Information

Übersetzung von Poly-U im Nirenberg- und Matthaei-Experiment

Übersetzung von Poly-U im Nirenberg- und Matthaei-Experiment



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Im Nirenberg- und Matthaei-Experiment wurde die künstliche mRNA, polyU, in einem zellfreien System in Polyphenylalanin übersetzt, wodurch nachgewiesen wurde, dass UUU das Codon für Phe ist. Wie funktionierte dies, da der künstlichen mRNA ein AUG-Initiationscodon fehlte, von dem wir heute wissen, dass es für die Translation zellulärer mRNAs benötigt wird?


Dies ist eine kluge Frage, die die in vielen Lehrbüchern angewandten Vereinfachungen hervorhebt, um experimentelle Wissenschaft sauberer und logischer erscheinen zu lassen, als dies tatsächlich der Fall ist. Nach dem, was wir jetzt über die Notwendigkeit eines AUG-Initiationscodons in der Proteinbiosynthese wissen, hätten diese Experimente nicht funktionieren sollen.

Der Grund dafür war, dass sie bei einer unphysiologisch hohen Mg .-Konzentration durchgeführt wurden2+ was die Notwendigkeit einer spezifischen Initiation überwindet (und nebenbei anderen Reaktionen der Proteinsynthese einen abnormalen Ablauf ermöglicht, insbesondere die Codon-gerichtete tRNA-Bindungsreaktion, die verwendet wird, um die Entschlüsselung des genetischen Codes abzuschließen). Sie sollten auch bedenken, dass die Effizienz der Reaktion wahrscheinlich viel geringer war als die innerhalb der Zelle, aber dies spielte keine Rolle, da nur ein Produkt synthetisiert werden musste.

Referenz

Ich habe Ende der 60er/Anfang der 70er Jahre in diesem Bereich gearbeitet und die Bedeutung der Magnesiumkonzentration war auf diesem Gebiet nur allgemein bekannt, daher ist es schwierig, eine Referenz anzuführen, um meine Behauptung zu untermauern. Eine kurze Recherche brachte jedoch eine zeitgenössische Veröffentlichung über die Wirkung von Magnesium auf die Initiation der Proteinsynthese in Phagen-RNA hervor, die ihre Bedeutung veranschaulicht. Es gibt zweifellos andere.


Der genetische Code | Genetik

Die Vier-Buchstaben-Sprache der Nukleinsäuren wird in die Zwanzig-Buchstaben-Sprache der Proteine, den genetischen Code, übersetzt. Die frühen genetischen Experimente zeigten, dass jede Aminosäure von einer bestimmten Anzahl aufeinanderfolgender Nukleotide in der DNA kodiert wird. Der beste Weg, den genetischen Code zu entschlüsseln, wäre daher, die Nukleotidsequenz eines Gen-enthaltenden DNA-Segments mit der Aminosäuresequenz seines spezifischen Proteins zu vergleichen.

Dies konnte aufgrund fehlender Kenntnisse über die Existenz von mRNA erst Anfang der 1960er Jahre erreicht werden. Als sich herausstellte, dass mRNA Informationen von der DNA zu einem bestimmten Protein überträgt, wurde das Problem vereinfacht. Danach wurde die Untersuchung des genetischen Codes biochemisch angegangen und bestand darin, die Beziehung zwischen der Nukleotidsequenz der mRNA und der Aminosäuresequenz ihres Proteins zu analysieren.

Nach und nach wurden die Codewörter für alle Aminosäuren entdeckt und durch genetische und biochemische Beweise bestätigt. Die Aufklärung des genetischen Codes ist eine der größten wissenschaftlichen Errungenschaften der letzten Zeit.

Der Triplett-Code:

Die 4 Codebuchstaben der DNA, die die Sequenz von 20 Aminosäuren angeben, sind die 4 Basen A, T, G und C. Wenn die 4 Basen in 2er-Gruppen angeordnet sind, können 4 2 = 16 Codepaare oder Kombinationen vorliegen Wörter. Da 16 Paare für die 20 Aminosäuren nicht ausreichen, muss der Code für jede Aminosäure mehr als 2 Basen enthalten. Die 4 gleichzeitig genommenen Basen können 4 3 = 64 verschiedene Aminosäuren spezifizieren. Der genetische Code für Aminosäuren besteht daher aus Tripletts von Basen.

Identifizieren von Codewörtern für Aminosäuren:

Nirenberg und Matthaei entwickelten 1961 ein zellfreies System zur Proteinsynthese. Sie könnten Zellen aufbrechen und eine Mischung der Zellbestandteile zur Synthese von Proteinen nutzen. Wurden den Zellextrakten radioaktiv markierte Aminosäuren zugeführt, wurden diese in den neu synthetisierten Proteinen nachgewiesen.

Nirenberg und Matthaei verwendeten auch künstlich synthetisierte mRNA im zellfreien System. Als sie eine synthetische mRNA hinzufügten, die nur aus einer Base Uracil (Poly U) bestand, bestand das synthetisierte Protein nur aus einer Aminosäure Phenylalanin. Da U für Polyphenylalanin kodiert, deutet dies darauf hin, dass das Triplett UUU für die Aminosäure Phenylalanin kodiert.

Durch ähnliche Experimente wurde herausgefunden, dass das synthetische Polyribonukleotid poly C für Polyprolin kodiert, dh das Triplett CCC kodiert für die Aminosäure Prolin. Die Synthese von Polyribonukleotid (mRNA) wie Poly U im Labor war durch die frühere Entdeckung des Enzyms Polynukleotid-Phosphorylase möglich.

Dieses Enzym wurde erstmals von Ochoa (Nobel Laureate) und seinen Kollegen aus Azobacter vinelandii isoliert. Ochoa und seine Kollegen entwickelten auch ein zellfreies System, das für die Proteinsynthese verwendet werden könnte. Sie fanden heraus, dass das Triplett AAA für Lysin kodiert.

Es wurden nun Versuche unternommen, statistische RNA-Copolymere in zellfreien Systemen unter Verwendung von 5′-Ribonukleosiddiphosphaten und dem Enzym Polynukleotidphosphorylase zu synthetisieren.

Bei dieser Methode katalysiert das Enzym die Addition der 5′-Ribonukleasediphosphate an die 3′ Enden der Verfügbarkeit der Diphosphate in Abhängigkeit von ihrer Konzentration. Das heißt, wenn die Konzentration von ADP das 5-fache der von CDP beträgt, dann enthält das synthetisierte Copolymer auch die 5-fache Anzahl von Cs im Vergleich zu As, jedoch in zufälliger Reihenfolge.

Die kodierenden Tripletts in einem solchen Copolymer führen zur Synthese einer Polypeptidkette, die hauptsächlich Lysin, Threonin und Prolin enthält. Das liegt daran, dass C und A verschiedene mögliche Tripletts wie CCA, CAC, AAC, ACA, CCC, AAA bilden können. Da der Anteil von as im Copolymer fünfmal höher ist als der von Cs, wäre die Häufigkeit von AAA-, AAC- und CAA-Codons entsprechend höher als die der restlichen Codons.

Durch Verwendung synthetischer Copolymere konnten die meisten der möglichen Codons Aminosäuren zugeordnet werden. Diese Technik konnte jedoch nur die Zusammensetzung der Codewörter bestimmen. Die Nukleotidsequenz in den Tripletts, also die Schreibweise eines Codons, blieb noch unbekannt.

Der Triplett-Bindungstest:

1964 entdeckten Nirenberg und Leder eine direkte Methode zur Bestimmung der Nukleotidsequenz im Code. Sie fanden heraus, dass synthetische Homopolymere wie Poly U die Bindung seiner spezifischen Aminoacyl-tRNA (d. h. Phenylalanin-tRNAphe) an Ribosomen stimulierten, gleichzeitig binden diese Ribosomen an die synthetische mRNA (Poly U).

Keine andere Aminoacyl-/RNA wird an Ribosomen und an Poly U binden. In ähnlicher Weise induzierte die synthetische mRNA, die aus Poly A bestand und Ribosomen hinzugefügt wurden, die Bindung von Lysin-tRNA und nicht von irgendeiner anderen Aminoacyl-tRNA. Dies wird als Triplett-Bindungsassay oder tRNA-Bindungstechnik bezeichnet. Später wurde dieser Test auch auf Polyribonukleotid-Copolymere angewendet, die als synthetische mRNA verwendet wurden (Abb. 15.20).

Nirenberg und Leder fanden auch heraus, dass der Triplett-Code eine Polarität hat. Somit stimuliert das Triplett GUU die Bindung von Valin-tRNAval, während UUG Leucin-tRNALeu bindet. Als nächstes fuhren sie fort, Trinukleotide mit bekannter Basensequenz zu synthetisieren.

