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Probleme beim Western-Blot-Transfer

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Ich habe einige Probleme mit der Übertragungseffizienz auf Nitrozellulosemembranen. Um alle technischen Informationen aus dem Weg zu räumen:

Überweisungsmethode: Nasser Tanktransfer über Nacht bei 30 V mit normalem Tris-Glycin-Transferpuffer + 20 % Methanol. Ich mache das bei RT unter Rühren. Bemerkenswert: Ich habe mein Gel in letzter Zeit nicht in Transferpuffer äquilibriert, da berichtet wurde, dass dies den Transfer von basischen Proteinen aufgrund des Strippings von SDS verringert (ich kann diese Referenz liefern, wenn jemand interessiert ist).

Stichprobe: In allen Fällen handelt es sich um in vitro rekonstituierte Nukleosomen mit oder ohne bestimmte Enzyme - die Hauptübertragungsprobleme sind die Kernhistone, die stark basisch sind (pI 10-11). Es sollten nicht mehr als etwa 100 ng jedes Histons pro Bahn übertragen werden. Das Salz in der Probe ist < 25 mM. Sie werden vor dem Laden gekocht. In den Proben gibt es vor oder nach dem Kochen keinen merklichen Niederschlag, jedoch ist das Volumen ziemlich klein (20 ul), sodass ich nicht unbedingt einen Niederschlag feststellen würde.

Nitrocellulose ist 0,2 um und wird vor dem Transfer in Transferpuffer voräquilibriert.

Das Gel: Ich verwende ein 15% Gel, 1,0-1,5 mm dick. Das von mir verwendete Acrylamid ist 37,5:1 Acrylamid:bis. Hier könnten einige Probleme auftreten - die Acrylamidlösung ist etwa 1 Jahr alt und wurde die ganze Zeit bei RT gelagert (was auf dem Etikett empfohlen wird). Darüber hinaus halten wir normalerweise einen Lagerbestand von 10% APS bei 4C, daher kann ich nicht garantieren, dass mein APS nicht schlecht geworden ist.

Ich habe im Allgemeinen sehr sorgfältig darauf geachtet, dass sich keine Blasen zwischen den Komponenten des Sandwiches befinden und Filterpapier / Schaumstoffkissen in Transferpuffer getränkt sind.

Nun zum Thema. Anbei Bilder der Membran nach dem Transfer (und auch nach der Verarbeitung, also der relativ hohe Hintergrund vom Blockierungspuffer) sowie des Gels nach dem Transfer. Wie Sie von Spur zu Spur sehen können, scheine ich unterschiedliche Übertragungseffizienzen zu haben. Dies ist bei meinen letzten drei Blots aufgetreten. Mein erster Gedanke war Probenniederschlag, aber ich hatte dieses Problem noch nie zuvor, obwohl ich im letzten Jahr im Wesentlichen den gleichen Blot viele Male ausgeführt habe.

Irgendwelche Gedanken? Ziemlich frustrierend, da es plötzlich mit identischen Protokollen/Reagenzien wie zuvor aufgetreten ist.


Das erste, was mir in den Sinn kommt, ist, dass die Übertragung übermäßig erscheint ... ist Histon nicht unter 20 kDa? Ich habe oft ähnlich große Proteine ​​bei 4C für 30 min, 30V übertragen.

Im Allgemeinen hemmt das Vorhandensein von SDS die Übertragungseffizienz, und eine Erhöhung des Alkoholgehalts in Ihrem TG-Puffer wird der Wirkung von vorhandenem SDS entgegenwirken. Vielleicht das Methanol auf 10 % senken? Ich wäre jedoch neugierig, diesen Hinweis in Bezug auf das SDS / die Vorabgleichung zu sehen. Das widerspricht sicherlich meinem Verständnis der Funktionsweise. (Hinweis: Ich wechsele zwischen Äquilibrieren oder Nicht-Äquilibrieren meiner Gele ohne beobachtbare Unterschiede.)

Wenn Ihr Acrylamid oder ACS schlecht geworden wäre, würde Ihr Gel nicht aushärten.

Wenn Sie dies noch nicht getan haben, würde ich vorschlagen, einen Bradford- oder BCA-Test für Ihre Proben durchzuführen, um sicherzustellen, dass Sie die gleiche Menge in jede Vertiefung laden. Wenn Sie mehr in jede Vertiefung geladen haben, kann dies den Anschein einer ungleichmäßigen Übertragung erwecken.

Um ehrlich zu sein, verstehe ich nicht wirklich, was Sie mit ungleichmäßigem Transfer meinen, basierend auf Coomassie und Ponceau. Wenn Sie einen Gradienteneffekt über einen großen Teil des Gels sehen, würde ich vorschlagen, dass Sie eine visuelle Überprüfung durchführen, um sicherzustellen, dass die von Ihnen gegossenen Gele über die gesamte Breite gleichmäßig verteilt sind. Ein dickeres Gel an einer Stelle als an einer anderen kann den Widerstand (Wärme) in diesem Teil des Gels und die Stoßübertragung beeinträchtigen. Wenn Sie eine Verschiebung der Übertragungseffizienz von Spur zu Spur sehen, würde ich lokale pH- oder Temperaturänderungen aufgrund einer ungleichmäßigen Beladung von Salzen, Proteinkonzentration oder Lipidkonzentration vorschlagen.

Hoffe das hilft!


Western Blot: Technik, Theorie und Fehlersuche

Western Blotting ist eine wichtige Technik in der Zell- und Molekularbiologie. Mithilfe eines Western-Blots sind Forscher in der Lage, spezifische Proteine ​​aus einem komplexen Gemisch von Proteinen zu identifizieren, die aus Zellen extrahiert wurden. Die Technik verwendet drei Elemente, um diese Aufgabe zu erfüllen: (1) Trennung nach Größe, (2) Übertragung auf einen festen Träger und (3) Markierung des Zielproteins unter Verwendung eines geeigneten primären und sekundären Antikörpers zur Visualisierung. In diesem Artikel wird versucht, die Technik und Theorie hinter Western Blot zu erklären und einige Möglichkeiten zur Fehlerbehebung aufzuzeigen.

Schlüsselwörter: Western Blot für biomedizinisches Forschungsprotein.

Interessenkonflikt-Erklärung

Interessenkonflikt: Keiner angegeben.

