängigen genomischen Fragmente, die amplifiziert werden, so steuern, dass sie durch ein gewähltes Gelelektrophoresesystem optimal aufgelöst werden können. Obwohl für die Kopplungsanalyse nützlich, erlaubt der RAPD-Ansatz keine Unterscheidung von Maussequenzen von denen anderer Spezies und kann daher nicht als Mittel zur Gewinnung von Maus-Genomfragmenten aus Zellen verwendet werden, die einen definierten Teil des Mausgenoms enthalten den Kontext des heterologen genetischen Hintergrunds.

Ein alternativer Ansatz, der wie RAPD auch die gleichzeitige PCR-Amplifikation mehrerer genomischer Fragmente ermöglicht, basiert auf dem natürlichen Vorkommen von DNA-Elementen mit hoher Wiederholungsrate, die im gesamten Genom verteilt sind. Drei Familien von Maus-Wiederholungselementen — B1, B2 und L1 — sind jeweils in ungefähr 100.000 Kopien vorhanden (siehe Abschnitt 5.4). Eine Amplifikation dieser Elemente an und für sich mit Repeat-spezifischen Primern wäre nicht sinnvoll, erstens, weil ihre Kopienzahlen zu groß sind, um von jedem verfügbaren Gelsystem aufgelöst zu werden, und zweitens, weil es keine Möglichkeit gäbe, die meisten einzelnen Elemente zu unterscheiden voneinander entfernt, da die meisten die gleiche Konsensgröße haben würden. Wenn man jedoch stattdessen einen wiederholungsspezifischen Primer verwendet, der aus dem Element "aussah", würde man nur DNA-Regionen amplifizieren, die zwischen zwei Elementen vorhanden sind, die ausreichend nah beieinander und in der richtigen Orientierung sind, um die PCR-Reaktion zu ermöglichen fortfahren. Die Anzahl der Fälle, in denen zwei Elemente diese Bedingungen erfüllen würden, wird viel geringer sein als die Gesamtkopienzahl, da diese Elemente im Durchschnitt in Abständen von ungefähr 30 kb voneinander entfernt sind 63 und für alle praktischen Zwecke die PCR-Amplifikation dies nicht tut treten über Entfernungen von mehr als 1-2 Kilobasen auf. Durch die Arbeit mit (1) einem oder einer Kombination von zwei oder mehr Primern zusammen, die (2) an ganze Familien oder Teilmengen von Elementen innerhalb einer Familie hybridisieren, von (3) zwei Enden desselben Elements oder von verschiedenen Elementen, kann man einstellen die Anzahl der PCR-Produkte, die erzeugt werden, um die maximale Anzahl zu erhalten, die durch ein ausgewähltes System der Gelelektrophorese aufgelöst werden kann (Herman et al., 1992).

Dieses allgemeine Protokoll wird als . bezeichnet Eingestreute repetitive Sequenz (IRS) PCR (IRS-PCR). Es wurde zuerst für die Verwendung mit dem stark wiederholten . entwickelt Alu Familie von Elementen im menschlichen Genom (Nelson et al., 1989) und wurde anschließend auf das Mausgenom angewendet (Cox et al., 1991). Cox und Mitarbeiter verwendeten individuelle Primer, die jede der Hauptklassen hochdisperser repetitiver Elemente — B1, B2 und L1 — repräsentierten, um genomische Fragmente von Inzucht-B6-Mäusen zu amplifizieren (M. musculus) und M. Spretus. Obwohl die bei der Agarosegelelektrophorese erhaltenen IRS-PCR-Muster äußerst komplex waren, war es möglich, klare Hinweise auf die Speziesspezifität zu erkennen. Um die Muster zu vereinfachen, haben diese Arbeiter die IRS-PCR-Produkte geblottet und sequentiell an Oligonukleotide mit einfacher Sequenz (12-mere, die drei Tandemkopien eines Tetramers enthalten) hybridisiert, die häufig im Genom vorhanden sind, aber nur zufällig in einer Untergruppe der amplifizierten inter -Regionen wiederholen. Die erhaltenen vereinfachten Muster ermöglichten die Identifizierung und Kartierung von 13 neuen polymorphen Loci.

Der Nutzen der IRS-PCR als allgemeines Kartierungswerkzeug ist eindeutig nicht größer als der der RAPD-Technik oder eines anderen Protokolls, das die zufällige Amplifikation von PCR-Fragmenten aus der Umgebung des Genoms ermöglicht. Die wahre Stärke der IRS-PCR liegt jedoch nicht in der allgemeinen Kartierung, sondern in der Identifizierung und Gewinnung mausspezifischer Sequenzen aus Zellhybriden, wie in Abschnitt 8.4 diskutiert.

8.3.6 Mikrosatelliten: Einfache Sequenzlängenpolymorphismen

8.3.6.1 Die magische Kugel ist angekommen

Obwohl die Fähigkeit, einfache Basenpaar-Substitutionen zu identifizieren und zu typisieren, die Genetik veränderte, war sie kein Allheilmittel. Das Auffinden von RFLPs innerhalb einer klonierten Region ist oft nicht einfach, wenn sie gefunden werden, ihr polymorpher Gehalt ist oft begrenzt und schließlich diallel, schließlich ist die Typisierung einer großen Anzahl von RFLP-Loci durch Southern-Blot-Analyse relativ arbeitsintensiv. Nicht-RFLP-Basisänderungen können ebenfalls schwer zu finden sein, obwohl diese Aufgabe mit der Entwicklung des SSCP-Protokolls einfacher geworden ist. Allerdings zeigen die meisten SSCPs immer noch einen begrenzten polymorphen Gehalt mit nur zwei unterscheidbaren Allelen. Minisatelliten sind viel polymorpher als Loci, die durch Nukleotid-Substitutionen definiert sind, und Minisatelliten-Sonden ermöglichen es oft, gleichzeitig mehrere über das Genom verteilte Loci zu typisieren. Jedoch weisen Minisatellitenelemente als Klasse keine einzigartigen Sequenzmerkmale auf und werden nur durch die Southern-Blot-Muster erkannt, die sie erzeugen, wenn sie als Sonden verwendet werden. Die Zahl der bisher entdeckten Minisatelliten-Loci beträgt weniger als 1.000. Somit können Minisatelliten im Allgemeinen keine spezifischen Griffe zum Typisieren neu klonierter Gene oder genomischer Regionen bereitstellen. Andere zuvor beschriebene Verfahren der Multi-Locus-Analyse leiden an den gleichen Einschränkungen.

Im nächsten Kapitel wird man sehen, dass eine sehr wichtige Verwendung von DNA-Markern nicht darin besteht, bestimmte interessierende Gene in einer Segregationsanalyse zu verfolgen, sondern vielmehr "Anker" bereitzustellen, die entlang jedes Chromosoms im Genom. Zusammen können diese Anker-Loci verwendet werden, um "Framework Maps" für neue Kreuzungen zu erstellen, die wiederum verwendet werden können, um schnell jeden neuen Locus oder jede Mutation, die von echtem Interesse ist, zu kartieren. Wenn die Anzahl der Anker ausreicht, ist nur ein einziges Kreuz erforderlich, um eine Kartenposition für den neuen Ort bereitzustellen. Es ist nicht erforderlich, dass Anker-Loci die tatsächlichen Gene repräsentieren. Ihr einziger Zweck besteht darin, bestimmte Punkte entlang des DNA-Moleküls in jedem der Chromosomen in einem Genom zu markieren.

Es gibt drei Kriterien, die perfekte Ankerorte definieren. Erstens sollten sie extrem polymorph sein, damit es eine gute Chance gibt, dass zwei beliebige Chromosomenhomologe in einer Spezies unterschiedliche Allele tragen. Zweitens sollten sie leicht zu identifizieren sein, damit man einen geeigneten Satz von Ankern für die Analyse jeder komplexen Spezies entwickeln kann, die ein Genetiker untersuchen möchte. Schließlich sollten sie bei einer großen Anzahl von Personen leicht und schnell einzugeben sein.

Mit Beginn der 1990er Jahre ist nun das gekommen, was Genetiker (die die Maus sowie alle anderen Säugetiere untersuchen) in der Tat auf das Wundermittel gewartet haben: ein genomisches Element mit ungewöhnlich hohem polymorphem Gehalt, das bei hohe Dichte in allen untersuchten Säugetiergenomen, lässt sich leicht aufdecken und schnell typisieren: der Mikrosatellit. Ein Mikrosatellit — auch bekannt als Simple Sequence Repeat (oder SSR) — ist ein genomisches Element, das aus einer mono-, di-, tri- oder tetrameren Sequenz besteht, die mehrfach in einem Tandem-Array wiederholt wird.

Im Gegensatz zu anderen Familien dispergierter kreuzhybridisierender Elemente — wie B1, B2 und L1 —, bei denen einzelne Loci durch Retrotransposition von gemeinsamen Vorfahrensequenzen abgeleitet werden (siehe Abschnitt 5.4), werden mit ziemlicher Sicherheit einzelne Mikrosatelliten-Loci abgeleitet de novo, durch das zufällige Auftreten kurzer einfacher Sequenzwiederholungen, die eine Vorlage für ungleiche Crossover-Ereignisse liefern (wie in Abbildung 8.4 dargestellt), die durch stochastische Prozesse zu einer Erhöhung der Anzahl der Wiederholungen führen können. Im Allgemeinen sind Mikrosatelliten-Loci nicht über weit entfernte Artenlinien hinweg konserviert, zum Beispiel von der Maus bis zum Menschen, und es scheint unwahrscheinlich, dass diese Elemente — die praktisch keinen Informationsgehalt haben — irgendeine Funktionalität entweder zum Nutzen der Wirtsgenom 64 oder an und für sich. Mikrosatelliten scheinen keine egoistischen Elemente zu sein (siehe Abschnitt 5.4). Vielmehr sind Mikrosatelliten wie Minisatelliten einfach genomische Macken, die aus Fehlern bei der Rekombination oder Replikation resultieren.

Es wurden Mikrosatelliten identifiziert, die alle Nukleotidkombinationen enthalten. Die am häufigsten im Mausgenom gefundene Klasse enthält jedoch ein (CA) n •(GT) n -Dimer und wird oft als CA-Wiederholung bezeichnet. Die Existenz von CA-Repeats, ihr Vorkommen bei hoher Kopienzahl und ihre Verteilung über die Genome einer Vielzahl von höheren eukaryotischen Spezies wurde erstmals vor einem Jahrzehnt von mehreren verschiedenen Laboratorien nachgewiesen (Miesfeld et al., 1981 Hamada et al., 1982 Jeang und Hayward, 1983). Obwohl im folgenden Jahrzehnt unabhängige Beispiele für CA-Repeat-Polymorphismen auftauchten, fanden erst 1989 drei unabhängig voneinander arbeitende Gruppen ausreichende Beweise dafür, dass Mikrosatelliten als Klasse von Natur aus extrem polymorph waren (Pickford, 1989 Weber und May, 1989 Pedersen et al ., 1993). Weitere systematische Studien haben den hohen Polymorphismus bestätigt, der mit vielen Mikrosatelliten-Loci in allen untersuchten höheren Eukaryoten verbunden ist.

8.3.6.2 Typisierung durch PCR

Ohne PCR wären die meisten Mikrosatelliten als genetische Marker nutzlos. Die allelische Variation 65 basiert vollständig auf Unterschieden in der Anzahl von Wiederholungen, die in einem Tandem-Array vorhanden sind, und nicht auf spezifischen Basenpaar-Änderungen. Die einzige Möglichkeit, Allele zu unterscheiden, besteht also darin, die Gesamtlänge des Mikrosatelliten zu messen. Dies wird am einfachsten durch PCR-Amplifikation des Mikrosatelliten selbst zusammen mit einer kleinen Menge definierter flankierender Sequenz auf jeder Seite erreicht, gefolgt von Gelelektrophorese, um die relative Größe des Produkts zu bestimmen, wie in Abbildung 8.10 dargestellt.