Durch die Triplett-Bindungsmethode konnten sie bestimmen, welche Aminoacyl-tRNA in Gegenwart eines Trinukleotids bekannter Sequenz spezifisch an Ribosomen gebunden wurde. Auf diese Weise wurde für viele der Aminosäuren die Nukleotidsequenz in einem Triplett festgelegt.

H.G. Khorana und seine Kollegen haben auf diesem Gebiet einige sehr herausragende Beiträge geleistet. Khorana erhielt 1968 den Nobelpreis. Sie lieferten experimentelle Beweise für Codon-Sequenzen unter Verwendung synthetischer mRNAs bekannter Nukleotidsequenzen.

Sie synthetisierten verschiedene Copolymere mit zwei, drei und vier Arten von Basen. Wenn beispielsweise ein aus Poly-GUA bestehendes Copolymer hergestellt wurde, hatte es die Sequenz GUAGUAGUAGUAGUAGUA. Zuerst synthetisierten sie zwei komplementäre Desoxyribonukleotide mit jeweils neun Resten, nämlich d(TAC)3 und d(GTA)3.

Dann verwendeten sie diese beiden Oligonukleotidketten als Matrizen, auf denen lange DNA-Ketten aus den vier Desoxyribonukleosidtriphosphaten durch das Enzym DNA-Polymerase I synthetisiert wurden. Keine der beiden Oligonukleotidketten konnte allein als Matrizen dienen. Wenn jedoch beide Ketten vorhanden waren, fungierte d(TAC)3 als Matrize für die Synthese von Poly d(GTA) und d(GTA)3 diente als Matrize für die Synthese von Poly d(TAC). Diese beiden langen komplementären Ketten bildeten eine Doppelhelixstruktur.

Danach stellten Khorana und Kollegen lange Polyribonukleotidketten mit einer Sequenz her, die poly d(TAC) und poly d(GTA) entsprach. Dies wurde durch die Verwendung der poly d(TAC)- und poly d(GTA)-Doppelhelix als Matrize für die Synthese durch die RNA-Polymerase erreicht. Die Wahl, welcher DNA-Strang von der RNA-Polymerase transkribiert werden würde, hing von den Ribonukleosidtriphosphaten ab.

Wenn GTP, UTP und ATP zugegeben wurden, war das aus dem Poly-d(TAC)-Matrizenstrang synthetisierte Polyribonukleotid Poly-GUA. Der andere Strang wurde aufgrund des Fehlens von CTP aus dem Inkubationsgemisch nicht transkribiert. Aber wenn CTP, UTP und ATP geliefert wurden, wurde poly UAC aus dem zweiten Matrizenstrang synthetisiert. Durch dieses Verfahren wurden zwei lange Polyribonukleotide synthetisiert, von denen jedes definierte sich wiederholende Sequenzen aufwies.

Bis 1965 hatte die Arbeit von Khorana, Nirenberg und Mathaei sowie von Ochoa zur Identifizierung der kodierenden Tripletts für alle Aminosäuren geführt (Tabelle I von Crick).

Merkmale des genetischen Codes:

1. Der Code ist kommalos, dh es ist kein Nukleotid für Satzzeichen reserviert, um das Ende eines Codons und den Beginn des nächsten anzuzeigen. Die Tripletts werden nacheinander gelesen.

2. Es ist ein degenerierter Code in dem Sinne, dass die meisten Aminosäuren von mehr als einem Triplett codiert werden. Beispielsweise werden die Aminosäuren Tyrosin, Histidin, Glutaminsäure und einige andere von jeweils zwei Tripletts kodiert und die Aminosäuren Arginin, Serin und Leucin werden jeweils von 6 Tripletts kodiert. Es gibt nur 2 Aminosäuren Tryptophan und Methionin, die von einem einzigen Triplett kodiert werden.

3. Von den 64 Tripletts kodieren 3 für keine Aminosäure. Dies sind UAG, UAA und UGA. Diese Tripletts dienen als Signale für die Termination von Polypeptidketten.

4. Die ersten beiden Basen im Triplett geben die Aminosäure an, die dritte Base ist weniger spezifisch.

Laut Crick (1966) tendiert die dritte Basis zum “wobble”, auf deren Grundlage er seine Wobble-Hypothese vorschlug. Crick bemerkte, dass die Degeneration des Codes in den meisten Fällen nur die dritte Base im Codon betrifft. Somit kodieren UUU und UUC beide für Phenylalanin UUA und UUG für Leucin und GCU, GCC, GCA und GCG für Alanin.

Crick erklärte die Wobble-Hypothese auf der Grundlage der Codon-Anticodon-Basenpaarung. Die Paarung von mRNA-Codon und tRNA-Anticodon ist antiparallel. Konventionell wird das Nukleosid am 5′ Ende nach links geschrieben. Daher ist die dritte Position des Codons die erste Position des Anticodons.

Dies führt zu folgender Art der Paarung:

Crick schlug diese Paarungsregeln (Wobble-Regeln) für die Codon-Position vor. Nach diesen Regeln ist es möglich, mehr als eine tRNA-Spezies mit jeweils einem spezifischen Anticodon in Beziehung zu setzen, um spezifische Codons zu lesen.

Somit würde erwartet, dass die Codons für Glutamin CAA und CAG mit einem einzelnen Anticodon UUG paaren. Die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen des Codons und des Anticodons sind jedoch locker genug, damit der Komplex dissoziieren kann, was während der aktiven Proteinsynthese erforderlich ist.

5. Der genetische Code ist universell: Er ist auf das Tabakmosaikvirus, Bakteriophagen, E. coli, Tiere und den Menschen anwendbar. Bei allen getesteten Arten sind die Codetripletts identisch.

Genetische Beweise für den Code:

Vergleichende Studien zu Mutationen (Änderungen in der Genstruktur) und entsprechenden Veränderungen der Aminosäuresequenz eines bestimmten Proteins haben die Gültigkeit des genetischen Codes bestätigt. Einige dieser Studien beziehen sich auf die Auswirkungen von Mutationen auf die Aminosäuresequenz von Hämoglobin, dem Protein in roten Blutkörperchen.

Ein Hämoglobinmolekül enthält 4 Polypeptidketten, zwei identische α-Ketten, die jeweils aus 141 Aminosäuren bestehen, und zwei β-Ketten, die ebenfalls identisch sind und jeweils 146 Aminosäuren enthalten. 1956 untersuchte Ingram das abnormale Hämoglobin (S) von Patienten mit Sichelzellenanämie.

Er fand heraus, dass in der β-Kette die Aminosäure an der sechsten Position Valin ist, während es im normalen Hämoglobin (A) Glutaminsäure ist. An erster Stelle steht bereits ein Valin. Die beiden Valine an den Positionen 1 und 6 assoziieren und führen vermutlich zu einer sichelförmigen Konformation des Erythrozyten (Abb. 15.21).

Dass Hämoglobin S aus einer Mutation im Gen resultiert, kann an der Vererbung des Proteins beobachtet werden. Personen mit Sichelzellenanämie sind homozygot für das Gen, das Hämoglobin S kontrolliert. Wenn eine solche Person eine normale Person heiratet, sind alle ihre Kinder heterozygot, da sie ein Gen für Hämoglobin S und ein Gen für normales Hämoglobin A tragen.

Die roten Blutkörperchen heterozygoter Personen enthalten ungefähr die Hälfte normales Hämoglobin und die Hälfte Sichelzellenhämoglobin. Solche Personen gelten als Träger des Sichelzellenmerkmals und führen ein fast normales Leben. Die meisten Homozygoten sterben vor ihrem 30. Lebensjahr an Sichelzellenanämie. Bei Sauerstoffmangel neigen Sichelzellen dazu, sich zu verklumpen. Die Klumpen verstopfen die Kapillaren, so dass die Blutversorgung einiger Regionen beeinträchtigt ist.

Viele andere Arten von mutierten Hämoglobinen mit einer abnormalen Aminosäure in der β-Kette, einige in der α-Kette, wurden untersucht. Die Substitution der Aminosäure wird damit erklärt, dass nur ein einziges Nukleotid im kodierenden Triplett verändert ist. Das veränderte Triplett wird zu einem Codon für eine andere Aminosäure.

Einzelne Punktmutationen wurden auf ihre Wirkung auf die Sequenz viraler Hüllproteine ​​untersucht. Das Tabakmosaikvirus besteht nur aus RNA und Protein Mutationen wurden in viraler RNA durch Behandlung mit salpetriger Säure vor der Infektion von Tabakblättern induziert.

