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Eine Frage zu DNA-Triplex

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In verschiedenen Organismen wurden kurze DNA-Triplexstränge identifiziert. Aber würde die Injektion eines einzelnen DNA- oder RNA-Strangs (mit seinen Basen komplementär zu den DNA-Basen in der großen Furche eines bestimmten Gens) dazu führen, dass ein DNA-Triplex an diesem Gen gebildet wird?


Möglicherweise ja, aber es gibt Komplikationen.

Es gibt andere Bedingungen, die dazu beitragen, die energetisch günstigen Bedingungen für die Bindung von Basen unter Bildung eines Triplex zu schaffen, einschließlich Säure und Anwesenheit von Magnesiumionen.

Die DNA-Region, in der sich Ihr interessierendes Gen befindet (oder ihre regulatorischen Regionen, je nachdem, was Sie tun möchten) müsste ebenfalls entpackt werden. DNA wird normalerweise in Chromatin verpackt. Histonkomplexe, die die DNA umhüllen, bieten einen gewissen Schutz der großen Furche. Um einen Triplex herzustellen, benötigen Sie biochemische Bedingungen, die Histone abwickeln und die Triplexbildung im Allgemeinen unterstützen.

Insbesondere die Verwendung von RNA könnte kompliziert sein, wenn sie zu einem kurzen oder microRNA-Element verarbeitet wird oder verarbeitet werden könnte, das bei der Herunterregulierung der Population von mRNA-Molekülen (die wiederum letztendlich die Genexpression reguliert) verbraucht werden könnte. Es ist nicht hilfreich, wenn es aufgebraucht ist, bevor es sich an Ihr interessierendes Triplex bindet.

Es besteht ein gewisses pharmazeutisches Interesse an TFOs (Triplex-bildenden Oligonukleotiden) als Wirkstoffabgabemechanismus.

Wenn ein Gen gebrochen ist und beispielsweise an einer genetischen Krankheit beteiligt ist und seine DNA oder nahegelegene regulatorische Regionen zugänglich gemacht werden können, kann möglicherweise ein TFO verabreicht werden, das dazu beiträgt, die Expression des Proteinprodukts dieses Gens zu erhöhen oder zu verringern.

Papiere über TFOs könnten Sie wahrscheinlich auf andere technische Probleme hinweisen, auf die Forscher gestoßen sind und die gelöst werden müssen, um ein wirksames Medikament zu entwickeln.


DNA Triplex und Quadruplex assemblierte Nanosensoren zur Korrelation von K + und pH in Lysosomen

Es bleibt eine unbeantwortete Frage, ob der Fluss von K + und H + in Lysosomen aufgrund von Schwierigkeiten bei der gleichzeitigen Abbildung dieser beiden Ionen korreliert ist. Diese Frage ist von großem Wert für das Verständnis der lysosomalen Ansäuerung. Hier haben wir DNA-Quadruplex- und Triplex-basierte Lumineszenz-Nanosensoren entwickelt, die K + bzw. pH im lysosomalen Lumen überwachen können. Jeder Sensor enthielt einen Aufwärtskonversions-Nanopartikel-Luminophor und einen Gold-Nanopartikel-Quencher, die grüne bzw. blaue Lumineszenzsignale für K + bzw. H + erzeugten. Die Sensoren wurden in Puffern getestet, die dynamische Bereiche von 5 bis 200 mM K + und pH 5,0 bis 8,2 zeigten. Co-Imaging mit diesen beiden Sensoren in Zellen zeigte, dass der Einstrom von H + mit dem Ausstrom von K + einherging, wodurch diese seit langem bestehende Frage der lysosomalen Biochemie gelöst wurde.

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anie202013302-sup-0001-misc_information.pdf3.5 MB Ergänzend

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DNA Triplex und Quadruplex assemblierte Nanosensoren zur Korrelation von K + und pH in Lysosomen

DNA Quadruplex- und Triplex-Nanosensoren sind für die gleichzeitige Überwachung von K + und pH durch den Zusammenbau von Aufkonversions-Nanopartikel-Leuchtstoffen und Gold-Nanopartikel-Quenchern konzipiert. Die gleichzeitige Abgabe der beiden Sensoren mit ATP-Stimulation weist darauf hin, dass die lysosomale Ansäuerung mit dem Efflux von K + einhergeht.

Abstrakt

Es bleibt eine unbeantwortete Frage, ob der Fluss von K + und H + in Lysosomen aufgrund von Schwierigkeiten bei der gleichzeitigen Abbildung dieser beiden Ionen korreliert ist. Diese Frage ist von großem Wert für das Verständnis der lysosomalen Ansäuerung. Hier haben wir DNA-Quadruplex- und Triplex-basierte Lumineszenz-Nanosensoren entwickelt, die K + bzw. pH im lysosomalen Lumen überwachen können. Jeder Sensor enthielt einen Aufwärtskonversions-Nanopartikel-Leuchtstoff und einen Gold-Nanopartikel-Quencher, die grüne bzw. blaue Lumineszenzsignale für K + bzw. H + erzeugten. Die Sensoren wurden in Puffern getestet, die dynamische Bereiche von 5 bis 200 mM K + und pH 5,0 bis 8,2 zeigten. Co-Imaging unter Verwendung dieser beiden Sensoren in Zellen zeigte, dass der Einstrom von H + mit dem Ausstrom von K + einherging, wodurch diese seit langem bestehende Frage der lysosomalen Biochemie gelöst wurde.


Obwohl unsere DNA ähnlich ist, sehen die Menschen sehr unterschiedlich aus. Aber die Merkmale, die wir verwenden, um die Rasse einer Person zu erraten, funktionieren nicht immer gut. Denken Sie an die Hautfarbe. Es gibt nicht nur ein paar Farben: Es gibt mehr Schattierungen, als Sie jemals zählen können. Die von uns verwendeten Eigenschaften sind auch unabhängig voneinander. Wenn du zum Beispiel groß bist, heißt das nicht, dass du auch dunkle Haare hast. Egal welche Eigenschaften wir verwenden, es gibt keine gute Möglichkeit, Menschen anhand ihres Aussehens oder ihrer DNA zu gruppieren.

Stattdessen teilt jeder die Leute in Rassen ein, basierend auf den Eigenschaften, die sie für am wichtigsten halten. Auch die Art und Weise, wie wir Menschen in Rassen einteilen, ändert sich im Laufe der Zeit. Denken Sie an Leute, die Sie kennen, die Iren oder Italiener sind. Heute könnten wir sie wie viele Menschen aus Europa als weiß kategorisieren. Aber vor 100 Jahren galten sie nicht als die gleiche Rasse wie Amerikaner mit europäischen Wurzeln. Menschen lieben es, Dinge in Gruppen zu organisieren. Aber wenn es um Rassen geht, sagen uns diese Gruppen mehr über unsere Kultur als über unsere Biologie.


MATERIALEN UND METHODEN

Molekulardynamik (MD)-Simulationen

Ein 30-mer DNA-Duplex allein und im Komplex mit einem 10-mer dritten DNA-Strang wurde in wässriger Lösung mit und ohne Helix-Twist-Beschränkung simuliert. Um eine Helix-Twist-Beschränkung aufzuerlegen, wurde der DNA-Duplex als kontinuierliches Polymer behandelt. Dies bedeutet, dass die DNA-Helix von einem Ende des Simulationsvolumens zum gegenüberliegenden Ende verlängert wird, wo sie durch die normale Bindungskonnektivität fortgesetzt wird (25). Wir kennzeichnen das System mit der Helix-Twist-Einschränkung, kontinuierlich Helix und die ohne, isoliert Wendel.

Alle MD-Simulationen wurden mit der GROMACS-Programmsuite (Version 4.5) durchgeführt ( 26, 27). Das Kraftfeld CHARMM27 (28, 29) wurde verwendet, um die DNA-Strukturen und Natriumionen zu beschreiben. Die DNA-Systeme wurden in eine kubische Box von 12 nm eingebracht. Für die wurde eine rechteckige Box von 9 nm Höhe verwendet kontinuierlich DNA-Systeme. Anschließend wurden die Boxen mit TIP3P-Wassermolekülen gefüllt (30). Um das System zu neutralisieren, wurden Natriumionen zufällig in die Simulationsbox gegeben.

Zur Behandlung von Coulomb-Wechselwirkungen wurde die Partikelmesh-Ewald-Methode (31) mit einem Schaltabstand von 1,0 nm und einem Raster von 0,12 nm eingesetzt. Lennard-Jones-Wechselwirkungen wurden zwischen 1.0 und 1.2 nm ausgeschaltet. Konstanter Druck P und Temperatur T wurden durch schwache Kopplung des Systems an ein externes Bad bei 1 bar und 300 K unter Verwendung des Berendsen-Barostats (32) bzw. des Geschwindigkeitsskalierungsthermostats (33) aufrechterhalten. Das System wurde mit einer Kopplungszeit von 0,1 ps an das Temperaturbad gekoppelt. Die Druckkopplungszeit betrug 1,0 ps und die isotherme Kompressibilität 4,5·10 -5 bar -1 . Bei der kontinuierlich DNA-System (das isotrop in der x und ja Richtungen, aber nicht in der z Richtung).

Bindungsabstände und -winkel von Wasser wurden unter Verwendung des SETTLE-Algorithmus eingeschränkt ( 34). Andere Bindungsabstände wurden unter Verwendung des LINCS-Algorithmus eingeschränkt ( 35). Es wurde ein Leap-Frog-Integrator mit einem Integrationszeitschritt von 2 fs verwendet.

Die Ausgangsstrukturen der 30-mer 5′AACTGCTAAA-GAGGGAGGGA-CTTGATGTAT 3′ und 10-mer 5′AGGGAGGGAG 3′ DNA wurden in der B-Form als Doppelstrang bzw. Einzelstrang mit dem Softwarepaket 3DNA erzeugt ( 23) . Um die Ausgangsstruktur des DNA-Triplexes zu generieren, wurden 10 ns MD-Simulationen unter Verwendung von Abstandseinschränkungen zwischen den Wasserstoffbrücken-Donor- und -Akzeptoratomen der Watson-Crick-Seite des 30-mer Purins und der reversen Hoogsteen-Seite des dritten Strangs durchgeführt. Nach 10 ns Äquilibrierung wurden 50 ns MD-Simulation für jedes System durchgeführt.

Strukturanalyse

Um eine mögliche Fehlklassifizierung von DNA-Konformationen, wie in der Einleitung erwähnt, zu vermeiden, analysieren wir DNA-Doppelhelixschritte in unseren MD-Trajektorien mit der 3DNA ( 23, 36)-Software und ihrem Satz von Rubin Skripte namens x3dna_ensemble. Diagramme und statistische Analysen wurden mit selbst erstellten Skripten erstellt, die in geschrieben wurden R ( 37).

Basenpaarparameter für Watson-Crick-Schritte und Hoogsteen-Schritte wurden für jedes Basenpaar bestimmt und über die Zeit gemittelt. Der Einfachheit halber wurde die DNA-Helix in drei Regionen unterteilt: erster Duplex, Homo-Purin und zweiter Duplex. Durchschnittliche Stufenparameter für jede Region wurden durch Mittelung der zeitgemittelten Werte des Basenpaars erhalten. Der Standardfehler des Mittelwerts wurde mittels Blockmittelung berechnet ( 38).

Für eine schnelle und detaillierte Interpretation des Konformationsraums von Basenpaarschritten untersuchen wir die lokalen helikalen Parameter Neigung versus x-Verschiebung, die Basisschrittparameter Roll vs. Slide ( 39) und die lokale Achse der Phosphor-zu-Phosphor-Vektorprojektionen zwischen den Strängen |$z$| P(h) gegen |$z$| P für jeden Schritt in den simulierten DNAs. Gleiten (Dx) kann zwischen B-DNA- und A-DNA-Konformationen unterscheiden, da ihre Mittelwerte weit auseinander liegen, während Roll (ρ) können A-DNA und B-DNA von TA-DNA unterscheiden, aber nicht zwischen ihnen ( 40). Es wurde gezeigt, dass die Phosphor-zu-Phosphor-Vektorprojektion auf dem |$z$| -Achse des lokalen Schraubenachsenbezugssystems |$z$| P(h), effektiv zwischen B-DNA- und TA-DNA-Konformationen unterscheidet ( 41), und dass die entsprechende Projektion auf das Referenzsystem der mittleren Stufe |$z$| P unterscheidet zwischen A-DNA- und B-DNA-Konformationen ( 42).

Um globale Merkmale zu analysieren, werden die Breiten der Haupt- und Nebenrillen als Phosphor-Phosphor-Abstände zwischen den Strängen berechnet ( 43). Diese Werte können mit lokalen Merkmalen korreliert werden, die durch die Schrittparameter des Basispaars beschrieben werden. Darüber hinaus präsentieren wir endocyclische und exocyclische Basenpaarschrittüberlappungen, die mit DNA-Basenstapelgeometrien und Wechselwirkungen korrelieren ( 23, 39).

Um den Einfluss des dritten Strangs auf die helikale Struktur zu quantifizieren, werden Winkel zwischen den Massenzentren von Watson-Crick-Basenpaaren berechnet. Insbesondere haben wir die Winkel zwischen dem mittleren Basenpaar (Position 15 in der 30-mer DNA) und äquidistanten benachbarten Basenpaaren berechnet.

Um die konformationellen Fluktuationen der helikalen Struktur in Gegenwart und Abwesenheit von TFO zu vergleichen, haben wir eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) (44–46) der doppelsträngigen DNA-fusionierten Trajektorien durchgeführt. Alle Atome werden berücksichtigt. Vor der Durchführung der Analyse wird jeder Koordinatensatz in der Trajektorie verschoben und gedreht, um die beste Anpassung an den mittleren helikalen Rahmen (zwischen den Basenpaaren 11 und 20) der Duplex-Referenzstruktur zu erzielen. Die ersten vier (von insgesamt 5715) Eigenvektoren beschreiben 86 % der Gesamtschwankungen.

Potenzial der mittleren Kraft (PMF)

Um das Base-Flipping zu modellieren, wurde die PMF unter Verwendung von Umbrella-Sampling mit einem harmonischen Potentialbias |$w$| . berechnet ich = k(xxich) 2 /2 entlang einer Reaktionskoordinate x, definiert als Pseudo-Diederwinkel zwischen dem Massenmittelpunkt der Flipping-Base, des entsprechenden Zuckers, des ersten Nachbarzuckers und des ersten benachbarten Basenpaares. Diese Reaktionskoordinate wurde häufig verwendet, um das Basen-Flipping in DNA und RNA zu untersuchen ( 47–49) (für eine detaillierte Definition siehe ( 47)). Die PMF-Berechnungen wurden mit der GROMACS-Programmsuite (Version 4.5) unter Verwendung von Dieder-Einschränkungen durchgeführt, die über virtuelle Interaktionsstellen auf den Massenschwerpunkt wirken.

Base-Flipping-PMFs wurden durch Ausführen von 72 unabhängigen Simulationsfenstern erhalten, die den Referenz-Pseudo-Diederwinkel variierten xich, von -180° bis 180° in 5°-Schritten. Die anfänglichen Konformationen für jedes Fenster wurden erzeugt, indem man jeweils 5 ps entlang der Reaktionskoordinate mit k = 20 000 kcal/(molrad 2 ). In der Produktionsphase wurde jedes Fenster für 5 ns (von denen die letzten 4 ns für die Analyse verwendet wurden) mit k = 2000 kcal/(Molrad 2 ). Die Dieder-Zurückhaltung, die durch virtuelle Interaktionsorte auf den Massenschwerpunkt wirkt, wurde verwendet. Die Werte für den Pseudo-Diederwinkel wurden bei jedem Schritt aufgezeichnet. Die PMF-Kurven wurden aus den resultierenden Distanzverteilungen unter Verwendung der Weighted Histogram Analysis Method ( 50, 51) mit einer Toleranz von 10 –6 , 720 Bins und Erzwingung der Periodizität der Reaktionskoordinate erzeugt. Fehlerbalken wurden erhalten, indem die Datensammlung in jedem Fenster in vier Teile geteilt und ihre Standardabweichung berechnet wurde.