Figuren

Montiertes Gestell zur Gelverfestigung

Montiertes Gestell zur Gelverfestigung

Gellösung mit einer Transferpipette zugeben

Laufpuffer zum…

Laufpuffer in den Elektrophorator geben

Proben und molekularen Marker hinzufügen…

Fügen Sie dem Gel Proben und molekularen Marker hinzu, nachdem Sie die Kämme entfernt haben

(a) Proben, die durch die…

(a) Proben, die durch das Sammelgel laufen (niedrigere Spannung). (b): Proben, die durch…


Einführung

Western Blot wird normalerweise in der Analyse verwendet, um Proteine ​​zu trennen und zu etablieren. In diesem System wird eine Mischung von Proteinen hauptsächlich nach Molekulargewicht und damit nach Art mittels Gelelektrophorese getrennt. Diese Ergebnisse werden dann auf eine Membran übertragen, die für jedes Protein eine Bande erzeugt. Die Membran wird dann mit Markierungs-Antikörpern inkubiert, die speziell für das Protein der Neugierde sind.

Der ungebundene Antikörper wird abgewaschen, wobei nur der bestimmte Antikörper gegen das Kuriosum-Protein zurückbleibt. Die bestimmten Antikörper werden dann durch Wachsen des Films nachgewiesen. Da die Antikörper ausschließlich an das Kuriosum-Protein binden, ist nur eine Bande zu sehen. Die Dicke der Bande entspricht der Menge des Proteinstroms, so dass ein gewöhnlicher Mensch auf die Menge des Proteinstroms hinweisen kann. Das Papier wird zuerst das Protokoll für Western Blot beschreiben, begleitet von Filmmaterial, um dem Leser und einer Idee zu helfen, das Protokoll zu rationalisieren. Dies kann durch die theoretische Klärung des Prozesses und im späteren Teil durch Vorschläge zur Fehlerbehebung bei weit verbreiteten Problemen übernommen werden.

Technik

Zelllyse, um Protein zu extrahieren

Protein kann aus ganz anderen Proben gewonnen werden, die an Gewebe oder Zellen erinnern. Unten ist das Protokoll zum Extrahieren von Proteinen aus anhaftenden Zellen.

  1. Waschen Sie die Zellen in der Tissue-Tradition-Flasche oder -Schale, indem Sie kühle phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) einschließen und vorsichtig schütteln. PBS entsorgen. (Tipp: Bewahren Sie die Tissue-Tradition-Schale ganz auf Eis auf).
  2. Fügen Sie PBS hinzu und verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu entfernen. Pipettieren Sie die Kombination in Mikrozentrifugenröhrchen.
  3. Zentrifugieren Sie bei 1500 U/min für fünf Minuten und verwerfen Sie den Überstand.
  4. Fügen Sie 180 ul eiskalten Zelllysepuffer mit 20 ul zeitgenössischem Protease-Inhibitor-Cocktail hinzu. (Tipp: Wenn der Proteinfokus im Finish einfach nicht übermäßig genug ist, wird empfohlen, den Vorgang mit einem besseren Anteil an Protease-Inhibitor-Cocktail zu wiederholen).
  5. 30 Minuten auf Eis inkubieren und dann das Lysat durch 10-minütiges Schleudern bei 12.000 U/min bei 4 °C klar machen.
  6. Überstand (oder Proteinkombinat) auf Eis in ein modernes Röhrchen und Einzelhändler überführen oder bei -20°C oder -80°C einfrieren.
  7. Messen Sie den Fokus des Proteins mit einem Spektrophotometer.

Probenvorbereitung

  1. Bestimmen Sie die Menge an Proteinextrakt, um sicherzustellen, dass 50 μg in jedem effektiv sind.
  2. Fügen Sie dem Muster 5 μL Musterpuffer hinzu und gleichen Sie die Menge in jeder Spur mit doppelt destilliertem H . aus2O (dd H2Ö). Effektiv mischen. (Tipp: In der Regel wird eine Gesamtmenge von 15 μL pro Spur empfohlen).
  3. Erhitzen Sie die Proben mit einer trockenen Platte für fünf Minuten bei 100 °C.

Gelvorbereitung

  1. Nachdem Sie die 10%-Stapelgel-Antwort vorbereitet haben, bauen Sie das Gestell für die Gelverfestigung zusammen [Abbildung 1]. (Tipp: 10% AP und TEMED verfestigen die Antwort aufgrund dieser Tatsache, jedes Gel kann zur gleichen Zeit fertig sein, wenn die oben genannten Reagenzien normalerweise nicht bis zum oberen Rand hinzugefügt werden).
  2. Fügen Sie das Stapelgel vorsichtig hinzu, bis das Ausmaß der unerfahrenen Stange entspricht, die die Glasplatten hält [Abbildung 2]. H . hinzufügen2O zum Höchsten. Warten Sie 15–30 Minuten, bis das Gel verfestigt ist. (Tipp: Die Verwendung einer Saugpipette könnte das Einbringen des Gels auf die Glasplatte vereinfachen).In einem separaten Fenster öffnenAbbildung 2Gel-Antwort mit einer Umschaltpipette hinzufügen
  3. Überlagern Sie das Sammelgel mit dem Trenngel, nachdem Sie das Wasser entfernt haben. (Tipp: Es ist gesünder, das Gerät zu kippen und das Wasser mit einem Papiertuch zu entfernen).
  4. Setzen Sie den Kamm ein und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
  5. Warten Sie, bis das Gel verfestigt ist. (Tipp: Die Verfestigung kann einfach überprüft werden, indem etwas Gellösung in einem Röhrchen belassen wird).

Elektrophorese

  1. Gießen Sie den Arbeitspuffer in den Elektrophorator [Abbildung 3].In einem separaten Fenster öffnenAbbildung 3Fügen Sie dem Elektrophorator den Arbeitspuffer hinzu
  2. Das enthaltene Gel in den Elektrophorator einlegen und mit einem Beeinflussungsgerät verbinden. (Tipp: Wenn Sie sich mit dem Fähigkeitsangebot verbinden, verbinden Sie die ganze Zeit Purpur mit Purpur und Schwarz mit Schwarz).
  3. Stellen Sie sicher, dass der positive Puffer das Gel vollständig bedeckt, und nehmen Sie den Kamm sorgfältig ab.
  4. Laden Sie den Marker (6 μL), der von den Proben (15 μL) angenommen wird, effektiv in jeden [Abbildung 4].In einem separaten Fenster öffnenAbbildung 4Fügen Sie dem Gel Proben und molekularen Marker hinzu, nachdem Sie die Kämme beseitigt haben
  5. Lassen Sie das Gel mit niedriger Spannung (60 V) laufen, um das Gel zu trennen, verwenden Sie eine höhere Spannung (140 V), um das Gel zu stapeln [Abbildung ​[Abbildung5a5a und ​andbb].Abbildung 5(a) Proben, die mit dem Stapelgel arbeiten (Spannung verringern). (b): Proben, die mit dem Trenngel arbeiten (höhere Spannung)
  6. Lassen Sie das Gel etwa eine Stunde lang laufen oder bis der Farbstoffeingang von der Unterseite des Gels abläuft [Abbildung 6].Abbildung 6 Führen Sie das Gel zur Unterseite des Elektrophorators

