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9.1A: Entdeckung und Nachweis von Viren – Biologie

9.1A: Entdeckung und Nachweis von Viren – Biologie


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Viren sind infektiöse Partikel, die etwa 100-mal kleiner als Bakterien sind und nur durch Elektronenmikroskopie beobachtet werden können.

Lernziele

  • Beschreiben Sie, wie Viren zuerst entdeckt wurden und wie sie erkannt werden

Wichtige Punkte

  • Virionen, einzelne Viruspartikel, haben einen Durchmesser von 20–250 Nanometern.
  • In der Vergangenheit wurden Viren nach der Art der enthaltenen Nukleinsäure, DNA oder RNA, und ob sie einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäuren hatten, klassifiziert.
  • Die molekulare Analyse viraler Replikationszyklen wird heute routinemäßiger verwendet, um Viren zu klassifizieren.

Schlüsselbegriffe

  • Virus: ein submikroskopischer infektiöser Organismus, der heute als nichtzelluläre Struktur verstanden wird, die aus einem Kern aus DNA oder RNA besteht, der von einer Proteinhülle umgeben ist
  • virion: ein einzelnes einzelnes Partikel eines Virus (das virale Äquivalent einer Zelle)

Erkennung und Erkennung

Viren wurden erstmals nach der Entwicklung eines Porzellanfilters, des sogenannten Chamberland-Pasteur-Filters, entdeckt, der alle im Mikroskop sichtbaren Bakterien aus jeder flüssigen Probe entfernen konnte. 1886 zeigte Adolph Meyer, dass eine Krankheit der Tabakpflanzen, die Tabakmosaikkrankheit, über flüssige Pflanzenextrakte von einer erkrankten Pflanze auf eine gesunde übertragen werden kann. Dmitri Ivanowski zeigte 1892, dass diese Krankheit auch auf diese Weise übertragen werden kann, nachdem der Chamberland-Pasteur-Filter alle lebensfähigen Bakterien aus dem Extrakt entfernt hatte. Es dauerte jedoch viele Jahre, bis sich herausstellte, dass diese „filtrierbaren“ Infektionserreger nicht einfach nur sehr kleine Bakterien waren, sondern eine neue Art von winzigen, krankheitserregenden Partikeln.

Virionen, einzelne Viruspartikel, sind sehr klein, etwa 20–250 Nanometer im Durchmesser. Diese einzelnen Viruspartikel sind die infektiöse Form eines Virus außerhalb der Wirtszelle. Im Gegensatz zu Bakterien (die etwa 100-mal größer sind) können wir Viren mit einem Lichtmikroskop nicht sehen, mit Ausnahme einiger großer Virionen der Pockenvirus-Familie. Erst mit der Entwicklung des Elektronenmikroskops in den späten 1930er Jahren erhielten Wissenschaftler einen ersten guten Einblick in die Struktur des Tabakmosaikvirus (TMV) und anderer Viren. Die Oberflächenstruktur von Virionen kann sowohl durch Raster- als auch durch Transmissionselektronenmikroskopie beobachtet werden, während die inneren Strukturen des Virus nur in Bildern mit einem Transmissionselektronenmikroskop beobachtet werden können. Der Einsatz dieser Technologien hat die Entdeckung vieler Viren aller Arten lebender Organismen ermöglicht. Sie wurden zunächst nach gemeinsamer Morphologie gruppiert. Später wurden Gruppen von Viren nach der Art der enthaltenen Nukleinsäure, DNA oder RNA, und ob ihre Nukleinsäure einzel- oder doppelsträngig war, klassifiziert. In jüngerer Zeit hat die molekulare Analyse viraler Replikationszyklen ihre Klassifizierung weiter verfeinert.


Pestivirus: Epidemiologie, Evolution, Biologie und klinische Merkmale

Pestiviren infizieren überwiegend Paarhufer, sind weltweit verbreitet und können die Nutztier- und Schweineproduktion wirtschaftlich beeinträchtigen. Ihre potentiellen Unterschiede in der Epidemiologie und sogar in der molekularen Epidemiologie können als lokale Marker fungieren und die Wirksamkeit von Impfstoffen und Strategien für Gegenmaßnahmen beeinträchtigen. Darüber hinaus kann der Nachweis bei atypischen Wirten und Wildtieren den Gesundheitszustand dieser Tierarten und sogar die Virusentwicklung und das Auftreten neuer Varianten beeinflussen. Darüber hinaus liefert die Entdeckung neuer Mitglieder dieser wichtigen Virusgattung wichtige Informationen über die Evolution und das Wirtsspektrum. Die kontinuierliche Überwachung aktualisiert das Wissen auf diesem Gebiet und führt zu einem besseren Verständnis von Pathogenese, Evolution und Wirtsspektrum.

Dieses Forschungsthema zielt darauf ab, Beiträge im Bereich der Pestivirus-Forschung und gewonnene Erkenntnisse zu ihrer wirtschaftlichen und tiergesundheitlichen Bedeutung, klinischen Manifestationen und einer aus folgenden Gründen bedrohlichen Verbreitung zu diskutieren:
- Wirtschaftliche Verluste durch Pestivirus-Infektionen und Einschleppung in bisherige Nichtendemiegebiete
- Störung der Immunität und Impfstoffeffizienz durch das Auftreten neuer Virusarten, Unterarten und Varianten
- Atypische Wirte, die direkt betroffen sein können oder als Reservoir für die Tierproduktion dienen
- Mangelndes Wissen über die Mechanismen der Virus-Wirt-Interaktion
- Neue Pestiviren und atypische Wirte, die neue Informationen zur Virusentwicklung hinzufügen können
- Ungewöhnliche klinische Manifestationen und virulentere Virusstämme.

Geeignete Themen für Einreichungen sind unter anderem:
- Epidemiologie, Nachweis, genetische Vielfalt und Evolution von Pestiviren
- Virus-Wirtszell-Interaktion
- Pestivirus-Infektion bei Wildtieren
- Immunantwort und Impfstoffentwicklung
- Pathogenese und klinische Manifestationen

Schlüsselwörter: BVDV, CSFV, BDV, HoBi-ähnliches Virus, APPV, Bungowannah-Pestivirus

Wichtiger Hinweis: Alle Beiträge zu diesem Forschungsthema müssen sich im Rahmen der Sektion und Zeitschrift befinden, für die sie eingereicht werden, wie in ihren Leitbildern definiert. Frontiers behält sich das Recht vor, ein Manuskript, das außerhalb des Geltungsbereichs liegt, in jeder Phase des Peer-Reviews an eine geeignetere Sektion oder Zeitschrift weiterzuleiten.

Pestiviren infizieren überwiegend Paarhufer, sind weltweit verbreitet und können die Nutztier- und Schweineproduktion wirtschaftlich beeinträchtigen. Ihre potentiellen Unterschiede in der Epidemiologie und sogar in der molekularen Epidemiologie können als lokale Marker fungieren und die Wirksamkeit von Impfstoffen und Strategien für Gegenmaßnahmen beeinträchtigen. Darüber hinaus kann der Nachweis bei atypischen Wirten und Wildtieren den Gesundheitszustand dieser Tierarten und sogar die Virusentwicklung und das Auftreten neuer Varianten beeinflussen. Darüber hinaus liefert die Entdeckung neuer Mitglieder dieser wichtigen Virusgattung wichtige Informationen über die Evolution und das Wirtsspektrum. Die kontinuierliche Überwachung aktualisiert das Wissen auf diesem Gebiet und führt zu einem besseren Verständnis von Pathogenese, Evolution und Wirtsspektrum.