Änderungen der freien Energie in der Basenpaaröffnung wurden durch Integration der Wahrscheinlichkeitsverteilungsfunktion (erhalten aus der PMF-Kurve) über den geschlossenen und offenen Zustand für A- und T-Flipping berechnet. Um offene und geschlossene Zustände für das Basenpaar zu definieren, berechneten wir die für das Lösungsmittel zugängliche Oberfläche des H3-Atoms in Pyrimidin und N1 in Purin. Die für das atomare Lösungsmittel zugängliche Oberfläche wurde numerisch berechnet ( 52 ), wobei die Lösungsmittelsonde auf einen Radius von 0,14 nm für Kohlenstoff, 0,13 nm für Sauerstoff und Phosphor und 0,10 nm für Wasserstoff eingestellt wurde. Ein geschlossenes Basenpaar ist so definiert, dass es eine für das Atomlösungsmittel zugängliche Oberfläche von weniger als 0,001 nm 2 hat.

Die Energiebarrieren für das Base Flipping wurden durch die Differenz zwischen den minimalen und maximalen Werten der PMF-Kurve definiert.


Polymerase-Kettenreaktion: Techniken und Variationen

Lesen Sie diesen Artikel, um mehr über die Techniken und Variationen der Polymerase-Kettenreaktion mit Diagramm zu erfahren.

Polymerase Kettenreaktion :

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine Labortechnik (in vitro) zur Erzeugung großer Mengen einer bestimmten DNA.

Offensichtlich ist die PCR eine zellfreie Amplifikationstechnik zum Synthetisieren mehrerer identischer Kopien (Milliarden) eines beliebigen DMA von Interesse. Die 1984 von Karry Mullis entwickelte PCR gilt heute als grundlegendes Werkzeug für den Molekularbiologen. So wie ein Fotokopierer im Büro eine Grundvoraussetzung ist, so ist auch das PCR-Gerät in einem molekularbiologischen Laboratorium!

Prinzip der PCR:

Die interessierende doppelsträngige DNA wird denaturiert, um sich in zwei einzelne Stränge aufzutrennen. Jeder Strang wird dann mit einem Primer hybridisieren gelassen (Renaturierung). Der Primer-Template-Duplex wird für die DNA-Synthese verwendet (das Enzym-DNA-Polymerase). Diese drei Schritte – Denaturierung, Renaturierung und Synthese werden immer wieder wiederholt, um mehrere Formen von Ziel-DNA zu erzeugen.

Technik der PCR:

Nachfolgend sind die wesentlichen Anforderungen für die PCR aufgeführt:

1. Eine Ziel-DNA (100-35.000 bp Länge).

2. Zwei Primer (synthetische Oligonukleotide mit einer Länge von 17-30 Nukleotiden), die komplementär zu Regionen sind, die die Ziel-DNA flankieren.

3. Vier Desoxyribonukleotide (dATP, dCTP, dCTP, dTTP).

4. Eine DNA-Polymerase, die einer Temperatur von bis zu 95 °C standhalten kann (d. h. thermostabil).

Die Reaktionsmischung enthält die Ziel-DNA, zwei Primer (im Überschuss), eine thermostabile DNA-Polymerase (isoliert aus dem Bakterium Thermus aquaticus (dh Taq-DNA-Polymerase) und vier Desoxyribonukleotiden. Die eigentliche PCR-Technik umfasst wiederholte Zyklen zur Amplifikation von Ziel-DNA.

Jeder Zyklus hat drei Phasen:

Beim Erhöhen der Temperatur auf etwa 95 °C für etwa eine Minute wird die DNA denaturiert und die beiden Stränge trennen sich.

2. Renaturierung oder Glühen:

Wenn die Temperatur der Mischung langsam auf etwa 55°C abgekühlt wird, bilden die Primer Basenpaare mit den komplementären Regionen, die die Ziel-DNA-Stränge flankieren. Dieser Vorgang wird als Renaturierung oder Annealing bezeichnet. Eine hohe Primerkonzentration gewährleistet ein Annealing zwischen jedem DNA-Strang und dem Primer anstelle der beiden DNA-Stränge.

Die Initiierung der DNA-Synthese erfolgt am 3′-Hydroxyl-Ende jedes Primers. Die Primer werden verlängert, indem die zu DNA-Strängen komplementären Basen verbunden werden. Der Syntheseprozess bei der PCR ist durchaus vergleichbar mit der DNA-Replikation des Leitstrangs.

Allerdings muss die Temperatur entsprechend den Anforderungen des Enzyms DNA-Polymerase optimal gehalten werden. Für die Taq-DNA-Polymerase liegt die optimale Temperatur bei etwa 75 °C (für die E. coli-DNA-Polymerase bei etwa 37 °C). Die Reaktion kann durch Temperaturerhöhung (auf ca. 95 °C) gestoppt werden.

Die 3 Phasen der PCR in Abhängigkeit von Temperatur und Zeit sind in Abb. 8.1 dargestellt. Jeder PCR-Zyklus dauert etwa 3-5 Minuten. In der üblichen Praxis wird die PCR in einem Automaten durchgeführt.

Wie aus Abb. 8.2 (Zyklus I) ersichtlich ist, liegt der neue DNA-Strang, der mit jedem Primer verbunden ist, jenseits der Sequenz, die zum zweiten Primer komplementär ist. Diese neuen Stränge werden als lange Matrizen bezeichnet und werden im zweiten Zyklus verwendet.

Für den zweiten PCR-Zyklus werden die DNA-Stränge (ursprüngliches + neu synthetisiertes langes Template) denaturiert, mit Primern angelagert und einer DNA-Synthese unterzogen. Am Ende der zweiten Runde werden lange Matrizen und kurze Matrizen (DNA-Stränge mit Primersequenz an einem Ende und Sequenz komplementär zum Primer am anderen Ende) gebildet.

Im dritten Zyklus der PCR sind die ursprünglichen DNA-Stränge zusammen mit langen und kurzen Matrizen die Ausgangsmaterialien. Die Techniken der Denaturierung, Renaturierung und Synthese werden wiederholt. Dieser Vorgang wird für jeden Zyklus immer wieder wiederholt. Es wird geschätzt, dass am Ende des 32. PCR-Zyklus etwa eine Million-fache Ziel-DNA synthetisiert wird (Tabelle 8.1). Die kurzen Matrizen, die genau die Ziel-DNA als doppelsträngige Moleküle besitzen, reichern sich an.

Quellen der DNA-Polymerase:

Bei der ursprünglichen PCR-Technik wurde das Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase verwendet. Dieses Enzym wird bei höheren Temperaturen denaturiert, daher musste für jeden Zyklus frisches Enzym hinzugefügt werden. Ein Durchbruch gelang mit der Einführung der Taq-DNA-Polymerase aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus. Die Taq-DNA-Polymerase ist hitzebeständig, daher ist es nicht erforderlich, dieses Enzym für jeden PCR-Zyklus neu zuzugeben.

Schlüsselfaktoren für eine optimale PCR:

Primer spielen eine bedeutende Rolle bei der Bestimmung der PCR. Ideal sind die Primer (17-30 Nukleotide) ohne Sekundärstruktur und ohne Komplementarität untereinander. Die komplementären Primer können hybridisieren, um ein Primer-Dimer zu bilden und in der PCR amplifiziert werden. Dies verhindert die Vermehrung der Ziel-DNA.

Wie bereits beschrieben, wird Taq-DNA-Polymerase bevorzugt, da sie hohen Temperaturen standhalten kann. Im Hot-Start-Protokoll wird DNA-Polymerase nach dem Hitzedenaturierungsschritt des ersten Zyklus zugegeben. Dies vermeidet die Verlängerung der fehlgepaarten Primer, die normalerweise bei niedriger Temperatur auftritt.

Der Taq-Polymerase fehlt die Aktivität der Exonuklease (3′-5′) für das Korrekturlesen, was zu Fehlern in den PCR-Produkten beitragen könnte.Einige andere thermostabile DNA-Polymerasen mit Korrekturleseaktivität wurden identifiziert, z. B. Tma-DNA-Polymerase aus Thermotoga maritama Pfu-DNA-Polymerase aus Pyrococcus furiosus.

Im Allgemeinen ist die Effizienz der PCR umso besser, je kürzer die Sequenz der Ziel-DNA ist. In den letzten Jahren wurde jedoch über die Amplifikation von DNA-Fragmenten bis zu 10 kb berichtet. Die Sequenz der Ziel-DNA ist auch bei der PCR wichtig. Somit behindern CC-reiche Regionen des DNA-Strangs die PCR.

Promotoren und Inhibitoren:

Die Zugabe von Proteinen wie Rinderserumalbumin (BSA) verbessert die PCR durch den Schutz des Enzyms DNA-Polymerase. Huminsäuren, die häufig in archäologischen Proben von Ziel-DNA gefunden werden, hemmen die PCR.

Variationen der PCR:

Die grundlegende Technik der PCR wurde beschrieben. Da es sich um eine vielseitige Technik handelt, wird die PCR gemäß den spezifischen Anforderungen der Situation modifiziert. Somit gibt es viele Variationen in der ursprünglichen PCR, von denen einige im Folgenden diskutiert werden.

Verschachtelte PCR:

Sequenzähnlichkeiten zwischen der Ziel-DNA und verwandter DNA werden sehr häufig beobachtet. Dadurch können die Primer an beide DNAs binden und somit wird auch die unerwünschte DNA in der PCR amplifiziert. Die Verwendung von verschachtelten Primern erhöht die Spezifität der PCR und amplifiziert selektiv die Ziel-DNA. Verschachtelte PCR ist in Abb. 8.3 dargestellt. Im ersten Zyklus der PCR stammen die Produkte sowohl von Ziel-DNA als auch von unerwünschter DNA. Ein zweiter Satz interner Primer wird nun verwendet. Sie werden selektiv an Ziel-DNA binden und die Amplifikation schreitet fort.

Inverse PCR:

Bei der inversen PCR wird die DNA der unbekannten Sequenzen aus der bekannten Sequenz amplifiziert (Abb. 8.4). Die Ziel-DNA wird mit einer Restriktionsendonuklease gespalten, die die bekannte Sequenz nicht schneidet, aber die unbekannte Sequenz auf beiden Seiten schneidet. Die so gebildeten DNA-Fragmente werden invertiert und zirkularisiert (DNA-Ligase wird als Versiegelungsmittel verwendet).

Der Kreis mit den bekannten Sequenzen wird nun mit einem anderen Restriktionsenzym geschnitten. Dadurch wird nur die bekannte Sequenz gespalten. Die so gebildete Ziel-DNA enthält an beiden Enden die bekannte Sequenz mit der Ziel-DNA in der Mitte. Nun kann die PCR-Amplifikation durchgeführt werden. Es ist zu beachten, dass die Primer in entgegengesetzter Richtung zur Normalen erzeugt werden, da die ursprüngliche Sequenz während der Zirkularisierung invertiert wird.

Verankerte PCR:

Bei der verankerten PCR kann eine kleine Nukleotidsequenz an die Ziel-DNA angehängt (markiert) werden, d. h. die DNA wird verankert. Dies ist besonders nützlich, wenn die die Ziel-DNA umgebende Sequenz nicht bekannt ist. Der Anker ist häufig ein Poly-G-Schwanz, für den ein Poly-C-Primer verwendet wird. Die Verankerung kann auch durch die Verwendung von Adaptern erfolgen. Da die Adapter eine bekannte Sequenz besitzen, kann der Primer gewählt werden.

Reverse Transkription PCR:

Die PCR-Technik kann auch zur Amplifikation von RNA-Molekülen verwendet werden, in diesem Fall wird sie als reverse Transkription – PCR (RT-PCR) bezeichnet. Dazu muss das RNA-Molekül (mRNA) zunächst durch das Enzym Reverse Transkriptase in komplementäre DNA (cDNA) umgewandelt werden. Die cDNA dient dann als Matrize für die PCR. Für die Synthese des ersten cDNA-Strangs können verschiedene Primer verwendet werden. Dazu gehören die Verwendung von Zufallsprimern, Oligo-dT-Primern und einem sequenzspezifischen Primer (Abb. 8.5).

Asymmetrische PCR:

Die PCR-Technik kann auch für die Synthese einzelsträngiger DNA-Moleküle verwendet werden, die insbesondere für die DNA-Sequenzierung nützlich sind. Bei der asymmetrischen PCR werden zwei Primer im Verhältnis 100:1 verwendet. Nach 20-25 PCR-Zyklen ist ein Primer erschöpft. Das Ergebnis ist, dass in den nächsten 5-10 PCR-Zyklen nur einzelsträngige DNAs erzeugt werden.

Quantitative Echtzeit-PCR:

Die Quantifizierung von PCR-Produkten in verschiedenen Zyklen ist nicht so einfach, wie es theoretische Überlegungen projizieren (Tabelle 8.1). In der Praxis treten große Schwankungen auf. Die am häufigsten verwendete Technik zum Messen der Menge an PCR ist die Verwendung einer Fluoreszenzverbindung wie Eithidiumbromid.

Das Prinzip besteht darin, dass die doppelsträngigen DNA-Moleküle an Ethidiumbromid binden, das eine nachweisbare Fluoreszenz emittiert und DNA quantifiziert. Die Synthese von Genen durch PCR und die Rolle der PCR bei der ortsgerichteten Mutagenese werden an anderer Stelle beschrieben.

Zufällig amplifizierte polymorphe DNA (RAPD):

Normalerweise besteht das Ziel der PCR darin, definierte DNA-Fragmente aus hochspezifischen Primern zu erzeugen. Im Fall von RAPD (ausgesprochen als schnell) werden kurze Oligonukleotid-Primer willkürlich ausgewählt, um einen Satz von DNA-Fragmenten zu amplifizieren, die zufällig über das Genom verteilt sind. Diese Technik, zufällig amplifizierte polymorphe DNA, ist auch als Arbitrary-Primed-PCR (AP-PCR) bekannt.

Das Verfahren der RAPD ist mit der allgemeinen Technik der PCR vergleichbar. Dieses Verfahren beinhaltet grundsätzlich die Verwendung eines einzelnen Primers mit niedriger Stringenz. Ein einzelnes kurzes Oligonukleotid (normalerweise ein 9-10 Basen-Primer) bindet an viele Stellen im Genom und die DNA-Fragmente werden daraus amplifiziert. Die Stringenz der Primerbindung kann nach wenigen PCR-Zyklen erhöht werden. Dies ermöglicht die Verstärkung der besten Fehlanpassungen.

RAPD kann sorgfältig entworfen werden, um schließlich genomspezifische Bandenmuster zu liefern, die für vergleichende Analysen nützlich sind. Dies ist möglich, da genomische DNA von zwei verschiedenen Individuen oft unterschiedliche amplifizierte Muster durch RAPD erzeugt. Somit kann für ein Individuum ein bestimmtes DNA-Fragment erzeugt werden und für das andere nicht, und dies stellt einen DNA-Polymorphismus dar, der als genetischer Marker verwendet werden kann.

RAPD wird von Pflanzenmolekularbiologen häufig zur genetischen Identifizierung von Pflanzenarten verwendet. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Kombinationen von Nukleotiden, die meisten davon zufällige Oligonukleotid-Primer, entworfen und sind im Handel erhältlich. Da jeder Zufallsprimer an eine andere DNA-Region anlagert, können viele verschiedene Loci-Regionen auf der DNA identifiziert werden. RAPD ist somit nützlich für die Konstruktion genetischer Karten und als Methode zum genomischen Fingerabdruck.