Elektrotransfer

  1. 6 Filterschichten passend zur Messung des Gels zuschneiden und eine Polyvinylidenfluorid (PDVF)-Membran mit identischen Abmessungen.
  2. Befeuchten Sie den Schwamm und das Filterpapier in Wechselpuffer und befeuchten Sie die PDVF-Membran in Methanol.
  3. Trennen Sie die Glasplatten und entnehmen Sie das Gel.
  4. Erstellen Sie ein Switch-Sandwich wie folgt: Schwamm3 FilterpapiereGel PVDF3 Filterpapiere (Tipp: Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen zwischen dem Gel und der PVDF-Membran befinden und drücken Sie weitere Flüssigkeit heraus).
  5. Bringen Sie das Sandwich zum Schaltgerät, das auf Eis positioniert werden muss, um 4°C zu gewährleisten. Fügen Sie dem Gerät Weichenpuffer hinzu und stellen Sie sicher, dass das Sandwich mit dem Puffer überdacht ist. Platzieren Sie die Elektroden oben auf dem Sandwich und stellen Sie sicher, dass sich die PVDF-Membran zwischen dem Gel und einer optimistischen Elektrode befindet [Abbildung 7].Abbildung 7Der Transfer muss auf Eis durchgeführt werden
  6. Transfer für 90 Minuten [Abbildung 8]. (Tipp: Die Verarbeitungszeit muss proportional zur Dicke des Gels sein, daher kann diese bei 0,75-mm-Gelen auf 45 Minuten verkürzt werden).In einem separaten Fenster öffnenAbbildung 8Membran nach dem Umschalten

Blockierung und Antikörperinkubation

  1. Blockieren Sie die Membran mit 5% Magermilch in TBST * für 1 Stunde.
  2. Geben Sie den Hauptantikörper in 5% Rinderserumalbumin (BSA) hinzu und inkubieren Sie an einem einzigen Tag bei 4 °C auf einem Schüttler [Abbildung 9].Abbildung 9Verwenden Sie einen Schüttler, um die Membran mit dem Antikörper zu inkubieren
  3. Waschen Sie die Membran mit TBST für fünf Minuten. Tun Sie dies dreimal. (Tipp: Alle Wasch- und Antikörper-Inkubationsschritte müssen auf einem Schüttler bei Raumtemperatur durchgeführt werden, um eine gleichmäßige Bewegung zu gewährleisten).
  4. Fügen Sie sekundären Antikörper in 5% Magermilch in TBST hinzu und inkubieren Sie für 1 Stunde.
  5. Waschen Sie die Membran mit TBST für fünf Minuten. Mach das Dreimal
  6. Bereiten Sie den ECL-Mähdrescher vor (nach dem vom Hersteller gelieferten Verhältnis von Antwort A und B). Inkubieren Sie die Membran für 1–2 Minuten [Abbildung 10]. (Tipp: Verwenden Sie eine 1000-μl-Pipette, um sicherzustellen, dass ECL die höchste und die Rückseite der Membran bedeckt).
  7. Visualisieren Sie das Endergebnis im nächtlichen Raum [Abbildung 11]. (Tipp: Wenn der Hintergrund einfach zu robust ist, kürzen Sie die Werbezeit).

Rezept

  1. Das nächste in 800 ml destilliertem H . auflösen2Ö
    • 8.Acht g NaCl
    • 0,2 g KCl
    • 3g Trisbase
  2. Fügen Sie 500ul Tween-20 . hinzu
  3. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein
  4. Destilliertes H . hinzufügen2O bis 1L
  5. Sterilisieren durch Filtration oder Autoklavieren

Theorie

Probenvorbereitung

Zelllysate sind der am häufigsten verwendete Mustertyp für Western Blot. Die Proteinextraktion versucht, alle Proteine ​​im Zellzytosol zu sammeln. Dies muss bei kühlen Temperaturen mit Protease-Inhibitoren durchgeführt werden, um die Denaturierung der Proteine ​​zu stoppen. Da Gewebemuster ein besseres Konstruktionsdiplom aufweisen, ist eine mechanische Erfindung, die an Homogenisierung erinnert, oder Beschallung erforderlich, um die Proteine ​​zu extrahieren.

Nach der Extraktion des Proteins ist es äußerst wichtig, einen guten Vorschlag für den Fokus des Extrakts zu haben. Dies ermöglicht es dem Forscher schließlich, sicherzustellen, dass die Proben auf einer gleichwertigen Grundlage kontrastieren. Der Proteinfokus wird normalerweise unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen. Die Verwendung dieses Fokus ermöglicht es, die Masse des Proteins, das in jeden geladen wird, effektiv durch die Verbindung zwischen Fokus, Masse und Menge zu messen.

Nachdem die geeignete Menge des Musters ermittelt wurde, wird es direkt in einen Ladepuffer verdünnt, der Glycerin enthält, damit die Proben einfach in die Wells des Gels sinken. Im Puffer kann auch ein Überwachungsfarbstoff (Bromphenolblau) vorhanden sein, der es dem Forscher ermöglicht, zu sehen, wie weit die Trennung fortgeschritten ist. Das Modell wird erhitzt, nachdem es direkt in einen Ladepuffer verdünnt wurde, um die Konstruktion höherer Ordnung zu denaturieren, während Sulfidbrücken erhalten bleiben. Die Denaturierung der übermäßigen Konstruktion stellt sicher, dass die ungünstigen Kosten der Aminosäuren einfach nicht neutralisiert werden, sodass das Protein in einem elektrischen Bereich manövrieren kann (der während des gesamten Elektrotransfers verwendet wird).