Dieses Forschungsthema zielt darauf ab, Beiträge im Bereich der Pestivirus-Forschung und gewonnene Erkenntnisse zu ihrer wirtschaftlichen und tiergesundheitlichen Bedeutung, klinischen Manifestationen und einer aus folgenden Gründen bedrohlichen Verbreitung zu diskutieren:
- Wirtschaftliche Verluste durch Pestivirus-Infektionen und Einschleppung in bisherige Nichtendemiegebiete
- Störung der Immunität und Impfstoffeffizienz durch das Auftauchen neuer Virusarten, Unterarten und Varianten
- Atypische Wirte, die direkt betroffen sein können oder als Reservoir für die Tierproduktion dienen
- Mangelndes Wissen über die Mechanismen der Virus-Wirt-Interaktion
- Neue Pestiviren und atypische Wirte, die neue Informationen zur Virusentwicklung hinzufügen können
- Ungewöhnliche klinische Manifestationen und virulentere Virusstämme.

Geeignete Themen für Einreichungen sind unter anderem:
- Epidemiologie, Nachweis, genetische Vielfalt und Evolution von Pestiviren
- Virus-Wirtszell-Interaktion
- Pestivirus-Infektion bei Wildtieren
- Immunantwort und Impfstoffentwicklung
- Pathogenese und klinische Manifestationen

Schlüsselwörter: BVDV, CSFV, BDV, HoBi-ähnliches Virus, APPV, Bungowannah-Pestivirus

Wichtiger Hinweis: Alle Beiträge zu diesem Forschungsthema müssen sich im Rahmen der Sektion und Zeitschrift befinden, für die sie eingereicht werden, wie in ihren Leitbildern definiert. Frontiers behält sich das Recht vor, ein Manuskript, das außerhalb des Geltungsbereichs liegt, in jeder Phase des Peer-Reviews an eine geeignetere Sektion oder Zeitschrift weiterzuleiten.


Anwendungen der Nanotechnologie bei der Erkennung, Verfolgung und Infektion von Viren

Viren gehören zu den ansteckendsten Krankheitserregern und sind für die weltweit höchste Todesrate verantwortlich. Das Fehlen wirksamer klinischer Medikamente für die meisten Viren unterstreicht die schnelle und genaue Diagnose in frühen Stadien der Infektion, um eine schnelle Ausbreitung der Krankheitserreger zu verhindern. Die Nanotechnologie ist ein aufstrebendes Feld mit Anwendungen in verschiedenen Bereichen, in denen die nanobiomedizinische Wissenschaft viele bedeutende Beiträge leistet, wie z. Zu den Nanomaterialien, die für die Erkennung und Verfolgung von Viren berichtet wurden, gehören hauptsächlich magnetische und Gold-NPs, ZnO/Pt-Pd, Graphen und Quantenpunkte (QDs). Darüber hinaus ermöglichte die Single-Virus-Tracking-Technologie (SVT) die Verfolgung der Lebenszyklusstadien eines einzelnen Virus, um seine Dynamik innerhalb der lebenden Zellen besser zu verstehen. Sowohl anorganische als auch nichtmetallische fluoreszierende Materialien teilen sich die Vorteile einer hohen photochemischen Stabilität, einer breiten Palette von Lichtabsorptionskurven und einer polychromatischen Emission. Daher werden sie als potenzielle fluoreszierende Nanosonden für SVT angesehen. Es gibt jedoch noch einige Herausforderungen: (i) die klinische Falsch-Positiv-Rate einiger Nachweismethoden ist immer noch hoch (ii) beim Virus-Tracking-Prozess, geringere Anpassungsfähigkeit von QDs aufgrund größerer Größe, Flimmern und möglicher Störung der Virusfunktion und ( iii) In-vivo-Tracking eines einzelnen Virus in Echtzeit bedarf weiterer Verfeinerung. Zukünftig werden kleinere, ungiftige und chemisch stabile Nanomaterialien benötigt, um die Effizienz und Genauigkeit des Nachweises und der Überwachung von Virusinfektionen zu verbessern, um die Sterblichkeitsrate einzudämmen. Dieser Artikel ist kategorisiert unter: Therapeutische Ansätze und Wirkstoffforschung > Nanomedizin für von der Biologie inspirierte Nanomaterialien für Infektionskrankheiten > Protein- und Virus-basierte Strukturen.

Schlüsselwörter: Erkennung von Nanopartikeln einzelnes Virus Tracking Virus.

© 2021 Wiley Periodicals LLC.

Interessenkonflikt-Erklärung

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte für diesen Artikel erklärt.

Figuren

In‐vitro‐Selektion zielspezifischer…

In‐vitro‐Selektion zielspezifischer Aptamere basierend auf magnetischer Trennung durch SELEX (Xi…

Das enzymgekoppelte Immunadsorptionsmittel mit verstärkter Fluoreszenz…

Der Enhanced Fluorescence Enzyme-Linked Immunosorbent Assay zum Nachweis von Alpha‐Fetoprotein und…

Ein Modell zum Nachweis der virusspezifischen künstlichen DNA/RNA mit hoher Empfindlichkeit gegen…

Ein „Fahrerwechsel“-Mechanismus von…

Ein „Treiberumschaltmechanismus“ des Influenzavirustransports von Mikrofilamenten zu Mikrotubuli (L.‐J.…

Ein ortsspezifisches Protokoll für Enterovirus…

Ein ortsspezifisches Protokoll für Enterovirus‐Capsid und monodisperse AuNPs (Marjomäki et al., 2014).…

Einstufige Strategie der „Synthese‐Modifikations‐Integration“ für…

Einstufige Strategie der „Synthese‐Modifikations‐Integration“ zur Herstellung von Boronsäure‐funktionalisierten C‐Punkten (Shen &…


Virusentdeckung durch Deep Sequencing und Assemblierung von Virus-abgeleiteten Small Silencing RNAs

Als Reaktion auf eine Infektion verarbeiten wirbellose Tiere replizierende virale RNA-Genome in siRNAs unterschiedlicher Größe, um die Virus-Clearance durch RNA-Interferenz zu steuern. Hier zeigen wir, dass virale siRNAs, die aus Fruchtfliegen-, Moskito- und Nematodenzellen sequenziert wurden, sich alle in der Sequenz überlappten, was auf eine Möglichkeit der Verwendung von siRNAs für die virale Genommontage und Virusentdeckung hindeutet. Um diese Idee zu testen, untersuchten wir Contigs, die aus veröffentlichten kleinen RNA-Bibliotheken zusammengestellt wurden, und entdeckten fünf zuvor unbeschriebene Viren aus kultivierten Drosophila-Zellen und erwachsenen Mücken, darunter drei mit einem Positivstrang-RNA-Genom und zwei mit einem dsRNA-Genom. Bemerkenswerterweise wiesen vier der identifizierten Viren nur geringe Sequenzähnlichkeiten mit bekannten Viren auf, so dass keines einer existierenden Virusgattung zugeordnet werden konnte. Wir berichten auch über den Nachweis von Virus-abgeleiteten PIWI-interagierenden RNAs (piRNAs) in Drosophila melanogaster, die zuvor in keiner anderen Wirtsart beschrieben wurden, und zeigen den Zusammenbau des viralen Genoms aus viralen piRNAs in Abwesenheit von viralen siRNAs. Somit bietet diese Studie einen leistungsstarken kulturunabhängigen Ansatz für die Virusentdeckung bei Wirbellosen, indem virale Genome direkt aus Immunreaktionsprodukten des Wirts ohne vorherige Virusanreicherung oder -amplifikation zusammengesetzt werden. Wir schlagen vor, dass wirbellose Viren, die durch diesen Ansatz entdeckt wurden, zuvor unbeschriebene virale Pathogene von Menschen und Wirbeltieren umfassen können, die durch Vektoren von Arthropoden übertragen werden.