Einschränkungen von RAPD:

Das Hauptproblem der RAPD ist mit der Reproduzierbarkeit verbunden. Es ist oft schwierig, in verschiedenen Experimenten ähnliche Werte der Primerbindung zu erhalten. Daher ist es schwierig, Ergebnisse verschiedener Forschungsgruppen zu RAPD zu korrelieren.

Amplifizierter Fragmentlängenpolymorphismus (AFLP):

AFLP ist eine sehr sensitive Methode zum Nachweis von Polymorphismus im Genom. Es basiert auf dem Prinzip des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus und RAPD. AFLP kann geeigneterweise als diagnostisches Fingerprinting-Verfahren angesehen werden, das genomische Restriktionsfragmente erkennt.

Beim AFLP wird eher die PCR-Amplifikation als das Southern-Blotting (meist verwendet in RFLP) zum Nachweis von Restriktionsfragmenten verwendet. Es sei darauf hingewiesen, dass AFLP verwendet wird, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Restriktionsfragmenten und nicht die Länge dieser Fragmente nachzuweisen. Dies ist der Hauptunterschied zwischen AFLP und RFLP. AFLP wird in der Pflanzengenetik sehr häufig verwendet.

Sie hat sich bei der Kartierung von Tiergenomen nicht als nützlich erwiesen, da diese Technik hauptsächlich auf dem Vorhandensein hoher Raten von Substitutionsvariationen beruht, die bei Tieren nicht gefunden werden. Andererseits treten bei Pflanzen häufiger Substitutionsvariationen auf, die zu RFLPs führen. Das Grundprinzip der AFLP besteht in der Amplifikation von Teilmengen von RFLPs mittels PCR (Abb. 8.6).

Eine genomische DNA wird isoliert und gleichzeitig mit zwei verschiedenen Restriktionsendonukleasen verdaut – EcoRI mit einer Erkennungsstelle von 6 Basenpaaren und Msel mit einer Erkennungsstelle von 4 Basenpaaren. Diese beiden Enzyme können die DNA spalten und zu kleinen Fragmenten (< 1 kb) führen, die durch PCR amplifiziert werden können. Dazu werden die DNA-Fragmente mit EcoRI- und Msel-Adaptern ligiert.

Diese gemeinsamen Adaptersequenzen (flankierende genomische Sequenzen) dienen als Primer-Bindungsstellen auf den Restriktionsfragmenten. Die DNA-Fragmente können mit AFLP-Primern amplifiziert werden, die jeweils nur ein selektives Nukleotid aufweisen. Diese PCR-Produkte werden verdünnt und als Matrizen für die selektive Amplifikation verwendet, wobei zwei neue AFLP-Primer verwendet werden, die 2 oder 3 selektive Nukleotide aufweisen.

Nach der selektiven Amplifikation durch PCR werden die DNA-Produkte auf einem Gel aufgetrennt. Der resultierende DNA-Fingerabdruck wird durch Autoradiographie identifiziert. AFLP-Fragmente repräsentieren einzigartige Positionen in den Genomen und können daher als Orientierungspunkte verwendet werden, um die Lücken zwischen genetischen und physikalischen Karten von Genomen zu überbrücken. In Pflanzen ist AFLP nützlich, um Karten mit hoher Dichte zu erzeugen und genomische Klone nachzuweisen.

Schnelle Amplifikation von cDNA-Enden (RACE):

Wie bereits beschrieben (siehe S. 115), führt reverse Transkription gefolgt von PCR (RT-PCR) zur Amplifikation von RNA-Sequenzen in cDNA-Form. Die Haupteinschränkung der RT-PCR hängt jedoch mit unvollständigen DNA-Sequenzen in der cDNA zusammen. Dieses Problem wird gelöst, indem die Technik der schnellen Amplifikation von cDNA-Enden verwendet wird. RACE ist in Abb. 8.7 dargestellt und wird im Folgenden kurz beschrieben.

Die Ziel-RNA wird durch Verlängerung eines DNA-Primers in eine partielle cDNA umgewandelt. Dieser DNA-Primer wurde zuerst an einer Intervallposition der RNA, nicht zu weit vom 5′-Ende des Moleküls, angelagert. Nun verlängert die Zugabe von dATP (As) und terminaler Desoxynukleotidyltransferase das 3′-Ende der cDNA.

Dies geschieht aufgrund der Zugabe einer Reihe von DNA zur cDNA. Diese als Serie wirken nun als Primer zum Annealing an den Ankerprimer. Durch Verlängerung des Ankerprimers kann ein zweiter DNA-Strang gebildet werden. Die doppelsträngige DNA ist nun bereit für die Amplifikation durch PCR. Das oben beschriebene Verfahren wird als 5′-RACE bezeichnet, da es durch Amplifikation des 5′-Endes der Ausgangs-RNA durchgeführt wird. Ein ähnliches Protokoll kann verwendet werden, um 3′-RACE durchzuführen, wenn die 3′-Ende-RNA-Sequenz gewünscht wird.

Einschränkungen von RACE:

Da ein spezifischer Primer verwendet wird, kann die Spezifität der Amplifikation von RACE nicht sehr hoch sein. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass die Reverse Transkriptase die 5′-Enden der RNA möglicherweise nicht vollständig erreicht, was den Nutzen von RACE einschränkt. In den letzten Jahren wurden einige Modifikationen vorgenommen, um RACE zu verbessern.


Teil I: Reise zur Entdeckung &mdash

Der gewundene Pfad zur DNA-Doppelhelix

[Die chemische Natur des Gens zu definieren] "ist eine der großen dringenden Aufgaben der Menschheit. Wenn wir es einmal geschafft haben, erweitern sich die Grenzen unseres Horizonts jenseits unserer Vorstellungskraft, und wir sehen endlich, was wir sind."

- Florence Bell, aus ihrer Doktorarbeit (1939). Siehe Referenzen.

Das Problem

Wie werden Eigenschaften von den Eltern an die Nachkommen weitergegeben? Der erste Durchbruch zu diesem Problem gelang Gregor Mendel, einem Mönch aus dem 19. Jahrhundert, der Erbsen studierte. Mendel zeigte, dass Merkmale als diskrete Einheiten vererbt werden, die später als Gene bekannt wurden (siehe Narrative on Inheritance von Tilghman). Das Gen wurde zu einem sehr wichtigen Konzept in der Biologie, und im frühen 20. Jahrhundert war bekannt, dass Gene:

1) Informationen speichern. Frühere Arbeiten hatten gezeigt, dass ein Gen Informationen enthält, die die Produktion eines Proteins anweist.

2) Replizieren. Es muss ein Kopiermechanismus existieren, der es ermöglicht, genetische Informationen von einer Generation zur nächsten weiterzugeben.

3) Mutieren. Gelegentliche Veränderungen der Gene bringen Nachkommen hervor, die sich von ihren Eltern unterscheiden. Diese Variation ist der Motor der Evolution durch natürliche Selektion (siehe Narrative on Mutations von Doug Koshland).

Aber was ist ein Gen? Aus was ist es gemacht? Wie sieht es aus? Wenn man die physikalisch-chemische Natur von Genen wüsste, könnte man vielleicht verstehen, wie Gene Informationen speichern, sich replizieren und mutieren.

Beweise an der Wende des 20. Jahrhunderts legten nahe, dass Gene auf Chromosomen liegen (siehe Dig Deeper 1 ). Chromosomen bestehen sowohl aus DNA als auch aus Proteinen. Welches Gen war das? In der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts dachten Wissenschaftler aus folgenden Gründen, dass Gene aus Proteinen und nicht aus DNA bestehen:

1) Polypeptide (ein anderer Name für Proteine) sind lineare Ketten, die aus 20 verschiedenen Bausteinen bestehen – den Aminosäuren. DNA hingegen besteht aus nur 4 verschiedenen Bausteinen – den Basen . Da Proteine ​​komplexer sind als DNA, wurden Polypeptide als bessere Möglichkeit angesehen, die komplexen Informationen des Lebens zu speichern.

2) Es wurde angenommen, dass DNA eine monotone, sich wiederholende Kette von Nukleotiden ist, die für die Informationsspeicherung nicht nützlich wäre. Phoebus Levene förderte diese Ansicht mit seiner "Tetranukleotid-Hypothese", die postulierte, dass die vier Basen der DNA in gleichen Mengen vorhanden sind und sich entlang des Chromosoms in einem festen Muster immer wieder wiederholen. Diese Hypothese stellte sich als völlig falsch heraus, war aber zu ihrer Zeit einflussreich.

Aufgrund dieser Denkweise dachten viele Wissenschaftler, dass DNA in den ersten 80 Jahren nach ihrer Entdeckung langweilig sei. DNA ist ein Beispiel dafür, warum das Eliminieren falscher Ideen oft genauso wichtig ist wie das Kreieren neuer Ideen.

In unserer Journey to Discovery werden wir auf zwei berühmte Experimente stoßen, eines von Avery-MacLeod-McCarty und eines von Hershey-Chase, die zusammen die Idee, dass Proteine ​​das Molekül der Vererbung sind, auf den Kopf stellten und mit dem Finger direkt auf die DNA zeigten (erklärt in Clue 3 unten). Die Tetranukleotid-Hypothese wurde schließlich durch die unten in Hinweis 4 beschriebenen Daten widerlegt.

Doch selbst mit diesen bis 1952 korrigierten Fehlern konnte sich niemand vorstellen, wie die DNA in der Vererbung funktioniert. Sogar die Vorstellung, dass DNA einen Code enthält, eine grundlegende Tatsache über die DNA, die die meisten Menschen heute kennen, wurde damals nicht gewürdigt. Max Delbruck (ein bekannter Wissenschaftler in Koshlands Narrative on Mutations and the Meselson-Stahl Key Experiment) sagte:

"Niemand, absolut niemand, hatte bis zum Tag der Watson-Crick-Struktur gedacht, dass die Spezifität auf diese überaus einfache Weise, durch eine Sequenz, durch einen Code, übertragen werden könnte."

- Zitat aus Der achte Tag der Schöpfung (siehe Referenzliste)

Unsere Reise zur Entdeckung endet mit dem von Jim Watson und Francis Crick vorgeschlagenen Modell der DNA-Doppelhelix. Die Struktur deutete unerwartet auf einen eleganten Mechanismus für die Replikation und Vererbung von Genen hin und löste damit das Rätsel, das Mendel ein Jahrhundert zuvor gestellt hatte. Seitdem steht das einst langweilige DNA-Molekül im Rampenlicht.

Hinweis 1: Die Chemie der DNA

Im Jahr 1869 untersuchte Johann Friedrich Miescher die chemische Natur von "Eiter", den er aus weggeworfenen chirurgischen Verbänden einer örtlichen chirurgischen Klinik erhielt. Seine Eiterstudien führten zur Entdeckung einer neuen Substanz, die er "Nuclein" nannte, die sauer, reich an Phosphor und schwefelarm war und sie von Proteinen unterschied. Bald darauf fand er eine noch bessere Nukleinquelle – Lachssperma. Was Miescher entdeckte, ist heute als Desoxyribonukleinsäure oder DNA bekannt.

Es wurde entdeckt, dass Nuclein aus vier verschiedenen chemischen Einheiten besteht, die als Basen bezeichnet werden – Adenin, Guanin, Thymin, Cytosin (Abbildung 1). Guanin (abgekürzt als "G") wurde erstmals 1844 in den Exkrementen von Vögeln (genannt "Guano") gefunden. Adenin (abgekürzt als "A") wurde 1885 aus Rinderpankreas isoliert. Guanin und Adenin sind einander ähnlich (ein Sechseck von Kohlenstoffen, das zu einem Fünfeck mit einer gemeinsamen Seite verbunden ist) und werden "Purine" genannt. Die anderen DNA-Basen Thymin (T) und Cytosin (C) wurden zuerst aus Kalbsthymusdrüsen isoliert. Thymin und Cytosin (Hexagone) werden Pyrimidine genannt.

Abbildung 1 Die DNA-Basen und ihre Quelle/Entdeckungsdatum.

Die chemische Struktur der DNA wurde durch die Arbeit mehrerer Wissenschaftler weiter aufgeklärt, allen voran Alexander Todd, der für seine Arbeit den Nobelpreis erhielt. Weitere Details werden in der Wissensübersicht vorgestellt, aber die Grundlagen werden hier vorgestellt, da sie sich auf die Entdeckung der DNA-Struktur beziehen. Die Grundbausteine ​​der DNA sind nicht nur die Basen, sondern Nukleotide. Ein Nukleotid ist eine Base (eine von vier), die mit einem Zucker (Desoxyribose für DNA) verbunden ist, der wiederum mit einem Phosphat verbunden ist (Abbildung 2). DNA ist ein langes Polymer von Nukleotiden und wird manchmal als Polynukleotid (viele Nukleotide) bezeichnet. Die Nukleotide sind kopf-an-schwanz durch Bindungen zwischen einem Phosphat und zwei benachbarten Zuckern verbunden, eine der Bindungen verbindet das Phosphat mit dem sogenannten 5′-Kohlenstoff eines Zuckers, und die andere Bindung wird mit die 3′-Kohlenstoff auf einem anderen Zucker. So bilden die Phosphate und Zucker ein durchgehendes Rückgrat des DNA-Moleküls, wobei die Basen in regelmäßigen Abständen herausragen. Die DNA-Kette hat eine Direktionalität, die durch die Ausrichtung der 5′- und 3′-Kohlenstoffatome der Zucker definiert wird (Abbildung 2).

Abbildung 2 DNA ist ein Polymer von Nukleotiden. Das DNA-Polymer hat eine Polarität, die durch die Orientierung der 5'- und 3'-Kohlenstoffatome am Desoxyribose-Zucker definiert wird.

Hinweis 2: Die erste Röntgenstruktur der DNA von Florence Bell

Rosalind Franklin fertigte 1952 ein berühmtes Röntgenbild der DNA an, auf das wir bald eingehen werden. Das erste Röntgenbild der DNA wurde jedoch 14 Jahre zuvor an der University of Leeds von einem jungen Doktoranden – Florence Bell – angefertigt.

Florence Bell ( Abbildung 3 ) wurde 1913 in London geboren und studierte Chemie und Physik am College und wurde von zwei führenden wissenschaftlichen Experten in Röntgenkristallographie unterrichtet. Gut ausgebildet zog sie dann 1937 nach Leeds, um ihre Doktorarbeit zu beginnen. Studien bei William Astbury, einem weiteren bekannten Röntgenkristallographen. Bell erhielt ihren Ph.D. 1939 trug ihre Dissertation den Titel "Röntgen und verwandte Studien zur Struktur der Proteine ​​und Nukleinsäuren" (siehe Literatur). Bell hat eine außergewöhnliche Doktorarbeit vorgelegt, die weitgehend übersehen wurde. Es sollte nicht sein.

Abbildung 3 Foto von Florence Bell (von Wikipedia erhalten) auf der Titelseite ihrer Dissertation aus den Bibliotheksarchiven der University of Leeds (mit Genehmigung erhalten und in der Referenzliste verfügbar).

Bells Forschung bestand darin, einen Röntgenstrahl durch ausgerichtete biologische Fasern wie DNA zu richten. Die Fasern streuen einen Teil der Röntgenstrahlen, die dann mit einem röntgenempfindlichen Film als Bild festgehalten werden. Ein unscharfes, diffuses Bild auf dem Film weist auf das Fehlen einer regelmäßigen Molekülordnung in der Faser hin. Ein Muster von Flecken oder Linien spiegelt jedoch eine zugrunde liegende Ordnung von Atomen in der Faser wider. Wie später erörtert wird, können aus dem Röntgenmuster möglicherweise Informationen über die Anordnung von Atomen in der Faser abgeleitet werden. Bell arbeitete jedoch schon in der Anfangszeit daran, Röntgenstrahlen zu verwenden, um die Strukturen von Molekülen zu untersuchen. Die Anordnung der Atome in einfachen Salzkristallen war mit Röntgenstrahlen bestimmt worden, aber die Strukturen biologischer Moleküle, die komplizierter sind als einfache Salze, waren mit dieser Methode noch nicht aufgeklärt.