Die von mutierten Virusstämmen erzeugten Läsionen unterscheiden sich von denen des normalen Virus. Die Proteine ​​der Mutantenstämme wurden von Wittmann isoliert. Er konnte 29 verschiedene Aminosäuresubstitutionen in den aus 157 Aminosäuren bestehenden Polypeptidketten analysieren.

Der genetische Code wurde auch durch die Untersuchung von Frameshift-Mutationen bestätigt, die so genannt werden, weil der normale Leseraster von Nukleotidtripletts aufgrund der Addition oder Deletion einer einzelnen Base verändert wird. Frameshift-Mutationen produzieren defekte Proteine ​​mit veränderter Aminosäuresequenz an entsprechenden Positionen und verifizieren so den genetischen Code.

Crick, Brenner und ihre Kollegen führten 1961 genetische Experimente mit solchen Mutationen durch und stellten Folgendes fest:

(a) Tripletts von Basen kodieren für jede Aminosäure

(b) Der Code ist nicht überlappend

(c) Die Basensequenz wird von einem festen Startpunkt abgelesen, das erste Nukleotid der Sequenz, wenn der Startpunkt um eine Base verschoben wird, wird das Ablesen der nachfolgenden Tripletts falsch

Crick und seine Kollegen experimentierten mit Proflavin-induzierten Mutationen in rII-Mutanten des Bakteriophagen T4. Proflavin ist ein ätzendes Mutagen, das entweder eine oder mehrere Basen in der DNA hinzufügt oder löscht. Der Wildtyp-TA wächst sowohl auf E. coli-Stamm B als auch auf E. coli K12 (λ). Die rII-Mutanten von T4 wachsen nicht auf Stamm K und produzieren Plaques vom r-Typ auf E. coli. B. Crick et al. (1961) arbeiteten mit einer mutierten P13, die in FCO umbenannt wurde, im B-Cistron der rII-Region.

Crick argumentierte, dass, wenn eine Mutation auf die Zugabe einer Base zurückzuführen ist, die Deletion einer Base die Mutante in den Wildtyp zurückführen könnte. Sie fanden heraus, dass die Reversion tatsächlich auf eine zweite Mutation zurückzuführen war, bei der ein Suppressor im selben Gen beteiligt war. Der so hergestellte Wildtyp war eine Doppelmutante. Sie konnten 18 Suppressoren in der B-Region von mutiertem FCO kartieren.

Die Suppressoren erzeugen eine r-Mutation, die Phagen wachsen nicht auf E. coli K und produzieren r-Plaques auf dem B-Stamm. Zu beachten war, dass, obwohl die rII-Mutanten ähnlich aussahen, jede einen Strukturdefekt in einer anderen Region des B-Cistrons aufwies.

Die Experimente von Brenner hatten bereits gezeigt, dass durch Doppelinfektion von E. coli die Defekte in den Genen zweier Viren rekombiniert werden können, um Nachkommen mit beiden Defekten in einem Gen zu erhalten. Die Schlussfolgerung, dass ein Nukleotid in einer Mutante hinzugefügt oder deletiert wurde, wurde auf folgende Weise erreicht.

Die Viren wurden in zwei Gruppen eingeteilt. Wenn die Defekte in zwei beliebigen Viren derselben Gruppe rekombiniert würden, würden die resultierenden rII-Mutanten nicht auf E. coli K wachsen. Wenn jedoch Defekte in Viren der beiden Gruppen kombiniert würden, würden die resultierenden Nachkommenviren auf Stamm K und . wachsen produzierten Wildtyp-Plaques auf E. coli B.

Crick und seine Kollegen nahmen an und bewiesen später durch weitere Experimente, dass die 3 Nukleotide eines einzelnen Tripletts oder Codons allein durch ihre Position relativ zum ersten Nukleotid des Gens bestimmt werden.

Nehmen wir der Einfachheit halber an, dass die rII-Mutanten aufgrund einer wie folgt wiederholten Abfolge von Tripletts r-Plaques bilden:

Angenommen, eine rll-Mutante hätte eine Deletion der vierten Base in der Sequenz und eine andere Mutante erhielt eine zusätzliche Base G, die zwischen der 6. und 7.

Diese Tripletts kodieren für verschiedene Aminosäuren und das resultierende Protein produziert Plaques vom r-Typ. Wenn durch Doppelinfektion die Basen 1 bis 5 des ersten mutierten Virus mit den Basen 6 ab dem zweiten kombiniert würden, hätte das resultierende Virus DNA von ursprünglicher Länge und Sequenz

C A T A T G C A T C A T C A T C A T ….

Somit werden nach dem zweiten Wechsel die Triolen C A T wiederhergestellt. Eine solche Sequenz könnte ein Protein mit einer falschen Aminosäure (kodiert durch ATG) produzieren. Es kann angenommen werden, dass, wenn Deletion und Insertion nicht zu weit auseinander liegen, sie ein Protein produzieren könnten, das normal genug ist, um das Wachstum des Virus auf E. coli K zu ermöglichen. In der Tat durch Anwendung der Kartierungstechnik von Benzer und Vergrößerung des Abstands zwischen der Löschung und der Einfügung wurde diese Annahme als wahr befunden.

Nicht kodierte Aminosäuren in Proteinen:

Einige Proteine ​​enthalten Aminosäuren, die nicht von einem Nukleotidtriplett kodiert werden. Zum Beispiel Hydroxyprolin und Hydroxylysin in Kollagen, Desmosin in Elastin, N-Methyl-Lysin in einigen Muskelproteinen und einige andere. Solche Aminosäuren entstehen aufgrund der posttranslationalen Modifikation von Aminosäuren, die nach Anweisungen von ihren spezifischen Tripletts in das Polypeptid eingefügt wurden.


Übersetzung des Lebenskodex und des Nobelpreises, 1962-1968

Trotz ihres anfänglichen Erfolgs hatte Nirenbergs und Matthaeis neu entdeckte Berühmtheit einige unbeabsichtigte Folgen. Während das Poly-U-Experiment der Beweis dafür war, dass sie den genetischen Code tatsächlich "geknackt" hatten, waren viele Wissenschaftler - insbesondere der Nobelpreisträger von 1959 Severo Ochoa - bestrebt, ihn auf die nächste Stufe zu heben. Nachdem verstanden wurde, dass UUU das RNA-"Codewort" für Phenylalanin ist, machten sich die Wissenschaftler daran, die einzigartigen Codewörter für die zwanzig wichtigsten Aminosäuren zu entdecken. Mit diesem Wissen, so die Theorie der Wissenschaftler, wüsste man nicht nur, wie RNA Botschaften von der DNA in Proteine ​​übersetzt, sondern wäre auch in der Lage, den gesamten genetischen Code lebender Organismen zu lesen. Wie Jerard Hurwitz und J. J. Furth in Wissenschaftlicher Amerikaner 1962 würde das Verständnis des genetischen Codes erklären, wie "der Traum vom Gen [wird] zur Realität des Proteins". New York Times schlug 1961 vor, dass "der chemische Vererbungscode, der die Form und Funktion jedes Lebewesens bestimmt und damit die Grundlage für die Genetik bildet, noch vor Jahresende geknackt wird."

Plötzlich befanden sich die jungen NIH-Wissenschaftler in einem Forschungswettlauf mit einigen der berühmtesten (und finanzkräftigsten) Molekulargenetiker und Biochemiker der Welt, insbesondere Ochoa von der New York University School of Medicine. Im Laufe der nächsten fünf Jahre arbeitete Nirenberg kontinuierlich mit einem Team von etwa zwanzig Postdoktoranden und Technikern (einige von anderen NIH-Labors). erweiterte seine Experimente mit synthetischer RNA noch weiter und fand heraus, dass Poly-C (drei Cytosine) die Produktion von Prolin stimuliert. Sie konnten jedoch Poly-G (drei Guanine) oder Poly-A (drei Adenine) nicht dazu bringen, Aminosäuren zu produzieren. Sie entdeckten, dass sie durch den Austausch von ein oder zwei Einheiten eines Tripletts durch andere Nukleotide die Produktion anderer Aminosäuren steuern könnten. Sie fanden zum Beispiel heraus, dass eine synthetische RNA, die aus einer Einheit Guanin (G) und zwei Einheiten Uracil (UU) besteht, die Anlagerung von Valin an eine sich entwickelnde Aminosäurekette anordnete. In der Kurzschriftmethode von Nirenberg war das Codewort für Valin GUU. Gleichzeitig entdeckte die Gruppe von Ochoa (einschließlich Robert S. Gardner, Albert J. Wahba, Carlos Basilio, Robert S. Miller, Joseph F. Speyer und Peter Lengyel), dass poly-A für eine Aminosäure (Lysin) kodiert, wenn a Es wurde eine andere Methode verwendet und viele synthetische RNA-Nukleotidkombinationen gefunden, die für andere Aminosäuren kodierten.