Interessenkonflikt-Erklärung

Die Autoren geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Figuren

Position und Verteilung der FHV…

Position und Verteilung von FHV- und SINV-siRNA-Contigs aus kleinen RNAs…

Entdeckung von dsRNA-Viren DTV…

Entdeckung von dsRNA-Viren DTV ( EIN ) und DBV ( B )…

S2-GMR-Zellen enthielten vier infektiöse…

S2-GMR-Zellen enthielten vier infektiöse RNA-Viren. ( EIN ) DTV, DBV, DXV,…

Größenverteilung ( EIN )…

Größenverteilung ( EIN ) und aggregierte Nukleotidzusammensetzung ( B ) von…


Abstrakt

Die Entwicklung von Methoden zur Antizipation des Auftretens oder Wiederauftretens von Infektionskrankheiten ist sowohl wichtig als auch rechtzeitig, jedoch werden traditionelle modellbasierte Ansätze durch die Unsicherheit über die zugrunde liegenden Treiber behindert. Hier demonstrieren wir einen operativen, mechanismus-agnostischen Erkennungsalgorithmus für das (Wieder-) Auftreten von Krankheiten, der auf Frühwarnsignalen (EWSs) basiert, die aus der Theorie der kritischen Verlangsamung abgeleitet wurden. Insbesondere verwendeten wir Computersimulationen, um einen überwachten Lernalgorithmus zu trainieren, um die dynamischen Fußabdrücke des (Wieder-)Auftretens in epidemiologischen Daten zu erkennen. Unser Algorithmus wurde dann herausgefordert, das sich langsam manifestierende, räumlich replizierte Wiederauftreten von Mumps in England Mitte der 2000er Jahre und Keuchhusten nach 1980 in den Vereinigten Staaten vorherzusagen. Unsere Methode antizipierte erfolgreich das Wiederauftreten von Mumps 4 Jahre im Voraus, während dieser Zeit hätten Minderungsmaßnahmen durchgeführt werden können. Ab 1980 identifizierte unser Modell wiederauflebende Zustände mit zunehmender Genauigkeit, was ab 1992 zu einer zuverlässigen Klassifizierung führte. Darüber hinaus haben wir den Erkennungsalgorithmus erfolgreich auf 2 vektorübertragene Fallstudien angewendet, nämlich den Ausbruch von Dengue-Serotypen in Puerto Rico und eine sich schnell entwickelnde Ausbruch der Pest im Jahr 2017 auf Madagaskar. Zusammengenommen veranschaulichen diese Ergebnisse die Leistungsfähigkeit theoretisch fundierter maschineller Lerntechniken zur Entwicklung von Frühwarnsystemen für das (Wieder-)Auftreten von Infektionskrankheiten.

Zitat: Brett TS, Rohani P (2020)Dynamische Fußabdrücke ermöglichen die Erkennung des Auftretens von Krankheiten. PLoS Biol 18(5): e3000697. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000697

Wissenschaftlicher Redakteur: Christophe Fraser, University of Oxford, VEREINIGTES KÖNIGREICH

Empfangen: 2. Oktober 2019 Akzeptiert: 23. April 2020 Veröffentlicht: 20. Mai 2020

Urheberrechte ©: © 2020 Brett, Rohani. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium gestattet, sofern der ursprüngliche Autor und die Quelle angegeben werden.

Datenverfügbarkeit: Alle Datendateien sind im Zenodo-Repository verfügbar (URL: https://doi.org/10.5281/zenodo.3713381).

Finanzierung: Die Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health (Preis-Nr. U01GM110744 https://www.nigms.nih.gov) finanziert. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Abkürzungen: AUC, Fläche unter der Receiver-Operator-Kennlinie DENV, Dengue-Virus EWS, Frühwarnsignal LA, Kommunal-MRSA, Methicillin-resistent Staphylococcus aureus ROC, Receiver-Operator-Merkmal SARS-CoV, schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus XDR TB, weitgehend arzneimittelresistente Tuberkulose


Materialen und Methoden

Methodenübersicht

In dieser Studie folgten wir Methoden und verwendeten Code, der von Allen et al. abgeleitet wurde [19]. Wir haben die ersten Berichte in der von Experten begutachteten Literatur über Infektionen beim Menschen für jedes RNA-Virus in unserer Datenbank über einen Zeitraum von 118 Jahren von 1901 bis 2018 zusammengestellt und geokodiert. Ein Poisson Boosted Regression Tree (BRT)-Modell – eine Methode, die räumlich abhängige Daten gut – wurde mit einer Reihe von Variablen, die als mögliche Erklärungsfaktoren angesehen werden, an die Daten des humanen RNA-Virus angepasst. Indem wir die Anzahl der Virusentdeckungen und alle erklärenden Faktoren in jeder Rasterzelle mit 1° Auflösung (ca. 110 km am Äquator) nach Dekade abgeglichen haben, haben wir den Beitrag jedes erklärenden Faktors zu den Vorhersagen geordnet. Anschließend haben wir die Parameterschätzungen des am besten passenden BRT-Modells verwendet, um die Wahrscheinlichkeit der Virusentdeckung für alle Gitterzellen weltweit in den Jahren 2010–2019 unter Verwendung der Werte aller erklärenden Faktoren im Jahr 2015 vorherzusagen Menschen oder streng zoonotisch und vektorübertragen oder nicht vektorübertragen), um die Erklärungsfaktoren für die Entdeckung bestimmter Kategorien von Viren zu finden.

Datenquelle menschlicher RNA-Viren und Aktualisierung

Daten zu menschlichen RNA-Viren stammen aus einer aktualisierten Version unserer zuvor veröffentlichten Datenbank (https://datashare.is.ed.ac.uk/handle/10283/2970), die 214 Viren enthält, mit Entdeckungsdaten zwischen 1901 und 1901 2017. Suchbegriffe, durchsuchte Datenbanken und Ein- oder Ausschlusskriterien für die Datenerhebung wurden in unserem vorherigen Artikel [1] angegeben. Die aktualisierte Version für 2018 enthält neun zusätzliche humane Virusarten, die kürzlich von ICTV erkannt oder neu in die Datenbank aufgenommen wurden: Orthonairovirus der Nairobi-Schafskrankheit, Achimota-Virus 2, Menangle-Rubulavirus, Madariaga-Virus, Pegivirus H, Zentrales Schimpansen-Simian-Schaumvirus, Guenon-Affen-Schaumvirus, Enterovirus H und Orthohepevirus C (S1 Tabelle). Die Metadaten geben Auskunft über Entdeckungsdatum, Übertragbarkeit, Übertragungsweg und Wirtsbereich [1].

Wir haben „Entdeckung“ als den ersten Bericht über eine ICTV-anerkannte RNA-Virusspezies von Mensch(en) in der von Experten begutachteten Literatur definiert, und der Ort der erstmaligen Exposition/Infektion des Menschen mit dem Virus wurde als Entdeckungsort genommen. Wenn der Standort aus der Originalarbeit nicht bekannt war, wurde der Standort des Forschungslabors als Fundort verwendet (n = 3). Wenn weder der Expositions-/Infektionsort für den Menschen noch der Standort des Forschungslabors verfügbar waren, wurde stattdessen die Adresse des Erstautors als Fundort verwendet (n = 19). In unserer Datenbank wurden für 201 (90%) Viren (S1 Tabelle) und keiner davon wurde auf Reisen geschlossen. Die Standorte wurden gemäß der Originalliteratur so genau wie möglich georeferenziert, von präzisen Punktkoordinaten bis hin zu Daten auf Polygonebene (z. B. Stadt, Landkreis, Landkreis, Bundesland oder Land) (siehe S1-Text für Details). Für nicht spezifizierte Standorte, die mehr als eine Rasterzelle (S2-Tabelle) wurde Sampling in unserem Bootstrap-Framework verwendet, wie unten beschrieben.