Bell ließ Röntgenstrahlen durch eine außerordentliche Anzahl biologischer Substanzen, die wie ein Hexengebräu klingen – Sehnen von Froschzehen, Quallen, menschliche Haare, Haifischflossenrippen usw. Diese Proben bestehen aus Proteinen. Bell betrachtete jedoch auch DNA aus verschiedenen Quellen. Eine DNA-Probe (aus Kalbsthymus) lieferte interessante Ergebnisse.

Wenn Sie in der Grund- oder Mittelschule DNA aus Erdbeeren hergestellt haben, erinnern Sie sich vielleicht an DNA als einen klebrigen Klumpen. Wie oben besprochen, erzeugt ein Klecks von desorganisierten Molekülen ein unscharfes Röntgenbild ohne Informationen. Daher musste Bell zunächst einen Weg finden, die DNA-Moleküle auszurichten. Sie tat dies, indem sie DNA auf einen Rahmen trocknete, der langsam gedehnt werden konnte.Die Dehnung half dabei, die DNA-Moleküle in die gleiche Richtung auszurichten, wodurch ein gewisses Maß an Ordnung geschaffen wurde.

Bell leitete den Röntgenstrahl durch ihre Wadenthymus-DNA-Fasern und die gestreuten Röntgenstrahlen erzeugten ein Bild auf dem fotografischen Film ( 4 ). Es war ein bisschen schmierig, aber es gab ein Muster. Allein die Beobachtung eines Musters war ein großes Ergebnis, es war der erste Hinweis darauf, dass die DNA eine Art molekularer Ordnung hat. Dies war keine Selbstverständlichkeit. Röntgenstrahlen würden beispielsweise kein Muster erzeugen, wenn sie durch ein Präparat aus RNA (einem anderen Polynukleotid) oder Polysacchariden (Polymeren von Zuckern) geleitet würden. Diese Polymere können zahlreiche 3D-Strukturen annehmen und so unregelmäßige Fasern erzeugen.

Abbildung 4 Röntgenbeugung von DNA-Fasern, wie sie von Florence Bell untersucht wurde. Das Foto stammt aus Bells Dissertation (https://explore.library.leeds.ac.uk/special-collections-explore/650413).

Bell erfuhr aus ihren Röntgenaufnahmen einiges über DNA. Erstens zeigte die große halbkreisförmige Bande ganz oben und unten (die im Jargon der Röntgenbeugung als "Reflexion" bezeichnet wird) dass sich ein Element in der DNA in regelmäßigen Abständen von 3,4 Angström (Angström, abgekürzt mit Symbol "Å" ist 10-10 Meter ein Zehntel Nanometer). Sie bestätigte diese Periodizität in DNA, die aus Viren und Pankreas gewonnen wurde, und zeigte damit, dass es sich um eine universelle Eigenschaft der DNA handeln muss. Aus anderen Informationen auf dem Foto bestimmt sie die Breite eines DNA-Moleküls mit 18,1 (nahe dem derzeit akzeptierten Wert von 20 Å). Aus diesen Daten erstellte Bell in ihrer Diplomarbeit ( Abbildung 5 ) ein Modell, das Folgendes zeigt:

1) DNA ist eine lange Säule, die eine starre Struktur bildet.

2) Die Basen liegen senkrecht zur Säulenachse und stapeln sich alle

3,4 . (Dies war ein Schlüsselparameter im Watson- und Crick-Modell, wie wir gleich sehen werden).

Abbildung 5 Das DNA-Modell von Bell und Astbury zeigt Basen, die sich entlang einer starren Säule in regelmäßigen Abständen von . stapeln

3.4 (https://explore.library.leeds.ac.uk/special-collections-explore/650413.). Sie spekulierten auch, dass diese regelmäßige DNA-Struktur ein Gerüst für Proteine ​​​​bildet, die für die Vererbung erforderlich sein könnten ( Dig Deeper 2 ).

Dass DNA eine starre Säule mit einer Breite von ∼20 ist und ihre Basen alle 3,4 stapeln, ist richtig. Bell kam jedoch nicht zu dem Schluss, dass die DNA eine Doppelhelix ist. Ihre DNA-Präparation (wie die frühen von Franklin) war eine Mischung aus zwei DNA-Formen, die die Dinge komplizierte und das Bild verwischte. Selbst wenn sie das "richtige" Foto hatte, gab es zu diesem Zeitpunkt noch keine Theorie, um ein Röntgenmuster mit spiralförmiger Struktur zu interpretieren.

Obwohl das in Abbildung 5 gezeigte DNA-Modell nicht ganz korrekt ist, stellte Bells Pionierarbeit im Jahr 1938 eine bedeutende Errungenschaft dar, volle 15 Jahre vor den berühmten DNA-Papieren, die 1953 erschienen zugrundeliegende Struktur. Ihre Arbeit zeigte, dass es ein machbares Unterfangen war, eine Struktur für die DNA zu erhalten, und zog andere (Franklin, Wilkins) an, das Problem auf die nächste Ebene zu bringen. Tatsächlich untersuchte Franklin weiterhin Thymus-DNA, dieselbe DNA-Quelle, die Bell in ihren Strukturstudien am besten fand. Die Wissenschaft geht in Schritten vor, die die notwendige Grundlage für große Fortschritte legen.

Viele Jahre später, im Jahr 1951, fertigte Bells Berater William Astbury ein besseres Röntgenbild der DNA an, tatsächlich eines ähnlich dem berühmten Foto von Rosalind Franklin (siehe unten). Astbury veröffentlichte oder präsentierte dieses Ergebnis jedoch nie öffentlich, es war wahrscheinlich, dass er seine Bedeutung nicht begriff. Wenn sie veröffentlicht und Linus Pauling und Francis Crick zugänglich wäre, hätte sich die Geschichte der DNA-Doppelhelix sehr wahrscheinlich verändert.

Könnte Florence Bell das Problem der DNA-Doppelhelix geknackt haben? Wir können die Antwort nicht wissen. Der Zweite Weltkrieg störte ihre wissenschaftliche Arbeit (wie wir später sehen werden für Francis Crick). Astbury versuchte, in ihre Rekrutierung durch das britische Kriegsministerium einzugreifen und erklärte, er könne "ohne ihre Hilfe kaum weitermachen". Aber Bell schloss sich den Kriegsanstrengungen als Funker der Women’s Auxiliary Air Force an. Dann heiratete sie einen amerikanischen Soldaten, kam in die USA und verließ die Wissenschaft endgültig. Wir werden in den Schlussgedanken zu Florence Bell zurückkehren.

Hinweis 3: Die Avery-MacLeod-McCarty- und die Hershey-Chase-Experimente weisen auf DNA und nicht auf Protein als Material der Vererbung hin

Wie bereits erwähnt, bestehen Chromosomen aus Proteinen und DNA. Aber welche speichert die Informationen des Gens? Proteine ​​wurden bevorzugt, aber ein Experiment war erforderlich, um dieses Problem zu lösen. Dieses Experiment wurde 1944 von Oswald Avery, Collin MacLeod und Maclyn McCarty durchgeführt.

Avery, MacLeod und McCarty folgten einer bemerkenswerten Beobachtung von Frederick Griffith aus dem Jahr 1928. Griffith untersuchte zwei verwandte Stämme des Bakteriums Streptococcus pneumonia – einen Stamm, der virulent war und bei Injektion in Mäuse eine Lungenentzündung verursachte, und einen anderen Farbstoff, der nicht- virulent (verursacht keine Krankheit). Der Unterschied zwischen den beiden Stämmen bestand darin, dass der virulente Stamm eine Beschichtung aufwies, die ihn vor der Zerstörung durch das Immunsystem schützte. Griffith führte ein Experiment durch, bei dem er virulente Bakterien mit Hitze tötete und diese toten Bakterien zusammen mit lebenden nicht-virulenten Bakterien in Mäuse injizierte. Was ihn dazu bewegte, dieses Experiment durchzuführen, ist aus meiner Lektüre nicht klar, aber die Ergebnisse waren erstaunlich. Griffith fand heraus, dass einige der nicht-virulenten Bakterien dauerhaft in virulente Bakterien "transformiert" wurden, die eine Lungenentzündung erzeugen würden (Abbildung 6). Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass Gene (in diesem Fall diejenigen, die den Schutzmantel verleihen, der die Bakterien virulent macht) zwischen Bakterien übertragbar waren, unglaublich sogar von toten Bakterien auf lebende. Dies war die erste experimentelle Demonstration des Gentransfers, einer Methode, die die heutige Biotechnologieindustrie antreibt. Diabetiker werden beispielsweise mit Humaninsulin behandelt, das von Bakterien hergestellt wird, die mit dem Humaninsulin-Gen transformiert sind.

Abbildung 6 Das Griffith-Experiment zeigt, dass Gene von einem Bakterium (in diesem Fall sogar von einem toten) auf ein anderes übertragen werden können. Dieser Vorgang wurde als "Transformation" bezeichnet.

Was war der chemische Wirkstoff, der während der genetischen "Transformation" zwischen den Bakterien übertragen wurde? Avery, MacLeod und McCarty fanden heraus, dass DNA und nicht Protein der verantwortliche Erreger war. Sie argumentierten, dass Gene aus DNA bestehen. Dieses Ergebnis war überraschend und widersprach dem damaligen Dogma. In Video 1 erfahren Sie mehr über das Experiment von Avery, MacLeod und McCarty.

Video 1 Ein Whiteboard-Video, das das Experiment von Avery, MacLeod und McCarty erklärt.

Viele Wissenschaftler widersetzten sich jedoch der Schlussfolgerung, dass Gene aus DNA bestehen. Die abweichenden Wissenschaftler dachten, es könnten noch einige Proteine ​​​​verbleiben, die das DNA-Präparat kontaminierten. Trotz der Eleganz des Avery-, MacLeod- und McCarty-Experiments blieb die chemische Natur des Gens in den Köpfen vieler Menschen ungeklärt.

Langjährige Ideen sind oft schwer zu entthronen. Falsche Ideen werden jedoch irgendwann unter dem Gewicht wissenschaftlicher Beweise zerbröckeln. Der nächste Beweis für die DNA kam 8 Jahre später (1952) in einem Experiment von Alfred Hershey und Martha Chase. Hershey und Chase untersuchten die Replikation von Viren, Bakteriophagen (kurz Phagen) genannt, die Bakterien infizieren. Phagen landen auf der Oberfläche der Bakterien und injizieren ein Molekül hinein. Dann werden viele neue Phagen innerhalb der Bakterien produziert. Das Molekül, das Bakterien injiziert wurde, muss sicherlich für die Vererbung verantwortlich sein, da es Informationen besitzt, um die Produktion neuer Phagen zu bestimmen. Hershey und Chase entdeckten, dass die Phagen die DNA und nicht das Protein in die Bakterien injizierten. Um zu erfahren, wie Hershey und Chase ihr Experiment durchgeführt haben, sehen Sie sich Video 2 an.

Video 2 Ein Whiteboard-Video, das das Hershey-Chase-Experiment erklärt.

Da sowohl die Avery-MacLeod-McCarty- als auch die Hershey-Chase-Experimente mit sehr unterschiedlichen Methoden zu demselben Ergebnis kamen, begann die wissenschaftliche Gemeinschaft, die Vorstellung, dass Gene aus DNA bestehen, breiter zu akzeptieren.

In unserem nächsten Hinweis werden wir einem Wissenschaftler begegnen, der sofort die Bedeutung des Avery-MacLeod-McCarty-Experiments erkannte und sein Forschungsprogramm von Proteinen auf DNA verlagerte. Diese Person war Erwin Chargaff.

Hinweis 4: Chargaffs Erkenntnisse

Erwin Chargaff war Biochemiker und stellte sich einer einfachen Frage: Wie viel von jeder der vier Basen ist in der DNA vorhanden? Die von Phoebus Levene vorgeschlagene Tetranukleotid-Hypothese besagt, dass Basen in gleichen Anteilen (jeweils ein Viertel) vorhanden sein sollten. Chargaff analysierte chemisch die DNA, um zu sehen, ob dies wahr war oder nicht. Die Ergebnisse von Chargaff sind in Abbildung 7 zusammengefasst.

Abbildung 7 Chargaffs Ergebnisse zur Basenzusammensetzung der DNA. Die obigen Ergebnisse sind aus zwei Publikationen von Chargaff zusammengestellt (siehe Referenzliste). Die Ergebnisse wurden in % jeder Base (wobei sich die vier Basen zu 100 % addieren) und nicht wie in den Originalarbeiten in % Phosphat neu berechnet.

Frage des Entdeckers: Was sagen diese Ergebnisse über die "Tetranukleotid-Hypothese" aus?

Antworten: Die Tetranukleotid-Hypothese schlug vor, dass sich die Basen entlang der DNA regelmäßig wiederholen, was gleiche (25%) Mengen der vier Basen vorhersagt. Die Daten von Chargaff zeigten jedoch, dass dies nicht der Fall ist. In anderen Daten stellte Chargaff auch fest, dass sich die Häufigkeit der Basen in verschiedenen Organismen (z. B. Hefe, Bakterien, Mensch) bis zu einem gewissen Grad unterscheidet, während die Tetranukleotid-Hypothese einen ähnlichen Prozentsatz der Basen in allen Organismen vorsah.

Frage des Entdeckers: Bemerken Sie Ähnlichkeiten in den relativen Mengen der Nukleotidbasen?

Antworten: Die Prozentsätze von Adenin und Thymin sind ähnlich. Ebenso die Prozentsätze von Guanin und Cytosin (obwohl sie sich im menschlichen Thymus etwas unterscheiden, wahrscheinlich aufgrund von experimentellen Variationen oder Fehlern).

Erwin Chargaffs Feststellung gleicher Prozentsätze von Adenin und Thymin sowie von Guanin und Cytosin ist heute als „Chargaff’s Rule“ bekannt. Als "Regel" schien es damals jedoch weniger offensichtlich. Chargaff selbst schien sich der Bedeutung in seinem Artikel von 1950 nicht sicher zu sein:

"Es ist bemerkenswert, wenn auch möglicherweise nur zufällig, dass bei allen bisher untersuchten Desoxypentose-Nukleinsäuren die Molverhältnisse von Gesamtpurinen zu Gesamtpyrimidinen nicht weit von 1 lagen. Mehr sollte in diese Zahlen nicht hineininterpretiert werden."

Glaubte man an Chargaffs Daten, so deuteten die unitären Verhältnisse von G zu C und A zu T stark auf eine Art Komplementarität hin. Ein passendes Schloss und Schlüssel sind ein Beispiel für strukturelle Komplementarität. Waren G-C und A-T komplementäre Schlösser und Schlüssel?

Wir werden auf die Chargaff-Daten zurückkommen, da sie das Watson-Crick-Modell der DNA bestätigen. Hinweise sind im Nachhinein leichter zu erkennen und werden oft übersehen. Auch Watson und Crick haben die Bedeutung von Chargaffs Daten nicht frühzeitig begriffen. Als sie jedoch ihre Bedeutung vollständig erkannt hatten, schnappten die beiden DNA-Stränge in ihren Köpfen zu einer Doppelhelix zusammen, wie wir gleich sehen werden.

Die Entdeckung: DNA ist eine Doppelhelix

Abbildung 8 zeigt eine der berühmtesten Fotografien der Biologie: Jim Watson und Francis Crick, die im März 1953 in Cambridge, England, vor ihrem 3D-Metallmodell der DNA-Doppelhelix stehen dieses modell entfaltete sich in einer erstaunlich kurzen zeit von ca. 4 wochen. Wir werden untersuchen, was in diesem Wundermonat passiert ist.

Abbildung 8 Watson und Crick stehen vor ihrem Modell der DNA-Doppelhelix.