Es kann auch entscheidend sein, optimistische und ungünstige Kontrollen für das Muster zu haben. Für ein optimistisches Management wird eine identifizierte Versorgung mit Zielprotein, die an gereinigtes Protein erinnert, oder ein Management-Lysat verwendet. Dies hilft, die Identifizierung des Proteins und die Aktivität des Antikörpers zu überprüfen. Ein ungünstiges Management besteht darin, dass eine Nullzelllinie, die an β-Aktin erinnert, genauso effektiv verwendet wird, um zu überprüfen, dass die Färbung einfach nicht unspezifisch ist.

Gelelektrophorese

Western Blot verwendet zwei verschiedene Arten von Agarosegelen: Stapel- und Trenngel. Das größere, stapelbare Gel ist kaum sauer (pH 6,8) und hat einen geringeren Acrylamid-Fokus, wodurch ein poröses Gel entsteht, das Proteine ​​schlecht trennt, es jedoch ermöglicht, dünne, scharf umrissene Banden zu bilden. Das Abnahmegel, das als Trenn- oder Auflösungsgel bezeichnet wird, ist primär (pH 8,8) und hat einen besseren Polyacrylamidgehalt, wodurch die Poren des Gels enger werden. Protein wird also auf diesem Gel durch ihre Messung extra so abgetrennt, weil die kleineren Proteine ​​extra einfach und damit schneller reisen als größere Proteine.

Die auf das Gel geladenen Proteine ​​haben ungünstige Kosten, da sie durch Erhitzen denaturiert wurden und bei Anlegen einer Spannung zur optimistischen Elektrode wandern. Gele werden oft hergestellt, indem sie zwischen zwei Glas- oder Kunststoffplatten gegossen werden, wobei die im Protokollteil beschriebene Antwort verwendet wird. Die Proben und ein Marker werden in die Wells geladen und die leeren Wells werden mit Musterpuffer beladen. Das Gel wird dann auf die Fähigkeit bezogen und ablaufen gelassen. Die Spannung ist wichtig, da eine zu hohe Spannung die Bänder überhitzen und verzerren kann.

Blotting

Nach der Trennung der Proteinkombination wird sie auf eine Membran übertragen. Der Schalter wird unter Verwendung eines senkrecht zum Gelboden ausgerichteten elektrischen Bereichs abgeschlossen, wodurch Proteine ​​aus dem Gel und auf die Membran manövriert werden. Die Membran wird zwischen dem Gelboden und der optimistischen Elektrode in einem Sandwich positioniert. Das Sandwich verfügt über ein Faserpolster (Schwamm) an jedem Finish und Filterpapiere zum Schutz des Gels und der Blotting-Membran [Abbildung 12]. Hier sind zwei Punkte entscheidend: (1) der geschlossene Kontakt von Gel und Membran, um ein transparentes Bild zu gewährleisten und (2) die Position der Membran zwischen dem Gel und der optimistischen Elektrode. Die Membran sollte so positioniert werden, dass die negativ geladenen Proteine ​​vom Gel zur Membran wandern können. Diese Art von Schalter wird als elektrophoretischer Schalter bezeichnet und kann in halbtrockenen oder feuchten Situationen ausgeführt werden. Nasse Situationen sind oft besonders zuverlässig, da es viel weniger wahrscheinlich ist, dass das Gel austrocknet, und es ist am beliebtesten für größere Proteine.Abbildung 12

Montage eines Sandwiches in Western Blot

Die Membran, die starke Unterstützung, ist ein wesentlicher Bestandteil dieses Kurses. Es gibt zwei Arten von Membranen: Nitrozellulose und PVDF. Nitrocellulose wird wegen seiner übermäßigen Affinität zu Protein und seiner Fähigkeit zur Retention verwendet. Es ist jedoch spröde und ermöglicht nicht die Verwendung der Membran zum Nachprüfen. In dieser Hinsicht bieten PVDF-Membranen eine höhere mechanische Unterstützung und ermöglichen eine erneute Sondierung und Speicherung des Blots. Allerdings ist der Hintergrund innerhalb der PVDF-Membranen größer und daher ist sorgfältiges Waschen unerlässlich.

Waschen, Blockieren und Antikörperinkubation

Das Blockieren ist ein wichtiger Schritt des Western Blotting, da es verhindert, dass Antikörper unspezifisch an die Membran binden. Das Blockieren erfolgt normalerweise mit 5% BSA oder fettfreier Trockenmilch, verdünnt in TBST, um den Hintergrund zu reduzieren.

Fettfreie Trockenmilch ist normalerweise am beliebtesten, da sie billig und in großem Umfang erhältlich ist. Milchproteine ​​sind jedoch in der Regel nicht mit allen Nachweismarkierungen geeignet, daher sollte sorgfältig über die geeignete Blockierungsantwort entschieden werden. BSA-Blockierungsoptionen sind beispielsweise bei Biotin- und AP-Antikörpermarkierungen sowie Antiphosphoprotein-Antikörpern am beliebtesten, da Milch Casein, das selbst ein Phosphoprotein ist, und Biotin enthält, was die Testergebnisse beeinträchtigt. Es ist normalerweise eine sehr gute Technik, den ersten Antikörper mit BSA zu inkubieren, da er oft in größeren Mengen als der sekundäre Antikörper benötigt wird. Das Einfügen in die BSA-Antwort ermöglicht die Wiederverwendung des Antikörpers, wenn der Blot kein gutes Endergebnis liefert.

Der Fokus des Antikörpers beruht auf der Anweisung des Herstellers. Der Antikörper kann in einem Waschpuffer verdünnt werden, der an PBS oder TBST erinnert. Das Waschen ist wichtig, da es den Hintergrund minimiert und ungebundene Antikörper entfernt. Allerdings sollte die Membran nicht sehr sehr lange gereinigt werden, da sie das Schild unter Umständen zusätzlich einkürzen kann.

Die Membran wird dann unter Verwendung des Markierungsantikörpers nachgewiesen, oft mit einem Enzym, das an Meerrettichperoxidase (HRP) erinnert, das durch das von ihm erzeugte Zeichen ähnlich dem Ort des Zielproteins nachgewiesen wird. Dieses Zeichen ist auf einem Film festgehalten, der oft in einem dunklen Raum entwickelt wird.