Räumliche Erklärungsfaktoren

Ein Satz von 33 Variablen, die möglicherweise die räumliche Verteilung der Entdeckung von RNA-Viren beeinflussen, wurde zusammengestellt und als erklärende Faktoren verwendet. Vollständige Angaben zu Quellen, Originalauflösungen und Definitionen finden Sie in S3-Tabelle. Die Variablen wurden vier Gruppen zugeordnet: Klima, Sozioökonomie, Landnutzung und Biodiversität. Wir erwarten, dass das BIP, das BIP-Wachstum und die Anzahl der Universitäten usw. mit den Entdeckungsbemühungen korreliert werden, da sie mehr Ressourcen erfordern, die in die Virusforschung investiert werden könnten [25,26]. Andere Gruppen von Variablen, einschließlich Landnutzung, Klima und Biodiversität, hängen eher mit der natürlichen geografischen Reichweite des Virus zusammen [27], d. h. diese Variablen werden die Entdeckung über den Zwischenschritt des Auftretens beeinflussen.

Alle erklärenden Faktoren und Virenstandorte wurden durch eine 1° räumliche Rasterzelle abgeglichen, wobei die Daten bei Bedarf neu skaliert oder transformiert wurden (Details zur Datentransformation finden Sie in S2-Text). Unser Modell hat die Anzahl der Entdeckungen von RNA-Viren in jeder Rasterzelle mit historischen dekadischen Klimavariablen, Bevölkerungs-, BIP- und Landnutzungsdaten (unten beschrieben) abgeglichen, sodass wir die Daten für diese Variablen bis 1901 extrapolieren (siehe S2-Text für Details).

BRT-Modellierungsansatz

Durch die Anpassung eines Poisson-BRT-Modells schätzten wir das relative Risiko der Entdeckung von RNA-Viren für jede 1°-Auflösung einer Gitterzelle auf der ganzen Welt als Funktion der 33 erklärenden Faktoren ab. BRT ist eine baumbasierte maschinelle Lernmethode, die in ökologischen Studien bereits weit verbreitet ist [28, 29]. Es wendet die Boosting-Technik an, um viele einfachere Baummodelle adaptiv zu kombinieren, und bietet eine verbesserte Vorhersageleistung [30,31]. Baumbasierte Lernmethoden sind nützliche Werkzeuge zum Modellieren nichtlinearer Beziehungen und Wechselwirkungen höherer Ordnung zwischen Variablen. Darüber hinaus kann BRT mit räumlich abhängigen Daten gut umgehen, da es komplexe Strukturen innerhalb der Daten erfassen kann, die viele andere Modellierungsmethoden nicht können [32]. Wir haben Moran's I (ein Index der räumlichen Abhängigkeit) berechnet, um die Fähigkeit des BRT-Modells abzuschätzen, die räumliche Abhängigkeit in den Virusdaten zu berücksichtigen, indem wir das Paket spdep in R v. mit den Cut-Off-Werten im Bereich von einem bis dreißigfachen Abstand einer Gitterzelle mit 1° Auflösung am Äquator, dh 110 km bis 3300 km) [33]. Im Gegensatz zu den traditionellen, signifikanzbasierten Ansätzen bewertet BRT den individuellen Effekt jeder Variablen, indem die relative Bedeutung jeder Variablen für die Vorhersagen geschätzt wird.

Der Bootstrap-Resampling-Ansatz wurde angewendet, um die räumliche Unsicherheit bei der Lokalisierung von Virusfunden zu berücksichtigen, und generierte 95 %-Quantile. Bei Viren mit ungenauen Fundorten wurde jeweils eine Rasterzelle zufällig ausgewählt. Für jede Gitterzelle mit Virusentdeckung wurden zwei Gitterzellen ohne Entdeckung zufällig aus allen Zellen auf der ganzen Welt ausgewählt, die zu allen Zeitpunkten „virenentdeckungsfrei“ waren. In jedes Modell wurden also 223 Gitterzellen mit Virusentdeckung und 446 ohne Virusentdeckung eingeschlossen. Wir haben die Virusdaten mit allen Erklärungsfaktoren abgeglichen (unter Verwendung derselben Dekade für zeitvariable Erklärungsfaktoren, z. Wir nahmen an, dass die Viruszahl in jeder gegebenen Gitterzelle in jedem Jahrzehnt einer Poisson-Verteilung folgt, und verwendeten die Virusentdeckungszahl in jeder Gitterzelle pro Jahrzehnt als Antwortvariable.

Mit Bootstrap-Resampling haben wir 1000 replizierte BRT-Modelle angepasst und relative Beitragsdiagramme und partielle Abhängigkeitsdiagramme mit 95 %-Quantilen generiert. Der relative Beitrag oder Einfluss/Gewicht jeder Variablen ist ein Indikator für die Bedeutung dieser Variablen für die Vorhersage der Anzahl der Virenentdeckungen. Die relativen Beiträge aller Variablen eines BRT-Modells summieren sich zu 100 %, wobei höhere Zahlen einen stärkeren Einfluss auf die Antwort anzeigen. Wir definierten die einflussreichsten Erklärungsfaktoren als diejenigen, deren relativer Beitrag über dem Mittelwert lag (d. h. 100/(Total Erklärungsfaktoren zählt*100) in dieser Studie: 100/(33*100) = 3,03 %) [28]. Partielle Abhängigkeitsdiagramme sind eine Methode zur Visualisierung der Beziehungen zwischen den Vorhersagevariablen einer BRT und ihrem Ergebnis nach Berücksichtigung der durchschnittlichen Auswirkungen aller anderen Variablen. Die Mittelwerte der Vorhersagen aller 1000 Modelle wurden verwendet, um die Wahrscheinlichkeit einer Virusentdeckung weltweit in den Jahren 2010–2019 unter Verwendung von 2015-Werten der 33 erklärenden Faktoren vorherzusagen. Unter Verwendung der Gleichung der Poisson-Wahrscheinlichkeitsverteilung haben wir die kontinuierliche Vorhersagekarte in eine Wahrscheinlichkeitskarte umgewandelt. Wir haben die Pakete dismo und gbm in R v. 3.5.1 verwendet, um BRT-Modelle anzupassen. Parameter einschließlich Baumkomplexität (die die Anzahl von Knoten in einem Baum widerspiegeln), Lernrate (Verkleinerung des Beitrags jedes hinzugefügten Baums) und Beutelfraktion (die den Anteil der bei jedem Schritt auszuwählenden Daten spezifizieren) wurden gemäß Elith et al. [31] um sicherzustellen, dass jedes Resampling-Modell mindestens 1000 Bäume enthält. Die endgültigen Parameter des optimalen Modells hatten die folgenden Werte: Baumkomplexität = 5, Lernrate = 0,003, Beutelfraktion = 0,5. Eine stufenweise Kreuzvalidierungsfunktion wurde verwendet, um die optimale Anzahl von Bäumen in jedem Modell zu identifizieren [31]. Mit diesen Parametern passten die 1000-Replikat-BRT-Modelle an einen Mittelwert von 1214 Bäumen.

Die Vorhersageleistung des Modells wurde durch die Berechnung der Abweichung des Bootstrap-Modells sowie durch die Durchführung von 50 Runden einer zehnfachen Kreuzvalidierung bewertet. Details zur Modellvalidierung finden Sie in S3-Text und S4 Tisch.

Wir haben auch Sensitivitätsanalysen durchgeführt, indem wir i) nur Daten von 1980 bis 2000 verwendet haben (da erklärende Variablen nur für diesen Zeitraum ohne Extrapolation verfügbar sind) und ii) die 22 Entdeckungsberichte entfernt haben, die keine Orte infizierter Menschen waren (da diese weniger genau sind .). ). Modellparameter werden bereitgestellt in S5-Tabelle.

