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Was ist die höchstmögliche Kompetenz für E coli?

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Ich suche einen hochkompetenten E-coli-Stamm. Ich erstelle eine Bibliothek eines ~ 6,6 kb großen Plasmids und erreiche keine ausreichend hohe Effizienz. Hat jemand einen Vorschlag für einen Stamm/ein Protokoll mit ultrahoher Effizienz (>1010).


Dies ist eine großartige Frage, da ich gerade meine eigenen "homebrew" chemisch kompetenten Zellen hergestellt habe.

Es gibt eine Vielzahl von E coli Stämme, die üblicherweise zum Klonen verwendet werden. Sie können chemisch durch Hitzeschockverfahren oder elektrisch durch Elektroporation umgewandelt werden (eine kurze Zusammenfassung finden Sie hier). Diese können manuell im Labor hergestellt oder im Handel von seriösen Anbietern gekauft werden (ich empfehle Invitrogen/Life Tech, NEB, Promega).

Chemische Kompetenz wird unter Verwendung des Hanahan-Verfahrens oder einer Variation davon erreicht. Das Verfahren beinhaltet das Waschen der Bakterien in einer Reihe von Puffern, die verschiedene Chloridsalze mit zweiwertigen Kationen (CaCl2, RbCl2, etc). Im Handel erhältlich E coli werden als "regulär" und "ultra" kompetent verkauft, im Bereich von 106 bis 106 für normal, und der höchste, den ich gesehen habe, ist 1010 cfu/µg DNA. Für maximale Effizienz, zumal ein kleines Plasmid wie Ihres leicht zu transformieren ist, Elektroporation ist eine effizientere Technik, erfordert jedoch spezielle Ausrüstung. Elektroporation kann >10 . ergeben10 KBE/µg. Für Standardklonierungspraktiken sind reguläre oder hochwirksame chemisch kompetente E. coli vollkommen ausreichend. Da Sie erwähnt haben, dass Sie eine Bibliothek erstellen, möchten Sie sicherlich eine hocheffiziente chemische Transformation oder, wenn Sie über die erforderliche Ausrüstung verfügen, eine Elektroporation durchführen. Ich habe keine berichteten Elektroporationseffizienzen von > 5x10 . gesehen10.

Die Transformationseffizienzen werden standardisiert, indem eine Rate als die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (cfu) pro ug eines Kontrollplasmids, typischerweise pUC19, angegeben wird. Die Transformationseffizienz ist sehr empfindlich gegenüber vielen Faktoren, einschließlich Hitzeschockzeit, Kühlzeiten, Auftauzeit, Menge und Größe der Plasmid-DNA. Wenn alle Dinge gleich sind, sind die Größe und Menge der DNA für Ihre Zwecke wichtig. Die Transformationseffizienz steigt im Allgemeinen mit der DNA-Menge, aber es gibt einen Sättigungspunkt, und schließlich verringert ein Überschuss an DNA die Ausbeute. Außerdem nimmt die Effizienz linear mit der Plasmidgröße ab. pUC19, der Kontrollvektor, ist beispielsweise ~2,7 kbp und Ihr Bibliotheksplasmid ist ~6,6 kbp. Sie sollten also erwarten, dass Sie für die gleiche DNA-Masse aufgrund der Plasmidgröße 60 % Transformation verloren haben. Dieser Verlust ist darauf zurückzuführen, dass die physikalisch größere DNA schwieriger in die Bakterien gelangen kann.


Ich habe gehört, dass die elektrokompetenten Zellen Epi300 (1) von Epicenter sehr effizient sind: > 1 x 1010 cfu/ug pUC19. Dan Gibson verwendete sie in seiner Arbeit zur Synthese des mitochondrialen Genoms (2). Wir dachten auch darüber nach, sie für unsere Baugruppen zu verwenden, aber sie sind ziemlich teuer.

1. TransforMax™ EPI300™ Elektrokompetente E. coli

2. Chemische Synthese des mitochondrialen Genoms der Maus, Gibson et. al.


Schau das Video: How to Make Chemically Competent E. coli (Kann 2022).