Quantifizierung

Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die mit einem Western Blot erzeugten Informationen oft als halbquantitativ angesehen werden. Dies liegt daran, dass es eine relative Vergleichbarkeit von Proteinbereichen liefert, jedoch kein absolutes Mengenmaß. Dafür gibt es zwei Ursachen: Erstens gibt es Variationen in der Beladung und Wechselladungen zwischen den Proben in separaten Bahnen, die auf separaten Blots völlig unterschiedlich sind. Diese Variationen müssen früher standardisiert werden, als eine besonders genaue Vergleichbarkeit hergestellt werden könnte. Zweitens ist das durch die Erkennung erzeugte Vorzeichen während der Fokusvariation der Samples nicht linear. Da das erzeugte Zeichen also nicht linear ist, sollte es nicht verwendet werden, um den Fokus zu modellieren.

Fehlerbehebung

Auch wenn der Prozess für Western Blot unkompliziert ist, können viele Probleme auftreten, die zu plötzlichen Ergebnissen führen. Der Nachteil kann in 5 Klassen eingeteilt werden: (1) ungewöhnliche oder plötzliche Streifen, (2) keine Streifen, (3) schwache Streifen oder schwache Zeichen, (4) übermäßiger Hintergrund auf dem Fleck und (5) fleckige oder ungleichmäßige Flecken auf der Fleck.

Ungewöhnliche oder plötzliche Banden können durch den Proteaseabbau entstehen, der Banden an plötzlichen Positionen erzeugt. In diesem Fall ist es ratsam, ein auf Eis gelagertes, zeitgemäßes Muster zu verwenden oder den Antikörper zu verändern. Wenn das Protein an einer zu übermäßigen Stelle zu sein scheint, kann das erneute Erhitzen des Musters helfen, den quartären Proteinaufbau zu unterbrechen. In ähnlicher Weise sind verschwommene Bänder manchmal auf eine übermäßige Spannung oder einen Luftblasenstrom im gesamten Schalter zurückzuführen. In diesem Fall muss sichergestellt werden, dass das Gel mit einer verringerten Spannung betrieben wird und das Switch-Sandwich korrekt bereit ist. Darüber hinaus kann auch das Ändern des Arbeitspuffers das Problem unterstützen. Nicht flache Bänder können das Ergebnis einer zu schnellen Fahrt mit dem Gel sein, die auf einen geringen Widerstand zurückzuführen ist. Um dies zu reparieren, muss das Gel an das Muster angepasst werden. Schließlich resultieren weiße (ungünstige) Streifen im Film aus einer übermäßigen Menge an Protein oder Antikörpern.

Ein weiterer Nachteil: Es können auch keine Banden auftreten, die auf viele Ursachen zurückzuführen sind, die mit dem verwendeten Antikörper, Antigen oder Puffer verbunden sind. Wenn ein falscher Antikörper verwendet wird, sowohl der Haupt- als auch der Sekundärantikörper, wird die Bande nicht angezeigt. Außerdem muss der Fokus des Antikörpers akzeptabel sein, denn wenn der Fokus einfach zu niedrig ist, wird das Vorzeichen nicht gesehen. Es ist wichtig zu bedenken, dass einige Antikörper normalerweise nicht für Western Blots geeignet sind. Ein weiterer Zweck für nicht sichtbare Banden ist der untere Fokus oder die Abwesenheit des Antigens. In diesem Fall kann Antigen aus einem anderen Vorrat verwendet werden, um zu überprüfen, ob das Problem am Muster oder an anderen Teilen liegt, z. B. am Antikörper. Darüber hinaus kann auch längeres Waschen das Vorzeichen senken. Puffer können ebenfalls zu dem Problem beitragen. Es muss sichergestellt werden, dass Puffer wie Switch Buffer, TBST, Working Buffer und ECL alle neu und nicht kontaminiert sind. Wenn die Puffer mit Natriumazid verunreinigt sind, kann es durchaus HRP inaktivieren.

In ähnlicher Weise können schwache Indikatoren auf einen geringen Fokus von Antikörpern oder Antigenen zurückzuführen sein. Die Erhöhung der Werbezeit kann auch dazu beitragen, die Band klarer zu machen. Ein anderer Zweck könnte fettfreie Trockenmilch sein, die das Antigen maskiert. Verwenden Sie in diesem Fall BSA oder verringern Sie die verwendete Milchmenge.

Ein hoher Hintergrund ist normalerweise auf einen zu starken Fokus des Antikörpers zurückzuführen, der an PVDF-Membranen binden könnte. Ein weiterer Nachteil könnten die Puffer sein, die zu früher sein können. Eine Verlängerung der Waschzeit kann auch dazu beitragen, den Hintergrund abzusenken. Außerdem kann auch eine zu übermäßige Werbung zu diesem Nachteil führen. Daher ist es ratsam, ganz unterschiedliche Werbeanlässe zu überprüfen, um einen optimalen Zeitpunkt zu erzielen.

Fleckige und ungleichmäßige Flecken auf dem Fleck sind oft auf einen falschen Wechsel zurückzuführen. Wenn zwischen dem Gel und der Membran Luftblasen eingeschlossen sind, erscheint es im Film dunkler. Es kann auch notwendig sein, für alle Inkubationen einen Schüttler zu verwenden, damit es während der Inkubation nicht zu ungleichmäßigem Rühren kommt. Auch hier ist das Waschen von größter Bedeutung, um den Hintergrund effektiv zu reinigen. Dieser Nachteil kann auch auf Antikörper zurückzuführen sein, die an die Blockierungsmakler binden, in diesem Fall muss ein anderes Blockierungsmittel ausprobiert werden. Das Filtern des Blockierungsmittels kann auch dazu beitragen, einige Verunreinigungen zu entfernen. Schließlich kann dieser Nachteil auch auf die Aggregation des sekundären Antikörpers zurückzuführen sein. In diesem Fall muss der sekundäre Antikörper zentrifugiert und filtriert werden, um das Aggregat zu entfernen.Gehe zu:


Transferpuffer

Transferpuffer enthalten ein leitfähiges, starkes Puffermittel (z. B. Tris, CAPS oder Carbonat), um die Leitfähigkeit und den pH-Wert des Systems während des Transfers aufrechtzuerhalten. Außerdem kann Alkohol (Methanol oder Ethanol) im Transferpuffer enthalten sein, um die Bindung von Proteinen an Membranen zu fördern, und SDS kann hinzugefügt werden, um die Elution von Proteinen aus Gelen zu fördern.