Geschichtete Analyse

Es wurden zwei stratifizierte Analysen durchgeführt, um erklärende Faktoren zu finden, die für die Entdeckung verschiedener Viruskategorien spezifisch sind. In der ersten stratifizierten Analyse wurden 131 Viren unterschieden, die streng zoonotisch sind (alle menschlichen Infektionen werden durch eine Infektion in einem nicht-menschlichen Reservoir erworben) und 92 Viren, die sich innerhalb menschlicher Populationen ausbreiten können (d. h. direkt oder indirekt zwischen Menschen übertragbar sind) (S1 Tabelle), basierend auf bereits veröffentlichten Daten [34]. Eine zweite stratifizierte Analyse wurde separat für 93 vektorübertragene Viren und 130 nicht vektorübertragene Viren durchgeführt (S1 Tabelle). Wir verwendeten den gleichen BRT-Modellierungsansatz für stratifizierte Analysen wie zuvor beschrieben, und für jede Viruskategorie wurden relative Beitragsdiagramme und partielle Abhängigkeitsdiagramme mit 95 %-Quantilen erstellt. Modellparameter werden bereitgestellt in S5-Tabelle. Basierend auf stratifizierten BRT-Modellen wurden auch Vorhersagen der Entdeckungswahrscheinlichkeit für jede Virenkategorie in den Jahren 2010–2019 unter Verwendung von 2015-Werten der 33 erklärenden Faktoren durchgeführt.

Alle statistischen Analysen wurden mit der R-Software, Version 3.5.1 (R Foundation for Statistical Computing, Wien, Österreich) durchgeführt und alle Karten wurden mit ArcGIS Desktop 10.5.1 (Environmental Systems Research Institute) visualisiert. Das in der Studie verwendete World Shapefile wurde von Data and Maps for ArcGIS (ehemals Esri Data & Maps, https://www.arcgis.com/home/group.html?id=24838c2d95e14dd18c25e9bad55a7f82#overview) unter einer CC-BY-Lizenz bezogen (S4-Text). Rohdaten und unterstützende R-Skripte, die zum Generieren von Zahlen für das vollständige Modell verwendet werden, sind in . dargestellt S1 R-Skript.


1. Einleitung

Nach der Entdeckung des Tabakmosaikvirus im Jahr 1892 und des Maul- und Klauenseuchevirus im Jahr 1898 wurde 1901 das erste beim Menschen entdeckte 𠆏iltrierbare Agens’ das Gelbfiebervirus [1]. Neue humane Virusarten werden immer noch identifiziert, mit einer Rate von drei oder vier pro Jahr (siehe unten), und Viren machen mehr als zwei Drittel aller neuen humanpathogenen Erreger aus [2], eine höchst signifikante Überrepräsentation, da die meisten humanpathogene Spezies sind Bakterien, Pilze oder Helminthen. Diese neuen Viren unterscheiden sich stark in ihrer Bedeutung und reichen von der seltenen und leichten Krankheit durch das Menangle-Virus bis hin zu den verheerenden Auswirkungen von HIV-1 auf die öffentliche Gesundheit.

In diesem Papier verfolgen wir einen ökologischen Ansatz zur Untersuchung der Vielfalt menschlicher Viren (definiert als Viren, für die es Hinweise auf eine natürliche Infektion des Menschen gibt). Zunächst beschreiben und analysieren wir zeitliche, geografische und taxonomische Muster bei der Entdeckung menschlicher Viren (ੲ). Wir betrachten dann die Prozesse, durch die neue menschliche Viren entstehen (ੳ). Es gibt eine Reihe von Definitionen von 𠆎mergence’ [3]. Wir interessieren uns hier für alle Phasen des Prozesses, durch den ein Virus von einer Infektion des Menschen zu einem bedeutenden menschlichen Krankheitserreger wird. Wie Erfahrungen mit HIV-1 und neuen Varianten der Influenza A (und auch mit neuartigen Tierpathogenen wie dem caninen Parvovirus [4]) zeigen, kann diese Verschiebung schnell über Jahrzehnte, Jahre oder sogar Monate erfolgen.

Natürlich sind nicht alle neu identifizierten humanen Virusarten ‘neu’ in dem Sinne, dass sie erst vor kurzem damit begonnen haben, Menschen zu infizieren, viele von ihnen sind schon seit geraumer Zeit beim Menschen vorhanden, wurden aber erst vor kurzem erkannt (siehe [2 ] für eine ausführlichere Diskussion). Darüber hinaus erkennen wir an, dass ‘Spezies’ selbst eine ungenaue Bezeichnung ist, insbesondere für Viren wie Influenza A, bei denen verschiedene Serotypen sehr unterschiedliche Epidemiologien und gesundheitliche Auswirkungen haben können. Tatsächlich kann die Abgrenzung zwischen Gattung, Artkomplex, Art und Serotyp (oder anderen Bezeichnungen subspezifischer Variation) etwas willkürlich sein. Nichtsdestotrotz ist eine Untersuchung derzeit anerkannter ‘Spezies’ ein natürlicher Ausgangspunkt für Versuche, Muster der Virusdiversität zu charakterisieren und zu interpretieren.


4. ÜBERTRAGUNG UND PATHOGENESE

4.1. Eintrittsmodus in die Zelle

Es ist gut dokumentiert, dass SARS-CoV und HCoV-NL63 denselben Rezeptor, das Angiotensin-Converting-Enzym (ACE)-2, für den Eintritt in die Wirtszelle verwenden [41, 42]. Die Folgen nach der Einreise sind jedoch sehr unterschiedlich. SARS-CoV verursacht schwere Atemnot, während HCoV-NL63 zu einer leichten Atemwegsinfektion führen kann. Dies wurde der Fähigkeit jedes Virusrezeptor-bindenden Proteins, Spike- oder S-Proteins, zugeschrieben, an ACE-2 auf der Zelloberfläche zu binden. Es wurde festgestellt, dass das HCoV-NL63 S Protein eine schwächere Wechselwirkung mit ACE-2 hat als das SARS-CoV S Protein. Diese Interaktion mit niedrigerer Affinität mit ACE-2 könnte teilweise die unterschiedlichen pathologischen Folgen einer Infektion durch SARS-CoV und HCoV-NL63 erklären [43].

Dennoch wird erwartet, dass sich mit Coronaviren eine hohe Pathogenität entwickeln wird. Bei HCoV-NL63 ist die Möglichkeit der Entwicklung einer rekombinanten Virusvariante aufgrund seiner hohen Prävalenz und der Möglichkeit eines Rekombinationsereignisses durch Koinfektion hoch [24]. Darüber hinaus kann das Virus in wässriger Lösung und Atemwegssekreten bis zu sieben Tage überleben und bleibt bei Raumtemperatur infektiös. In dicht besiedelten Regionen gilt die direkte Übertragung von Mensch zu Mensch als Hauptweg der HCoV-NL63-Ausbreitung [42, 44].

4.2. Saisonale Inzidenz

Das Virus hat eine weltweite Verbreitung und wurde vor allem in der Wintersaison in gemäßigten Klimazonen beobachtet. Andererseits haben auch Länder mit extremen Wetterbedingungen, wie Kanada, von Januar bis März Virusaktivität gezeigt, obwohl mildere Symptome gemeldet wurden [45]. Interessanterweise wurden in China saisonale Schwankungen gemeldet, wo die Infektion mit HCoV-NL63 hauptsächlich im Frühjahr und Sommer auftrat [26]. Auch eine kürzlich durchgeführte Studie zu Coronaviren in Thailand zeigte keine saisonale Vorliebe [46], während Wu et al. (2007) berichteten, dass das Virus während der Herbstsaison in Taiwan nachgewiesen wird [47]. Es ist offensichtlich, dass das Virus keine Vorliebe für eine bestimmte Jahreszeit hat und nicht von Temperaturschwankungen beeinflusst wird, da Infektionen das ganze Jahr über auftreten können (Tabelle ​ 1 1 ).