Bevor wir untersuchen, wie Watson und Crick zu ihrem triumphalen Moment kamen, lassen Sie uns die Wissenschaftler in die Geschichte einführen.

Linus Pauling: Der Favorit

Wenn man darauf wetten wollte, wer die DNA-Struktur lösen würde, wäre das kluge Geld auf Linus Pauling gelegt worden. Pauling, ein Professor am Caltech, war einer der berühmtesten Wissenschaftler des 20. Pauling war auch ein Pionier bei der Anwendung der Chemie auf die Biologie. Im Jahr 1949 postulierte er richtigerweise, dass die Sichelzellenanämie eine Krankheit ist, die einen molekularen Defekt des Hämoglobins beinhaltet. 1951, nur 2 Jahre vor der DNA-Struktur, machte Pauling einen weiteren großen Sprung, indem er ein Atommodell für die Alpha-Helix baute, ein häufiges Strukturmotiv in Proteinen. Linus Pauling formulierte auch das Konzept der molekularen Komplementarität, einem Schloss-und-Schlüssel-ähnlichen Mechanismus dafür, wie zwei Moleküle auf einzigartige Weise miteinander interagieren können. 1948 erklärte er, warum Komplementarität für die Art und Weise, wie ein Gen eine Kopie von sich selbst erstellt, relevant sein könnte, und deutete tatsächlich das große Konzept hinter der DNA-Doppelhelix an:

„Besteht die als Vorlage dienende Struktur (das Gen oder das Virusmolekül) beispielsweise aus zwei Teilen, die ihrerseits komplementär aufgebaut sind, dann kann jeder dieser Teile als Form für die Herstellung einer Nachbildung des anderen dienen“ Teil, und der Komplex aus zwei komplementären Teilen kann somit als Form für die Herstellung von Duplikaten seiner selbst dienen."

Jim Watson und Francis Crick: Die Underdogs

Watson und Crick, unbekannte junge Wissenschaftler, die am Cavendish Laboratory in Cambridge, England, arbeiteten, verfügten über sich ergänzende Fähigkeiten und Persönlichkeiten, die es ihnen ermöglichten, das Modell der Doppelhelix zu entwickeln.

Jim Watson: Watson studierte zunächst Ornithologie als Bachelor an der University of Chicago und interessierte sich später für Genetik. Von Caltech und Harvard für die Graduiertenschule abgelehnt, landete Watson in U. Indiana bei dem hervorragenden Bakteriengenetiker Salvador Luria (Luria wird in der Koshland-Erzählung über Mutationen vorgestellt). Nach seinem Ph.D. Im Alter von 22 Jahren ging Watson nach Europa, um in Dänemark als Postdoc zu studieren. Als Watson sah, wie Maurice Wilkins (unten besprochen) seine Röntgenarbeit über DNA auf einem wissenschaftlichen Treffen vorstellte, entschied Watson, dass die Untersuchung der DNA-Struktur mit Wilkins spannender wäre als seine aktuelle Arbeit in Kopenhagen. Wilkins lud Watson jedoch nicht ein, seiner Gruppe beizutreten . Watson bewarb sich dann beim Cavendish Laboratory in Cambridge, einem führenden Zentrum für Röntgenstudien. Er kam im Oktober 1951, damals 23 Jahre alt, in Cambridge an, wo er Francis Crick kennenlernte. Bei ihrem ersten Treffen zeigten beide großes Interesse an der DNA und beschlossen, gemeinsam daran zu arbeiten, obwohl dies nicht die primäre Aufgabe war, die ihnen zugewiesen wurde.

Francis Crick: Crick begann zunächst Ph.D. Studium der Physik am University College London, seine Arbeit wurde jedoch unterbrochen, als seine Abteilung zu Beginn des Zweiten Weltkriegs nach Wales evakuiert werden musste. Crick schloss sich dann den Kriegsanstrengungen an und entwarf Marineminen. Nach Kriegsende kehrte Crick zur Wissenschaft zurück, interessierte sich jedoch dafür, wie Physik auf die Biologie angewendet werden könnte (siehe auch die Geschichte von Luria und Delbruck, zwei ausgebildeten Physikern, die sich in der Erzählung von Koshland der Biologie zuwandten). Crick trat dann 1949 in das Cavendish Laboratory ein, um dort zu promovieren. Ausbildung. Als sich Watson und Crick 1951 trafen, war Crick 12 Jahre älter als Watson, aber weiter hinten in seiner Ausbildung, da er noch ein Doktorand war, während Watson Postdoc war. Crick ist zwar für seinen enormen Intellekt bekannt, kann aber auch laut, dreist und manchmal für die leitenden Wissenschaftler ärgerlich sein. Um sich von Crick zu erholen, brachten die leitenden Wissenschaftler des Cavendish Laboratory Crick und den neuen Rekruten Watson in ihr eigenes Zimmer. Wäre das Doppelhelix-Modell entstanden, wenn Watson und Crick in getrennten Räumen arbeiten würden? Man kann nicht sagen, aber sicher, ihre Nähe ermöglichte eine ständige Diskussion, die ein wesentlicher Bestandteil ihres Erfolgs war.

Rosalind Franklin und Maurice Wilkins: Die Experimentalisten, die die Daten bekamen

Die Informationen aus der Röntgenaufnahme von Florence Bell (die zuvor in Hinweis 2 beschrieben wurde) reichten nicht aus, um die DNA-Struktur zu bestimmen. Eine nächste Generation von Röntgenkristallographen stellte sich der Herausforderung – Maurice Wilkins und Rosalind Franklin vom King’s College in London.

Maurice Wilkins: Wilkins wurde wie Crick ursprünglich als Physiker ausgebildet (erhielt seinen Ph.D. 1940) und half den britischen und US-amerikanischen Kriegsanstrengungen im Zweiten Weltkrieg. Wilkins trat dann einer neuen Biophysik-Einheit am King’s College London bei und begann mit Röntgenuntersuchungen der DNA. 1950 erhielt er anständige Röntgenaufnahmen von DNA, die Watson ein Jahr später sah. Wilkins unterhielt zwischen 1951 und 1953 eine enge Kommunikation mit Watson und Crick. Watson und Crick luden Wilkins ein, ihr DNA-Strukturpapier mitzuverfassen, aber Wilkins lehnte das Angebot ab und veröffentlichte seine eigene Röntgenarbeit. Wilkins' laufende Arbeit an der DNA trug dazu bei, das Doppelhelix-Modell zu festigen, mit dem er 1962 zusammen mit Watson und Crick den Nobelpreis erhielt.

Rosalind Franklin: Franklin wurde in London geboren und besuchte die Cambridge University. Ursprünglich als Physikochemikerin ausgebildet, arbeitete sie als Postdoktorandin in Paris, wo sie eine versierte Röntgenkristallographin wurde. Franklin erhielt ein dreijähriges Stipendium, um am King’s College London an Proteinen zu arbeiten. John Randall, der Direktor des King's College, beauftragte sie jedoch, an der DNA zu arbeiten. Schlechte Kommunikation zwischen Randall, Wilkins und Franklin führte zu einer erbitterten Beziehung zwischen Franklin und Wilkins. Wilkins dachte, dass Franklin beauftragt wurde, mit ihm zu arbeiten, und Franklin dachte, dass sie unabhängig arbeiten dürfte. Wir werden auf diesen Punkt in den Schlussgedanken zurückkommen.

Die Ansätze: Experimentalisten und Modellierer

Die Experimentalisten: Maurice Wilkins und Rosalind Franklin

Franklin und Wilkins suchten einen direkten Ansatz zur Lösung der DNA-Struktur mithilfe von Röntgendaten. Das Muster der Flecken auf dem Röntgenbild liefert Informationen, die im Prinzip dazu verwendet werden könnten, ein 3D-Bild des DNA-Moleküls zu rekonstruieren.

Wie verwendet man Röntgenstrahlen, um ein Bild der DNA zu erzeugen? Eine Kamera verwendet sichtbares Licht und Linsen, um Bilder der makroskopischen Welt nachzubilden. Ein Mikroskop verwendet die gleichen Prinzipien, mit einer stärkeren Linse, um Bilder der mikroskopischen Welt der Zellen zu machen. Die kleinere atomare Welt kann jedoch nicht mit sichtbarem Licht visualisiert werden. Stattdessen ist die kürzere Wellenlänge der Röntgenstrahlung (∼0,1 nm im Vergleich zu 400–700 Nanometer für sichtbares Licht) gut an die Dimensionen von Atomen angepasst. Da es jedoch nicht möglich ist, Linsen herzustellen, die Röntgenstrahlen fokussieren, können mit Röntgenstrahlen keine direkten Bilder von Atomen erzeugt werden. Unfokussierte Röntgenstrahlen, die von der Probe gestreut werden, können jedoch auf einem Film eingefangen werden, wodurch ein Muster von Punkten oder Linien erzeugt wird, das als Beugungsmuster bezeichnet wird. Das Beugungsmuster enthält Informationen über die 3D-Anordnung von Atomen in einer Probe. Eine mathematische Behandlung (Fourier-Transformation) des Beugungsmusters kann ein Bild nachbilden und damit eine vergleichbare Funktion wie eine Linse erfüllen.

Die Verwendung von Röntgenbeugungsinformationen zur Rekonstruktion eines detaillierten 3D-Modells von Atomen in einem Molekül ist heute sehr verbreitet (wenn man das Molekül dazu bringen kann, einen wohlgeordneten Kristall oder eine geordnete Faser zu bilden).Zur Zeit von Bell, Wilkins und Franklin steckte diese Methode jedoch noch in den Kinderschuhen, eine so komplexe Struktur eines biologischen Moleküls wie ein Protein oder eine DNA war zu diesem Zeitpunkt noch nicht gelöst. Erschwerend kommt hinzu, dass die mathematische Rekonstruktion eines Bildes in den 1950er Jahren noch von Hand berechnet werden musste, während heute leistungsstarke Computer diese Aufgaben übernehmen.

Die Modellierer: Watson und Crick und separat Pauling

Watson und Crick wollten die Struktur der DNA bestimmen, aber ohne die langsame und harte Arbeit, sie durch eine Rekonstruktion von Röntgendaten zu lösen. Außerdem war ihnen bewusst, dass Wilkins und Franklin vom King's College diesen Weg eingeschlagen hatten, und es schien keinen Sinn zu machen, ihre Bemühungen zu wiederholen. Vor allem Watson war ungeduldig und wollte das Rätsel so schnell wie möglich lösen. Also wandten sich Watson und Crick dem Modellbau zu. Allerdings nahmen andere Projekte die meiste Zeit in Anspruch, und sie wandten sich sporadisch dem DNA-Modellbau zu.

Das Erstellen eines Modells ist ein Prozess der Deduktion, der auf einer begrenzten Menge bekannter Informationen basiert. Es ist ein bisschen wie ein Spiel, ähnlich wie "Name That Tune". Einen Song zu identifizieren, nachdem man eine Minute lang Musik gehört hat, kann relativ einfach sein. Aber es kann schwer sein, aus 2 oder 3 Noten zu erraten. Die Arbeit von Florence Bell generierte zwei Informationen: (1) den Abstand zwischen den Basen und (2) die Breite des DNA-Moleküls. Aber das waren nicht genug Informationen, um ein korrektes Modell zu erstellen. Man brauchte mehr Informationen, aber wie viel mehr? Die Modellerstellung hängt auch stark von guten Daten ab. Falsche Daten sind irreführend und führen zu einem falschen Modell.

Linus Pauling war der Inbegriff des Modellbauers. Paulings Fähigkeit, die Struktur des Proteins Alpha-Helix durch Intuition und Regeln der Chemie abzuleiten, inspirierte Watson und Crick. Watson erzählt:

„Mir wurde bald beigebracht, dass Paulings Leistung ein Produkt des gesunden Menschenverstandes war und nicht das Ergebnis komplizierter mathematischer Überlegungen. Gelegentlich schlichen sich Gleichungen in seine Argumentation ein, aber in den meisten Fällen hätten Worte ausgereicht. Der Schlüssel zu Linus' Erfolg war sein Vertrauen auf die einfachen Gesetze der Strukturchemie.Die Alpha-Helix war nicht nur durch das Anstarren von Röntgenbildern gefunden worden, sondern der wesentliche Trick bestand darin, zu fragen, welche Atome gerne nebeneinander sitzen Hauptarbeitswerkzeug war ein Satz molekularer Modelle, der oberflächlich dem Spielzeug von Vorschulkindern ähnelte. Wir sahen daher keinen Grund, warum wir die DNA nicht auf die gleiche Weise lösen sollten. Wir mussten nur einen Satz molekularer Modelle konstruieren und anfangen zu spielen - mit Glück wäre die Struktur eine Helix. Jede andere Art von Konfiguration wäre viel komplizierter."

Am achten Tag der Schöpfung (siehe Referenzliste)

Ein Modell ist keine Tatsache, es ist eine Hypothese dafür, wie etwas funktioniert, das hinterfragt und getestet werden muss. Manchmal verlieben sich Wissenschaftler in schöne Modelle, die falsch sind. Wie kommen Wissenschaftler zu dem Schluss, dass ein Modell richtig ist? Dies ist oft eine schwierige Frage, da mehrere Modelle mit verfügbaren experimentellen Daten übereinstimmen können, insbesondere wenn die Daten begrenzt sind. Ein gutes Modell macht jedoch neue Vorhersagen, die neue Experimente leiten, die weiter testen, ob ein Modell richtig ist oder zwischen konkurrierenden Modellen unterscheidet.

Bevor wir untersuchen, wie Watson und Crick zu ihrem triumphalen Moment kamen, wollen wir uns die Auswahlmöglichkeiten ansehen, die bei der Umwandlung der chemischen 2D-Struktur der DNA in eine dreidimensionale Struktur erforderlich sind:

1) Wie viele DNA-Ketten sind in einem biologischen DNA-Molekül vorhanden? Ist es eins, zwei, drei oder mehr?

2) Wenn mehr als eine, wie sind die Ketten ausgerichtet? Laufen sie in die gleiche oder in entgegengesetzte Richtungen?

3) Wenn mehr als eine Kette, wie interagieren sie miteinander? Interagieren die Ketten flächig oder drehen sie sich umeinander? Wenn verdreht, in welche Richtung verläuft die Drehung und über welche Entfernung macht die Drehung eine vollständige Drehung?

4) Wenn mehr als eine Kette, sind die Phosphate innen und die Basen außen? Oder umgekehrt?

Die begrenzte Anzahl von Parametern bei der Konstruktion eines 3D-Modells lässt dies wie ein leicht zu lösendes Rätsel erscheinen. Dass DNA eine Doppelhelix ist, sieht jedoch erst im Nachhinein klar aus. Watson/Crick und Pauling bevorzugten zuerst die falschen Entscheidungen, bevor die richtige Lösung gefunden wurde. Die DNA-Geschichte zeigt, dass es schwierig ist, die richtige Lösung für ein unbekanntes Problem zu finden. Wissenschaftler suchen in der Regel nicht sofort die richtige Antwort, sondern gelangen durch einen iterativen Prozess dorthin.

Watson und Crick produzierten ihr erstes Modell im November 1951, kurz nachdem Watson von den Wissenschaftlern des King’s College eine Präsentation über die Röntgenarbeit an DNA gehört hatte. Das erste Watson-Crick-Modell bestand aus drei DNA-Strängen, die in einer Tripelhelix gewickelt waren, wobei die Phosphate in der Mitte und die Basen nach außen zeigten. Diese Idee war damals erfreulich. Wenn die Basen, der interessanteste und variabelste Teil der DNA, außen platziert würden, könnten sie leichter mit Proteinen interagieren.