In den späten 1950er Jahren prägte der Biochemiker Sydney Brenner den Begriff "Codon", um die grundlegenden Einheiten der Proteinsynthese zu beschreiben, obwohl die Einheiten noch nicht vollständig bestimmt waren. Francis Crick machte den Begriff 1959 populär. Nach 1962 begann Nirenberg, "Codon" zu verwenden, um die aus drei Buchstaben bestehenden RNA-Codewörter zu charakterisieren. Da eines der vier Nukleotide einen Platz in einer Drei-Buchstaben-Codon-Anordnung einnimmt, schloss Nirenberg schnell, dass es 64 mögliche Kombinationen (4 x 4 x 4) von Drei-Buchstaben-Codons gab. Die Zuschauer können einige von Nirenbergs Originaldiagrammen sehen, die den Prozess zeigen, mit dem er die verschiedenen Kombinationen von Nukleotiden in den RNA-Codons im Abschnitt Dokumente verfolgt hat. 1964 und 1965 entwickelte Nirenbergs Postdoktorand Philip Leder eine ausgeklügelte Filtermaschine, die dem Team half, die Reihenfolge der Nukleotide in den Codons zu bestimmen. Diese Entwicklung beschleunigte die Zuordnung von Codewörtern zu Aminosäuren. 1966 gab Nirenberg bekannt, dass er die vierundsechzig RNA-Codons für alle zwanzig Aminosäuren entschlüsselt hatte. Diese bemerkenswerte persönliche und wissenschaftliche Leistung war nicht nur für Nirenberg, sondern auch für die Geschichte der modernen Wissenschaft von großer Bedeutung. Auf einer Konferenz 1966 bemerkte Geoffrey Zubay, Professor für Biologie an der Columbia University, dass "Francis [Crick] . vorhergesagt, dass der gesamte Code in [1961] gelöst werden würde – und es hat ein paar Jahre länger gedauert und das Tempo war trotz [Cricks] Vorhersagen wundersam schnell. Ich denke, es ist fair zu sagen, dass Marshall Nirenberg den Ball den ganzen Weg getragen hat."

In einem Vortrag von 1967 charakterisierte Nirenberg die Boten-RNA als einen "Roboter", dessen Zweck es war, den Befehlen der DNA zu gehorchen und lebenswichtige genetische Anweisungen auszuführen. „Der Mensch“, bemerkte Nirenberg, „versteht jetzt die Sprache der Zivilisation, hat ganz elementare Botschaften in der Form geschrieben, die Roboter verstehen, und hat über solche Texte direkt mit dem Roboter kommuniziert. Die Roboter lesen die Anweisungen und führen sie getreu aus.“ Für andere hingegen hing die Idee eines Codes, der unsere genetische Ausstattung kontrolliert, von weniger futuristischen Metaphern ab. Wie der Nobelpreisträger George Beadle von 1958 und seine Frau Muriel Beadle 1966 schrieben, "hat die Entschlüsselung des DNA-Codes gezeigt, dass wir eine Sprache besitzen, die viel älter ist als die Hieroglyphen, eine Sprache, die so alt ist wie das Leben selbst, eine Sprache, die die lebendigste Sprache der Welt ist". alles – auch wenn seine Buchstaben unsichtbar sind und seine Worte tief in den Zellen unseres Körpers vergraben sind."

Im Oktober 1968 erhielt Nirenberg die Nachricht, dass er den Nobelpreis für Medizin oder Physiologie gewonnen hatte, eine Ehre, die er mit Robert W. Holley und Har Gobind Khorana für ihre gemeinsamen Bemühungen bei der Entschlüsselung verschiedener Aspekte des genetischen Codes teilte. Die Zuschauer können ein Foto von Nirenberg sehen, der im Labor feiert. Für Wissenschaftler und Nicht-Wissenschaftler erfüllte dieser Erfolg die Vorhersagen, die nur sieben Jahre zuvor gemacht wurden, als zwei unbekannte NIH-Wissenschaftler zum ersten Mal das Poly-U-Experiment ankündigten.


Dieses Experiment hat zuerst den genetischen Code geknackt – aber die meisten Menschen haben noch nie davon gehört

Eines der wichtigsten Experimente der Welt schafft es, unter dem Radar der meisten Menschen zu fliegen. Nach jahrelanger experimenteller Arbeit mit Patienten gelang es zwei Wissenschaftlern herauszufinden, wie ein Code in der DNA in ein tatsächliches, physikalisches Protein übersetzt wurde.

Die Nukleobasen und RNA

Wenn Sie in der High School Biologie studiert haben, wissen Sie, dass die Buchstaben G, C, A und T eine besondere Bedeutung haben. Diese vier Buchstaben stehen für Guanin, Cytosin, Adenin und Thymin. Diese stickstoffreichen basischen Verbindungen reihen sich auf einem DNA-Strang aneinander. Füge drei zusammen und sie kodieren für eine Aminosäure. Füge Aminosäuren zusammen und sie bilden Proteine. Füge Proteine ​​genau in der richtigen Reihenfolge und zur richtigen Zeit zusammen, und sie machen einen Menschen – oder eine Fruchtfliege oder einen Hund oder irgendetwas anderes. Der genetische Code kann, richtig sequenziert, viele beliebige Kreaturen enthalten.

Sie haben vielleicht noch nichts von U oder Uracil gehört. Uracil ist nicht in der DNA, sondern in der RNA. Insbesondere ist es in Messenger-RNA enthalten, die kein Thymin verwendet. Messenger-RNA oder mRNA überträgt die Informationen über die DNA von der DNA selbst an das Ribosom – den Teil der Zelle, der das Protein aufbaut. DNA spult sich im Kern ein Stück weit ab. Die RNA kopiert die Sequenz, verlässt den Zellkern, wandert in das Zytoplasma und zum Ribosom, und die Arbeit beginnt. Es passiert jeden Moment eines jeden Tages in jeder Zelle.

Das Poly-U-Experiment

Dies auf kontrollierte Weise außerhalb einer Zellwand zu erreichen, ist ein viel selteneres Ereignis. Marshall Nirenberg und Heinrich Matthaei brauchten viel Arbeit, um eine winzige Aminosäure zu synthetisieren. Die Tatsache, dass sie Anfang 1961 arbeiteten, als die Wissenschaft der Genetik noch in den Kinderschuhen steckte, half nicht.

Es ist erstaunlich, dass Marshall, der das Experiment initiiert hat, nicht früh in die Irre geführt wurde. Die beiden suchten nach einer Möglichkeit, den genetischen Code zu knacken, bevor die Menschen überhaupt wussten, dass drei Nukleobasen für eine Aminosäure kodierten. Sie betrachteten eine Zeit, in der der Prozess von DNA zu RNA zu Protein nicht vollständig verstanden wurde und Materialien oft unrein waren. An einem Punkt, als er das Experiment verfeinerte, verwendete Marshall DNase, ein Enzym, das die DNA aufspaltete, um sicherzustellen, dass keine überschüssige DNA sein Experiment verunreinigte. Es dauerte einige Zeit, bis ihm klar wurde, dass er seltsame Ergebnisse erzielte, weil die DNase, die er von bestimmten Lieferanten bekam, nicht ganz funktionierte.

Durch wiederholtes Ausprobieren und Analysieren kamen sie zu einem eleganten Experiment. Zuerst zerstampften sie Zellen zu Gelee, damit sie ein Reagenzglas voller Zytoplasma erhielten. Es ist nicht mehr erforderlich, die Kopie der DNA aus dem Kern zu holen. Dann fügten sie diesem Reagenzglas DNase hinzu, die jede lose herumschwimmende DNA zerkauen würde. Kein komplexer Informationscode mehr. Als sie sich sicher waren, dass DNA nicht im Bilde war, bekamen sie etwas mRNA. Konkret fügten sie eine Sequenz von mRNA hinzu, die sie selbst hergestellt hatten, und das war unglaublich einfach. Es wäre alles Adenin, alles Cytosin, alles Guanin oder alles Uracil. Schließlich fügten sie dem Röhrchen eine Mischung von Aminosäuren hinzu und markierten eine Aminosäure – nur eine – mit einem radioaktiven Marker.

Am 27. Mai 1961 führten sie das Experiment mit einem synthetischen mRNA-Strang durch, der nichts anderes als Uracil war, ein Poly-U-Strang der mRNA. Aus der Mischung der Aminosäuren wurde nur Phenylalanin aufgenommen und zu einem seltsamen, ausschließlich aus Phenylalin bestehenden Protein aufgebaut. Die Ergebnisse waren eindeutig. Eine Kette von Uracil, und nur Uracil, kodiert für Phenylalin. Es war nur eine Aminosäure, aber jemand hatte den genetischen Code in Protein übersetzt.