Tabelle 1

Epidemiologische, demografische, klinische und virologische Merkmale von HCoV-HCOV-NL63-Infektionen

LandProbentypErkennungsmethodeSaisonale PrävalenzArt des StudiumsAnzahl der an der Studie beteiligten Patienten (Stichprobengröße)AlterInzidenz von HCoV-NL63Co-InfektionSymptomeRef.-Nr.
AustralienRachen- und NasenabstrichRT-PCRWinterCommunity-basiert234> 5 Jahre3.3%NDMild Keine Kruppe, Keine Bronchiolitis[54]
BelgienNRRT-PCRWinter (Januar-Februar)KrankenhauspatientenNRVariabel (6 Fälle unter 2 Jahren)2.3%AbwesendFieber, Husten, Keuchen, Atemnot, Durchfall[28, 88]
KanadaRachenabstrich, Nasopharygealabstrich, LungenautopsieRT-PCRWinter (Januar-März)Patienten mit ARI5251 Monat-100 Jahre3,6% (13 Männer und 6 Frauen)AbwesendFieber, Schnupfen, Husten, Halsschmerzen, Bronchiolitis[45]
FrankreichNRRT-PCRWinter (Februar)Krankenhauspatienten für ARI300Variabel (18 Fälle unter 2 Jahren)9.3%AbwesendFieber, Rhinitis, Bronchiolitis, Verdauungsprobleme, Otitis, Pharyngitis und Konjuktivitis[29]
DeutschlandNasen-Rachen-SekreteEchtzeit-RT-PCRWinterBevölkerungsbasiert (stationär + ambulant)949< 3 Jahre5.2%GegenwärtigKruppbronchitis Bronchiolitis[52, 53]
China, HongkongNasen-Rachen-AspiratRT-PCRFrühling und SommerKrankenhauspatienten für ARI5876-57 Monate2.6%GegenwärtigKrupp Fieber Hautausschlag Halsschmerzen Husten Schnupfen Kurzatmigkeit Heiserkeit Asthma-Exazerbationen Krampfanfälle[26]
ItalienNasen-Rachen-AspiratRT-PCRWinter (Dezember-Februar)Hospitalisierte Säuglinge für ARI150ς Jahre1.86%GegenwärtigBronchiolitis Pneumonie Bronchospasmus Keuchende Rhinitis Bronchiolitis Laryngitis[51]
JapanNRRT-PCRJanuar MärzNR419NR5 FälleNDND[49]
KoreaNasen-Rachen-AspiratRT-PCRApril MaiKinder mit Infektionen der unteren Atemwege515 1.6%25%Fieber, Rasselgeräusche pfeifendes Atmen Pneuminie Krupp Asthma-Exazerbation[71]
TaiwanNasen-Rachen-AspiratQuantitative RT-PCRHöhepunkt im OktoberKrankenhauspatienten für ARI539< 3 Jahre1.3%GegenwärtigFever, cough , croup, and straidor[47]
ThailandNasopharyngeal aspirateRT-PCRHerbstHospitalized patients with pneumonia+ out patients with flu like illnesses18901month-65 years7/734 (first year) 1/1156 (second yearGegenwärtigCough, fever, straidor, croup[46]
SüdafrikaNasal swabRT-PCRNRND238Median age= 12.4 months8.3%GegenwärtigWheezing[89]
SchweizNasopharyngeal swabRT-PCRCold monthsoutpatients82Neonates (less than 1 year)7%NDCough, wheeze, fever, rhinitis , otitis, tonsillitis[60]
SchwedenNasopharyngeal aspirateRT-PCRNROupatients (Children attending to pediatric department)212ND6%NDND[90]
Vereinigte Staaten von AmerikaRespiratory specimensRT-PCRMostly January-FebruaryBoth ambulatory and hospitalized patients for ARI895< 5 years8.8%GegenwärtigCough, rhinnorhoea, tachpnea, fever, abnormal breath sounds, hypoxia[91]

4.3. Prevalence

The human coronaviruses account for a significant number of hospitalization for children under 18 years of age, the elderly and immunocompromised individuals. In fact, a one-year study of children hospitalized in Hong Kong (China) has shown that respiratory tract infection with coronaviruses accounts for 4.4% of all admissions for acute respiratory infections. Of these, HCoV-NL63 was the most common coronavirus identified with an incidence of 2.6% [48]. Moreover, a study in Japan has shown that out of 419 specimens that tested negative for common respiratory viruses, five (1.2%) were positive for human coronavirus HCoV-NL63 [49]. Another Japanese report has indicated that out of 118 nasopharyngeal swab samples obtained from hospitalized children younger than two years of age, three (2.5%) were positive for HCoV-NL63 [50].

In Europe, high prevalence was also noted. In Italy, a study conducted on 322 infants suffering from acute respiratory disease has shown that 8.7% of the cases examined were caused by coronaviruses, with HCoV-NL63 accounting for 21.4% of the latter [51]. In France, 300 respiratory specimens were checked for HCoV-NL63 presence of the 300 samples, 28 (9.3%) were positive [29]. Likewise, seven cases were reported in a one-year study in Belgium [28]. Interestingly, the Dutch group that first described the virus has obtained 949 samples from a German group who conducted a population-based study on lower respiratory tract infection in children under three years of age [52] the group re-analyzed the samples and detected a 5.2% incidence of HCoV-NL63 [53]. In Australia, the virus was detected in Melbourne, where a study conducted on 543 patients with respiratory symptoms has shown 18 cases (3.3%) of human coronavirus HCoV-NL63 infection [54]. Moreover, in the USA and Canada, the virus was reported in 79 (8.8%) out of 895 and 19 (3.6%) out of 525 patients, respectively.

Currently, the accuracy of the percentage of detection is hampered by two main problems: firstly, the suitability of the samples examined: a recent study has shown that there are differences between respiratory samples collected by nose/throat swabs and by nasopharyngeal aspirates, specifically regarding their potential to detect and identify respiratory pathogens [55]. The second problem is that diagnostic tests for HCoVs are not frequently used in the routine testing for viruses, which probably results in the percentage of HCoVs infections being greatly underestimated [56]. Moreover, throughout the years several methods of variable sensitivity were used to determine the incidence of the virus [57-59].

4.4. Co-Infection

Many groups have reported that the occurrence of co-infections with HCoV-NL63 and other respiratory viruses, including other human coronaviruses, influenza A virus, respiratory syncytial virus (RSV), parainfluenza virus and human metapneumovirus (hMPV), are common [26, 30, 46, 47, 51, 53, 54, 60, 61]. Also, co-infected patients are more likely to be hospitalized, indicating the severity of this kind of superinfection. In a study from Germany, RSV-A and HCoV-NL63 was the most common co-infection indentified in children less than three years of age. This is probably due to the high incidence of RSV-A in winter and the overlap in seasonality of the viruses [53]. Also, in Italy, HCoV-NL63 circulates as a mixture of variant strains and is often associated with other viral infections [30]. In South Africa, co-infection of patients with HCoV-NL63 and bocavirus in hospitalized children is reported. Nasopharyngeal and bronchoalveolar lavage samples from 341 patients were screened for common respiratory viruses, and the co-presence of HCoV-NL63 and bocavirus in at least one sample was reported [62].

Interestingly, the viral load of HCoV-NL63 is lower in co-infected patients than in patients infected with HCOV-NL63 only. There are various possible explanations for this phenomenon [53]:

HCoV-NL63 might be the initial infection that weakens the immune system enough for a second infection to gain a foothold. By the time this second infection shows symptoms, the HCoV-NL63 infection might have already have been brought under control by the host immune system,

the two viruses may be in competition for the same receptor or target cell in the respiratory organs,

the elevated activation of the innate immune response triggered by the second respiratory virus may cause inhibition of HCoV-NL63 or,

prolonged persistence of HCoV-NL63 at low levels.

The high prevalence of co-infections of HCoV-NL63 and other respiratory viruses increases the chances of genetic recombination with these human or zoonotically transmitted viruses. In fact, Pryc et al. (2006) states HCoV-NL63 resulted from a recombination event between PEDV and an ancestral HCoV-NL63 strain. Theoretically, these types of recombination events could enable highly pathogenic virus variants to arise [24].

4.5. Klinische Merkmale

Recent scientific and clinical evidence has indicated that the virus is found during upper and lower respiratory tract infections, causing symptoms and signs that do not differ greatly from the symptoms described for the 'old' viruses HCoV-229E and HCoV-OC43. Other systems involvement is still controversial [63].