Mikrosatelliten-Loci können auf zwei Arten identifiziert werden – durch Durchsuchen von DNA-Sequenzdatenbanken oder durch Hybridisieren an Bibliotheken oder Klone mit einem geeigneten Oligonukleotid wie (CA) 15 . Im ersteren Fall werden flankierende Sequenzinformationen direkt aus der Datenbank bezogen. Im letzteren Fall ist es zunächst notwendig, über die Wiederholungsregion hinweg zu sequenzieren, um flankierende Sequenzinformationen abzuleiten. Ein einzigartiges Oligonukleotid auf jeder Seite des Repeats wird für die Produktion eines Primers gemäß den Kriterien, die oben in Abschnitt 8.3 beschrieben sind, ausgewählt. Es ist am besten, zwei Primer zu wählen, die so nah wie möglich an der Wiederholungssequenz liegen – je kleiner das PCR-Produkt, desto einfacher ist es, einen absoluten Größenunterschied zu erkennen. Variationen in der Länge von PCR-Produkten können durch Trennung auf NuSieve™-Agarose (FMC Corp.)-Gelen (Love et al., 1990 Cornall et al., 1991) oder Polyacrylamidgelen (Weber und May, 1989, Love et al. , 1990). Agarosegele sind einfacher zu handhaben, Polyacrylamidgele bieten jedoch eine höhere Auflösung. Wenn Allele mit nativen Gelen schwer aufzulösen sind, ist es oft möglich, die Auflösung durch denaturierende Gele zu verbessern. Banden werden durch Ethidiumbromid- oder Silberfärbung von Gelen oder durch Autoradiographie von PCR-Produkten, die mit markierten Primern gebildet wurden, nachgewiesen.

Eine noch höhere Kosteneffizienz kann durch die Kombination von zwei oder mehr Loci zur gleichzeitigen Analyse durch Multiplex-PCR erreicht werden. Proben können vor der PCR-Reaktion kombiniert werden — wenn gezeigt wurde, dass die verschiedenen Primerpaare keine kombinatorischen Artefakte verursachen — oder nach der PCR-Reaktion, aber vor dem Gellauf. In allen Fällen lässt sich der gesamte Prozess automatisieren.

8.3.6.3 Klassifizierung und Häufigkeit von Mikrosatelliten

Mikrosatelliten können zuerst nach der Anzahl der Nukleotide in der Wiederholungseinheit klassifiziert werden. Mononukleotid- und Dinukleotid-Wiederholungselemente sind ziemlich häufig, wobei mit jedem nachfolgenden Inkrement der Nukleotidlänge — von Trinukleotid über Tetranukleotid zu Pentanukleotid — die Häufigkeit des Auftretens schnell abnimmt. Perfekt Mikrosatelliten sind solche, die ein einzelnes ununterbrochenes Wiederholungselement enthalten, das auf beiden Seiten von nicht wiederholten Sequenzen flankiert wird (Weber, 1990). Ein großer Teil der Mikrosatelliten-Loci ist unvollkommen mit zwei oder mehr Durchläufen derselben Wiederholungseinheit, die durch kurze Abschnitte anderer Sequenzen unterbrochen werden. Die polymorphen Eigenschaften unvollkommener Mikrosatelliten werden durch die längste Strecke der perfekten Wiederholung innerhalb des Ortes bestimmt. Nicht selten sind Mikrosatelliten von unvollkommen und Verbindung Natur, mit einer Vermischung von zwei oder mehr unterschiedlichen Läufen unterschiedlicher Wiederholungseinheiten.

Basierend auf einer quantitativen Dot-Blot-Analyse schätzten Hamada und seine Kollegen (1982a, 1982b) die Zahl der CA-Repeat-Loci im Mausgenom auf 𞲔.000, was einem Durchschnitt von einem Locus alle 30 kb entspricht. Eine weitere Schätzung der CA-Wiederholungskopienzahl wurde durch Scannen von 287 kb genomischer Maussequenzen, die in die GenBank für (CA) n eingegeben wurden, erhalten, wobei n sechs oder mehr war (Stallings et al., 1991). Diese Analyse ergab, dass sich CA im Durchschnitt einmal alle 18 kb wiederholt. Der Unterschied zwischen diesen beiden Schätzungen kann vollständig durch Sequenzen mit nur 6-9 Wiederholungen erklärt werden, die zu kurz sind, um durch die auf Hybridisierung basierende Dot-Blot-Analyse nachgewiesen zu werden (Weber, 1990).

Die zweithäufigste Mikrosatellitenklasse im Mausgenom ist die GA-Wiederholung, die mit einer Häufigkeit von etwa der Hälfte der für CA-Wiederholungen beobachteten auftritt (Cornall et al., 1991). GA-Repeat-Loci sind ebenso wahrscheinlich polymorph wie CA-Repeat-Loci. Durch das gleichzeitige Screening nach beiden können die Chancen, einen nützlichen Mikrosatelliten zu finden, um 50% erhöht werden.

Das Mononukleotid-Repeat poly(A•T) wird im Mausgenom mit einer Häufigkeit gefunden, die der der CA-Repeats ähnelt, wenn nicht sogar größer. Es ist jedoch oft in den stark dispergierten B1-, B2- und L1-Wiederholungen enthalten, die ihrerseits in 𞲔.000 Kopien pro haploidem Genom vorhanden sind. Daher werden zufällige Screenings auf Poly(A•T)-Trakten Forscher häufig in diesen ausgedehnteren repetitiven Regionen landen, wo es schwierig sein wird, ortsspezifische Primerpaare für die PCR-Analyse abzuleiten. Wenn man sich dieser Falle bewusst ist, wird es jedoch möglich, Computerprogramme zu verwenden, um bei dieser Aufgabe zu helfen, und es ist oft möglich, Mikrosatelliten-enthaltende B1-(oder B2- oder L1)-Elemente zu tippen (Aitman et al., 1991) . Mononukleotid-Wiederholungen, sowohl innerhalb als auch außerhalb der komplexeren Wiederholungselemente, sind genauso wahrscheinlich polymorph wie Dinukleotid-Wiederholungen (Aitman et al., 1991). Ein zweiter potenzieller Fallstrick bei langen Poly(A•T)-Trakten besteht jedoch darin, dass wie bei langen (TA) n •(AT) n-Dinukleotid-Trakten eine reduzierte Schmelztemperatur vorliegt, die den Einsatz von PCR erforderlich macht Elongationsschritte unter Bedingungen reduzierter Spezifität, was zu einem erhöhten Auftreten von Artefaktprodukten führt. Als Folge dieser Fallstricke wurden Poly(A•T)-Trakten viel seltener als Quelle für polymorphe Mikrosatelliten-Marker verwendet. Der Mikrosatellit Poly(C•G) ist mit keiner dieser Fallstricke verbunden, wird aber viel seltener – um eine Größenordnung – im Mausgenom beobachtet (Aitman et al., 1991).

Tri- und Tetranukleotid-Wiederholungseinheiten-Mikrosatelliten sind ebenfalls im Genom vorhanden, jedoch mit einer Häufigkeit, die zehnmal unter der der Dinukleotid-(CA)n- und (GA)n-Loci liegt (Hearne et al., 1992). 67 Als solche werden sie in genomischen Bibliotheken und einzelnen Klonen viel seltener vertreten sein. Sobald sie jedoch entdeckt wurden, sind diese Mikrosatelliten höherer Ordnung viel besser zu bearbeiten als die Dinukleotid-Loci. Der Polymorphismus, der bei den Tri- und Tetranukleotid-Loci beobachtet wird, scheint dem bei CA- und GA-Wiederholungen beobachteten ähnlich zu sein, aber Allele werden mit 3-4 bp-Mobilitätsverschiebungen für jede Wiederholungseinheitsdifferenz viel leichter aufgelöst. Darüber hinaus erscheinen Leitern von artefaktischen PCR-Produkten, die üblicherweise bei Dinukleotid-Wiederholungen gesehen werden, nicht so oft oder so intensiv bei Wiederholungseinheiten-Loci höherer Ordnung (Hearne et al., 1992).

8.3.6.4 Polymorphismusniveaus und Mutationsraten

Wie bei Minisatelliten-Loci ist die Erzeugung neuer Mikrosatelliten-Allele nicht auf klassische Mechanismen der Mutagenese zurückzuführen. Vielmehr wird die Anzahl der Tandem-Wiederholungen als Folge von Fehlpaarungen oder Schlupf während der Rekombination oder Replikation innerhalb der Tandem-Wiederholungssequenz geändert. Wie in Abbildung 8.4 dargestellt, erzeugen Ereignisse dieses Typs neue Allele, indem sie die Größe des Locus vergrößern oder verkleinern. Die Häufigkeit, mit der diese Ereignisse auftreten, ist eine Funktion der Anzahl der Wiederholungen im Locus mit einer sigmoidalen Verteilung. CA-Mikrosatelliten mit 10 oder weniger Wiederholungseinheiten zeigen wahrscheinlich keinen Polymorphismus mit 11 bis 14 Wiederholungseinheiten, es besteht eine mittlere und steigende Wahrscheinlichkeit, Polymorphismus mit 15 Wiederholungseinheiten oder mehr zu erkennen, es besteht eine maximale Wahrscheinlichkeit, Polymorphismus zu erkennen (Weber , 1990 Dietrich et al., 1992). Um die Wahrscheinlichkeit des Erkennens von Polymorphismus zu maximieren, sollte man daher die Analysen auf CA-Repeat-Loci mit n >= 15. Hybridisierungsscreens können eingerichtet werden, um diese Aufgabe zu erfüllen, indem Blots mit einem (CA) 15 -Oligonukleotid unter hochstringenten Bedingungen von 65 °C mit 0,1 X SSC untersucht werden (Dietrich et al., 1992).

Eine Vielzahl von Laboratorien hat inzwischen die Ergebnisse von Untersuchungen zur Häufigkeit des Nachweises von Mikrosatelliten-Polymorphismen im Vergleich von zwei oder mehr Inzuchtstämmen oder Mausspezies veröffentlicht.Es ist zu erwarten, dass die tatsächlichen Ergebnisse je nach der Methode zur Gewinnung von Mikrosatelliten (da dies die untere Grenze für die Wiederholungszahl bestimmt) und der Methode zur Typisierung der PCR-Produkte (da Agarosegele weniger auflösend sind als Polyacrylamidgele) variieren. In einer Analyse von über 300 CA-Repeat-Mikrosatelliten, die überwiegend aus den n >= 15 Klasse wurde eine durchschnittliche Polymorphismusrate von ca. 50 % in paarweisen Vergleichen von neun klassischen M. musculus Bei Inzuchtstämmen betrug der niedrigste beobachtete Polymorphismus zwischen DBA/2J und C3H/HeJ 35 % und der höchste 57 % zwischen B6 und LP/J (Dietrich et al., 1992). Nicht unerwartet wurden bei paarweisen Vergleichen zwischen klassischen Inzuchtstämmen und anderen . sogar noch höhere Polymorphismen beobachtet Mus Art oder Unterart. Die Polymorphismusrate zwischen B6 und M. m. Castaneus war 77% und zwischen B6 und M. Spretus, es betrug ㆒% (Love et al., 1990 Dietrich et al., 1992). Bei einer kleinen, aber signifikanten Anzahl von Loci konnten die Primer, die zur Amplifikation eines Inzuchtstamm-Locus entwickelt wurden, kein allelisches Produkt aus dem M. Spretus Genoms (Love et al., 1990) ist dies mit ziemlicher Sicherheit auf einen interspezifischen Polymorphismus in einer Zielsequenz zurückzuführen, die von einem der flankierenden Primer erkannt wird.