Die Folgen

Das Experiment machte einen überraschend kleinen Spritzer. Marshall und Matthaei wiederholten ihren Erfolg mit anderen Sequenzen. Poly-A machte Lysin und Poly-C machte Prolin. Trotzdem war die Reaktion gedämpft. Es war sogar gedämpft, als Marshall seine Ergebnisse auf einer Wissenschaftlerkonferenz in Moskau vorstellte. Die Konferenz war voll von angesehenen Wissenschaftlern, aber Marshall war unbekannt und sein Vortrag über seine Ergebnisse hatte keine große Teilnehmerzahl. Es hatte einen wichtigen Teilnehmer. Matthew Meselson, ein Harvard-Professor, der später entdeckte, wie sich DNA in Zellen repliziert, erkannte die Bedeutung von Marshalls Arbeit. Er ging zu Francis Crick, dem berühmten Watson and Crick, und erzählte ihm von dem Vortrag.

Crick erkannte den Durchbruch. Er hatte die Macht, Marshall einen weiteren Vortrag zu verschaffen, und den Ruhm, andere Wissenschaftler zur Teilnahme zu bewegen. Marshalls zweiter Vortrag zog eine Menge an und brachte viele Leute in dieser Menge zum Reden, Anrufen und Telegrafieren in ihre eigenen Labors. Die Nachricht vom Poly-U-Experiment verbreitete sich schnell. 1968 bekam Marshall, wenn auch umstritten nicht Matthaei, einen Nobelpreis. Dennoch ist das Poly-U-Experiment bis heute relativ unbekannt. Der erste Bruch im berühmtesten Code der Welt bleibt ziemlich still.


Siehe auch

Francis Harry Compton Crick war ein britischer Molekularbiologe, Biophysiker und Neurowissenschaftler. Er, James Watson und Rosalind Franklin spielten eine entscheidende Rolle bei der Entschlüsselung der helikalen Struktur des DNA-Moleküls. Crick und Watsons Papier in Natur 1953 legte er den Grundstein für das Verständnis der DNA-Struktur und -Funktionen. Gemeinsam mit Maurice Wilkins erhielten sie 1962 gemeinsam den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin „für ihre Entdeckungen über die molekulare Struktur von Nukleinsäuren und ihre Bedeutung für die Informationsübertragung in lebendem Material“.

Die genetischer Code ist das Regelwerk, das von lebenden Zellen verwendet wird, um im genetischen Material kodierte Informationen in Proteine ​​zu übersetzen. Die Translation wird durch das Ribosom bewerkstelligt, das proteinogene Aminosäuren in einer von der Messenger-RNA (mRNA) festgelegten Reihenfolge verknüpft, wobei Transfer-RNA-(tRNA-)Moleküle verwendet werden, um Aminosäuren zu tragen und die mRNA drei Nukleotide gleichzeitig zu lesen. Der genetische Code ist bei allen Organismen sehr ähnlich und kann in einer einfachen Tabelle mit 64 Einträgen ausgedrückt werden.

Die Hershey–Chase-Experimente waren eine Reihe von Experimenten, die 1952 von Alfred Hershey und Martha Chase durchgeführt wurden, um zu bestätigen, dass es sich bei der DNA um genetisches Material handelt. Während die DNA den Biologen seit 1869 bekannt war, gingen viele Wissenschaftler damals noch davon aus, dass Proteine ​​die Informationen für die Vererbung trugen, da die DNA ein inertes Molekül zu sein schien, und da sie sich im Zellkern befindet, wurde ihre Rolle als Phosphor angesehen Lagerung. In ihren Experimenten zeigten Hershey und Chase, dass, wenn Bakteriophagen, die aus DNA und Proteinen bestehen, Bakterien infizieren, deren DNA in die Wirtsbakterienzelle eindringt, der größte Teil ihres Proteins jedoch nicht. Hershey und Chase und spätere Entdeckungen dienten alle dazu, zu beweisen, dass DNA das Erbmaterial ist.

Proteinbiosynthese ist ein zentraler biologischer Prozess, der innerhalb von Zellen abläuft und den Verlust von zellulären Proteinen durch die Produktion neuer Proteine ​​ausgleicht. Proteine ​​erfüllen als Enzyme, Strukturproteine ​​oder Hormone eine Reihe wichtiger Funktionen. Die Proteinsynthese ist sowohl für Prokaryoten als auch für Eukaryoten ein sehr ähnlicher Prozess, aber es gibt einige deutliche Unterschiede.

NC_012920-ATP8%2BATP6_Overlap.svg.png" />

In molecular biology, a Codon stoppen is a codon that signals the termination of the translation process of the current protein. Most codons in messenger RNA correspond to the addition of an amino acid to a growing polypeptide chain, which may ultimately become a protein stop codons signal the termination of this process by binding release factors, which cause the ribosomal subunits to disassociate, releasing the amino acid chain.

Die zentrales Dogma der Molekularbiologie ist eine Erklärung des Flusses genetischer Information innerhalb eines biologischen Systems. It is often stated as "DNA makes RNA, and RNA makes protein", although this is not its original meaning. It was first stated by Francis Crick in 1957, then published in 1958:

The Central Dogma. Dies besagt, dass "Informationen", die einmal in das Protein gelangt sind, nicht wieder herauskommen können. In more detail, the transfer of information from nucleic acid to nucleic acid, or from nucleic acid to protein may be possible, but transfer from protein to protein, or from protein to nucleic acid is impossible. Information means here the precise determination of sequence, either of bases in the nucleic acid or of amino acid residues in the protein.

In molecular biology and genetics, Übersetzung is the process in which ribosomes in the cytoplasm or endoplasmic reticulum synthesize proteins after the process of transcription of DNA to RNA in the cell's nucleus. The entire process is called gene expression.

Die Crick, Brenner et al. Experiment (1961) was a scientific experiment performed by Francis Crick, Sydney Brenner, Leslie Barnett and R.J. Watts-Tobin. It was a key experiment in the development of what is now known as molecular biology and led to a publication entitled "The General Nature of the Genetic Code for Proteins" and according to the historian of Science Horace Judson is "regarded. as a classic of intellectual clarity, precision and rigour". This study demonstrated that the genetic code is made up of a series of three base pair codons which code for individual amino acids. The experiment also elucidated the nature of gene expression and frame-shift mutations.

Die Nirenberg and Leder experiment was a scientific experiment performed in 1964 by Marshall W. Nirenberg and Philip Leder. The experiment elucidated the triplet nature of the genetic code and allowed the remaining ambiguous codons in the genetic code to be deciphered.

Marshall Warren Nirenberg was an American biochemist and geneticist. He shared a Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1968 with Har Gobind Khorana and Robert W. Holley for "breaking the genetic code" and describing how it operates in protein synthesis. In the same year, together with Har Gobind Khorana, he was awarded the Louisa Gross Horwitz Prize from Columbia University.

Xenobiology (XB) is a subfield of synthetic biology, the study of synthesizing and manipulating biological devices and systems. The name "xenobiology" derives from the Greek word xenos , which means "stranger, alien". Xenobiology is a form of biology that is not (yet) familiar to science and is not found in nature. In practice, it describes novel biological systems and biochemistries that differ from the canonical DNA–RNA-20 amino acid system. For example, instead of DNA or RNA, XB explores nucleic acid analogues, termed xeno nucleic acid (XNA) as information carriers. Es konzentriert sich auch auf einen erweiterten genetischen Code und den Einbau nicht-proteinogener Aminosäuren in Proteine.

J. Heinrich Matthaei is a German biochemist. He is best known for his unique contribution to solving the genetic code on 15 May 1961. Whilst a post-doctoral visitor in the laboratory of Marshall Warren Nirenberg at the NIH in Bethesda, Maryland, he discovered that a synthetic RNA polynucleotide, composed of a repeating uridylic acid residue, coded for a polypeptide chain encoding just one kind of amino acid, phenylalanine. In scientific terms, he discovered that polyU codes for polyphenylalanine and hence the coding unit for this amino acid is composed of a series of Us or, as we now know the genetic code is read in triplets, the codon for phenylalanine is UUU. This single experiment opened the way to the solution of the genetic code. It was for this and later work on the genetic code for which Nirenberg shared the Nobel Prize for Medicine and Physiology. In addition, Matthaei and his co-workers in the following years published a multitude of results concerning the early understanding of the form and function of the genetic code.

Steven Albert Benner has been a professor at Harvard University, ETH Zurich, and the University of Florida where he was the V.T. & Louise Jackson Distinguished Professor of Chemistry. In 2005, he founded The Westheimer Institute of Science and Technology (TWIST) and the Foundation For Applied Molecular Evolution. Benner has also founded the companies EraGen Biosciences and Firebird BioMolecular Sciences LLC.