Tisch ​ 1 1 shows that patients diagnosed with the virus have presented with mild symptoms, indicating upper respiratory tract infection such as fever, cough and rhinorrhoea. On the other hand, the disease is also known to cause significant more alarming lower respiratory tract infection. One of the most alarming symptoms is bronchiolitis, an inflammation of the membranes lining the bronchioles. This symptom was reported by several research groups [25, 50, 64], and although a population-based study in China did not report an association of HCoV-NL63 with bronchiolitis [26], it is still believed to be one of the presenting symptoms. Several research groups have linked HCoV-NL63 to croup [26, 53]. Croup children present with pharangitis, sore throat and hoarseness of voice, and are considered for hospitalization. Of the rare findings, a group has reported the association between HCoV-NL63 and Kawasaki disease, a form of childhood vasculitis that is presented as fever, polymorphic exanthema, oropharyngeal erythema and bilateral conjuctivitis [65]. However, others fail to report on this association [66, 67].

It is noteworthy to say that the report of symptoms in young children, who represent the majority of patients, is based mainly on parental observations, where other possible subjective signs and symptoms fail to be recognized by the parents. Moreover, most of the studies were conducted on patients reporting to hospitals suffering from acute respiratory tract infection. To date, there are only few population-based studies and the question arises whether larger numbers of such studies might reveal the involvement of other body systems.


Applications of molecular techniques

NEW APPROACHES TO THE DISCOVERY OF VIRUSES AND DISEASE AETIOLOGIES

Molecular techniques have been instrumental in the recent discoveries of viruses associated with hepatitis. 4 The most important of these came in 1989 with the partial characterisation of the infectious agent associated with most cases of non-A non-B hepatitis. 5, 6 This condition usually presented as post-transfusion jaundice and was long suspected to have a viral aetiology. Nucleic acid from infectious chimpanzee blood was used to produce sufficient quantities of virus encoded proteins for the development of a diagnostic antibody assay. This molecular approach was successful in developing a laboratory diagnostic assay before the virus had been isolated and characterised in the conventional sense now named hepatitis C virus, it has been characterised extensively using molecular techniques. Another virus has been similarly discovered and characterised, 7 and although termed hepatitis G virus, a role for this virus or group of viruses in human disease remains unclear. 8

A powerful PCR based technique known as representational difference analysis has been used to discover a virus associated with cancer in HIV infected individuals. 9 Apart from epidemiological data suggesting an infectious cause of Kaposi's sarcoma, there had been no characterisation of the newly discovered member of the herpesvirus group. Human herpesvirus 8, or KS virus, has been detected in tissue from HIV infected individuals, including those with Kaposi's sarcoma lesions, 10, 11 and also from sarcoid. 12

DIAGNOSTIC PROBLEMS

Traditionally, laboratory diagnostic techniques in virology have relied on an ability to propagate infectious virus from clinical material in cell culture, or on the detection of a specific antibody. Where virus propagation is not successful, laboratory diagnosis has remained a problem because direct detection methods for viral antigen, nucleic acid, or morphology by microscopy in clinical material have low sensitivity. These difficulties, together with the time interval required to detect a specific immune response and the interpretation of antibody values for viruses that cause latent infections, has caused continuing diagnostic dilemmas for the clinical virologist. A reliable diagnosis of HIV and HCV infection is usually achieved by the detection of antibody however, these viruses can be transmitted vertically and passive acquisition of maternal antibody confuses confirmation of infection in the neonate. The serological diagnosis of HIV and HCV infection is also impossible in the “window period” before seroconversion, and this poses a concern for the safety of blood products: an estimated risk of HCV transmission in western Germany is 1/20 000 for first time donors and 1/200 000 for repeat donors. 13

Molecular assays in some circumstances might be no more sensitive or specific than traditional techniques, although they may be more suited to large scale screening programmes. The detection of C trachomatis infection, an “atypical” organism that has traditionally been the interest of the virologist, has evolved from isolation in cell lines, which is technically difficult but has good specificity, to antigen detection by enzyme immunoassay or fluorescence antibody test, and now to molecular amplification of pathogen DNA. The commercial molecular assays that have been developed are more sensitive than antigen detection, 14 and much better suited to routine use than cell culture isolation. The use of molecular detection has led to a growing awareness of the extent of chlamydial infection and the potential value of a comprehensive screening programme.

CENTRAL NERVOUS SYSTEM INFECTION

Central nervous system (CNS) viral infections, although recognised clinically, are a diagnostic difficulty because of the generally low sensitivity of virus isolation methods from cerebrospinal fluid (CSF). Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is rarely recoverable from the CSF of patients with herpes simplex virus (HSV) encephalitis, probably because relatively few viable virus particles are released into the CSF. For a while, techniques based on the detection of virus in brain biopsy were attempted to provide a reliable, prompt diagnosis in this illness, but the advent of effective antivirals of low toxicity has made invasive techniques difficult to justify. In cases of enterovirus meningitis, virus might be recovered from CSF, although not all serotypes grow in laboratory cell lines, and growth is generally too slow to aid differentiating between viral and bacterial meningitis. Hitherto, patients with viral CNS infection have often received only a presumptive diagnosis based on clinical presentation: without supportive laboratory evidence an understanding of the aetiology and epidemiology of viral CNS disease has been limited.

Molecular amplification techniques have been able to overcome many of these problems through the ability to detect just a few copies of viral nucleic acid directly in CSF. The use of the PCR technique for the diagnosis of HSV encephalitis was one of its first applications in the clinical virology laboratory, and when it was demonstrated that PCR could potentially provide sensitive and specific diagnosis, 15 the test was evaluated extensively in several prospective studies. 16– 18 Assays for the other herpesviruses and enteroviruses have also been developed and found to contribute to laboratory diagnosis and patient management. 19– 22 The molecular amplification approach to the diagnosis of HSV encephalitis is now recognised as the method of choice for this disease, 17, 23 and also for viral CNS infection in general. 24 PCR analysis of CSF has demonstrated that symptoms of meningitis might be caused by the reactivation of varicella zoster virus (VZV), 25, 26 or herpes simplex virus type 2 (HSV-2) 26, 27 infection without concurrent skin lesions. HSV-2 infection has been shown to be the cause of Mollaret's meningitis 28 and an important cause of apparent sporadic aseptic meningitis in one study, this virus was the most common aetiology found in women with this clinical diagnosis. 29 Where traditional diagnostic methods are insensitive, our understanding of the natural history of viral disease continues to be improved through the use of molecular techniques, and in CNS infection our knowledge of the range of viral aetiologies has improved alongside the potential for early therapeutic intervention.

DIAGNOSIS IN IMMUNOSUPPRESSED PATIENTS

The development of antiviral drugs has highlighted the potential value to treatment of a rapid diagnosis of virus reactivation in immunosuppressed patients. Cytomegalovirus (CMV) is a major cause of post-transplant morbidity and, because it replicates only slowly in conventional cell culture, methods such as immunostaining for CMV early antigen expression have been used to speed the detection of virus replication in inoculated cell monolayers in the laboratory. Methods for detecting directly either virus specific antigen 30 or nucleic acid 31 in clinical material have removed the need for virus cell culture. An early concern that the high sensitivity of molecular amplification techniques would result in the detection of latent herpesvirus genome, so lowering the clinical specificity of virus nucleic acid detection, have been unfounded: the detection of viraemia has been found to correlate well with active CMV disease 32, 33 and CMV PCR is now often incorporated into routine post-transplant microbiological surveillance of susceptible patients.