Eine Reihe von Forschern haben versucht, die Rate zu messen, mit der neue Mikrosatelliten-Allele erzeugt werden. Dies kann bei der Maus leicht erreicht werden, wo die Beziehungen zwischen einer großen Anzahl verschiedener Inzuchtstämme gut dokumentiert sind und es möglich ist, die Generationen zu zählen, die verschiedene Stämme voneinander trennen (Bailey, 1978). Die Ergebnisse dieser Studien zeigen, dass die Rate der Mutation ist sehr variabel — über mindestens eine Größenordnung. Diese Variabilität könnte eine Folge von genomischen Positionseffekten sein, aber der Mechanismus der Allelerzeugung muss geklärt werden, bevor man mit Sicherheit sagen kann. In der bisher umfassendsten Analyse analysierten Dietrich und Kollegen (1992) die durchschnittliche Mutationsrate an 300 Loci innerhalb des BXD-Satzes rekombinanter Inzuchtstämme. Die durchschnittliche Mutationsrate wurde mit 1 zu 22.000 pro Locus pro Generation berechnet, was 5-50-mal höher ist als die, die normalerweise der Mutagenese an klassischen Loci zugeschrieben wird. Diese durchschnittliche "Mutationsrate" von Mikrosatelliten ist hoch genug, um die Erzeugung einer großen Menge an Polymorphismus zwischen Individuen innerhalb einer Art zu ermöglichen, aber niedrig genug, um die Trennung von zwei oder mehr Allelen von einer Generation zur nächsten genau verfolgen zu können innerhalb einer typischen genetischen Kreuzung.

8.3.6.5 Die unglaubliche Kraft von Mikrosatelliten

Der hohe Polymorphismus, der mit Mikrosatelliten (als Klasse) verbunden ist, stellt nur eine Komponente ihres schnellen Aufstiegs dar, um das "genetische Werkzeug der Wahl" für Kartographen zu werden, die mit allen Tierarten arbeiten. Ihre Einzigartigkeit und Kraft liegt auch in der Leichtigkeit, mit der sie entdeckt, getippt und verbreitet werden können. Um ein Panel von Mikrosatelliten-Loci für die Analyse des Mausgenoms zu entwickeln, durchsuchten Todd und seine Kollegen einfach die EMBL- und GenBank-Datenbanken nach Einträgen, die (CA) 10 , (GA) 10 oder deren Ergänzungen enthielten (Love et al., 1990 .). ). Um die Größe dieses Panels für eine Kartierungsanalyse mit höherer Auflösung zu erhöhen, wurden Genombibliotheken, die so konstruiert waren, dass sie kurze Inserts enthielten, mit CA-Repeat-Sonden gescreent und positive Klone wurden isoliert und sequenziert (Cornall et al., 1991 Dietrich et al., 1992).

Unter Verwendung eines kombinierten Panels von 317 Mikrosatelliten-Loci entwickelte das Whitehead/MIT Genome Center eine Kopplungskarte des gesamten Mausgenoms der ersten Generation mit einem durchschnittlichen Abstand von 4,3 cM (Dietrich et al., 1992). Mit der Veröffentlichung der Oligonukleotidsequenzen, die die Typisierung jedes Locus definieren und ermöglichen, wurden die Marker auf demokratische Weise für jedermann verfügbar. Bis Januar 1994 hatte die Whitehead-Gruppe über 3.000 Mikrosatelliten-Loci definiert und kartiert. 68 Aktuelle Kartierungs-, Stammverteilungs- und Sequenzinformationen zu all diesen Loci können elektronisch wie in Anhang B beschrieben abgerufen werden. Darüber hinaus hat das kommerzielle Unternehmen Research Genetics Inc. der Mausgenetik-Gemeinschaft das Leben noch einfacher gemacht, indem es jeden Primer anbietet Paar in diesem Panel zu stark reduzierten Kosten im Vergleich zur kundenspezifischen DNA-Synthese.

Da die Mikrosatellitentypisierung PCR-basiert ist und in der Regel kein Blotting oder Sondieren erforderlich ist, können mit minimalem Aufwand an oft kostbarem Material und immer kostbaren Mann- und Frauenstunden schnell Ergebnisse erzielt werden. Dietrich und Kollegen (1992) berichteten, dass zwei Wissenschaftler "neue Kreuzungen für das gesamte Genom in wenigen Wochen pro Kreuzung " können, was eine Verbesserung um eine Größenordnung gegenüber RFLP-basierten Ansätzen darstellt.

Mikrosatelliten können nicht nur als Tags für anonyme Loci dienen, sondern auch für funktionelle Gene. Stallings und seine Kollegen (1991) fanden heraus, dass 78% der Klone aus einer Maus-Cosmid-Bibliothek CA-Wiederholungen aufweisen. Würde man auch nach GA-Repeats suchen, wäre der Prozentsatz an Mikrosatelliten-positiven Cosmidklonen noch größer. Eine noch höhere Wahrscheinlichkeit der Identifizierung von Mikrosatelliten-Loci — nahe 100 % — kann mit Klonen erreicht werden, die aus größeren Insert-Bibliotheken gewonnen wurden, die mit künstlichen Hefe-Chromosomen (YACs) oder speziellen prokaryontischen Vektoren konstruiert wurden (siehe Abschnitt 10.3.3). Kleine Fragmente, die den Mikrosatelliten enthalten, können subkloniert und sequenziert werden, um einen einzigartigen Satz flankierender Primer für die genetische Analyse zu identifizieren. Mikrosatelliten können wirklich als universelle genetische Kartierungsreagenzien angesehen werden.

In den 1980er Jahren führten die Schwierigkeiten bei der Suche nach RFLPs unter den klassischen Inzuchtstämmen zur Entstehung der interspezifischen Kreuzung — zwischen a M. musculus-abgeleitete Inzuchtsorte und M. Spretus —, das zu einem entscheidenden Werkzeug für die Entwicklung der ersten hochauflösenden DNA-Lokus-basierten Karten des Mausgenoms wurde (Avner et al., 1988 Copeland und Jenkins, 1991 und Abschnitt 9.3). Interspezifische Rückkreuzungspanels stellen immer noch ein leistungsfähiges Werkzeug zur Kartierung neu charakterisierter DNA-Klone dar. Mit Mikrosatelliten ist es nun jedoch möglich, auf klassische Kreuzungen zwischen M. musculus Stämme, um interessante phänotypische Varianten zu kartieren, wie in Abschnitt 9.4 diskutiert.


Top 8 der in der Genomik verwendeten Techniken &ndash erklärt!

Hier beschreiben wir die acht wichtigsten Techniken, die in der Genomik verwendet werden.

Die acht Techniken sind: (1) Isolierung genomischer DNA, (2) Trennung von DNA, (3) Schneiden und Verbinden von DNA, (4) Klonen und Vektoren, (5) Nachweis des interessierenden Gens, (6) rekombinante DNA und Klonen, (7) Herstellung mehrerer DNA-Kopien unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und (8) DNA-Sequenzierung.

1. Genomische DNA-Isolierung:

Da DNA im Zellkern vorhanden ist, werden viele Methoden verwendet, um die äußeren Barrieren wie extrazelluläre Matrix, Kernhülle und Zellwand bei Pflanzen zu zerstören.

Diese werden durch die Behandlung des Gewebes oder der Zelle mit verschiedenen Arten von Detergenzien erreicht, die die äußeren Barrieren auflösen. Bei Pflanzenzellen werden einige Enzyme wie Cellulase, Pektinase, Cellobiosidase, Xylanase usw. verwendet, die die Zellwand abbauen.

Sobald die Zelle aufgebrochen ist, werden die Trümmer (extrazelluläre Matrix, Membran usw.) durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation entfernt. Nach der Zentrifugation werden die unerwünschten Proteine ​​und RNA durch Behandlung mit Enzymen wie Protease (abbauende Proteine) und RNAse (abbauende RNA) entfernt.

Zur Isolierung sehr reiner DNA wird eine Technik namens Dichtegradienten-Ultrazentrifugation verwendet (Abb. 81). Dabei werden verschiedene zelluläre Komponenten auf einen Gradienten mit unterschiedlicher Dichte gebracht (NaCl und Saccharose wird verwendet) und mit einer sehr hohen Geschwindigkeit von 40.000 Umdrehungen pro Minute auf 70.000 (U/min) zentrifugiert.

Da verschiedene Zellkomponenten unterschiedliche Dichten aufweisen, wandern sie und stoppen am Gradienten, wo ihre Dichte gleich der Dichte von NaCl und Saccharose ist. Auf diese Weise stoppt auch die DNA bei einer bestimmten Dichte und wird aus dem Gradientenrohr extrahiert.

2. DNA-Trennung:

DNA-Moleküle sind negativ geladen, so dass sie sich, wenn sie einem elektrischen Feld ausgesetzt werden, von der negativen zur positiven Elektrode bewegen. Für die Bewegung der DNA unter dem Einfluss von elektrischem Strom wird ein Medium verwendet, das als Gel bezeichnet wird. Dies ist eine halbfeste Substanz aus Polymeren wie Agarose, Polyacrylamid usw.

Dieses gelierende Material bildet ein poröses Fasernetzwerk und die DNA-Moleküle bewegen sich durch diese Poren. Zur Trennung großer DNA-Moleküle wird Agarosegel und zur Trennung kleiner DNA-Fragmente Polyacrylamidgel verwendet. Diese Methode wird Gelelektrophorese genannt. Für die Gelelektrophorese wird ein Puffer verwendet, der daran beteiligt ist, den Strom durch das Gel zu leiten.

Wenn sich DNA-Moleküle von der negativen zur positiven Elektrode bewegen, bewegen sich die größeren DNA-Moleküle langsam und näher am negativen Pol. Die kleineren DNA-Moleküle bewegen sich schneller und sind mehr zum Pluspol hin positioniert. Dieses Phänomen ist in Abb. 8.2 dargestellt.

3. Schneiden und Verbinden von DNA:

Die rekombinante DNA-Technologie beinhaltet hauptsächlich das präzise Schneiden und Verbinden von DNA-Molekülen. Um die DNA an einer bestimmten Stelle zu schneiden, werden spezielle Enzymtypen verwendet, die als Restriktionsenzyme bezeichnet werden. Das charakteristische Merkmal des Restriktionsenzyms besteht darin, dass es spezifische Sequenzen (Nukleotide) auf den DNA-Molekülen erkennt und an dieser Stelle schneidet. Durch dieses präzise Schneiden erzeugen sie kompatible Enden von DNA-Molekülen, die später verbunden werden können.

Die Art der Sequenz, die von den Restriktionsenzymen erkannt wird, wird als Palindromsequenz bezeichnet (das sind spiegelbildliche Sequenzen – Abb. 8.3). Sobald die DNA durch ein Restriktionsenzym geschnitten wurde, können die beiden Teile eines beliebigen DNA-Moleküls durch ein anderes Enzym namens Ligase verbunden werden.

4. Klonen und Vektoren:

Zum Einfügen eines Stücks fremder DNA und zur Vermehrung des DNA-Fragments für die Produktion im großen Maßstab wird ein Vektor verwendet. Vektoren sind Klonierungsvehikel, die sich in einem geeigneten Wirt replizieren können. Für das molekulare Klonen werden viele verschiedene Arten von Vektoren verwendet – dies sind hauptsächlich Plasmid (zirkuläres doppelsträngiges DNA-Molekül), Cosmid (zirkuläre DNA-Moleküle, die auch in ein Virus verpackt werden können), Bakteriophagen (Virus, das verschiedene Bakterienstämme infiziert) usw. ( Müller, 1992).

Sobald der geeignete Vektor ausgewählt ist, wird er mit einem Restriktionsenzym geschnitten, um eine Stelle für die Insertion der Fremd-DNA zu schaffen. Anschließend wird die Fremd-DNA mit dem Vektor ligiert und in eine Wirtszelle transferiert, wo sich der Vektor zusammen mit der Fremd-DNA vermehren kann. Um den Vektor innerhalb der Wirtszelle auszuwählen, werden verschiedene Arten von selektierbaren Markern verwendet – wie Antibiotikaresistenz usw.