In molecular biology and genetics, the sense of a nucleic acid molecule, particularly of a strand of DNA or RNA, refers to the nature of the roles of the strand and its complement in specifying a sequence of amino acids. Depending on the context, sense may have slightly different meanings. For example, DNA is positive-sense if an RNA version of the same sequence is translated or translatable into protein, negative-sense if not.

Ein expanded genetic code is an artificially modified genetic code in which one or more specific codons have been re-allocated to encode an amino acid that is not among the 22 common naturally-encoded proteinogenic amino acids.

Cell-free protein synthesis, auch bekannt als in vitro Proteinsynthese oder CFPS, is the production of protein using biological machinery in a cell-free system, that is, without the use of living cells. Die in vitro protein synthesis environment is not constrained by a cell wall or homeostasis conditions necessary to maintain cell viability. Thus, CFPS enables direct access and control of the translation environment which is advantageous for a number of applications including co-translational solubilisation of membrane proteins, optimisation of protein production, incorporation of non-natural amino acids, selective and site-specific labelling. Due to the open nature of the system, different expression conditions such as pH, redox potentials, temperatures, and chaperones can be screened. Since there is no need to maintain cell viability, toxic proteins can be produced.

Maxine Frank Singer is an American molecular biologist and science administrator. She is known for her contributions to solving the genetic code, her role in the ethical and regulatory debates on recombinant DNA techniques, and her leadership of Carnegie Institution of Washington. In 2002, Entdecken magazine recognized her as one of the 50 most important women in science.

Die RNA Tie Club is a scientific "gentleman's club" of select individuals who contributed to the understanding of DNA and the manner in which it relates to proteins and/or the ability to "read" the "message" in DNA.

EIN codon table can be used to translate a genetic code into a sequence of amino acids. The standard genetic code is traditionally represented as an RNA codon table, because when proteins are made in a cell by ribosomes, it is messenger RNA that directs protein biosynthesis. The mRNA sequence is determined by the sequence of genomic DNA. In such context, the standard genetic code is referred to as translation table 1. It can also be represented in a DNA codon table. The DNA codons in such tables occur on the sense DNA strand and are arranged in a 5′-to-3′ direction. Different tables with alternate codons are used depending on the source of the genetic code, such as from a cell nucleus, mitochondrion, plastid, or hydrogenosome.

Alexander Latham Dounce was an American professor of biochemistry. Among his fields of study were the isolation and purification of cellular organelles, protein crystallization, enzymes, DNA binding proteins, and the chemical basis of protein synthesis. He also invented the Dounce homogenizer, which was named after him.


Poly(U) cracked the code: a Marshall Nirenberg memoir

T he recent death of Marshall Nirenberg reminds us of his remarkable contribution to molecular biology in 1961. Marshall's place in all the textbooks on biology, biochemistry, and microbiology is secure and deserved: he opened the door to elucidation of the genetic code in an elegant and straightforward way.

Marshall came to my attention with a note in a biochemistry journal that worried me a great deal. The note stated that first, E coli ribosomes, prepared very crudely, could incorporate radioactive amino acids into protein. Second, washing the ribosomes with salt reduced the level of incorporation. Third, adding back some RNA that had been removed by the salt wash restored the level of amino acid incorporation. Based on these results, Marshall concluded that the RNA washed off had something to do with programming protein synthesis on the ribosomes (1).

This note worried me because at exactly that time I was working with Jim Ofengand in Cambridge, furiously trying to show that E coli ribosomes we had programmed with RNA from a plant virus were actually synthesizing the plant virus coat protein (2). There was no question that we were making new protein, but the identity of the product was troubling its tryptic fingerprint did not match that of the coat protein. My experiments with Jim had been prompted by the results from Cal Tech in the summer of 1960, when Sydney Brenner, Francois Jacob, and Matt Meselson found that an unstable RNA carried the genetic information of phage T2 from the DNA to the ribosome in infected E. coli.

Many people knew that plant viruses were a good source of RNA having a specific nucleotide sequence, so we thought that it would be only a short time before Marshall did the same experiments we were doing. That happened. Marshall arranged to go to Berkeley to the laboratory of Heinz Fraenkel-Conrat, one of the world experts on tobacco mosaic virus (TMV). There, he repeated the experiment exactly as we had done it in Cambridge, with the same result— namely, that the added plant virus RNA stimulated the synthesis of new protein tremendously. At this point our results diverged. While we were never able to show what protein we were making, the group in California published a result that was interpreted to mean that they were making the virus coat protein. Later this result was shown to be wrong, but at the time it was quite exciting (although it was overshadowed by the control experiment that Marshall did back in Bethesda).

What sorts of controls might one do to show that the system was faithfully translating the nucleotide sequence of the RNA into the amino acid sequence of a protein? Suppose one had RNA with a nonsensical sequence and used that to attempt to program synthesis of a protein. It should not work. And so Marshall used a simple synthetic RNA containing a string of the nucleotide uridine (polyU for short). And indeed, when added to E coli ribosomes it did not stimulate the synthesis of a protein but instead directed the synthesis of a simple polypeptide, polyphenylalanine (3). At one stroke, he showed that the code could be broken—that by using synthetic RNAs of defined sequence it should be possible to determine all the elements of the genetic code. And this was done—by Marshall and Phil Leder at NIH and by Gobind Khorana at Wisconsin (4, 5).

Marshall Nirenberg: 1927–2010, Nobel Prize in Physiology or Medicine, 1968.


3 Kinds of Approaches by which the Genetic Code has been Cracked or Deciphered

The genetic code has been cracked or deciphered by the following kinds of approaches:

A. Theoretical Approach:

George Gamow proposed the diamond code (1954) and the triangle code (1955) and suggested the following properties of the genetic code:

(i) A triplet codon corresponding to one amino acid of the polypeptide chain.

(ii) Direct template translation by codon-amino acid pairing.

(iii) Translation of the code in an overlapping manner.

(iv) Degeneracy of the code, i.e., an amino acid being coded by more than one codon.

(v) Colinearity of nucleic acid and the primary protein synthesized.

(v) Universality of the code, i.e., the code being essentially the same for different organisms.

B. The in vitro codon Assignment:

1. Discovery and use of polynucleotide phosphorylase enzyme:

Manago and Ochoa isolated an enzyme from the bacteria (e. g., Azobacter vinelandii) that catalyzes the breakdown of RNA in bacterial cells. This enzyme is called polynucleotide phosphorylase. They found that outside of the cell (in vitro), with high concentrations of ribonucleotides, the reaction could be driven in reverse and an RNA molecule could be made.

Incorporation of bases into the molecule is random and does not require a DNA template. Thus, in 1955 Manago and Ochoa made possible the artificial synthesis of polynucleotides (=mRNA) containing only a single type of nucleotides (U, A, C, or G respectively) repeated many times.

Polynucleotide

Configuration

1. Polyuridylic acid or poly (U)

2. Polyadenylic acid or poly (A)

3. Polycytilic acid or poly (C)

4. Polyguanidylic acid or poly (G)

Thus, the action of polynucleotide phosphorylase can be represented in the following way:

(RNA)n + ribonucleoside diphosphate ß—-àpolynucleotide phosphorylase (RNA)n+1 + Pi

The polynucleotide phosphorylase enzyme differs from RNA polymerase used to transcribe mRNA from DNA polymerase used to transcribe mRNA from DNA in that: (i) it does not require a template or primer (ii) the activated substrates are ribonucleoside diphosphates (e. g., UDP, ADP, CDP and GDP) and not triphosphates and (iii) orthophosphate (Pi) is produced instead of pyrophosphates (PPi).

The deciphering of the genetic code was made possible by the use of synthetic (or artificial) polynucleotides and trinucleotides. The different types of techniques used include the use of polymers containing a single type of nucleotide (called homopolymers), the use of mixed polymers (copolymers) containing more than one type of nucleotides (heteropolymers) in random or defined sequences and the use trinucleotides (or “minimessengers”) in ribosome-binding or filter-binding.

2. Codon assignment with unknown sequence:

(i) Codon assignment by homopolymer:

The first clue to codon assignment was provided by Nirenberg and Matthaei (1961) when they used in vitro system for the synthesis of a polypeptide using an artificially synthesized mRNA molecule containing only one type of nucleotide (i.e., homopolymer). Prior to performing the actual experiments, they tested the ability of a cell-free protein synthesizing system to incorporate radioactive amino acids into newly synthesized proteins.

Their cell-free extracts of E. coli contained ribosomes, tRNAs, aminoacyl-tRNA synthetase enzymes, DNA and mRNA. The DNA of this extract was eradicated by the help of deoxyribonuclease enzyme, thus, the template which might synthesize new mRNA was destroyed.