VIRAL GENOTYPING

The problem of drug resistant virus phenotypes is becoming more recognised with an increase in the number of immunosuppressed patients receiving long term antiviral treatment. The use of prophylactic antiviral treatment for reactive herpesvirus infection, and the use of combinations of drugs to suppress viral replication in HIV infection, has selected for mutations conferring drug resistance. Under selective pressure, a drug resistant strain can quickly become the dominant phenotype, but molecular based assays have improved the clinical management of these patients by facilitating the detection of mutations conferring resistance. For the HIV genome, a commercial assay is available based on molecular amplification of the viral genome followed by hybridisation with mutation specific DNA probes. At present, these methods are used for the detection of resistance to the reverse transcriptase inhibitor class of antiviral compounds, but as a rapid and inexpensive approach it is likely to be used for other phenotypic determinants. A similar technique has been used for genotyping HCV infection for epidemiological study and for predicting the response to treatment. 34, 35

VIRAL LOAD

Molecular assays have had an important role in the study of the natural history of HIV infection, and subsequently in the development of effective treatment strategies. Quantitative molecular assays have shown that HIV-1 infection is characterised by high rates of virus production and clearance of both infected cells and cell free virions. 36 This discovery led to the development of highly active antiretroviral treatment, the aim of which is the durable maximum suppression of virus replication. 37 This advance in HIV treatment has been facilitated by the recent commercial development of viral load assays. The assessment of viraemia is now used as a prognostic indicator in HIV, 38 HCV, 39 and hepatitis B virus 40 infections, and is also used in monitoring the efficacy of antiviral treatment in systemic viral infections of immunosuppressed patients. 33


John Lednicky

Title: Research Professor
Uni: Public Health and Health Professions
Department: Environmental and Global Health
Curriculum vitae: PDF
Research Interests: Detection, isolation, and genetic analysis of arboviruses and respiratory viruses (especially animal and human influenza viruses and coronaviruses) Discovery and genetic analyses of viruses associated with fatal infections in farmed cervids Aerovirology specializing in the collection of airborne viruses Stability, spread and decontamination of respiratory viruses on environmental surfaces Polyomavirus regulatory region structure and function Molecular and classical diagnostic virology (human and animal) Paramyxovirus detection, isolation, and genetic analysis Development of human and animal virus detection, isolation, and identification methodologies Determination of whole genomic sequences of DNA and RNA viruses Diagnostic (clinical) microbiology (bacteriology, mycology, parasitology, and virology) Reverse genetics of RNA viruses: expression of viral genes and virus production.
Hobbies: Cooking and dining, soccer, wildlife viewing, and attending cultural events

Dr. John Lednicky has broad training and experience in microbiology and molecular biology, and performs both basic and applied research. He has worked with various bacteria, fungi, and viruses, some of which are select agents, in a variety of settings that include A/BSL3 laboratories. At the University of Florida, he engages in many multi-disciplinary projects that cover a range in topics, including aerobioogy, virus discovery, and research on the outcomes of inhaled nanoparticles on subsequent respiratory virus infections.

At his previous job at MRIGlobal, first as Principal Scientist, then as Senior Advisor, he managed and provided technical oversight and guidance for programs involving molecular biology, virology, and microbiology served as a corporate expert in the area of virology and molecular biology developed and directed research programs wrote and reviewed research proposals, technical reports, and presentations and managed technical aspects, schedules, and budgets of programs. While there, he established a ferret model for intranasal and aerosol studies with H5N1 and other influenza viruses.

His recent work includes detection and/or isolation of metapneumoviruses, unusual reassortant influenza A viruses, neurotropic Canine morbillivirus, an arenavirus, human and murine coronaviruses, the genetic characterization of a unique rhinovirus C and of a unique strain of human polyomavirus. The Lednicky laboratory also engineers cells that express specific virus receptors these cells facilitate the isolation and propagation of the viruses that bind the receptors. Finally, the laboratory also evaluates antivirals (synthetic and natural) in-vitro and has the experience to do so in animal models.


CRISPR discovery from Wuerzburg paves the way for novel COVID testing method

Most conventional molecular diagnostics usually detect only a single disease-related biomarker. Great examples are the PCR tests currently used to diagnose COVID-19 by detecting a specific sequence from SARS-CoV-2. Such so-called singleplex methods provide reliable results because they are "calibrated" to a single biomarker. However, determining whether a patient is infected with a new SARS-CoV-2 variant or a completely different pathogen requires probing for many different biomarkers at one time.

Scientists from the Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI) and the Julius Maximilians University (JMU) in Würzburg have now paved the way for a completely new diagnostic platform with LEOPARD. It is a CRISPR-based method that is highly multiplexable, with the potential to detect a variety of disease-related biomarkers in just one test.

How LEOPARD works

LEOPARD, which stands for "Leveraging Engineered tracrRNAs and On-target DNAs for PArallel RNA Detection," is based on the finding that DNA cutting by Cas9 could be linked to the presence of a specific ribonucleic acid (RNA). This link allows LEOPARD to detect many RNAs at once, opening opportunities for the simultaneous detection of RNAs from viruses and other pathogens in a patient sample.

The study published today in "Science" was initiated by Chase Beisel, professor at JMU and research group leader at HIRI, and Professor Cynthia Sharma from JMU's Institute of Molecular Infection Biology (IMIB). "With LEOPARD, we succeeded in detecting RNA fragments from nine different viruses,' says Beisel. "We were also able to differentiate SARS-CoV-2 and one of its variants in a patient sample while confirming that each sample was correctly collected from the patient."

CRISPR-Cas9 is principally known as a biomolecular tool for genome editing. Here, CRISPR-Cas9 function as molecular scissors that cut specific DNA sequences. These same scissors are naturally used by bacteria to cut DNA associated with invading viruses. Whether editing genomes or eliminating viruses, Cas9 cutting is directed by guide RNAs. The guide RNAs found in bacteria must pair with a separate RNA called the tracrRNA. The RNA couple then can work with Cas9 to direct DNA cutting.

Eine unerwartete Entdeckung

The tracrRNA was thought to only pair with guide RNAs coming from the antiviral system. However, the Würzburg scientists discovered that the tracrRNA was pairing with other RNAs, turning them into guide RNAs. Cynthia Sharma, Chair of Molecular Infection Biology II at the IMIB and spokesperson of the Research Center for Infection Diseases (ZINF) at JMU was astounded by this discovery: "When we searched for RNAs binding to Cas9 in our model organism Campylobacter, we surprisingly found that we detected not only guide RNAs, but also other RNA fragments in the cell that looked like guide RNAs. The tracrRNA was pairing with these RNAs, resulting in "non-canonical" guide RNAs that could direct DNA cutting by Cas9."

The LEOPARD diagnostic platform builds on this discovery. "We figured out how to reprogram the tracrRNAs to decide which RNAs become guide RNAs," says Beisel. "By monitoring a set of matching DNAs, we can determine which RNAs were present in a sample based on which DNAs get cut. As part of the ongoing pandemic, LEOPARD could allow a doctor to figure out whether the patient is infected with SARS-CoV-2, if it's a unique variant, and whether the sample was correctly taken or needs to be repeated--all in one test."

In the future, LEOPARD's performance could dwarf even multiplexed PCR tests and other methods. "The technology has the potential to revolutionize medical diagnostics not only for infectious diseases and antibiotic resistances, but also for cancer and rare genetic diseases," says Oliver Kurzai, director of JMU's Institute of Hygiene and Microbiology, which provided patient samples for the study.

"The work highlights the excellent collaborative and interdisciplinary research taking place here in Würzburg," says Jörg Vogel, director of IMIB and HIRI, a joint facility of JMU with the Helmholtz Center for Infection Research in Braunschweig. "LEOPARD impressively demonstrates that we can cover the full spectrum of complementary cutting-edge research in Würzburg, from the fundamentals of RNA research to clinical applications."

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Bemerkungen:

  1. Shakasida

    Es gab einen Mangel

  2. Akinozragore

    Kompetent geschrieben und sehr überzeugend, erzähl uns mal genauer, wie du es selbst herausgefunden hast

  3. Faushakar

    Und wie es sich um paraphrasieren?

  4. Narg

    Darin ist es auch für mich, dass es eine hervorragende Idee ist. Ganz mit Ihnen werde ich zustimmen.

  5. Daric

    Ich verstehe deine Logik nicht



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