5. Nachweis des interessierenden Gens:

Zum Nachweis eines bestimmten interessierenden Gens sind die üblicherweise verwendeten Techniken Southern-Hybridisierung, Kolonie-Hybridisierung, Dot-Blot (Sambrook et al. 1989). Das Prinzip dieser Methoden ist einfach. Das DNA-Molekül von unserem Interesse, das wir nachweisen möchten, wird als Target bezeichnet.

Das DNA-Molekül mit bekannter Sequenz, mit dem wir das Zielmolekül in einer Mischung anderer DNA-Moleküle nachweisen werden, wird als Sonde bezeichnet. Die Sonde wird durch Einbau eines radioaktiven Phosphatisotops hergestellt. Normalerweise wird das Radioisotop P 32 oder P 33 von Phosphat verwendet. Das P 32 oder P 33 wird in dATP eingebaut, das der Baustein der DNA ist. Diese werden dann durch den als Markierung bezeichneten Prozess in das Sondenmolekül eingebaut.

Bei der Southern-Hybridisierung wird das Ziel-DNA-Molekül nach seinem Molekulargewicht durch Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt. Dann wird die DNA im Gel mit einem Alkali wie NaOH denaturiert (DNA wird einzelsträngig). Nach der Denaturierung wird die DNA auf eine feste Oberfläche wie Membranen aus Nylon oder Nitrozellulose übertragen.

Die auf die Membran übertragene DNA wird als Replikat verwendet und mit der radioaktiv markierten Sonde hybridisiert. Nach Beendigung der Hybridisierung wird die Membran mit Puffern gewaschen, so dass die unspezifische Bindung der Sonde entfernt wird.

Die Membran wird dann getrocknet und in eine Röntgen-Autoradiographie-Kassette gegeben. Nach Belichtung der membrangebundenen Sonde mit dem Röntgenfilm wird das radioaktive Signal auf dem Röntgenblatt nachgewiesen. Das Signal entspricht der Position des interessierenden Gens.

6. Rekombinante DNA und Klonen:

Rekombinante DNA ist ein chimäres DNA-Molekül, das DNA aus einer Quelle enthält und ein Teil des DNA-Moleküls aus einer anderen Quelle stammt. Wie bereits erläutert, kann das DNA-Molekül mit Hilfe von Restriktionsenzymen genau an einer bestimmten Stelle geschnitten werden. Wenn zwei DNA-Moleküle mit einem bestimmten Restriktionsenzym geschnitten und dann durch ein Enzym namens Ligase verbunden werden, wird das resultierende DNA-Molekül als chimäres oder rekombinantes DNA-Molekül bezeichnet.

Klonen bedeutet die Herstellung einer exakten Kopie eines beliebigen Materials. Es ist wie bei einem Xerox-Gerät, das immer wieder dieselbe Kopie eines Dokuments erstellt. Das Klonen ist ein wesentlicher Bestandteil der rekombinanten DNA-Technologie. Das Klonen eines DNA-Moleküls bedeutet die Herstellung identischer Kopien dieses DNA-Moleküls. Dabei wird das DNA-Molekül mit einem Vektor oder Vehikel verbunden (was im vorherigen Abschnitt erläutert wurde).

Der Vektor enthält die Informationen für die Replikation, die auch als Replikationsursprung bezeichnet wird. Aufgrund des Vorhandenseins des Replikationsursprungs in der Vektor-DNA repliziert der Vektor – wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird. Bei der Replikation des Vektors produziert dieser auch große Kopien seiner eigenen und auch der fremden DNA (Abb. 8.4).

7. Herstellung mehrerer DNA-Kopien mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR):

Durch PCR können mehrere Kopien eines DNA-Moleküls hergestellt werden. 1983 begründete der Biochemiker Kary Mullis das Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Dies ist nur möglich, wenn Teile der betreffenden Sequenz bekannt sind. Dabei wird das Template-DNA-Molekül (von dem wir mehrere Kopien machen wollen) bei hoher Temperatur von 94-95 °C denaturiert (DNA wird einzelsträngig).

Dann werden kurze einzelsträngige DNA, sogenannte Primer (Oligonukleotide von normalerweise 20-25 Basen Länge) hinzugefügt. Sie markieren den Startpunkt der DNA-Synthese nach Zugabe von DNA-Polymerase und Desoxynukleosidtriphosphaten. Primer sind Homologe zur Sequenz der Matrizen-DNA.

Die Primer binden an die homologe Sequenz auf der Template-DNA und dieser Vorgang wird als Annealing bezeichnet. Es werden zwei Primer ausgewählt, die durch ihre Position auf dem DNA-Fragment sicherstellen, dass die Synthese an entgegengesetzten Enden des Fragments beginnt, wobei zu berücksichtigen ist, dass die enzymatische Polymerisation von 5′ bis 3′ verläuft. Nach dem Annealing wird eine thermostabile DNA-Polymerase zugegeben, die als Taq-Polymerase bezeichnet wird (abgeleitet von einem hitzestabilen Bakterium Thermus aquaticus und arbeitet bei 72 °C).

Diese thermostabile Polymerase ist auch bei höheren Temperaturen wie 94-95 °C aktiv. Diese Polymerase fügt den Primern immer wieder die komplementären Basen hinzu und ein neues DNA-Molekül wird synthetisiert. Dieser gesamte Vorgang wird mehrmals wiederholt und jedes Mal als Zyklus bezeichnet. Aus diesem Grund wird die Technik Polymerase-Kettenreaktion (PCR) genannt.

Bei der PCR wird die DNA exponentiell amplifiziert. Das bedeutet, dass aus einem DNA-Molekül zwei DNA-Moleküle hergestellt werden. Diese beiden DNA-Moleküle dienen im nächsten Zyklus als Template und bilden vier DNA-Moleküle. Dieser gesamte Vorgang wird zyklisch wiederholt.

Die wiederholte Änderung der Temperatur, um verschiedene Schritte in einem PCR-Zyklus abzuschließen, erfolgt in einer Maschine, die als Thermocycler (PCR-Maschine) bezeichnet wird. Dies ist ein auf der Peltier-Technologie basierendes, mikroprozessorgesteuertes Gerät, das in der Lage ist, die Temperatur in wenigen Sekunden schnell zu ändern (Abb. 8.5).

Die PCR wird nicht nur zur Amplifikation genomischer DNA verwendet, sondern auch zum Nachweis und zur Analyse der RNA-Expression sowie zum Klonen exprimierter Gene. In diesen Fällen geht dem Amplifikationsprozess eine Reverse Transkriptase (RT)-Reaktion voraus. Aus dem RNA-Material wird die analysierte, einzelsträngige cDNA synthetisiert. Dies ist als RT-PCR bekannt.

8. DNA-Sequenzierung:

Um die Sequenz eines DNA-Abschnitts zu bestimmen, wird eine Technik verwendet, die als Sanger-Methode der Di+Desoxy-Sequenzierung bekannt ist. Bei diesem Verfahren wird die DNA denaturiert und man lässt den Primer an den DNA-Strang anlagern. Anschließend wird die Polymerisationsreaktion in Gegenwart von Klenow-DNA-Polymerase und dNTP (Desoxy-Ribo-Nukleotid-Triphosphat) durchgeführt. Üblicherweise werden vier Reaktionen durchgeführt und in jeder Reaktion wird zusammen mit der Mischung von dNTP ein Di+Desoxynukleotidtriphosphat (dd-NTP) verwendet – z.B. dd-ATP, dd-GTP, dd-CTP, dd-TTP (Abb. 8.6).

Das Prinzip hinter der Reaktion besteht darin, dass die DNA-Polymerase den komplementären DNA-Strang synthetisiert und während der Synthese, wenn das dd-NTP-Derivat eingebaut wird, die Reaktion stoppt, da keine freie Hydroxylgruppe an der 3′ . verfügbar ist Ende. Durch diesen Prozess werden Fragmente unterschiedlicher Länge erzeugt, die am 5′ -Ende rediomarkiert werden.

Diese kleinen Fragmente werden dann in einem Acylamid-Harnstoff-Sequenzierungsgel aufgelöst und eine Autoradiographie wird durchgeführt, um die genaue Position der Banden zu kennen. Aus der Position der Banden können wir die Sequenz der DNA bestimmen, da die unterste Bande (kleinste Bande) die erste Base ist, an der die Sequenz endet.


Die Wissenschaft hinter dem Test auf das COVID-19-Virus

Der neue Test der Mayo Clinic auf das Virus, das COVID-19 verursacht, wird in einer kürzlich veröffentlichten Pressemitteilung als PCR-Test beschrieben. Während die meisten nicht wissen, was das bedeutet, ist die PCR ein weit verbreitetes Werkzeug im Labor und bei medizinischen Tests. Larry Pease, Ph.D., ein Immunologe der Mayo Clinic und der Gordon H. und Violet Bartels Professor für Zellbiologie und Kyle Rodino, Ph.D., ein klinischer Mikrobiologe, erklären, wie dieser Test funktioniert.

PCR steht zunächst für eine Labortechnik, die als Polymerase-Kettenreaktion bekannt ist. Ziel dieses Tests ist es, selektiv Spuren von genetischem Material zu amplifizieren und bestimmte Teile der DNA zu identifizieren. Zur Erinnerung: DNA ist der genetische Code, der in jeder Zelle des Körpers vorhanden ist. Wenn sich eine Zelle teilt, kopiert sie DNA, trennt die beiden Stränge und erzeugt dann durch Kopieren der Matrize einen neuen DNA-Strang. PCR ahmt nach, was normalerweise in Zellen passiert.

Die Mayo Clinic gibt am 12. März 2020 bekannt, dass sie einen Test entwickelt hat, der das SARS-CoV-2-Virus in klinischen Proben nachweisen kann. Das Virus SARS-CoV-2 verursacht COVID-19.

DNA wird verwendet, weil die Struktur der DNA Ihnen auf der anspruchsvollsten Ebene sagen kann, welcher Organismus betrachtet wird. Beim Menschen kann die PCR eine Person anhand ihrer genetischen Signatur identifizieren. Im Fall von COVID-19 haben Forscher mehr als 100 Genome veröffentlicht, die von Patienten gesammelt wurden, um die wichtigsten Merkmale des Virus, das diese Krankheit verursacht, SARS-CoV-2, zu identifizieren.

PCR funktioniert nur bei DNA, und das COVID-19-Virus verwendet RNA als genetischen Code. RNA ist DNA ähnlich, hat aber nur einen Einzelstrang. Glücklicherweise wurden vor Jahrzehnten virale Enzyme zur Umwandlung von RNA in DNA entdeckt und zusammen mit der PCR genutzt, um auch einzigartige Signaturen in RNA zu finden. In diesem Fall wird die PCR als reverse Transkriptions-PCR oder RT-PCR bezeichnet.

Zuerst ruft eine Person mit Symptomen von COVID-19 ihren örtlichen Gesundheitsdienstleister an und fragt, wie sie beurteilt werden soll. Denken Sie daran: Rufen Sie zuerst an. Gehen Sie nicht in Ihre Klinik oder Ihr Krankenhaus, ohne anzurufen, um herauszufinden, wie Sie sich am sichersten testen lassen. Sobald ein Patient an einer sicheren Teststelle ankommt, wird eine Probe vom Gesundheitsteam entnommen. Normalerweise bedeutet dies, dass ein schmaler Tupfer in die Nase oder den Mund einer Person gelegt wird, um Zellen aus dem Rachen zu sammeln.

"Eine Probe der oberen Atemwege, insbesondere ein Nasen-Rachen-Abstrich, ist die am häufigsten entnommene Probe, um das Virus zuverlässig nachzuweisen", sagt Dr. Rodino. "Einige Proben der unteren Atemwege wie Sputum sind in manchen Situationen auch akzeptabel."