Kompatibler Transferpuffer nach Geltyp

Geltyp Transferpuffer Western Blotting Transfersystem
SDB-SEITE Towbin mit oder ohne SDS, CAPS, Carbonat, Bjerrum Schafer-Nielsen Tank-Blotting oder Semi-Dry-Blotting
Tris-Tricine Towbin, CAPS Empfohlenes Tankblotting erfordert eine Membran mit hoher Kapazität und kleiner Porengröße Der pH-Wert des Puffers kann kritisch sein
Nativ, nicht denaturierend Abhängig vom pH-Wert des Gelpuffers und dem pI des interessierenden Proteins Um die Aktivität aufrechtzuerhalten, ist möglicherweise eine vom Tank Blotting empfohlene Temperaturregelung erforderlich
Saurer Harnstoff 0,7% Essigsäure Verwenden Sie das Säure-Gel-Transferprotokoll (Membran in Richtung Kathode)

SDB und Alkohol

SDS und Alkohol spielen bei einer Übertragung gegensätzliche Rollen. SDS fördert die Elution des Proteins aus dem Gel und in Fällen, in denen bestimmte Proteine ​​schwer aus dem Gel zu eluieren sind, kann dem Transferpuffer SDS zugesetzt werden. SDS im Transferpuffer verringert jedoch die Bindungseffizienz des Proteins an die Nitrozellulosemembran PVDF-Membran kann, falls gewünscht, ersetzt werden.

Alkohol hingegen entfernt das SDS aus SDS-Protein-Komplexen und verbessert die Bindung des Proteins an die Nitrozellulosemembran. Alkohol kann jedoch eine Verringerung der Porengröße des Gels, eine Ausfällung einiger Proteine ​​und eine positive Ladung oder Neutralität einiger basischer Proteine ​​verursachen.

Empfohlener Transferpuffer nach Anwendung

Anwendung Empfohlener Transferpuffer
Hochmolekulare Proteine Towbin mit SDB
Kleine Proteine ​​und Peptide Towbin, CAPS
Basische Proteine ​​(pI > 9) in denaturierenden Gelen CAPS, Karbonat, Bjerrum Schafer-Nielsen
Basische Proteine ​​(pI > 9) in nativen oder nicht denaturierenden Gelen 0,7% Essigsäure
Glykoproteine Towbin mit oder ohne SDS, CAPS, Carbonat, Bjerrum Schafer-Nielsen nicht denaturierende Gele
Proteoglykane Towbin, Bjerrum Schäfer-Nielsen

Tipps zum Transferpuffer

  • Verwenden Sie dieselbe Charge Transferpuffer nicht mehr als einmal, da der Puffer wahrscheinlich seine Fähigkeit verliert, während des Transfers einen stabilen pH-Wert aufrechtzuerhalten
  • Verdünnen Sie die Transferpuffer nicht, dies verringert auch die Pufferkapazität
  • Passen Sie den pH-Wert von Transferpuffern nicht an, wenn dies nicht angegeben ist, da dies die Pufferleitfähigkeit erhöht, was sich in einer höheren anfänglichen Stromabgabe und einem verringerten Widerstand äußert

Konstitutive Aktivität in Rezeptoren und anderen Proteinen, Teil B

Mercedes Dosil, James B. Konopka, in Methods in Enzymology, 2010

7.2 Western-Blot-Analyse der Rezeptorproteinproduktion

Die Western-Blot-Analyse ist eine weitere sehr bequeme Methode zum Nachweis von in Hefe produzierten Ste2-Proteinen. Wir verwenden einen dreifachen HA-Tag, der ein sehr empfindliches Erkennungsniveau bietet ( Dosil et al., 2000). Die Herstellung von Hefezellextrakten erfordert das Aufbrechen der Zellwand. Der mechanische Aufschluss durch Verwirbeln von Zellen mit Glasperlen ist am einfachsten und wird hier beschrieben. Ganze Zellextrakte können analysiert werden, aber die Sensitivität kann durch die Analyse einer rohen Membranfraktion erhöht werden. Methoden zur Trennung des Proteinextrakts durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Übertragung auf Nitrocellulose sind gängige Verfahren, die an anderer Stelle ausführlich beschrieben werden ( Sambrook et al., 1989 ).

Säurebehandelte 450 µm Glasperlen (z. B. Sigma Kat.# G8772).

TE/PP-Puffer: 100 mm NaCl, 50 mlm Tris-HCl (pH 7,5), 1 mm EDTA, 100 µg/ml PMSF, 2 µg/ml Pepstatin A.

PAGE Sample-Puffer (8 m Harnstoff, 3% SDB, 25 mm Tris (pH 6,8), 0,01 % Bromphenolblau, 0,01 % Xylolcyanol).

Züchte eine 50-ml-Hefekultur auf eine Dichte von etwa 1 × 10 7 Zellen/ml (OD660 = 0,5–1). Entweder YPD oder ein synthetisches Medium können verwendet werden.

Zentrifugenröhrchen und Puffer auf Eis kühlen.

Etwa 2,5 × 10 8 Zellen in ein konisches 50 ml-Röhrchen überführen und Zellpellet durch Zentrifugation bei 1000 × gewinneng für 5min.

Zellpellet mit 10 ml sterilem Wasser waschen und Zellen dann erneut durch Zentrifugation für 5 min pelletieren.

Zellpellet in 1 ml sterilem Wasser resuspendieren und in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen übertragen.

Zentrifugieren bei 14.000×g 30 s in einer Mikrozentrifuge und entfernen Sie dann den Überstand. (Die Zellen können zu diesem Zeitpunkt bei -70 °C gelagert oder bis zum Gebrauch auf Eis gelegt werden.)

Resuspendieren Sie 2,5 × 10 8 Zellen in 250 μl TE/PP-Puffer und fügen Sie 250 μl Glaskügelchen hinzu.

Zellen bei sehr hoher Geschwindigkeit 1 min vortexen. Kippen Sie das Rohr so, dass die Glasperlen maximal zerschmettern, um die Hefezellwände zu durchbrechen. 1 min auf Eis inkubieren, um die Probe kühl zu halten und Proteolyse zu verhindern. Dreimal wiederholen.

Übertragen Sie den Zellextrakt in ein frisches Röhrchen (lassen Sie die Glasperlen zurück).

Zentrifuge bei niedriger Geschwindigkeit (330×g) für 5 min bei 4 °C, um ungebrochene Zellen zu entfernen.

Übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei Höchstgeschwindigkeit für 15 min bei 4 ° C in einer Mikrofuge, um Membranen zu pelletieren.

Das rohe Membranpellet kann sofort verwendet oder bei −70 °C gelagert werden.