When twenty amino acids were added to this mixture along with ATP, GTP, K + and MG 2+ , they were incorporated into proteins. This incorporation continued so long as mRNA was present in such a cell-free suspension. It also continued in the presence of synthetic polynucleotides (mRNAs) which could be made with the help of polynucleotide phosphorylase enzyme.

The first successful use of this technique was made by Nirenberg and Matthaei who synthesized a chain of uracil molecules (poly U) as their synthetic mRNA (homopolymer). Poly (U) seemed a good choice, because there could be no ambiguity in a message consisting of only one base. Poly (U) was good choice for other reasons: it binds well to ribosomes and, as it turned out, the product protein was insoluble and easy to isolate.

When poly (U) was presented as the message to the cell-free system containing all the amino acids, one amino acid was exclusively selected from the mixture for incorporation into the polypeptide, called polyphenylalanine. This amino acid was phenylalanine and it could be concluded that some sequence of UUU coded for phenylalanine. Other homogeneous chains of nucleotides (Poly A, Poly C and Poly G) were inactive for phenylalanine incorporation. The mRNA code word of phenylalanine was, therefore, shown to be UUU. The corresponding DNA code word for phenylalanine can be deduced to be AAA. Thus, the first code word to be deciphered was UUU.

This discovery was extended in the laboratories of Nirenberg and Ochoa. The experiment was repeated using synthetic poly (A) and poly (C) chains, which gave polylysine and polyproline respectively. Thus, AAA was identified as the code for lysine and CCC as code of proline. A poly (G) message was found non-functional in vitro, since it attains secondary structure and, thus, could not attach to the ribosomes. In this way three of 64 codons were easily accounted for.

(ii) Codon assignment by heteropolymers (Copolymers with random sequences):

Further exposition of the genetic code took place by using synthetic messenger RNAs containing two kinds of bases. This technique was used in the laboratories of Ochoa and Nirenberg and led the deduction of the composition of codons for the 20 amino acids. The synthetic messengers contained the bases at random (called random copolymers). For example, in a random copolymer using U and A nucleotides eight triplets are possible, such as UUU, UUA, UAA, UAU, AAA, AAU, AUU and AUA.

Theoretically, eight amino acids could be coded by these eight codons. Actual experiments, however, yielded only six phenylalanine, leucine, tryosine, lysine asparagine and isoleucine. By varying the relative compositions of U and A in the random copolymer and determining the percentage of the different amino acids in the proteins formed, it was possible to deduce the composition of the code for different amino acids.

3. Assignment of codons with known sequences, (i) Use of trinucleotides or minimessengers in filter binding (Ribosome-binding technique):

Ribosome binding technique of Nirenberg and Leder (1964) made use of the finding that aminoacyl-tRNA molecules specifically bind to ribosome-mRNA complex. This binding does not require the presence of a long mRNA molecule in fact, the association of a trinucleotide or minimessenger with the ribosome is sufficient to cause aminoacyl-tRNA binding.

When a mixture of such small mRNA molecules- ribosomes and amino acid-tRNA complexes are incubated for a short time and then filtered through a nitrocellulose membrane, then the mRNA-ribosome-tRNA-amino acid complex is retained back and rest of the mixture passes through the filter.

By using a series of 20 different amino acid mixtures, each containing one radioactive amino acid at a time, it is possible to find out the amino acid corresponding to each triplet by analysing the radioactivity absorbed by the membrane, e.g., the triplet GCC and GUU retain only alanyl-tRNA and valyl-tRNA respectively. All 64 possible triplets have been synthesized and tested in this way. Forty five of them have given clear-cut results. Later on, with the help of longer synthetic messages it has been possible to decipher 61 out of the possible 64 codons.

C. The in vivo Codon Assignment:

The cell free protein synthetic systems, though have proved of great significance in decipherment of the genetic code, but they could not tell us whether the genetic code so deciphered is used in the living systems of all organisms also. Three kinds of techniques are used by different molecular biologists to determine whether the same code is also used in vivo (a) amino acid replacement studies (e.g., tryptophan synthetase synthesis in E. coli (Yanofsky et al. 1963) and haemoglobin synthesis in man), (b) fraftieshift mutations (e.g., investigations of Terzaghi et. al. 1966, on lysozyme enzyme of T4 bacteriophages, and (c) comparison of a DNA or mRNA polynucleotide cryptogram with its corresponding polypeptide clear text (e.g., comparison of amino acid sequence of the R17 bacteriophage coat protein with the nucleotide sequence of the R17 mRNA in the region of the molecule that dictates coat-protein synthesis by S. Cory et. al., 1970).

Thus, in vitro and in vivo studies, so far described, gave the way to formulate a code table for twenty amino acids.


Marshall Nirenberg (1927–2010)

A humble, gentle and visionary giant of molecular biology.

Marshall Warren Nirenberg was only 34 years old when, in August 1961, he reported his studies on the genetic code at the International Congress of Biochemistry in Moscow. For this and subsequent work he was awarded the 1968 Nobel Prize in Physiology or Medicine, together with Gobind Khorana and Robert Holley, “for their interpretation of the genetic code and its function in protein synthesis.” He was the National Institutes of Health's first Nobel laureate, and achieved these discoveries by a series of brilliant biochemical approaches — thereby disproving Ed Tatem's 1958 prediction that it would take a lifetime to break the code.

His fascination with biology began early in his life. Following a family move in his youth from New York City to a Florida dairy farm, he became an expert naturalist — studying birds, catching and releasing snakes, and collecting spiders. One previously unrecognized spider species from his collection was named “Marshall” by the American Museum of Natural History in New York City. His fascination with nature endured for a lifetime.

Nirenberg graduated in 1948 from the University of Florida in Gainesville, and obtained a PhD in carbohydrate biochemistry from the University of Michigan in Ann Arbor. He first came to the National Institutes of Health in 1957, joining the laboratory of Gordon Tomkins there three years later. Although Nirenberg's bold plan to decipher the genetic code was considered “suicidal” by one senior scientist, Tomkins was a supporter of the endeavour. On reflection, Nirenberg himself commented that the “goal was worth the risk”.

Indeed it was. His research answered the central question of how the hereditary information stored in DNA is translated into cellular proteins. He developed a succession of in vitro biochemical assays that led to the determination of the nucleic-acid content of the cell, the finding that trinucleotide sequences (codons) define a protein's amino-acid sequence, and the discovery of 'punctuation signals' — codons that mark the beginning and end of a peptide — and of the universality of the genetic code. Each approach was simple in execution but elegant in concept.

The first assay Nirenberg developed was a bacterium-based in vitro protein-synthesis method. Together with Heinrich Matthaei, he made the crucial discovery that RNA, rather than DNA, programmed the synthesis of proteins. This finding led to a bold shift to studying synthetic RNA polymers — composed of single, or random mixtures of, uracil, cytosine, adenine and guanine bases — as the 'messenger' RNA intermediate. And an outcome of this extraordinarily successful approach was the observation that polyuracil directed the synthesis of only polyphenylalanine.

On hearing of this breakthrough — DNA to mRNA to protein — described by Nirenberg in a small session of the 1961 Moscow congress, Francis Crick asked him to repeat his presentation to the entire congress in a special session. Nobel-prizewinning biologist Harold Varmus, at the time an aspiring student of English who was travelling in Moscow, remembers the presentation as being instrumental in changing the direction of his career from literature to science. At a more general level, the public announcement of this simple in vitro assay for protein synthesis triggered the race to match the base content of the genetic code to each of the 20 amino acids that constitute proteins.

Two technologies were, however, required to prove that the code was triplet and to determine the sequence order: an in vitro assay for molecules that interact with ribosomes (cellular factories for protein synthesis) and a method for generating synthetic codons to artificially recreate the process of translation. Nirenberg and Philip Leder developed a simple translation assay in which they used radioactively labelled aminoacyl transfer RNA, partially purified ribosomes and RNA codons to detect the stable translation complex. This elegant assay nonetheless required synthesis of all 64 possible codon triplets from the four bases to determine exactly which codons translate into each of the 20 amino acids. Nirenberg's laboratory synthesized the codons biochemically using an enzyme-based approach, and showed that an adenine triplet — but not a doublet — made only the tRNA for lysine and bound to the ribosome.

The translation assay was also a key analytical tool for subsequent achievements by other researchers in the field (including myself) these included the chemical, rather than enzyme-based, synthesis of codons by Gobind Khorana, which led to the rapid assignment of codons by both his and Nirenberg's laboratories, the finding that a single tRNA molecule could recognize more than one codon (the wobble concept), and the demonstration that the genetic code is universal across species — the topic of Nirenberg's address at a Vatican-sponsored meeting in 2008. Moreover, deciphering the genetic code made possible the spectacular era of DNA sequencing, recombinant DNA technology and genome projects that followed.