Im Labor wird die Probe verarbeitet, sodass RNA isoliert und gesammelt wird. Alles andere wird entfernt. Die RNA ist mit anderen Bestandteilen vermischt: Enzyme (DNA-Polymerase und Reverse Transkriptase), DNA-Bausteine, Cofaktoren, Sonden und Primer, die SARS-CoV-2 erkennen und daran binden.

Dann wird die virale RNA in eine DNA-Kopie umgewandelt, und diese einzelne Kopie wird dann mittels PCR in Millionen von Kopien umgewandelt, die leicht nachgewiesen werden können.

Der Prozess ist wie folgt: Durch Hitze und Enzyme werden umgewandelte virale DNA-Stränge auseinandergetrieben. Kurze DNA-Primer, die dem komplementären Strang der viralen DNA-Matrize entsprechen, kleben zusammen und fungieren als künstliche Startstelle für die DNA-Synthese.

Chemische DNA-Bausteine ​​werden hinzugefügt und miteinander verbunden, wodurch der synthetische DNA-Primer verlängert wird, um eine Kopie der viralen DNA-Matrize zu bilden. Ein zweiter Primer, der in der entgegengesetzten Orientierung stromabwärts des ersten Primers hergestellt wurde, ist auch in der Reaktion vorhanden. Dadurch entsteht eine zum ersten synthetisierten Strang komplementäre Kopie.

Nach einer Runde der DNA-Synthese wird die Reaktionsmischung erhitzt, um die beiden Stränge auseinander zu schmelzen, wodurch zwei Matrizen erzeugt werden, die in der nächsten Runde weiter amplifiziert werden können. Die Kopien häufen sich Runde für Runde exponentiell an, so dass Millionen und Abermillionen von Kopien erzeugt werden, die mit herkömmlichen Ansätzen untersucht werden.

Da die dem Reaktionsröhrchen zugesetzten Enzyme und Chemikalien relativ hitzebeständig sind – „Die hitzeempfindlichen Enzyme werden aus hitzebeständigen Bakterien aus heißen Quellen isoliert“, sagt Dr. Pease – kann die Reaktion automatisiert ablaufen: Erhitzen, Abkühlen und DNA-Synthese. Es dauert nur Stunden, um den Assay abzuschließen und die Ergebnisse zu erhalten.

Wenn SARS-CoV-2-komplementäre DNA in der Probe vorhanden ist, können die Primer die Zielregionen kopieren. Beim Kopieren dieser Regionen geben Sonden, die an diesen neuen Fragmenten haften, ein visuelles Signal ab, das von dem in diesem Prozess verwendeten Instrument gelesen werden kann.

„Die Millionen von Kopien verstärken dieses Signal, sodass es leicht als positives Ergebnis erkannt werden kann. Wenn das Virus nicht vorhanden ist, kleben die Sonden nicht, es gibt keine Signalabgabe und es ist ein negatives Ergebnis“, erklärt Dr. Rodino.

Diese Art der Analyse wird für Forschung und klinische Labortests verwendet. Mit der PCR können alle Arten von Bakterien, Parasiten, Viren und Pilzen nachgewiesen werden, beginnend mit DNA oder RNA. Obwohl das Prinzip und die Inhaltsstoffe ähnlich sind, erfordert jede Verwendung spezifische Primer oder Sonden, um verschiedene Organismen nachzuweisen. Deshalb musste etwas für SARS-CoV-2 von Grund auf neu entwickelt werden. Während der Entwicklung werden diese Arten von Tests optimiert, um sicherzustellen, dass sie den interessierenden Organismus sehr gut erkennen (empfindlich) und sicherstellen, dass der Test kein positives Ergebnis zeigt, wenn der Organismus nicht vorhanden ist (spezifisch).

"Die Bedeutung der Schritte der PCR wurde über Jahrzehnte von einer Reihe von Nobelpreisen anerkannt", sagt Dr. Pease. "Die medizinische Wissenschaft macht Fortschritte aufgrund grundlegender Entdeckungen über die molekularen Grundlagen lebender Systeme, und dies ist ein Beispiel dafür, wie diese Entdeckungen zusammenkommen, um ein wichtiges Problem in unserem Leben zu lösen."

Als Forschungs- und klinisches Team konnten Mayo-Experten innerhalb weniger Wochen einen PCR-Test auf SARS-CoV-2 einführen – was normalerweise Monate bis Jahre dauert.


Methoden zum Nachweis von Protein-DNA-Wechselwirkungen

Die Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) kann verwendet werden, um die Transkriptionsregulation durch Histonmodifikation (Epigenetik) oder Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsinteraktionen zu überwachen. Die ChIP-Assay-Methode ermöglicht die Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen, indem die Zellen mit Formaldehyd oder anderen Vernetzungsreagenzien behandelt werden, um die Wechselwirkungen für die nachgeschaltete Aufreinigung und Detektion zu stabilisieren. Die Durchführung von ChIP-Assays erfordert die Kenntnis des zu analysierenden Zielproteins und der zu analysierenden DNA-Sequenz, da die Forscher einen Antikörper gegen das interessierende Protein und PCR-Primer für die interessierende DNA-Sequenz bereitstellen müssen. Der Antikörper wird verwendet, um den Protein-DNA-Komplex selektiv aus den anderen genomischen DNA-Fragmenten und Protein-DNA-Komplexen auszufällen. Die PCR-Primer ermöglichen eine spezifische Amplifikation und Detektion der Ziel-DNA-Sequenz. Die quantitative PCR-Technik (qPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Menge der Ziel-DNA-Sequenz. Der ChIP-Assay eignet sich für Array-basierte Formate (ChIP-on-chip) oder die direkte Sequenzierung der vom immunpräzipitierten Protein eingefangenen DNA (ChIP-seq).

  • Schnappschuss einer spezifischen Protein-DNA
    Wechselwirkungen, wie sie in lebenden Zellen vorkommen
  • quantitativ in Verbindung mit qPCR-Analyse
  • Fähigkeit, einen Promotor für verschiedene Proteine ​​zu profilieren
  • Forscher müssen Antikörper in ChIP-Qualität beschaffen
  • erfordert die Entwicklung spezifischer Primer
  • schwer an Hochdurchsatz-Screening anzupassen

Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für erfolgreiche Chromatin-Immunopräzipitations-(ChIP)-Assays

Diese aktualisierte Übersicht über das ChIP-Verfahren enthält zusätzliche Details zur Auswahl von primären Antikörpern (d. h. ChIP-validierte Antikörper). Die Application Note beschreibt und liefert auch Beispiele für die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) als Technik zur Untersuchung der Epigenetik, da sie es Forschern ermöglicht, eine Momentaufnahme spezifischer Protein-DNA-Wechselwirkungen zu erfassen.

Unser 72-seitiges technisches Handbuch zur Proteininteraktion bietet Protokolle sowie technische und Produktinformationen, um die Ergebnisse von Proteininteraktionsstudien zu maximieren. Das Handbuch bietet Hintergrundinformationen, hilfreiche Hinweise und Ratschläge zur Fehlerbehebung für Immunpräzipitations- und Co-Immunpräzipitationsassays, Pulldown-Assays, Far-Western-Blotting und Crosslinking. Das Handbuch enthält auch einen erweiterten Abschnitt über Methoden zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen, einschließlich ChIP, EMSA und RNA-EMSA. Das Handbuch ist eine unverzichtbare Ressource für jedes Labor, das Proteininteraktionen untersucht.

Inhalt: Einführung in Proteininteraktionen, Co-Immunpräzipitationsassays, Pulldown-Assays, Far-Western-Blotting, Proteininteraktionskartierung, Hefe-Zwei-Hybrid-Reporterassays, Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays [EMSA], Chromatin-Immunpräzipitationsassays (ChIP), Protein –Nukleinsäurekonjugate und mehr.

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Der DNA Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) wird verwendet, um Proteine ​​zu untersuchen, die an bekannte DNA-Oligonukleotidsonden binden, und kann verwendet werden, um den Grad der Affinität oder Spezifität der Wechselwirkung zu bestimmen. Die Technik basiert auf der Beobachtung, dass Protein-DNA-Komplexe langsamer wandern als freie DNA-Moleküle, wenn sie einer nicht denaturierenden Polyacrylamid- oder Agarosegelelektrophorese unterzogen werden. Da die DNA-Migrationsrate bei Proteinbindung verschoben oder verzögert wird, wird der Assay auch als Gelshift- oder Gelretardationsassay bezeichnet. Durch Hinzufügen eines proteinspezifischen Antikörpers zu den Bindungskomponenten entsteht ein noch größerer Komplex (Antikörper-Protein-DNA), der während der Elektrophorese noch langsamer wandert. Dies wird als „Supershift“ bezeichnet und kann verwendet werden, um Proteinidentitäten zu bestätigen. Bis zur Konzeption der EMSA wurden Protein-DNA-Wechselwirkungen hauptsächlich durch Nitrocellulosefilter-Bindungsassays mit radioaktiv markierten Sonden untersucht.

  • Nachweis von DNA-bindenden Proteinen in geringer Menge aus Lysaten
  • Testen von Mutationen der Bindungsstelle unter Verwendung vieler Sondenkonfigurationen mit demselben Lysat
  • Test der Bindungsaffinität durch DNA-Sonden-Mutationsanalyse
  • nicht-radioaktive EMSA mit biotinylierten oder fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden möglich
  • analysieren Protein-DNA-Wechselwirkungen in vitro
  • schwer zu quantifizieren
  • müssen einen Supershift-Assay mit Antikörpern durchführen, um die Proteinidentität in einem Komplex sicherzustellen

Traditionell wurden DNA-Sonden mit ³²P radioaktiv markiert, indem ein [γ-³²P]dNTP während einer 3'-Auffüllreaktion unter Verwendung des Klenow-Fragments eingebaut wurde oder durch 5'-Endmarkierung unter Verwendung von [γ-³²P]ATP und T4-Polynukleotidkinase. Nach der Elektrophorese wird das Gel einem Röntgenfilm ausgesetzt, um die Ergebnisse zu dokumentieren. Das Thermo Scientific LightShift Chemilumineszenz-EMSA-Kit ist ein nicht-radioaktiver Assay, der eine robuste und empfindliche Leistung bietet. Das Kit enthält Reagenzien zum Einrichten und Anpassen von DNA-Bindungsreaktionen, einen Kontrollsatz aus DNA und Proteinextrakt zum Testen des Kit-Systems, stabilisiertes Streptavidin-HRP-Konjugat zur Sondierung des biotinmarkierten DNA-Ziels und ein außergewöhnlich empfindliches chemilumineszierendes Substratmodul zur Erkennung.

Chemilumineszierende EMSA von vier verschiedenen DNA-Protein-Komplexen. Biotin-markierte Zielduplexe hatten eine Größe von 21–25 bp. Die Transkriptionsfaktoren Oct-1, AP1 und NF-κB wurden aus HeLa-Kernextrakt abgeleitet. EBNA-1-Extrakt wird als Kontrolle im LightShift Chemiluminescent EMSA Kit bereitgestellt. Unmarkierte spezifische Kompetitorsequenzen (wo verwendet) waren in einem 200-fachen molaren Überschuss gegenüber dem markierten Ziel vorhanden. Die Belichtungszeiten für Röntgenfilme für jedes System reichten von 2 Minuten für EBNA, Oct-1 und AP1 und 5 Minuten für NF-κB.


Endpunkt-RT-PCR: relativ vs. kompetitiv vs. vergleichend

Trotz der schnellen Fortschritte im Bereich der Echtzeit-PCR-Nachweischemie und -Instrumentierung bleibt die Endpunkt-RT-PCR immer noch eine sehr häufig verwendete Technik zur Messung von Veränderungen der Genexpression in kleinen Probenmengen.