Lösen Sie das rohe Membranpellet in 100 μL 2 × PAGE-Ladepuffer auf. Erwärmen Sie die Röhrchen 10 min bei 37 ° C, bevor Sie das Gel laden. GPCR-Proben nicht kochen, da sie sonst aggregieren.

Zentrifugieren Sie bei Höchstgeschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge für 3 min vor dem Laden und führen Sie dann Gelelektrophorese und Western Blot gemäß Standardverfahren durch.


Schritt 5: Erkennung

Das verwendete Nachweisverfahren hängt von dem Enzym ab, an das der sekundäre Antikörper konjugiert ist. Das am häufigsten beim Western Blotting verwendete Enzym ist HRP, und das zum Nachweis verwendete Substrat ist als chemilumineszierendes Substrat bekannt.

Nachdem das Substrat hinzugefügt wurde, kann das emittierte Licht mit einem Film oder einem Foto-Imager erfasst werden.

Beachten Sie, dass der Film keine Informationen darüber enthält, wo sich die beleuchteten Bänder in Bezug auf die Membran befinden. Daher ist es sehr wichtig, ein Verfahren zu verwenden, das es ermöglicht, den Film genau auf die gleiche Weise wie beim Belichten des Films mit der Membran auszurichten. Üblicherweise wird die Membran nach dem Nachweisschritt angefärbt, damit das vorhandene Protein sichtbar gemacht und mit dem Film verglichen werden kann.


Chemilumineszenz-Detektion

Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.

  1. Bereiten Sie den Untergrund gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
  2. Legen Sie den Blot in einen Behälter und fügen Sie Substrat hinzu, um die Membran vollständig zu bedecken.
    1 Minute inkubieren.
  3. Überschüssiges Substrat abtropfen lassen.
  4. Legen Sie den Blot auf ein sauberes Stück Glas und wickeln Sie ihn in Plastikfolie ein.
    Notiz: Es kann auch eine zuschneidbare Schutzfolie oder ein Gefrierbeutel verwendet werden.
  5. Glätten Sie vorsichtig alle Luftblasen.
  6. Legen Sie die eingewickelte Membran in einem dunklen Raum in eine Filmkassette.
  7. Legen Sie ein Blatt Autoradiographiefilm darauf und schließen Sie die Kassette.
  8. Film aussetzen. Mehrfachbelichtungen von 15 Sekunden bis 30 Minuten sollten durchgeführt werden, um die optimale Belichtungszeit zu bestimmen 1 bis 5 Minuten sind üblich.

Western Blot Doctor™ — Blot-Hintergrundprobleme

28.02.23 09:30 AE,AI,AL,AM,AR,AT,AU,AZ,BA,BD,BE,BF,BG,BH,BN,BO,BR,BW,CA,CH,CL ,CM,CN,CO,CR,CY,CZ,DE,DK,DO,DZ,EC,EE,EG,EH,ER,ES,ET,FI,FM,FO,FR,GA,GE,GF,GH ,GP,GR,GT,GU,HK,HN,HR,HT,HU,ID,IE,IL,IN,IS,IT,JM,JO,JP,KE,KH,KR,KW,KZ,LB,LI ,LK,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,ML,MO,MQ,MS,MT,MU,MX,MY,NG,NI,NL,NO,NP,NZ,OM,PA,PE ,PF,PG,PH,PK,PL,PR,PS,PT,PW,PY,QA,RO,RS,RU,SA,SB,SE,SG,SI,SK,SN,ST,SV,TG,TH ,TN,TO,TR,TT,TW,TZ,UA,UG,UK,US,UY,UZ,VA,VE,VU,XK,YE,ZA,VN und LSR /LSR/Technologies/Western_Blotting N 0

Der Western Blot Doctor ist eine Anleitung zur Selbsthilfe, mit der Sie Ihre Western Blot-Probleme beheben können. In diesem Abschnitt finden Sie Lösungen für Probleme mit dem Blot-Hintergrundsignal.

Andere Abschnitte im Western Blot Doctor:

Probleme und Lösungen

Klicken Sie auf das Miniaturbild, das für Ihren eigenen Fleck am repräsentativsten ist, um die wahrscheinlichen Ursachen zu ermitteln und spezifische Lösungen für das Problem zu finden.

Problem: Weiße Flecken oder Regionen auf dem Fleck

Schaumstoffpads für Bio-Rad Nasstank-Blotting-Systeme:

  • Mini Trans-Blot ®-System (1703933)
  • Kriterium&Trade Blotter (1704086)
  • Trans-Blot-System (1703914)
  • Trans-Blot Plus-System (1703995)

As a diagnostic test, you can check transfer quality by imaging proteins on the gel and blot. If planning to use the blot in downstream steps, make sure that your stain can be removed or is compatible with antibody detection. For example, Coomassie and colloidal gold are not compatible with downstream steps (see Bio-Rad Protein Stains and the Protein Stain Selection Guide).

  • High-intensity transfers in tank blotting sample can cause buffer heating, leading to bubble formation ensure that buffer remains cool
    • Reduce current, and increase transfer time to compensate
    • Perform transfer in tank apparatus placed in ice or a temperature-controlled (4°C) room
    • Chill buffers before use
    • Use a cooling coil or &ldquoblue ice&rdquo insert in the cell
    • Mini Trans-Blot System (1703919)
    • Criterion Blotter (1704076, 1704087)
    • Trans-Blot System (1703912)
    • Trans-Blot Plus System (1703990)
    • Nitrocellulose: White regions on the nitrocellulose membrane indicate dry areas where protein will not bind. If wetting does not occur immediately by immersion of the sheet in transfer buffer, heat distilled water until just under boiling point and soak the membrane until completely wet. Equilibrate in transfer buffer until ready to use
    • PVDF: White regions on PVDF membrane indicate areas where the membrane was either inappropriately prewetted or allowed to dry out. Because of the hydrophobic nature of PVDF, the membrane must be prewetted in methanol prior to equilibration in aqueous transfer buffer. Once wet, do not allow membrane to dry out. If the membrane dries, rewet in methanol and re-equilibrate in TBS-T (caution: may adversely affect downstream detection processes)