Watson und Crick präsentierten Wilkins und Franklin ihr Drei-Helix-Modell. Es war verfrüht. Watson verdaute die von Franklin vorgelegten Röntgeninformationen nicht vollständig, was zu Fehlern in ihrem Modell führte. Franklin machte sofort auf diese Fehler aufmerksam, einschließlich der Phosphate in der Mitte. Es war ein demütigender Moment, nicht nur für Watson und Crick, sondern für das Cavendish Laboratory insgesamt. Der Direktor des Cavendish Laboratory, Sir Lawrence Bragg, verbot Watson und Crick die Arbeit an DNA und deutete an, dass sie die DNA-Struktur dem King’s College überlassen sollten, um sie zu lösen. Es gab eine lange Pause (über ein Jahr), bevor Watson und Crick wieder ernsthaft an der DNA arbeiteten.

Inzwischen war Linus Pauling am Caltech mit dem DNA-Modellbau beschäftigt. Watson und Crick waren mit Linus' Sohn Peter Pauling befreundet, der zu dieser Zeit in Cambridge studierte. Ende Januar 1953 erstellte Linus Pauling schließlich ein Manuskript, in dem sein DNA-Modell beschrieben wurde, das Watson und Crick über Peter sahen.

Paulings Modell (das im Februar 1953 im Druck erschien) hatte den gleichen Fehler wie das erste Modell von Watson und Crick. Auch sie war eine dreisträngige Helix mit den Phosphaten im Zentrum (Abbildung 9).

Abbildung 9 Linus Paulings falsche DNA-Struktur, die die Phosphate im Zentrum einer dreisträngigen Helix positioniert. Neu gezeichnet mit Modifikationen von Paulings Aufsatz von 1953 (siehe Referenzliste).

Warum hat Pauling, der Held der Protein-Alpha-Helix 2 Jahre zuvor, die falsche DNA-Struktur gefunden? Pauling hatte keinen Zugang zu dem informativen DNA-Foto von Rosalind Franklin, auf das weiter unten eingegangen wird. Aber sein Modell widersprach auch der bekannten Chemie, wie den anziehenden und abstoßenden Kräften zwischen Atomen (die negativ geladenen Phosphate in der Mitte zu platzieren würde die Ketten abstoßen und nicht zusammenhalten). Sein Modell beinhaltete auch nicht seine eigene (vorher beschriebene) Idee über Gene mit komplementären Hälften.

Einige spekulieren, dass Pauling das Gefühl hatte, in einem Rennen um die DNA-Struktur zu sein und schnell etwas herausbringen musste. Eine plausiblere Erklärung war jedoch, dass die DNA für Pauling keine große Priorität hatte. Pauling hätte vielleicht gedacht, dass die DNA eine weitere biologische Helix wäre, die vielleicht aus struktureller Sicht interessant ist, aber keine Struktur, die das "Geheimnis des Lebens" entschlüsseln würde. Matt Meselson (Autor des Key Experiment of How DNA Replicates) war zu dieser Zeit ein Doktorand bei Pauling und wusste nicht, dass sein Berater überhaupt an DNA arbeitete (persönliche Kommunikation). Pauling selbst sagte später: "Wir haben nicht sehr hart daran gearbeitet. Ich habe nicht viel Zeit in die Festlegung der Struktur investiert." (Achter Schöpfungstag siehe Referenzen). Hätte er erwartet, dass die DNA-Struktur das Rätsel der Vererbung aufdecken würde, hätte er wahrscheinlich der Lösung ihrer Struktur eine höhere Priorität eingeräumt.

Der Erfolg: Der Weg zur DNA-Doppelhelix

Mit besseren Röntgengeräten verbesserten Franklin und Wilkins die Röntgenaufnahmen der DNA gegenüber denen von Florence Bell und William Astbury. Ihre anfänglichen Fotografien waren jedoch immer noch schwer zu interpretieren. Franklin stellte dann fest, dass die Fotos verschwommen waren, weil es sich um ein Mischbild handelte, das von zwei verschiedenen DNA-Formen in der Faser erzeugt wurde. Durch kontrollierte Variation der Luftfeuchtigkeit fand sie dann Bedingungen für die Herstellung reiner Fasern aus den beiden DNA-Formen, die sie "A-Form" und "B-Form" nannte. Dieser experimentelle Fortschritt von Franklin war ein wichtiger Beitrag und ein wichtiger Wendepunkt in der Geschichte.

Am 2. Mai 1952 entwickelten Franklin und ihr Doktorand Raymond Gosling das Foto 51, eine >60-stündige Röntgenaufnahme der DNA-B-Form, die ein Muster kurzer Linien zeigte, die ein "X" bildeten (Abbildung 10). Ein ganzes Theaterstück (Foto 51) wurde auf dieses Bild geschrieben, eines der berühmtesten in der Biologie.

Abbildung 10 Foto 51 von Rosalind Franklin. Siehe Dig Deeper 3 für die in diesem Röntgenbeugungsmuster enthaltenen Informationen.

Foto 51 erzeugte jedoch keinen Heureka-Moment, seine Hinweise waren zu diesem Zeitpunkt nicht leicht zu erkennen. Franklin beschloss, sich auf die A-Form der DNA zu konzentrieren, die ihrer Meinung nach informationsreicher war und eine direkte Lösung für die Struktur bieten könnte. Da er bei der A-Form keine großen Fortschritte erzielen konnte, kehrte Franklin 1953 zur Analyse der einfacheren B-Form zurück, ungefähr zur gleichen Zeit, als Watson und Crick ihren Sprint zur unten beschriebenen Doppelhelix begannen.

Der „magische Monat“ der Doppelhelix begann am 30. Januar 1953. An diesem Tag fuhr Jim Watson mit dem Zug zum King’s College, um Wilkins und Franklin die Nachricht von Paulings falschem DNA-Manuskript mitzuteilen. Bei diesem Besuch zeigte Wilkins Watson das Foto 51, ohne zu wissen, dass diese Informationen für Watson interpretierbar waren. Watson, der vor Aufregung explodierte, eilte zurück nach Cambridge, um die Nachricht von dem zu teilen, was er gesehen hatte, ein klarer Beweis dafür, dass die DNA eine Helix ist. Watson überzeugte Bragg, den Direktor des Cavendish Laboratory, einen erneuten Versuch der DNA-Modellierung zuzulassen. Sie dachten, dass Pauling bald die Fehler in seinem DNA-Modell erkennen und möglicherweise die richtige Struktur herausfinden würde. Watson und Crick waren am 1. Februar 1953 wieder in der DNA-Geschäftsmodellierung tätig. Zu diesem Zeitpunkt wussten sie, dass DNA eine Helix ist, aber möglicherweise noch weit von einer vollständigen Lösung entfernt. Bemerkenswerterweise kamen sie vier Wochen später zu einem erfolgreichen Modell. Am 28. Februar verkündete Crick der Legende nach im Eagle Pub, er und Watson hätten "das Geheimnis des Lebens" entdeckt. Die wichtigsten Ereignisse in der DNA-Doppelhelix-Geschichte sind in der Zeitleiste in Abbildung 11 dargestellt.

Abbildung 11 Zeitleiste der Ereignisse, die zum Modell der Doppelhelix führten.

Drei bedeutende Puzzleteile kamen zusammen, um das endgültige Modell zu erstellen.

Puzzleteil 1: DNA ist eine Doppelhelix

Nach dem ersten gescheiterten Versuch eines DNA-Modells kehrte Crick zur Röntgenkristallographie von Proteinen zurück, insbesondere von Keratin, dem Hauptprotein des Haares. Keratin besteht aus Helices von Polypeptidketten. Crick, Cochran und Vand entwickelten eine Theorie dafür, wie das Röntgenmuster einer Helix aussehen sollte.

Watson, ein ausgebildeter Bakteriengenetiker, weder Physiker noch Kristallograph, lernte Röntgenbeugung von Crick und anderen in Cavendish. Dank Cricks Arbeit über helikale Strukturen und durch ihre ständigen Diskussionen verstand Watson, dass ein X-förmiges Muster von Flecken in einem Röntgenbild eine helikale Struktur bedeutet. Mit diesem Wissen ausgestattet, wusste Watson sofort, dass die DNA eine Helix ist, als er am 30. Januar am King’s College Foto 51 sah.

Die regelmäßig beabstandeten Linien, die das X-förmige Muster von Fotografie 51 bilden, lieferten Watson auch eine weitere wichtige Information: den Wiederholungsabstand der Helix (34 Å siehe Dig Deeper 3 ). Dies ist der Abstand, in dem sich die DNA-Kette umdreht und entlang der Achse zum gleichen relativen Punkt kommt (Abbildung 12). Watson und Crick kannten nun drei kritische numerische Parameter für die Erstellung eines 3D-Modells – den Wiederholungsabstand der Helix (34 ), die Breite des Moleküls (20 Å) und den Leiterabstand zwischen den Basen (3,4 ).

Watson kehrte schnell zum Modellbau zurück. Aufgrund seiner Untersuchung von Foto 51 wusste Watson jedoch nicht, ob die helikale Struktur der DNA aus einer, zwei oder drei Ketten bestand. Er vermutete, dass es sich um zwei Ketten handelte, die in dieselbe Richtung ausgerichtet waren. Sein Modell funktionierte jedoch nicht. Vielleicht stimmte etwas nicht.

Abbildung 12 Basierend auf seiner Untersuchung von Franklins Foto 51 schloss Watson, dass die DNA eine Art helikale Struktur mit einem Wiederholungsabstand von 34 war. Er wusste nicht, wie viele Stränge sich in der helikalen Struktur befanden, vermutete jedoch zunächst, dass es sich um zwei Stränge handelte, die in die gleiche Richtung orientiert waren.

Puzzleteil 2: DNA besteht aus zwei Strängen, die in entgegengesetzte Richtungen verlaufen

Da Watson in seiner Modellierung feststeckte, war es Crick, der die nächste kritische Erkenntnis lieferte. Die Führungsgruppe der Cavendish Laboratories erhielt einen Fortschrittsbericht vom King's College, der Crick zur Verfügung stand. Die Informationen waren zuvor öffentlich präsentiert worden und erschienen auf den ersten Blick möglicherweise nicht sehr nützlich. Crick griff jedoch einen Satz auf, der die DNA der A-Form als "gesichtszentriert monoklin" beschreibt. Dieses technische Detail lieferte Informationen über die Symmetrie von Molekülen in der DNA-Faser. Crick erkannte, was Wilkins und Franklin zu diesem Zeitpunkt nicht wussten, dass diese Symmetrie bedeutete, dass die DNA aus zwei identischen Teilen zusammengesetzt war, von denen einer zum anderen passte, aber in umgekehrter Ausrichtung. Crick folgerte, dass DNA aus zwei Strängen bestehen muss, die in entgegengesetzte Richtungen ausgerichtet sind ( 13 ). Indem Watson und Crick extrapolierten, dass die Symmetrie der A-Form-DNA auch für die B-Form-DNA gilt, waren Watson und Crick nun zuversichtlich, dass die DNA eine Doppelhelix ist und kannten nun die Orientierung der Stränge.

Abbildung 13 Crick entnimmt den Röntgendaten, dass DNA eine Doppelhelix ist, die aus zwei Strängen besteht, die in entgegengesetzte Richtungen ausgerichtet sind.

Frage des Entdeckers: Sie bauen ein Wendeltreppenmodell der DNA-Doppelhelix mit einem Wiederholungsabstand von 34 . Bei einer Wendeltreppe sind die Stufen in einem bestimmten Winkel versetzt. Welchen Winkel würden Sie zwischen den Basen in Ihrem DNA-Modell einführen? (Hinweis: Verwenden Sie Informationen von Florence Bell über den Abstand zwischen den Basen sowie den Wiederholungsabstand, der aus Foto 51 von Rosalind Franklin ersichtlich ist).

Antworten: Eine vollständige Umdrehung der Doppelhelix beträgt 34 ​​Å. Der Abstand zwischen den Basen beträgt 3,4 . Daher machen zehn Basen eine vollständige Drehung der Helix. Der Winkelversatz zwischen zwei benachbarten Basen wäre

36° (360° (eine komplette Drehung)/10 Basen).

Puzzleteil 3: Komplementäre Basispaarung hält die beiden Stränge zusammen

Die Röntgendaten der DNA der A- und B-Form zeigten eine Doppelhelix mit einem Wiederholungsabstand von 34 Å und die Stränge verlaufen in entgegengesetzte Richtungen. Doch Watson und Crick fehlten weitere Details. Wo sind die Basen? Was hält die beiden Stränge zusammen?

Watsons und Cricks Modell von 1951 und Paulings Modell von 1953 stellten beide die Phosphate in den Mittelpunkt. Von Franklin auf die Probleme mit dieser Ausrichtung aufmerksam gemacht, begannen Watson und Crick nun mit dem Bau von Modellen mit den Basen in der Mitte und den Phosphaten außen.

Watson begann damit, die Basen alle 3,4 zu stapeln, wie in Florence Bells Modell (Hinweis 3). Aber im Gegensatz zu Bells Modell, das aus einem Einzelstrang bestand, musste Watson nach plausiblen Wegen suchen, wie die Basen interagieren könnten, um die beiden Stränge der Doppelhelix zusammenzuhalten. Eine bekannte Anziehungskraft ist eine Wasserstoffbrücke, bei der ein Donorwasserstoff mit einem "Akzeptor" (normalerweise einem elektronegativen Atom wie Stickstoff (N) oder Sauerstoff (O)) wechselwirkt (siehe Wissensübersicht). Watson begann nach Möglichkeiten zu suchen, wie Wasserstoffbrücken zwischen Basen über die Doppelhelix gebildet werden könnten.

Um diesen Versuch zu starten, schlug Watson die chemischen Strukturen von Basen in einem angesehenen Lehrbuch nach. (Wie Sie gleich sehen werden, kann man dem, was man in einem Lehrbuch liest, nicht immer vertrauen!). Watson fand eine Lösung, die er für möglich hielt: Gleiches interagiert mit Gleichem. Bei dieser Homo-Basenpaarung (bedeutet "gleich") paart sich Adenin mit Adenin, Guanin mit Guanin, Cytosin mit Cytosin und Thymin mit Thymin ( 14 ).

Abbildung 14 Watsons Modell für die Homo-Paarung zwischen identischen Basen (ein falsches und kurzlebiges Modell). Kovalente Bindungen sind mit durchgezogenen Linien angegeben, und Wasserstoffbindungen sind mit gestrichelten Linien angegeben.

Frage des Entdeckers: Bietet das Homo-Basenpaarungsmodell der DNA eine Lösung dafür, wie ein Gen repliziert werden könnte?

Antworten: Jawohl. Die Homo-Paarung von Basen ist eine Form der Komplementarität und stellt eine einfache Regel dar, wie ein neuer DNA-Strang von einem bereits existierenden Strang kopiert werden könnte. In diesem Modell würden die beiden Stränge aus identischen Buchstabenfolgen bestehen.

Frage des Entdeckers: Können Sie sich ein Problem mit diesem Homo-Basenpaarungsmodell vorstellen?

Antworten: Das Modell hat ein großes Problem, eine Doppelhelix mit konstantem Durchmesser zu erzeugen. Die Purinpaarungen (G-G und A-A) sind breiter (da es sich um Doppelringe handelt) als die Pyrimidinpaarungen (T-T und C-C) (Einzelringbasen), was zu einer Variation der Molekülbreite führt.

Frage des Entdeckers: Stimmt das Modell der Homo-Basenpaarung mit den Daten von Chargaff überein?

Antworten: Nein. Das Homo-Basenpaarungsmodell liefert keine Erklärung dafür, warum das Verhältnis von G zu C und A zu T beide gleich 1 ist.

Watson war vom Homo-Basenpaarungsmodell begeistert, weil es eine einfache Regel für die Replikation eines Gens lieferte. Es gab jedoch Probleme mit dem Modell, wie oben in den Explorer-Fragen besprochen.