Endpunkt-RT-PCR kann verwendet werden, um Veränderungen der Expressionsniveaus unter Verwendung von drei verschiedenen Methoden zu messen: relativ, kompetitiv und vergleichend. Die am häufigsten verwendeten Verfahren zur Quantifizierung von Endpunkt-RT-PCR-Ergebnissen beruhen auf dem Nachweis eines Fluoreszenzfarbstoffs wie Ethidiumbromid oder der Quantifizierung des P32-markierten PCR-Produkts durch einen Phosphorimager oder in geringerem Maße durch Szintillationszählung.

Die relative Quantifizierung vergleicht die Transkripthäufigkeit über mehrere Proben hinweg, wobei eine co-amplifizierte interne Kontrolle zur Probennormalisierung verwendet wird. Die Ergebnisse werden als Verhältnisse des genspezifischen Signals zum internen Kontrollsignal ausgedrückt. Dies ergibt einen korrigierten relativen Wert für das genspezifische Produkt in jeder Probe. Diese Werte können zwischen Proben verglichen werden, um die relative Expression von Ziel-RNA in den Proben abzuschätzen, zum Beispiel 2,5-mal mehr IL-12 in Probe 2 als in Probe 1.

Die absolute Quantifizierung unter Verwendung kompetitiver RT-PCR misst die absolute Menge (z. B. 5,3 x 105 Kopien) einer spezifischen mRNA-Sequenz in einer Probe. Verdünnungen einer synthetischen RNA (identisch in der Sequenz, aber etwas kürzer als das endogene Ziel) werden Proben-RNA-Replikaten zugesetzt und mit dem endogenen Ziel co-amplifiziert. Das PCR-Produkt aus dem endogenen Transkript wird dann mit der Konzentrationskurve verglichen, die von der synthetischen "Kompetitor-RNA" erzeugt wird.

Die vergleichende RT-PCR ahmt die kompetitive RT-PCR insofern nach, als die Zielbotschaft von jeder RNA-Probe innerhalb einer einzigen Reaktion um Amplifikationsreagenzien konkurriert, was die Technik zuverlässig quantitativ macht. Da die cDNA aus beiden Proben die gleiche PCR-Primer-Bindungsstelle aufweist, fungiert eine Probe als Kompetitor für die andere, was die Synthese einer Kompetitor-RNA-Sequenz unnötig macht.

Sowohl relative als auch kompetitive RT-PCR-Quantifizierungstechniken erfordern Pilotversuche. Im Fall der relativen RT-PCR umfassen Pilotversuche die Auswahl einer Quantifizierungsmethode und die Bestimmung des exponentiellen Bereichs der Amplifikation für jede zu untersuchende mRNA. Für die kompetitive RT-PCR muss ein synthetisches RNA-Kompetitor-Transkript synthetisiert und in Pilotversuchen verwendet werden, um den geeigneten Bereich für die Standardkurve zu bestimmen. Die vergleichende RT-PCR ergibt eine ähnliche Sensitivität wie die relative und kompetitive RT-PCR, erfordert jedoch deutlich weniger Optimierung und erfordert keine Synthese eines Kompetitors.


METHODISCHE ASPEKTE

Der PCR-Assay in der Diagnose umfasst mehrere kritische Schritte, wie die DNA-Extraktion aus Proben, die PCR-Amplifikation und den Nachweis von Amplikons. Insbesondere wenn spezifische klinische Proben wie Liquor mit nur wenigen Bakterien durch PCR getestet werden, muss jedes Verfahren sorgfältig geplant und durchgeführt werden.

Liquor wird häufig zur Diagnose von Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS) verwendet. Da Liquor wichtige Funktionen hat, einschließlich der Abfederung des Gehirns, der Aufrechterhaltung eines konstanten Hirndrucks, der Bereitstellung von Nährstoffen und der Entfernung toxischer Metaboliten aus dem ZNS, kann eine indirekte Beurteilung des Gehirnstatus anhand des Liquor erfolgen. Da Liquor als keimfrei gilt, liefert der Nachweis von Mikroben in Liquor bereits in geringer Zahl wertvolle Hinweise auf eine mögliche Infektion. Es ist jedoch zu beachten, dass der Nachweis von Mikroben im Liquor nicht immer auf eine ZNS-Infektion hinweist, da eine Störung der Blut-Hirn-Schranke den Durchtritt von Mikroben ermöglichen kann. Dennoch ist der Nachweis, die Identifizierung und die Quantifizierung von Mikroorganismen im Liquor wichtig für die Diagnose von Meningitis und anderen ZNS-Infektionen. Neuere Studien weisen insbesondere auf eine mögliche Beteiligung von Mikroorganismen an bestimmten Erkrankungen des ZNS hin, darunter Alzheimer und MS (3, 30, 45, 56). Daher ist der Nachweis selbst einiger weniger Mikroorganismen im Liquor durch ein standardisiertes Protokoll ein kritischer Punkt für die Diagnose solcher Krankheiten. Der normale Erwachsene produziert ungefähr 500 ml Liquor pro Tag, wobei sich zu jeder Zeit ungefähr 150 ml Liquor im ZNS befinden (34). Daher sind die verfügbare Menge an Liquor und die Anzahl der Probenentnahmen für die Diagnose begrenzt. Daher wird die Durchführung einer PCR mit einer Liquorprobe aufgrund der Sensitivität, die nur eine begrenzte Menge an Liquor erfordert, der Spezifität des Assays und der Geschwindigkeit zum diagnostischen Test der ersten Wahl für ZNS-Infektionen (11, 33). Tatsächlich wurde über eine Reihe von Versuchen mit PCR zum Nachweis eines breiten Spektrums von Bakterien in Liquorproben berichtet (37, 38, 42, 66). Die Sensitivität und Spezifität des PCR-Assays zum Nachweis von Krankheitserregern ist jedoch möglicherweise nicht besser als die des Kulturassays, der für die meisten Krankheitserreger standardisiert und validiert wurde, da die PCR-Sensitivität vom Assayprozess abhängig ist. Daher kann ein negatives PCR-Ergebnis mit mäßiger Sicherheit verwendet werden, um eine Infektionsdiagnose auszuschließen (33).

Die Stabilität der bakteriellen Ziel-DNA während der Liquorlagerung ist ein wichtiger praktischer Aspekt in klinischen Labors. Es liegen jedoch nur begrenzte Informationen über die Auswirkungen verschiedener Handhabungs- und Lagerbedingungen auf die Stabilität bakterieller DNA in Liquor vor. Die Exposition von Liquor gegenüber verschiedenen Umgebungsbedingungen, wie z ). In diesem Bericht wurden jedoch nur begrenzte Umgebungsbedingungen getestet. Daher sind die richtige Lagerung und Handhabung von Liquor nach wie vor für den Nachweis von Mikroben nach der PCR-Amplifikation unerlässlich.

Kontamination.

Da die PCR auf DNA-Amplifikation basiert, können leicht falsch-positive oder -negative Ergebnisse auftreten. Insbesondere führt ein einzelner PCR-Zyklus zu einer sehr großen Anzahl amplifizierbarer Moleküle, die möglicherweise nachfolgende Amplifikationen derselben Zielsequenz verunreinigen können (39). Tatsächlich wurde eine Hauptquelle für falsch-positive Reaktionen als Verschleppung von amplifiziertem Produkt aus früheren Reaktionen identifiziert (41). Eine Verschleppung von Reagenzien, Pipettiergeräten, Laboroberflächen oder sogar der Haut von Arbeitern (35) kann zu falsch positiven Ergebnissen führen. Um eine solche Kontamination durch Verschleppung zu kontrollieren, muss man den physikalischen Transfer von DNA zwischen amplifizierten Proben und zwischen positiven und negativen experimentellen Kontrollen verhindern. Zu diesem Zweck muss die Probenvorbereitung für den PCR-Assay in einem Raum oder einer biologischen Sicherheitshaube getrennt von dem, in dem die Reaktionen durchgeführt werden, erfolgen. Die Verwendung einer Pipettenspitze mit Aerosolbarriere ist unerlässlich, um Kreuzkontaminationen sowie Kontaminationen durch Verschleppung zu vermeiden. UV-Exposition kann auch kontaminierende Amplikons zerstören, ist jedoch nur auf Oberflächen und bei Amplikons mit einer Größe von mehr als 300 bp wirksam (19). Verwendung von Uracil n-Glycosylase (UNG) zur Spaltung des in PCR-Produkten eingebauten dUTP wird als wirksames Protokoll angesehen, um eine Verschleppung von Amplikon-Kontamination enzymatisch zu verhindern (41), insbesondere in einem klinischen Labor, das PCR ausgiebig durchführt. Dies wird durchgeführt, indem dTTP durch dUTP ersetzt wird und UNG zu der Mastermischung hinzugefügt wird. Um das dUTP-haltige Produkt zu schützen, muss UNG chemisch oder durch Hitze inaktiviert werden, bevor das PCR-Produkt weiter analysiert werden kann. Daher erfordert das dUTP-Protokoll nur zwei Änderungen in einem Standard-PCR-Protokoll: die Substitution von dUTP durch dTTP in allen Reaktionen und die Inkubation aller PCR-Ansätze mit UNG vor dem Temperaturzyklus. Tatsächlich wurde dieses Protokoll erfolgreich zur Erkennung von Toxoplasma gondii in Liquor sowie anderen klinischen Proben (46).

DNA-Extraktion.

Da klinische Proben PCR-Inhibitoren wie Hämin enthalten, das an Taq Polymerase und hemmt ihre Aktivität (10), ist die DNA-Reinigung wichtig, um solche Effekte zu vermeiden. Tatsächlich werden in Liquorproben häufig Inhibitoren nachgewiesen (14), und das Abkochen von Liquor reicht nicht aus, um Inhibitoren zu entfernen, die den Nachweis von Mikroben durch PCR beeinträchtigen (9). Die Extraktionsausbeute der Ziel-DNA ist auch ein kritischer Faktor beim PCR-Nachweis von Bakterien in klinischen Proben, insbesondere wenn nur wenige Bakterien in den Proben zu erwarten sind. Da Bakterien eine starre Zellwand haben, die einem gewöhnlichen Verdauungsprotokoll für die DNA-Extraktion widerstehen kann, sollte das Extraktionsprotokoll für bakterielle DNA in klinischen Proben bei der Probenvorbereitung zusätzlich berücksichtigt werden.