    Problem: High background on blot

    • Increase the concentration of blocker (e.g., 3&ndash5% BSA, casein, or nonfat dry milk)
    • Increase the duration of the blocking step (overnight at 4°C instead of 1 hour at room temperature, or a longer incubation at room temperature)
    • Increase temperature at which blocking is performed, (up to room temp)
    • Use a different blocking reagent (albumin, gelatin, BSA, casein, or nonfat dry milk)
    • More blocking reagents:
    • Use a pure protein such as BSA or casein as a blocker (see Detergents and Blocking Reagents)
    • Do not reuse blocking buffers
    • Reduce incubation time with detection substrate
    • If using colorimetric reagent, remove the blot from the substrate solution when the signal-to-noise level is acceptable, and immerse in deionized water
    • Reduce/optimize primary and/or secondary antibody concentrations
    • Use a dot-blotting trial to optimize antibody concentrations
    • Reduce/optimize incubation times
    • Make sure all incubation trays are fully cleaned between experiments
    • Use disposable trays
    • Excessive protein loading
    • Too much SDS in transfer buffer
    • Excess protein loading:
    • Reduce the amount of protein on gel
    • Optimize sample loading see Determining the Appropriate Sample Load for Western Blots Protocol
    • Reduce concentration of SDS in transfer buffer
    • Add second membrane sheet to bind excess protein
    • Try other blocking reagents, e.g., albumin, gelatin, BSA, casein, or nonfat dry milk (see Bio-Rad Detergents and Blocking Reagents and more Blocking Reagents)
    • Do not use milk to block membranes when using avidin-biotin system because milk contains biotin
    • Increase length and/or number of washing steps (minimum of 5 x 5 min)
    • Use larger volume of wash buffer
    • Use a shorter exposure time
    • Use multi-acquisition feature on data acquisition software
    • Film users:
      • Wait 5&ndash10 minutes and then re-expose blot to film (film)
      • Reduce exposure and/or development time (film)
      • Consider switching to a digital imaging system such as Bio-Rad&rsquos ChemiDoc&trade Imaging Systems
      • Make sure membrane is thoroughly wetted when beginning procedure
      • Repeat procedure taking care that the blot does not dry out during any step by using sufficient volumes and agitation throughout
      • Make sure membrane remains submerged in incubation and wash buffers throughout all steps
      • Use a fresh aliquot of antibody that has been stored at &ndash20°C or below
      • If storing an antibody for a very long period of time may want to store at &ndash80°C
      • Make aliquots of antibody and only thaw one at a time as needed for blots
      • Avoid repeated freeze-thaw cycles
      • Try a lower incubation temperature such as 4°C
        Note: will need to increase incubation time
      • Try nitrocellulose instead (see Western Blotting Membranes)
      • Increase stringency of washing steps:
      • Use TBS containing 0.05&ndash0.1% Tween 20
      • Try a stronger detergent such as NP-40
      • Use fresh buffers
      • Filter all buffers through a 0.2 µm filter before using for washing or blocking and before adding antibody

      Problem: Blotchy or patchy background

      • Use a shaker during all incubation steps
      • Make sure membrane is thoroughly wetted when beginning procedure
      • Repeat procedure taking care that the blot does not dry out during any step by using sufficient volumes and agitation throughout. Make sure blot is always submerged
      • Do not handle membrane with bare hands. Always wear clean gloves, and handle blots with clean forceps whenever possible
      • Make sure electrophoresis equipment, blotting equipment, and incubation trays are clean and free of contaminants
      • Avoid touching the blot to surfaces
      • Increase washing buffer volume
      • Use a shaker during all incubation and wash steps
      • Avoid stacking blots in a single incubation container
        • When stacking blots in a single incubation container, ensure that sufficient flow of buffer exists between blots. The blots should move freely past each other with agitation during incubation and wash steps

        Problem: Uneven spots on blot or speckled background

        • Spin secondary antibody and/or filter to remove aggregates
        • Make sure blocking reagent is fully dissolved in buffer prior to use
        • Make fresh buffers if making blocking buffer from dry reagents
        • Check premade blocking buffers for precipitates before use
        • Add 0.05&ndash0.1% Tween 20 to blocking buffer
        • Filter blocking buffer through 0.2 µm filter before use
        • Wash blot with washing buffer before incubation with antibodies
        • Try a different blocking reagent, e.g., albumin, gelatin, BSA, casein, or nonfat dry milk (see Bio-Rad Detergents and Blocking Reagents and more Blocking Reagents)
        • Remove all residual acrylamide gel traces from surface of membrane following transfer before proceeding with downstream steps
        • Check that scanning and cassette surfaces are clean
        • Use fresh buffers. Make a new batch of buffer and repeat blot
        • Filter buffers for blocking and washing through 0.2 µm filter
        • Wrapping blots in plastic wrap or heat-sealed bags is a good safeguard against both particulate contamination and blot dehydration at the image acquisition step

        Problem: Gel cassette shadow transferred to blot (tank blotters)

        • Clean or replace foam pads
          • Foam pads for Bio-Rad wet tank blotting systems:
            • Mini Trans-Blot ® System (1703933)
            • Criterion&trade Blotter (1704086)
            • Trans-Blot System (1703914)
            • Trans-Blot Plus System (1703995)
            • Reduce amount of protein on the gel
            • Optimize sample loading see Determining the Appropriate Sample Load for Western Blots Protocol
            • Reduce the amount of SDS in transfer buffer
            • Add second membrane sheet to bind excess protein
            • Prepare fresh transfer buffer. Make a new batch of buffer and repeat blot
            • Filter buffers for blocking and washing through 0.2 µm filter

            02/28/23 09:30 AM AE,AI,AL,AM,AR,AT,AU,AZ,BA,BD,BE,BF,BG,BH,BN,BO,BR,BW,CA,CH,CL,CM,CN,CO,CR,CY,CZ,DE,DK,DO,DZ,EC,EE,EG,EH,ER,ES,ET,FI,FM,FO,FR,GA,GE,GF,GH,GP,GR,GT,GU,HK,HN,HR,HT,HU,ID,IE,IL,IN,IS,IT,JM,JO,JP,KE,KH,KR,KW,KZ,LB,LI,LK,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,ML,MO,MQ,MS,MT,MU,MX,MY,NG,NI,NL,NO,NP,NZ,OM,PA,PE,PF,PG,PH,PK,PL,PR,PS,PT,PW,PY,QA,RO,RS,RU,SA,SB,SE,SG,SI,SK,SN,ST,SV,TG,TH,TN,TO,TR,TT,TW,TZ,UA,UG,UK,US,UY,UZ,VA,VE,VU,XK,YE,ZA,VN en LSR /LSR/Technologies/Western_Blotting N 0


            Schau das Video: Western Blot - Theory and method (Kann 2022).