Dann geschah ein weiteres zufälliges Ereignis im magischen Monat. Jerry Donohue, ein Experte in der Chemie von Nukleotidbasen, besuchte das Cavendish Laboratory und wurde beauftragt, im selben Raum wie Watson und Crick zu arbeiten. Als Watson sein Homo-Basenpaarungsmodell vorstellte, sagte Donohue ihm, dass die chemischen Strukturen des "Lehrbuchs" für Guanin und Thymin wahrscheinlich falsch seien. Nukleotidbasen können zwei leicht unterschiedliche chemische Strukturen annehmen, sogenannte Tautomere, die den gleichen Satz von Atomen enthalten, sich jedoch in der Position eines einzelnen Wasserstoffatoms unterscheiden. Obwohl dieser Unterschied gering ist, ist er sehr wichtig, um den richtigen Satz von Wasserstoffbrücken zwischen den Basen herauszufinden. Donohue sagte, dass die in Watsons Homo-Basen-Paarungsmodell verwendeten Guanin- und Thymin-Tautomere wahrscheinlich falsch waren. Wenn man eine falsche Idee oder ein falsches Modell hat, kann man es am besten schnell verwerfen. Watsons Modell wurde innerhalb von 2 Tagen entwirrt.

Unter Verwendung der von Donohue beschriebenen korrekten Grundstrukturen begann Watson am 28. Februar 1953 mit dem Bau neuer Modelle. Er begann mit Pappstücken zu spielen, die in den Formen der vier Grundkörper ausgeschnitten waren, und suchte nach Wegen, wie sie interagieren konnten.Dann kam der "Heureka-Moment" in der DNA-Doppelhelix-Geschichte, wie er viele Jahre später von Jim Watson in diesem kurzen Video (Video 3) nachgestellt wurde. Noch am selben Tag genossen Watson und Crick ein feierliches Pint im Eagle Pub, bei dem sie einer biertrinkenden Kundschaft, die die historische Bedeutung des Augenblicks vielleicht nicht ganz verstanden hatte, das "Geheimnis des Lebens" verkündeten.

Video 3 Jim Watson erinnert sich, wie er auf die richtige Basenpaarung in der DNA kam. Dieser Videoclip wurde von einem längeren Video über die Doppelhelix von HHMI Biointeractive abgeleitet. https://www.biointeractive.org/classroom-resources/double-helix

Was Watson am 28. Februar 1953 entdeckte, waren einige sehr einfache Basenpaarungsregeln. Guanin (die von Donohue aufgezeigte tautomere Struktur) bildete mit Cytosin passende Wasserstoffbrückenbindungen. Unter Verwendung der korrekten Struktur für Thymin sah Watson auch, dass Adenin und Thymin ein perfektes Wasserstoffbrückenpaar bildeten. Watson und Crick erkannten, dass die G-C- und A-T-Wasserstoffbrücken der Schlüsselbestandteil sind, der benötigt wird, um die Doppelhelix zusammenzuhalten (Abbildung 15).

Abbildung 15 Die Basenpaare Adenin mit Thymin und Guanin mit Cytosin halten die Doppelhelix zusammen. Die gestrichelten Linien stellen Wasserstoffbrücken dar, die sich zwischen diesen Basen bilden. Das Phosphat-Zucker-Rückgrat ist violett gefärbt.

Frage des Entdeckers: Bietet das neue G-C- und A-T-Basenpaarungsmodell eine Lösung dafür, wie ein Gen repliziert werden könnte?

Antworten: Jawohl. Wie das Homo-Pairing-Modell bietet dies eine einfache Regel zum Erzeugen eines neu replizierten Strangs aus einem Template-Strang. Wenn der Elternstrang ein G hat, muss der replizierende Partnerstrang ihm ein C gegenüberstellen.

Frage des Entdeckers: Warum war das A-T- und G-C-Paarungsmodell eine bessere strukturelle Lösung als das Homo-Paarungsmodell?

Antworten: Die beiden Purin-Pyrimidin-Paare (G-C und A-T) sind gleich breit. Unabhängig von der Reihenfolge der Nukleotide in der DNA bleibt die Breite der Doppelhelix konstant.

Frage des Entdeckers: Stimmt das A-T- und G-C-Basenpaarungsmodell mit den Daten von Chargaff überein?

Antworten: Jawohl. In diesem Modell gibt es eine strukturelle Erklärung dafür, warum das Verhältnis von G zu C und A zu T gleich 1 ist. Watson und Crick haben die Chargaff-Daten jedoch ursprünglich nicht in das Modell eingearbeitet, wie Crick in The Eighth Day . erklärt der Schöpfung: "Das Paradoxe an der ganzen Sache ist, dass wir beim Bauen die Idee zunächst nicht verwendet haben. Wir haben es nicht gemacht, bis wir darauf getrieben wurden. … Und ich kann mich an den Moment erinnern, als wir das erkannten, von Gott, wir könnten eine Struktur aufbauen, in der sich die Basen ergänzen. Und so erklären wir Chargaffs Eins-zu-Eins-Verhältnisse."

Heute bauen Wissenschaftler mit Computern molekulare Modelle. In den Tagen vor dem Computer bauten Watson und Crick jedoch ein physisches Modell, ähnlich wie beim Bau eines Modellflugzeugs. Die Maschinenwerkstatt im Cavendish Laboratory schneidet Zinnplatten in die Form von Sockeln, die ihren relativen Abmessungen entsprechen, aber 300.000.000-fach größer als das Leben sind. Watson und Crick befestigten die Basen auf einem Rückgrat aus Metallzucker und -phosphaten und schufen so eine verdrehte Skulptur. Es war ein Modell der atomaren biologischen Welt, das sich der menschliche Geist ausgedacht hatte. Die Metalldoppelhelix war schön, aber ihre Form war nicht der entscheidende Durchbruch. Vielmehr war es die starke Idee der Komplementarität (die Paarung A-T und G-C). Pauling und andere dachten, dass Komplementarität einen Mechanismus zum Kopieren eines Gens bereitstellen könnte. Im Watson- und Crick-Modell lieferte die Komplementarität nun eine physikalische Erklärung dafür, wie die beiden Stränge in der DNA-Doppelhelix zusammengehalten wurden. Darüber hinaus lieferte es eine mögliche Erklärung für die Replikation von Genen, die in den nächsten Abschnitten Was als nächstes geschah und der Wissensüberblick diskutiert werden. Bell, Astbury, Watson, Crick, Pauling, Wilkins und Franklin konnten sich zu Beginn ihrer Studien nicht vorstellen, dass aus der Struktur der DNA ein klares Verständnis der Genreplikation hervorgehen würde. Die Tatsache, dass eine einfache Erklärung auftauchte, machte das Doppelhelix-Modell jedoch umso glaubwürdiger. Wie Watson sagte,

„Es gab viel zu viele Tage, an denen Francis und ich befürchteten, die DNA-Struktur könnte sich oberflächlich als sehr stumpf herausstellen, was nichts über ihre Replikation oder ihre Funktion bei der Kontrolle der Zellbiochemie aussagte Die Antwort stellte sich als äußerst interessant heraus." In The Double Helix (siehe Referenzen).

Viele Leser dieser Erzählung kennen wahrscheinlich das Spiel "Clue". In diesem Spiel sammeln die Spieler Hinweise, bis ein Spieler das Gefühl hat, genug Hinweise gesammelt zu haben, um eine Lösung des Verbrechens anzukündigen: "Es war Mr. Green, der den Mord mit einem Seil in der Bibliothek begangen hat." Nach der Ankündigung wartet der Spieler gespannt, ob seine Lösung von einem der anderen Spieler widerlegt werden kann.

Watson und Crick kündigten 1951 ihr erstes Modell einer DNA-Struktur an. Es war zu früh, sie hatten nicht genügend Hinweise gesammelt, und sie waren zumindest vorübergehend aus dem Spiel. Nun waren Watson und Crick bereit, ihr neues Modell anzukündigen und zu sehen, ob es jemand abschießen könnte: DNA ist eine Doppelhelix mit G-C- und A-T-Basenpaaren in der Mitte. Sie präsentierten es Donohue und dem Nukleotidexperten Alexander Todd (siehe Hinweis 1), die beide aus chemischer Sicht keinen Fehler finden konnten. Sie riefen Lawrence Bragg, den Leiter des Cavendish Laboratory, hinzu, der aus struktureller Sicht keine Einwände erheben konnte. Dann war es an der Zeit, Wilkins und Franklin nach Cambridge einzuladen, um ihr Modell zu sehen. Franklin und Wilkins wussten sofort, dass das Watson- und Crick-Modell mit ihren Daten übereinstimmte und daher wahrscheinlich, wenn auch nicht sicher, richtig war.

Was als nächstes geschah?

Ein Manuskript zum Doppelhelix-Modell wurde von Watson und Crick bei Nature eingereicht. Ein Münzwurf entschied die Reihenfolge der Autoren auf dem Papier. (Wir könnten es das Crick- und Watson-Modell nennen, wenn die Münze anders gelandet wäre.) Franklin und Wilkins erstellten separate Papiere über die Röntgendaten, die zu einem ähnlichen Zeitpunkt an Nature übermittelt wurden. Alle drei Papiere wurden zusammen am 25. April 1953 veröffentlicht.

Das Papier von Watson und Crick über die Modell-DNA-Struktur nahm im Wesentlichen eine einzige gedruckte Seite ein (siehe Guided Paper). Es hinterließ beim Leser diese provokative Botschaft:

"Uns ist nicht entgangen, dass die von uns postulierte spezifische Paarung sofort einen möglichen Kopiermechanismus für das genetische Material nahelegt."

Watson und Crick verzichteten in ihrer ersten Veröffentlichung auf detailliertere Überlegungen zur Replikation, da sie noch nicht alle Röntgendaten von Wilkins und Franklin gesehen hatten. Sie waren sich immer noch etwas unsicher, ob ihr Modell richtig war. Als sie jedoch die Papiere von Wilkins und Franklin sahen, wurden sie selbstbewusster. Watson und Crick veröffentlichten dann ihre provokativeren Ideen zur DNA-Replikation in einem nachfolgenden Nature-Artikel, der am 30. Mai veröffentlicht wurde. In diesem Artikel lieferten Watson und Crick weitere Informationen über die Basenpaarung. Sie postulierten jedoch nur zwei Wasserstoffbrücken für das G-C-Basenpaar, worauf Pauling später richtigerweise hinwies, dass es drei sein sollten. Auch klassische Papiere haben Unvollkommenheiten. In ihrem Replikationsmodell schlugen Watson und Crick vor, dass die Wasserstoffbrücken, die die Ketten zusammenhalten, (irgendwie) gebrochen sind und dass jeder einzelne Strang als Vorlage dient, um einen neuen komplementären Strang zu erzeugen. Dieses Modell wurde später als „semikonservative Replikation“ bezeichnet (Abbildung 16).

Abbildung 16 Semikonservative Replikation von DNA, wie von Watson und Crick vorgeschlagen. Die Doppelhelix entwirrt und jeder Elternstrang (in Lila dargestellt) dient als Vorlage für die Synthese eines neuen DNA-Strangs.

Das Modell der DNA-Helix und ihre Replikation wurden mit einer Mischung aus Begeisterung und Vorsicht aufgenommen. Pauling räumte anmutig ein, dass das Modell von Watson und Crick und nicht seines richtig war. Andere Wissenschaftler blieben skeptisch, da sie erkannten, dass die Daten der Röntgenarbeit die Details des Watson-Crick-Modells nicht vollständig unterstützen konnten. Darüber hinaus fehlten der Watson-Crick-Hypothese für die DNA-Replikation jegliche unterstützende Beweise.

Modelle müssen mit Experimenten getestet werden. Zwei 24-jährige Wissenschaftler, Matthew Meselson und Frank Stahl, stellten sich der Herausforderung. Ihr Experiment (das als "das schönste Experiment der Biologie" bezeichnet wurde) unterstützte die Hypothese von Watson und Crick der halbkonservativen Replikation und schloss konkurrierende Modelle aus (Video 4). Sie können dieses Experiment aus erster Hand von Meselson und Stahl in ihrem Schlüsselexperiment in XBio erfahren. Die Veröffentlichung von Meselson und Stahl von 1958 hatte einen erheblichen Einfluss auf das Feld. Nach diesen klaren Ergebnissen schwand die Skepsis gegenüber dem Watson- und Crick-Modell und die Akzeptanz des Doppelhelix-Modells leitete eine neue Ära der Molekularbiologie ein. Im selben Jahr wie das Meselson-Stahl-Experiment kündigte Arthur Kornberg die Entdeckung eines Enzyms namens DNA-Polymerase an, das DNA kopieren kann (besprochen in der Wissensübersicht).

Video 4 Whiteboard-Video zur Beschreibung des Meselson-Stahl-Experiments.

Interessanterweise wurde das Watson-Crick-Modell erst 1980 endgültig bewiesen, als die atomare Struktur der B-Form-DNA mit hochauflösenden Röntgendaten von einem Kristall anstelle einer Faser bestimmt wurde (später in Video 6 gezeigt). Es war das Ergebnis, von dem Rosalind Franklin träumte, aber es sollte erst 30 Jahre später passieren.

Was ist mit den Hauptfiguren nach der DNA-Doppelhelix passiert? Watson und Crick blieben Freunde, trennten sich jedoch für verschiedene wissenschaftliche Aktivitäten. Watson begann, an der Struktur der RNA zu arbeiten. Aber der Blitz schlug nicht zweimal ein. RNA hat eine komplexe und variable Struktur, und seine Bemühungen waren nicht erfolgreich. Watson leistete jedoch andere wichtige Beiträge, darunter die Mitentdeckung der Boten-RNA. Francis Crick promovierte 1954 im Alter von 37 Jahren mit einem Doktortitel und wandte sich dann der Frage zu, wie DNA als Code dient. Crick schlug das zentrale Dogma vor, das besagt, dass die Informationen der DNA unidirektional von DNA zu RNA zu Protein fließen (obwohl sich die spätere Entdeckung der reversen Transkription als Ausnahme von dieser Regel erwies). Der Code wird in der Wissensübersicht kurz besprochen, aber in einer anderen Erzählung ausführlicher behandelt.

Auch Franklin und Wilkins trennten sich. Wegen ihrer Schwierigkeiten am King's College traf Franklin im Juni 1952, nur einen Monat nach Erhalt von Foto 51, Vorkehrungen, um dem Birkbeck College beizutreten, und zog dann Mitte März 1953 um, kurz nachdem Watson und Crick ihr DNA-Modell entwickelt hatten. Als Teil dieses Übergangs wurde Franklin gebeten, ihre Arbeit am 28. Januar 1953 zusammenzufassen und dann ihre DNA-Daten an das King’s College zu übertragen. Nachdem er King's verlassen hatte, hinterließ Franklin die DNA. Sie wechselte zum Studium der Struktur von Viren, veröffentlichte 17 Artikel und leistete bahnbrechende Arbeiten auf diesem Gebiet. Wilkins arbeitete weiter an der DNA und leistete wichtige Beiträge, einschließlich der Entwicklung überzeugenderer Beweise für die Doppelhelix mithilfe von Röntgendaten und präziserer Modellbildung.

Franklin starb 1958 im Alter von 37 Jahren an Krebs, 4 Jahre bevor der Nobelpreis für die DNA-Struktur verliehen wurde. Vor ihrem Tod gab es keine Bitterkeit zwischen Franklin und Watson und Crick, im Gegenteil, sie entwickelte eine Freundschaft mit beiden und blieb sogar bei Cricks Haus in Cambridge, während sie sich von ihren Krebsbehandlungen erholte.

Die regelmäßige und einfache Struktur der DNA war viel einfacher zu lösen als die von Proteinen und RNAs, die komplexere Formen haben. Allerdings gelang es Max Perutz und John Kendrew vom Cavendish Laboratory relativ bald nach der Doppelhelix, die 3D-Struktur von Myoglobin, einem dem Hämoglobin ähnlichen sauerstofftragenden Protein aus dem Muskel, aufzuklären. Inzwischen sind über 150.000 Proteinstrukturen gelöst, die experimentelle Vorhersage der Proteinstruktur ist selbst mit modernen Supercomputern immer noch sehr schwierig. Jede dieser Proteinstrukturen erzählt eine interessante Geschichte, obwohl die DNA immer noch den Thron als die aufschlussreichste und wirkungsvollste Struktur aller Zeiten einnimmt.