Das klassische DNA-Extraktionsprotokoll basiert auf einer Reinigung mit organischen Lösungsmitteln wie Phenol-Chloroform, gefolgt von einer Präzipitation mit Ethanol. Die aus Liquor gewonnenen Niederschläge, die nur wenige Bakterien enthalten, können zu wenig Material enthalten und möglicherweise nicht sichtbar sein. Daher kann die Handhabung dieser Niederschläge Vermutungen erfordern, insbesondere während des Waschens der Niederschläge. Daher ist es wahrscheinlich, dass die resultierende Ausbeute an bakterieller DNA aus CSF mit nur wenigen Bakterien nicht konsistent ist. In diesem Zusammenhang wurde in einer kürzlich durchgeführten Studie ein neues Protokoll zur Reinigung von DNA unter Verwendung von Festphasenträgern entwickelt, die selektiv Nukleinsäuren absorbieren (7). Dieses Protokoll basiert auf der Natur von Nukleinsäuren, die in Gegenwart von chaotropen Mitteln wie NaI oder NaClO . an Kieselsäure- oder Glaspartikel binden können4 (44, 62, 65). Eine chaotrope Extraktions-Glasfaserfilter-DNA-Reinigung (GFX Pharmacia Biotech, Milwaukee, WI) ist ein solches Protokoll und verwendet eine Glasfasermatrix zur DNA-Isolierung.Ein DNA-Isolierungskit basierend auf dem Guanidiniumisothiocyanat-Silica-Bead-Verfahren (7) ist ebenfalls im Handel erhältlich (NucliSens-Isolierungskit Organon Teknika, Durham, N.C.). Der NucliSens-Isolierungskit führt zu einer ausreichenden DNA-Ausbeute und einer hoch reproduzierbaren PCR für β-Globin auf fixierten Zellen (16). Es gibt jedoch keinen Bericht über die Anwendung solcher Kits zur Isolierung bakterieller DNA aus klinischen Proben. Fahle und Fischer (22) untersuchten die Wirksamkeit der Isolierung viraler DNA aus klinischen Proben, einschließlich Liquor, mit sechs verschiedenen kommerziellen DNA-Extraktionskits. In dem Bericht wurde der Schluss gezogen, dass das NucliSens-Isolationskit und das Puregene-DNA-Isolationskit (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota) die empfindlichsten unter den getesteten Kits waren, einschließlich des Generation Capture Column Kit (Gentra Systems), MasterPure DNA-Reinigungskit (Epicentre Technologies, Madison, Wis.), IsoQuick-Nukleinsäureextraktionskit (MicroProbe Corp., Bothell, Washington) und QIAamp-Blutkit (Qiagen, Valencia, CA) zur Extraktion von Cytomegalovirus-DNA aus klinischen Proben, basierend auf der DNA-Wiederherstellung mit dem breiten Spektrum der ausgewerteten Probenarten. Ähnliche Bewertungen von DNA-Extraktionen mit kommerziellen Kits wurden auch von drei anderen Gruppen (13, 36, 61) durchgeführt. Aus diesen Studien ergab sich, dass das QIAamp-Kit besser geeignet ist als andere kommerzielle und nicht-kommerzielle Methoden, die für die Extraktion von DNA für die PCR evaluiert wurden. Einige kommerziell erhältliche Extraktions- und Reinigungskits, die auf einem Festphasen-Reinigungsprotokoll basieren, sind in Tabelle ​ Tabelle1 aufgeführt. 1. Diese Kits eliminieren nicht nur Rätselraten, sondern auch arbeitsintensive Phenol-Chloroform-Extraktionsschritte. Es gibt jedoch nur begrenzte Informationen zur Isolierung bakterieller DNA aus klinischen Proben, insbesondere Liquor, mit diesen kommerziellen Kits.

TABELLE 1.

Kommerzielle DNA-Extraktionskits basierend auf dem Festphasen-Reinigungsprotokoll

BausatzVerkäuferMethode
Generation Capture-Säulen-KitGentra-SystemeSäule ohne Siliziumdioxid
NucliSens-IsolationskitOrganon TeknikaKieselsäurepartikel
QIAmp DNA Mini-KitQiagenMembransäule auf Kieselsäurebasis
UltraClean BlutschleudersetMoBio-LaborsMembran auf Kieselsäurebasis
MagPrep-Blutgenom-DNA-KitNovagenMagnetische Kieselsäurepartikel
SNAP Vollblut-DNA-KitInvitrogenMembransäule auf Kieselsäurebasis
GFX genomisches Blut-DNA-AufreinigungskitAmershamGlasfasermatrix

Zielgene.

Die Wahl der Zielgene und das Design von Oligonukleotidprimern sind entscheidende Elemente bei der Bestimmung der Sensitivität der PCR (29, 53). Selbst wenn das gleiche Gen als Ziel ausgewählt wird, zeigt die PCR mit unterschiedlichen Primersätzen einen 100- bis 1.000-fachen Empfindlichkeitsunterschied zwischen den Primersätzen (29). Daher ist die Sequenz der Primer wichtig für die Sensitivität und Spezifität der PCR. Die Sensitivität der PCR hängt auch vom ausgewählten Zielgen ab, da die Kopienzahlen von Genen oder Operons pro Bakterium variieren. Betrachtet man in dieser Hinsicht nur die Sensitivität der PCR, ist die reverse Transkriptions-PCR aufgrund der multiplen Kopienzahlen von mRNAs pro Bakterium ein weiteres Selektionsverfahren. Der praktische Wert der reversen Transkriptions-PCR in der Diagnose ist jedoch aufgrund der kurzen Lebensdauer und der Anfälligkeit bakterieller mRNAs begrenzt.

Der Sequenzpolymorphismus eines Zielgens ist ein weiteres Problem in Bezug auf die PCR-Spezifität. Einige bakterielle Gene, wie z C. trachomatis äußeres Membranprotein-Gen, hypervariable Regionen innerhalb des Gens aufweisen (23). Daher können PCR-Produkte unterschiedlicher Größe sowie unterschiedlicher Sequenzen zwischen klinischen Isolaten des Bakteriums auftreten, wenn ein solches Gen als Ziel für die PCR ausgewählt wird.

Eine universelle PCR, die konservierte Regionen in verschiedenen Bakterien amplifiziert, ist ideal zum Nachweis von Krankheitserregern beim Screening von klinischen Proben (8, 40, 42, 49, 63). Zu diesem Zweck wurde der konservierte Bereich des 16S rRNA-Gens als Zielgen für die universelle PCR ausgewählt, da fast alle gängigen bakteriellen Erreger, die in Körperflüssigkeiten vorkommen, sequenziert wurden (27, 42, 49). Unter Verwendung dieser universellen PCR wurde eine hohe Nachweisempfindlichkeit der PCR für 10 gram-negative und 250 gram-positive Bakterien in Liquor berichtet (42). Da jedoch mit der universellen PCR fast alle Bakterien, einschließlich der normalen Flora wie Staphylokokken, auf der Haut nachgewiesen werden können, ist die Unterscheidung nach Kontaminanten schwierig, insbesondere wenn die Proben nur wenige Bakterien enthalten.

PCR-Protokolle.

Es gibt mehrere PCR-Protokolle, um die Sensitivität zu erhöhen, insbesondere wenn eine kleine Anzahl von Bakterien als Ziel verwendet wird. Nested PCR ist eines dieser Protokolle zum Nachweis von nur wenigen Bakterien in klinischen Proben. Das Verfahren verwendet zwei aufeinanderfolgende PCRs. Die erste PCR enthält ein externes Primerpaar, während die zweite entweder zwei verschachtelte Primer enthält, die sich innerhalb des ersten Primerpaars befinden, oder einen der ersten Primer und einen einzelnen verschachtelten Primer. Das bei der ersten Reaktion erzeugte größere Fragment wird als Matrize für die zweite PCR verwendet. Die Sensitivität und Spezifität der DNA-Amplifikation kann durch die Verwendung einer solchen Nested-PCR erheblich verbessert werden, manchmal mit einer 1000-fach höheren Sensitivität als eine Standard-PCR. Im Falle des Nachweises von C. pneumoniae durch nested-PCR in einer mit Bakterien versetzten Standardlösung wurde die Sensitivität im Vergleich zu einer Standard-Einzel-PCR nicht immer verbessert. Zum Beispiel verschachtelte und einzelne PCRs mit Primern, die spezifisch für die C. pneumoniae omp-1 Gen zeigte die gleiche Sensitivität (0,005 Einschlüsse oder 2,5 Elementarkörperchen pro PCR) (2).

Ein häufig anzutreffendes Problem bei der PCR-Amplifikation von Zielgensequenzen ist das Auftreten von störenden kleineren Banden im Produktspektrum (17). Dies wird normalerweise als Folge einer Fehlprimung durch eines oder beide der Oligonukleotid-Amplmere auf die Zielmatrize interpretiert. Touchdown-PCR wurde entwickelt, um solche Probleme zu vermeiden und bietet eine eindeutig spezifische PCR-Bande. Die Touchdown-PCR verwendet ein Protokoll mit abnehmenden Annealing-Temperaturen bei jedem Zyklus von oberhalb bis unterhalb der erwarteten Annealing-Temperatur (17). Die Anwendung dieser Technik zum Nachweis von C. pneumoniae stellte eine verbesserte analytische Sensitivität bereit (0,004 bis 0,063 einschlussbildende Einheit pro PCR) (43).

Nachweis von PCR-Produkten.

Neben der traditionellen Elektrophoresemethode auf einem Ethidiumbromid-haltigen Agarosegel gibt es mehrere verschiedene Nachweisprotokolle für PCR-Produkte. Southern-Hybridisierung mit einer spezifischen Sonde, die mit einem Radioisotop- oder Nicht-Radioisotop-Marker markiert ist, an PCR-Amplikons wurde weithin für die Untersuchung der PCR-Spezifität verwendet. Dieses Nachweisprotokoll bietet auch eine höhere Empfindlichkeit als das Ethidiumbromid-Nachweisverfahren, erfordert jedoch zusätzliche Blotting- und Hybridisierungsschritte. Der Digoxigenin (DIG)-PCR-Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ist eines der PCR-Amplikon-Nachweisverfahren unter Verwendung einer Mikrotiterplatte und ist jetzt im Handel erhältlich (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Ind.). Dieses Verfahren beinhaltet das Einfangen von Amplikons, die mit DIG durch die Sonde markiert sind, die auf der Oberfläche einer Streptavidin-beschichteten ELISA-Platte immobilisiert ist. Das gebundene Hybrid wird mit einem Anti-DIG-Peroxidase-Konjugat und dem kolorimetrischen Substrat nachgewiesen. Dieses ELISA-System hat sich als 10- bis 100-mal empfindlicher als das herkömmliche Elektrophorese-Verfahren erwiesen (48). Die PCR-Immunoassay-Nachweismethode unter Verwendung eines speziellen kleinen Geräts (Clearview Immunoassay Detection Device Oxoid Inc., Ogdensburg, NY), das eine Membran und ein Probenauftragskissen mit Latexkügelchen enthält, die mit einem Anti-2,4-Dinitrophenol-Antikörper markiert sind, ist eine andere Art des Nachweisverfahrens für Amplikons zum Nachweis spezifischer Bakterien in klinischen Isolaten (12, 59). Die in diesem System verwendete Membran ist mit Antibiotin-Antikörper- und Anti-DIG-Antikörperlinien beschichtet. Daher ist eine Bewertung von PCR-Ergebnissen als positiv oder negativ durch Verwendung dieses Nachweis-Kits in klinischen Labors, die keine Elektrophorese-Ausrüstung haben, relativ einfach. Die Anwendung dieses Kits zum Nachweis von Meningokokken in Liquor zeigte eine Nachweisgrenze von ein bis drei Organismen pro PCR, was zehnmal empfindlicher ist als der Nachweis von PCR-Produkten durch herkömmliche Elektrophorese mit Agarosegelen (54). Auf Fluoreszenzsonden basierende Assays mit markierten Primern oder spezifischen Sonden, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind, wurden mit den Vorteilen eines geschlossenen Systems entwickelt, das Verschleppungskontaminationen während der PCR und eine erhöhte Nachweisempfindlichkeit für Amplikons vermeidet. Es gibt zwei Arten von Assays, die Echtzeit- und Endpunktmesswerte verwenden. Vor allem die Real-Time-PCR, die schnelle und genaue Informationen über Zielgene liefert, wird zunehmend eingesetzt. Dieser Ansatz hat den Vorteil, die PCR in der exponentiellen Phase zu quantifizieren, anstatt die Endpunktakkumulation des PCR-Produkts zu verwenden oder zu versuchen, die PCR in der exponentiellen Phase einzufangen, wie dies zuvor bei vielen quantitativen PCRs der Fall war (52). Diese nicht auf Gel basierende Technik hat mehrere andere Vorteile gegenüber gewöhnlichen Techniken auf Agarosegel-Basis. Dieses System ermöglicht beispielsweise eine große Erhöhung des Durchsatzes. Der Fluoreszenzsonden-Assay wird in einem 96-Well-Format durchgeführt und viele der Schritte des Assays sind automatisiert. Der Assay ist ein geschlossenes System, bei dem das Reaktionsröhrchen nach der Amplifikation nie geöffnet wird. Darüber hinaus verwendet es ein automatisiertes Nachweissystem, das den Fluoreszenzgrad gegenüber dem der Kontrolle bei jedem Zyklus quantifiziert und berechnet und somit die Zykluszahl und den linearen Bereich für ein positives Ergebnis genau definiert (52). Obwohl derzeit nur wenige Berichte über den Nachweis und die Quantifizierung von Bakterien in Liquor durch Real-Time-PCR vorliegen, hat diese Technik aufgrund dieser Vorteile ein hervorragendes Potenzial als Hauptprotokoll für den PCR-Nachweis von Bakterien in klinischen Proben, einschließlich Liquor.