After his seminal work in molecular biology, Nirenberg redirected his research to neuroscience, investigating, among other questions, the cellular and biochemical basis of opiate addiction, and developing cellular models for the formation of the synaptic junctions between neurons. Throughout his career, Nirenberg put great emphasis on nurturing young scientists, and many of the researchers he trained are award-winning leaders in their own fields. One example is the American Chemical Society's recognition a few months back of his 'code team', nominated by Nirenberg himself.

Nirenberg's character created the environment I remember while working as a research associate in his lab. He combined an engaging, but retiring, personality with scientific focus. His laboratory, although small (112 square metres), fostered collaborative and successful ideas. His unusual circadian rhythm meant late-night planning of experiments, and excitement in the laboratory about implementing them the following afternoon. He strove to develop several approaches to a single question, while always seeking simplicity and accuracy. Our papers, for example, seldom had fewer than ten drafts in the pursuit of precision and clarity.

Nirenberg died from cancer on 15 January. For 41 years, Nirenberg's partner in life and science was, until her death, his first wife Perola Zaltzman. His second wife, Myrna Weissman, also shared his love of science, and her extensive family brought youth and excitement to Nirenberg's final years.


Experimental work

Nirenberg and Leder could not decode the remaining codons in the same manner as Nirenberg did with Mattaei. Because the mRNA bases were taken up at random by the ribosome, it is hard to determine which specific codon correlates with the amino acid. For example, to pick out the correct codon among non repeating codons (UCU, CUU, UUC) is difficult because they couldn't determine the specific sequence. [ 6 ] Instead, Leder and Nirenberg used very short artificial RNA sequences (three nucleotides) in the cell-free systems. These shorter length fragments were long enough to allow the ribosome to bind with the type of tRNA molecule that is complementary to the one codon and still be detectable. The key step of the experiment was that they labeled one type of amino acid at a time and then put the mixture through a Millipore filter. [ 6 ] This special filter allowed unbound tRNAs to pass through but did not allow the ribosomes with the bound triplet to pass through. [ 7 ] The sample was then tested for radioactivity. If there was radioactivity found in the sample that did not pass through the filter the corresponding Amino acid was added. [ 8 ]


Deciphering the Genetic Code: A 50 Year Anniversary

Marshall Nirenberg in the lab, ca. 1962
Profiles in Science

Fifty years ago, on January 18, 1965, Dr. Marshall W. Nirenberg (1927–2010) completed his first summary of the genetic code—one of the most significant documents in the history of twentieth-century science—a painstaking, handwritten chart of the discovery of how sequences of DNA, known as “triplets,” direct the assembly of amino acids into the structural and functional proteins essential to life. The chart is included in the Marshall W. Nirenberg Papers, held at the National Library of Medicine. Preserving this genetic code chart has been an important and exciting challenge for NLM conservators, as they study the best way to store this important document written on multiple sheets of paper in pencil, India ink, and multiple ball-point pen inks, and held together with adhesive tape.

The data provided in this summary was compiled beginning in 1961 after Dr. Nirenberg presented, in a now-famous speech about 30 scientists at the International Congress of Biochemistry in Moscow, the results of his “poly-U experiments” conducted with post-doctoral researcher J. Heinrich Matthaei. Francis Crick, who was in attendance at the Moscow meeting, had heard that Nirenberg and Matthaei had found a clue that might unravel one of the central mysteries of molecular genetics. Crick arranged to have the young scientist deliver his paper again, this time to the assembled body of about a thousand people. Many scientists–especially the 1959 Nobel Laureate Severo Ochoa–were eager to take it to the next level. Thus began a research race with some of the world’s most famous (and well-funded) molecular geneticists. Over the course of the next five years, Nirenberg worked steadily with a team of about twenty postdoctoral researchers and laboratory technicians, including Norma Heaton, who remained a member of Nirenberg’s team at the National Heart, Blood, and Lung Institute for forty years. Dr. DeWitt “Hans” Stetten, former director of the National Institute of General Medical Sciences, called this period of time “the finest hour of the NIH.”

In 2006, Dr. Nirenberg provided a description of this first summary chart:

“The DNA that we inherit from our parents contains the information that is needed to make the more than 100,000 kinds of proteins that are the molecular machinery of the body. DNA consists of four kinds of [nucleotides represented by the] letters, T, C, A and G, in long sequences. DNA is transcribed to RNA that also consists of long sequences of four letters, U, C, A, and G. The sequence of letters in RNA determines the sequence of amino acids in proteins. There are 64 kinds of 3 letter words or triplets in RNA. When we deciphered the genetic code, we determined the sequence of letters in each RNA triplet that corresponds to each kind of amino acid in protein. All forms of life on this planet use the same genetic code, although small differences in the code have been found in some organisms.

This is the first summary of the genetic code that I made on Jan. 18, 1965, when we had deciphered more than half of the code. The columns on the left and right of the chart are the 64 RNA triplets. The row across the top, ALA, ARG, ASP, etc., are the 20 amino acids. The numbers in the chart correspond to the amount of radioactive aminoacyl-tRNA that bound to a triplet on ribosomes. The second column on the right hand side contains the tentative amino acid-triplet assignments that we made at that time. Some of the tentative assignments were changed when we obtained more data, and all of the assignments that we published were correct.”

Throughout 1965, there would be several versions of the chart created to incorporate new findings from the many experiments conducted during this intense period of discovery. A second and last summary of the code was prepared at Dr. Nirenberg’s request by his technician, Norma Heaton, in late 1965 or early 1966, when almost all of the 64 codons had been deciphered. In an oral history interview from 2010 Norma Heaton remembers:

“I do not even know if the term spreadsheet had been invented then. It got to the point where we knew we needed to have some sort of means of seeing it all in one big picture. So I taped data paper together and drew the columns and rows with a pen and ruler…

One of my memories…is that I can remember being in the room, and Mert Bernfield and Edward M. Scolnick—Ed went on to be vice president of Merck.…They were both kind of, I don’t want to say loud, but they were not quiet, soft-spoken people. One of my memories is, they would hang over the [experiment], and they would have the tape and they would say, “Which one is this? Which one is this?” Then you would hear this shout, like, “Oh, we discovered a new one.””

Dr. Nirenberg would go on to win the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1968 for this work, sharing the award with Robert W. Holley of Cornell University and Har Gobind Khorana of the University of Wisconsin at Madison “for their interpretation of the genetic code and its function in protein synthesis.” He began donating his papers to NLM in 1999, and since then nearly 500 selections from the Marshall Nirenberg Papers have been digitized and made available on NLM’s Profiles in Science. Visitors can access archival materials related to the code, including pages from Dr. Nirenberg’s laboratory notebooks, photographs of Dr. Nirenberg in his laboratory, correspondence with other scientists working on the code, such as Francis Crick, and the full 2010 oral history interview with Norma Heaton, in which she recalls the technical challenges of the research, and more broadly, what it was like to work in Dr. Nirenberg’s laboratory during this time.

The staff of Nirenberg’s lab celebrating his Nobel Prize.
From left to right: Norma Zabriskie Heaton, Ed Scolnick, Mike Wilcox, Marshall Nirenberg, Theresa Caryk, Ty Jaouni (hidden), Wynn Russner (partially hidden), Darlene Levenson, Greg Milman, Frank Portugal.
Courtesy Marshall Nirenberg

On March 17, 2015 at 1:00, NLM will host a special two-hour program, “A Tribute to Marshall Nirenberg.” The program marks the 50th anniversary of Nirenberg’s Genetic Code Charts—groundbreaking scientific documents now held in NLM’s historical collections. Marshall Nirenberg’s Nobel Prize medal and certificate, newly given to NLM through the generous donation of his wife, Dr. Myrna Weissman, will be on display. Dr. Frank Portugal, author of The Least Likely Man: Marshall Nirenberg and the Discovery of the Genetic Code (MIT Press), and Dr. David Serlin, historian and curator of NLM’s Profiles in Science site on the Marshall Nirenberg Papers, will speak at the event. For more information and directions please visit our 2015 lectures page. Subsequent NIH events will be announced soon.

This article is part of a series that commemorates the 50th anniversary of the Genetic Code Charts. Stay tuned throughout the year to learn more about Marshall Nirenberg and these ground breaking documents.

Christie Moffatt is Manager of the Digital Manuscripts Program in the History of Medicine Division at the National Library of Medicine and Chair of the NLM Web Collecting and Archiving Working Group.


Schau das Video: Genetik 11 Nirenberg, Matthaei und der universelle Gen Code (August 2022).