Abbildung 17 fasst die wissenschaftliche Reise der DNA zusammen, beginnend mit Mendels Erbsen. Aber die Zeitleiste beginnt mindestens ein paar Milliarden Jahre früher. Damals existierte ein DNA-Molekül mit der gleichen Struktur wie heute. Diese DNA breitete sich aus und entwickelte sich, um schließlich Wesen hervorzubringen, die in der Lage waren, die Struktur des Moleküls zu entschlüsseln, das für ihre Existenz verantwortlich war.

Abbildung 17 Zeitleiste einiger der wichtigsten Fortschritte in der Genetik und DNA-Technologie.

Biologie Antworten

1. A: Alle Organismen beginnen ihr Leben als eine einzelne Zelle.
2. B: Wissenschaftler vermuten, dass die Evolution durch einen Prozess namens natürliche Selektion stattgefunden hat.
3. D: Die beiden in der Wissenschaft wichtigen Arten von Messungen sind quantitativ (wenn ein numerisches Ergebnis verwendet wird) und qualitativ (wenn Beschreibungen oder Eigenschaften angegeben werden).
4. C: Ein normales Sperma muss eines der menschlichen Chromosomenpaare enthalten. Insgesamt gibt es 23 Chromosomenpaare. Davon sind 22 autosomale Chromosomen, die bei der Geschlechtsbestimmung keine Rolle spielen. Das verbleibende Paar besteht entweder aus zwei X-Chromosomen bei einer Frau oder aus einem X- und einem Y-Chromosom bei einem Mann. Daher enthält eine normale Samenzelle 22 autosomale Chromosomen und entweder ein X- oder ein Y-Chromosom, aber nicht beides.
5. E: Alle lebenden Organismen auf der Erde verwenden den gleichen genetischen Triplett-Code, in dem eine Drei-Nukleotid-Sequenz, Codon genannt, Informationen liefert, die einer bestimmten Aminosäure entsprechen, die einem Protein hinzugefügt werden soll. Im Gegensatz dazu verwenden viele Organismen, insbesondere bestimmte Bakterienarten, keinen Sauerstoff. Diese Organismen leben in sauerstoffarmen Umgebungen und können durch Fermentation Energie produzieren. Andere Organismen können in dunklen Umgebungen leben, beispielsweise in Höhlen oder tief unter der Erde. Viele Organismen vermehren sich ungeschlechtlich durch Knospung oder Selbstbefruchtung, und nur die evolutionär am weitesten fortgeschrittenen Organismen nutzen Neurotransmitter in ihren Nervensystemen.
6. B: Durch die sexuelle Fortpflanzung können sich die genetischen Informationen zweier Elternteile vermischen. Es können Rekombinationsereignisse zwischen den beiden elterlichen Kopien einzelner Gene auftreten, die neue Gene erzeugen. Die Produktion neuer Gene und neuer Genkombinationen führt zu einer Zunahme der Diversität innerhalb der Bevölkerung, was für die Anpassung an Umweltveränderungen von Vorteil ist.
7. A: Der zweite Teil des wissenschaftlichen Namens eines Organismus ist seine Art. Das Benennungssystem für Arten wird binomiale Nomenklatur genannt. Der erste Name ist die Gattung und der zweite Name ist die Art. In der binomialen Nomenklatur ist die Art die spezifischste Bezeichnung. Dieses System ermöglicht die weltweite Verwendung des gleichen Namens, damit Wissenschaftler miteinander kommunizieren können. Gattung und Art sind nur zwei der Kategorien in der biologischen Klassifikation, auch Taxonomie genannt. Die Klassifizierungsebenen, von den allgemeinsten bis zu den spezifischsten, sind Königreich, Stamm, Klasse, Ordnung, Familie, Gattung und Art. Wie gezeigt, umfasst die binomiale Nomenklatur nur die zwei spezifischsten Kategorien.
8. D: Spaltung ist der Prozess, bei dem sich eine Bakterienzelle in zwei neue Zellen aufspaltet. Spaltung ist eine Form der ungeschlechtlichen Fortpflanzung, bei der sich ein Organismus in zwei Komponenten teilt, wobei sich jeder dieser beiden Teile zu einem eigenen Organismus entwickelt. Die beiden Zellen, auch Tochterzellen genannt, sind identisch. Die Mitose hingegen ist der Teil der eukaryontischen Zellteilung, bei dem sich der Zellkern teilt. Bei der Meiose trennen sich die homologen Chromosomen einer diploiden Zelle, wodurch die Anzahl der Chromosomen in jeder Zelle um die Hälfte reduziert wird. Bei der Replikation erzeugt eine Zelle doppelte Kopien der DNA.
9. A: Bakterienzellen enthalten keine Mitochondrien. Bakterien sind Prokaryonten, die aus einzelnen Zellen bestehen, deren Zellwände Peptidoglycane enthalten, und die normalerweise in den Mitochondrien ausgeführten Funktionen werden in der Zellmembran der Bakterienzelle ausgeführt. DNA ist die Nukleinsäure, die die genetische Information des Organismus enthält. Es ist als Doppelhelix geformt. DNA kann sich selbst reproduzieren und RNA synthetisieren. Ein Vesikel ist ein kleiner Hohlraum, der Flüssigkeit enthält. Ein Ribosom ist ein winziges Partikel aus RNA und Protein, in dem Polypeptide aufgebaut sind.


„Quadruple Helix“-DNA in menschlichen Zellen entdeckt

1953 veröffentlichten die Cambridge-Forscher Watson und Crick ein Papier, in dem die verwobene „Doppelhelix“-DNA-Struktur beschrieben wurde – der chemische Code für alles Leben.

Jetzt, im Jahr des 60-jährigen Jubiläums dieses wissenschaftlichen Meilensteins, haben Forscher aus Cambridge ein Papier veröffentlicht, das beweist, dass auch im menschlichen Genom viersträngige „Vierfachhelix“-DNA-Strukturen – bekannt als G-Quadruplexe – existieren. Sie bilden sich in DNA-Regionen, die reich an dem Baustein Guanin sind, meist abgekürzt mit „G“.

Die Ergebnisse markieren den Höhepunkt von über 10 Jahren Forschung von Wissenschaftlern, um diese komplexen Strukturen in vivo - in lebenden menschlichen Zellen - zu zeigen, die von hypothetischen über Computermodellierungen bis hin zu synthetischen Laborexperimenten und schließlich der Identifizierung in menschlichen Krebszellen mit fluoreszierenden Biomarkern arbeiten .

Die Forschung, veröffentlicht am 20. Januar in Naturchemie und finanziert von Cancer Research UK, zeigt weiterhin klare Verbindungen zwischen den Konzentrationen von viersträngigen Quadruplexen und dem Prozess der DNA-Replikation, der für die Zellteilung und -produktion entscheidend ist.

Indem man Quadruplexe mit synthetischen Molekülen anvisiert, die diese DNA-Strukturen einfangen und enthalten – wodurch die Zellen daran gehindert werden, ihre DNA zu replizieren und folglich die Zellteilung zu blockieren – glauben Wissenschaftler, dass es möglich sein könnte, die außer Kontrolle geratene Zellproliferation an der Wurzel des Krebses zu stoppen.

"Wir sehen Verbindungen zwischen dem Einfangen der Quadruplexe mit Molekülen und der Fähigkeit, die Zellteilung zu stoppen, was sehr aufregend ist", sagte Professor Shankar Balasubramanian vom Department of Chemistry der University of Cambridge und dem Cambridge Research Institute, dessen Gruppe die Forschung produzierte.

„Die Forschung zeigt, dass Quadruplexe eher in Genen von Zellen vorkommen, die sich schnell teilen, wie etwa Krebszellen. Für uns unterstützt sie nachdrücklich ein neues zu untersuchendes Paradigma – die Verwendung dieser viersträngigen Strukturen als Ziele für personalisierte Behandlungen.“ in der Zukunft."

Physikalische Studien der letzten Jahrzehnte hatten gezeigt, dass sich Quadruplex-DNA in vitro bilden kann – im „Reagenzglas“, aber die Struktur wurde eher als Kuriosität denn als in der Natur vorkommendes Merkmal angesehen. Die Forscher wissen nun erstmals, dass sie sich tatsächlich in der DNA menschlicher Zellen bilden.

„Diese Forschung unterstreicht das Potenzial für die Nutzung dieser ungewöhnlichen DNA-Strukturen zur Bekämpfung von Krebs – der nächste Teil dieser Pipeline besteht darin, herauszufinden, wie sie in Tumorzellen gezielt eingesetzt werden können“, sagte Dr. Julie Sharp, Senior Science Information Manager bei Cancer Research UK .

"Es ist sechzig Jahre her, dass seine Struktur gelöst wurde, aber Arbeiten wie diese zeigen uns, dass sich die Geschichte der DNA weiter dreht und dreht."

Die am 20. Januar veröffentlichte Studie wurde von Giulia Biffi geleitet, einer Forscherin in Balasubramaninans Labor am Cambridge Research Institute.

Aufbauend auf früherer Forschung konnte Biffi Antikörper-Proteine ​​generieren, die Bereiche in einem menschlichen Genom, die reich an Quadruplex-strukturierter DNA sind, erkennen und daran binden und so ihre Existenz in lebenden menschlichen Zellen belegen.

Mithilfe von Fluoreszenz zur Markierung der Antikörper konnten die Forscher dann „Hot Spots“ für das Vorkommen von viersträngiger DNA identifizieren – sowohl wo im Genom als auch vor allem in welchem ​​Stadium der Zellteilung.

Während Quadruplex-DNA ziemlich konsistent im gesamten Genom menschlicher Zellen und ihrer Teilungszyklen gefunden wird, wurde eine deutliche Zunahme gezeigt, wenn die Fluoreszenzfärbung während der "s-Phase" intensiver wurde - dem Punkt in einem Zellzyklus, an dem sich die DNA vor der Zelle teilt sich.

Krebs wird normalerweise von Genen namens Onkogene angetrieben, die mutiert sind, um die DNA-Replikation zu erhöhen – was dazu führt, dass die Zellproliferation außer Kontrolle gerät und zu Tumorwachstum führt.

Die erhöhte DNA-Replikationsrate in Onkogenen führt zu einer Intensität in den Quadruplex-Strukturen. Dies bedeutet, dass potenziell schädigende Zellaktivität mit synthetischen Molekülen oder anderen Behandlungsformen gezielt werden kann.

"Wir haben herausgefunden, dass wir die Quadruplex-DNA mit synthetischen Molekülen einfangen und stabilisieren können, was wichtige Erkenntnisse darüber liefert, wie wir die Zellteilung zum Stillstand bringen könnten", sagte Balasubramanian.

„Es gibt vieles, was wir noch nicht wissen. Ein Gedanke ist, dass diese Quadruplex-Strukturen während der DNA-Replikation ein bisschen lästig sein könnten – wie Knoten oder Knäuel, die sich bilden.

"Haben sie sich für eine Funktion entwickelt? Es ist eine philosophische Frage, ob sie von Natur aus da sind oder nicht - aber sie existieren und die Natur muss mit ihnen umgehen. Vielleicht tragen wir zu der Störung bei, die sie verursachen."

Die Studie zeigte, dass die Quadruplex-Spiegel sinken, wenn ein Inhibitor verwendet wird, um die DNA-Replikation zu blockieren – was die Idee beweist, dass DNA dynamisch ist, mit Strukturen, die ständig gebildet und nicht gebildet werden.

Die Forscher fanden auch zuvor heraus, dass ein überaktives Gen mit einem höheren Gehalt an Quadruplex-DNA anfälliger für externe Störungen ist.

"Die Daten unterstützen die Idee, dass bestimmte Krebsgene durch kleine Moleküle, die bestimmte DNA-Sequenzen binden sollen, nützlich gestört werden können", sagte Balasubramanian.

„Viele aktuelle Krebsbehandlungen greifen die DNA an, aber es ist nicht klar, welche Regeln gelten. Wir wissen nicht einmal, wo im Genom einige von ihnen reagieren – es kann ein Streuwaffenansatz sein.

„Die Möglichkeit, dass bestimmte Krebszellen, die Gene mit diesen Motiven beherbergen, jetzt gezielt angegriffen werden können und anfälliger für Störungen zu sein scheinen als normale Zellen, ist eine aufregende Aussicht.

„Die DNA-Struktur ‚Quadruple Helix‘ könnte der Schlüssel zu neuen Wegen sein, die Vermehrung von Krebszellen selektiv zu hemmen. Die Bestätigung ihrer Existenz in menschlichen Zellen ist ein echter Meilenstein.“


Tn7: schlauer als gedacht

Transposons – eine Klasse mobiler genetischer Elemente – sind in der Natur weit verbreitet und kommen in praktisch jedem untersuchten Organismus vor. Das bakterielle Transposon Tn7 ist wegen seiner Fähigkeit, mehrere verschiedene Arten von Zielstellen zu verwenden, von besonderem Interesse. Die hochentwickelten Zielstellen-Selektionswege von Tn7 unterstützen seine Verbreitung unter Bakterienpopulationen, indem sie Insertionen in Plasmide lenken, aber verhindern potenziell schädliche zufällige Insertionen in Bakterienchromosomen.

Die Tn7-Proteine ​​TnsA, TnsB und TnsC bilden die Kernmaschinerie für die Tn7-Transposition. TnsA und TnsB arbeiten zusammen, um die Transposase zu bilden. TnsC ist ein Regulator der Transposase-Aktivität, der zwischen der TnsAB-Transposase und den alternativen Zielstellen-Selektionsproteinen TnsD und TnsE kommuniziert.

Wenn das TnsE-Protein mit der TnsABC-Kernmaschinerie verwendet wird, steuert Tn7 bevorzugt Insertionen in konjugierbare Plasmide, die sich zwischen Zellen bewegen können. Die Interaktion zwischen TnsE und einer Struktur, die mit der Replikation des nacheilenden Strangs in Verbindung steht, ist wahrscheinlich entscheidend für die Zielerkennung in diesem Weg.

Wenn das TnsD-Protein mit der Kernmaschinerie verwendet wird, werden Insertionen an einer einzigen Stelle im Bakterienchromosom, genannt attTn7. Diese Stelle ist unter bakteriellen Chromosomen stark konserviert. TnsD erkennt spezifisch attTn7 und induziert eine Verzerrung am 5'-Ende der Bindungsstelle, die wahrscheinlich entscheidend für die Rekrutierung von TnsC ist. Footprinting-Ergebnisse zeigen, dass TnsC eine Plattform unter der Ziel-DNA bilden könnte, um die TnsAB-Transposase zu empfangen und zu aktivieren, um die Rekombination durchzuführen.

TnsC wirkt als Regulator der Tn7-Transposition durch seine Fähigkeit, sowohl mit der TnsAB-Transposase als auch mit der von TnsD oder TnsE gebundenen Ziel-DNA zu interagieren. TnsC ist auch für die Transposon-Immunität verantwortlich, ein Prozess, der das Auftreten von Insertionen in eine Ziel-DNA verhindert, wenn sich bereits eine Kopie von Tn7 in dieser DNA befindet. TnsC könnte einen dem molekularen Schalter von Ras ähnlichen Mechanismus verwenden, um die verschiedenen "ON"- und "OFF"-Signale auszugleichen, die die Transposition steuern.

Zukünftige Forschungen mit Tn7 sollten weitere Erkenntnisse darüber liefern, wie Multiprotein-Maschinen bei der Replikation, Reparatur und Rekombination auf DNA aufgebaut werden.


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