Diskussion

Wie in der Hypothese vorhergesagt und in den Abbildungen dargestellt.  1 , ​ ,2, 2 , ​ ,3, 3 , ​ ,4, 4 , ​ ,5, 5 , ​ ,6, 6 und ​ und7, 7 unterstützt das Auftreten unterschiedlicher PCR-Amplifikationsprofile für verschiedene Bakterienisolate (Abb.  3 ) die Hypothese, dass mehr als ein allgemeines Primerpaar erforderlich war, um alle Bakterien zu erkennen. die Hypothese sagte den Mangel von “Universal Primers” voraus. Die Ergebnisse zeigten, dass G4, G6, G8, G9 und G10 mit einem oder mehreren Isolaten ausgefallen waren. Das unvermeidliche Versagen universeller Primerpaare (oder allgemeiner Primerpaare) kann anhand der Primerverteilungen weiter vorhergesagt werden Tabelle  2 zeigt, dass kein einzelner Primer mit allen 44 aufgelisteten Gattungen reagieren könnte, was bedeutet, dass jedes gegebene Primerpaar mindestens einmal versagt ( 2,2%). Das “Universal” Primerpaar 909F.R (Tabelle  1 ) [17] wird bei 22 verschiedenen Gattungen oder 50 % der in Tabelle  2 aufgeführten fehlschlagen. Dies macht das 909-Primer-Paar weder spezifisch noch universell. Das Primerpaar QUGP-F3.R2 (das sich in dieser Studie als nützlich erwiesen hat, Tabelle  7 ) wird bei drei Gattungen versagen, denen die QUGP-R2-Sequenz fehlt (Aquifex, Rickettsia, Thermotoga Tabelle  2 ) und es wird mit neun Gattungen fehlschlagen, denen QUGP-F3 fehlt (Anabaena, Aquifiex, Bordetella, Campylobacter, Chlamedophila1, Desulfovibrio, Mycoplasma, Prochlorococcus, und Thermotoga). Bei der Anwendung dieses PCR-Primerpaares auf die in Tabelle  2 aufgeführten 44 Gattungen versagt das Primerpaar bei zehn Gattungen, was den Nachweis von nur 34 Gattungen (72 %) ermöglicht. In ähnlicher Weise erkennt das Primerpaar QUGP-F5.R4 84% der aufgeführten Gattungen QUGP-F5 wird mit zwei Gattungen fehlschlagen (Chlamydophila1,Rhodopirellula Tabelle  2 ), während QUGP-R4 fehlschlägt mit Chlamydophila1 und fünf weitere Gattungen (Mykoplasmen, Syntrophobacter, Thermus, Treponema und Wolbachia). Dementsprechend erkennt QUGP-F5.R4 nur 37 (84%) der in Tabelle  2 aufgeführten Gattungen. Mathematisch erkennen die beiden Paare QUGP-F3.R2 und QUGP-F5.R4 (95,4%) alle 44, aber (Chlamydophila1 und Mykoplasmen). Das Mischen der beiden Paare hat jedoch den zusätzlichen Vorteil, dass ein neues Paar (QUGP-F5.R2) generiert wird, das Mykoplasmen aber nicht Chlamydophila1. Daher führt das Mischen der vier Primer zum Nachweis von 43 Gattungen (97,8%). Nun ist klar, wie G7 mit seinen 10 Primerpaaren Bakterien nachweisen könnte. G7 erkennt alle 44 in Tabelle   2 aufgeführten Gattungen, die eine repräsentative Probe aller Bakterien darstellen können. Gemäß der vorliegenden Studie wurden weitere Gattungen (nicht in Tabelle  2 aufgeführt) von G7 entdeckt (Acinetobacter, Alkaligenes, Serratia, Klebsiella und andere Tabelle  7 ). Diese Berechnungen untermauern das Potenzial des UM-Ansatzes gegenüber dem “Universal Primer”-Ansatz.

Der limitierende Schritt bei der Identifizierung eines Bakteriums unter Verwendung des UM liegt im Nachweisschritt (Stufe I). Die UM löste diese Einschränkung durch die Bereitstellung einer Reihe von Primermischungen (Tabelle  5 A, B). Laut UM können Golden Mixtures G7 und G5 potenziell 12 verschiedene Primerpaare (oder PCR-Amplikons) produzieren. Zusätzliche Primerpaare können durch Einbau von QUGP-F1 und QUGP-R7 in Golden-Mischungen erzeugt werden. Der Einbau von QUGP-F1 erzeugt 6 zusätzliche Primerpaare (Tabelle  6 ). Die 20 möglichen Primerpaare, die in Tabelle  6 gezeigt werden, können wahrscheinlich jedes Bakterium erkennen. G7 ermöglichte die Bildung von 10 verschiedenen Primerpaaren, die für die in Abb.  6 a beobachteten Amplikons verantwortlich sind (QUGP-Fn3 paart weder mit QUGP-Rn3 noch mit QUGP-F4). Mit G5 können zwei zusätzliche Primerpaare (QUGP-Fn5.R4 und QUGP-Fn6.R4) generiert werden. Daher erhöht die Anwendung von G7 und G5 auf ein beliebiges Bakterium die Wahrscheinlichkeit, dieses Bakterium nachzuweisen, um das 12-fache gegenüber einem einzelnen PCR-Primerpaar oder um das 20-fache, wenn alle Primerpaare von Tabelle  6 verwendet werden sollen.

Der Nachweis aller 101 getesteten Bakterienisolate unter Verwendung der verschiedenen QUGP-Mischungen ohne Fehler unterstützt stark die Fähigkeit des UM, jedes Bakterium nachzuweisen. Golden Mixtures wurden aus praktischen Gründen entwickelt und um den Prozess im Vergleich zur Verwendung einzelner Primerpaare G7 allein zu vereinfachen, um positive PCR-Amplikons mit jedem der (67/67) getesteten Bakterienisolate zu produzieren, zeugt von seinem Potenzial, die meisten, wenn nicht alle Bakterien nachzuweisen.

Sowohl G7 als auch G10 konnten bei 10.000-facher Verdünnung bakterielle DNA nachweisen. Dies bedeutet, dass die Proben ausreichend verdünnt werden sollten, wenn eine zufällige Kontamination vermutet wird Verdünnung von Blutproben, die mit kontaminiert sind Staphylococcus epidermidis oder andere Bakterien können dazu beitragen, den Nachweis solcher Verunreinigungen zu vermeiden, dieser Bereich bedarf umfangreicher Untersuchungen, bevor er praktisch genutzt werden kann. G7 kann verwendet werden, um das Vorhandensein oder Fehlen von Bakterien in einer Vielzahl von Proben, einschließlich klinischer Proben, zu testen.

Die Anwendung von G7 ist wahrscheinlich am geeignetsten für die Analyse von Bakteriengemeinschaften, da davon ausgegangen wird, dass es die überwiegende Mehrheit, wenn nicht alle Arten innerhalb der getesteten Probe amplifiziert. Qualitative Analyse von gemischten PCR-Produkten mit verfügbaren Techniken wie Microarrays [12], C0t Analyse, Klonierung und Sequenzierung, RFLP, denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese-Analyse [14, 39] oder eine Kombination dieser Methoden werden unser Verständnis von Bakteriengemeinschaften verbessern.

Eine kritische Voraussetzung für die DNA-Sequenzierung besteht darin, dass ein Sequenzierungsprimer nur an eine einzelne Stelle der Matrizen-DNA anlagern sollte. Daher sind Proben, die gemischte DNA-Spezies enthalten, die mit General-Primern erhalten wurden, nicht für die direkte DNA-Sequenzierung geeignet. Ein weiteres Hindernis, das mit der sequenzierungsbasierten Ribotypisierung verbunden ist, ist ihre Abhängigkeit von der Verfügbarkeit von rDNA-Sequenzen für die Alignment-Analyse (BLAST). Beispielsweise identifizierte die BLAST-Analyse das Isolat QUBC35 als Citrobacter koseri (95,5%) wurde es auch identifiziert als Citrobacter freundii (92,5%) oder C. youngae (7,4 %) mit dem API 20E-System kann die Nichtverfügbarkeit einiger Spezies für die BLAST-Analyse die Identifizierung des Isolats als verzerrt haben C. koseri. Ein weiteres Beispiel wurde erhalten, als das spiralförmige Bakterium QUBC70 PCR-sequenziert, aber schlecht identifiziert wurde. Es war zu 95% identisch mit Phäospirillum sp. höchstwahrscheinlich aufgrund des Fehlens der passenden Sequenz aus Nukleotiddatenbanken. Das Isolat QUBC70 wird durch biochemisches Profiling identifiziert, die erhaltene Sequenz wird in der Genbank hinterlegt, nachdem das Bakterium identifiziert und bestätigt wurde. Eine vollständige bakterielle Nukleotid-/Genbank (insbesondere für ribosomale Nukleotidsequenzen) wird sicherlich die Zuverlässigkeit des UM und anderer sequenzbasierter Verfahren verbessern.

Isolate mit BLAST-Homologien von weniger als 98% wurden nicht akzeptiert, es sei denn, sie wurden durch eine andere Methode verifiziert. Zwei Hauptgründe trugen zu einer schlechten Identifizierung, einer schlechten Sequenzierung und dem Fehlen einer entsprechenden Sequenz aus der Nukleotiddatenbank bei. Zusätzliche Bedrohungen für die Gültigkeit der UM ergeben sich aus starken Assoziationen zwischen Bakterienarten wie im Fall der parasitären Bakterien (Bdellovibrio sp.), Genkopienzahl und Polymorphismus.

Wenn hochkonservierte Gene wie 16S-Gene zur Identifizierung von Bakterien verwendet werden, können lange Sequenzen (�ꂺsen) eine ausreichende Unterscheidungskraft zwischen Bakterien bieten als kürzere Sequenzen. Daher sind Sequenzen mit einer Länge von �ꂺsen für die Identifizierung vorzuziehen, obwohl speziesspezifische kürzere Sequenzen verwendet werden können [9, 20�, 24].

Die Gültigkeit der UM wurde festgestellt, alle 40 sequenzierten PCR-Amplikons waren diejenigen von 16S rDNA. Die UM entdeckte und identifizierte 24 Gattungen und 34 Arten. Dieses breite Spektrum an Artennachweis und Identifizierung rechtfertigt die Anwendung der Methode auf jedes andere Bakterium. Die UM wurde weiter validiert, da sie mit anderen Identifizierungsmethoden wie API, morphologischen und biochemischen Profilen und speziesspezifischen PCR-Primern übereinstimmte. Die Reproduzierbarkeit der von der UM erhaltenen Ergebnisse zeugen von ihrer Stabilitätserkennung aller Enterococcus faecalis Isolate (QUBC80,81 und 83). Die Fähigkeit der UM, zwischen Streptomyces spp. QUBC50, 102, 103, 104 und 106 wurden ebenfalls illustriert. Die Wiederholung der Sequenzierung und BLAST-Analyse mit dem gleichen Isolat wie in QUBC70 ergab die gleichen exakten Ergebnisse.

Zusammenfassend kann G7 zusammen mit G5 eine echte Substitution für universelle Primer darstellen, wie in der Hypothese vorhergesagt, diese beiden Mischungen enthielten insgesamt 8 allgemeine Primer (7 Primer in G7 und 4 Primer in G5). Potenziell können sie alle Bakterien erkennen, da sie insgesamt 12 Primerpaare erzeugen. G7 und G5 können für eine Reihe anderer Anwendungen verwendet werden, wie zum Beispiel den Nachweis von Bakterien in Proben, die Analyse von Bakteriengemeinschaften und die Identifizierung von Bakterien.



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