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Nachweis von nuklearer DNA in Suspension von Mitochondrien

Nachweis von nuklearer DNA in Suspension von Mitochondrien


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Gibt es eine Möglichkeit, nukleäre DNA in einer Suspension von Mitochondrien nachzuweisen, die aus Leukozyten extrahiert wurden? Ich muss sicherstellen, dass sich keine nukleäre DNA in der Suspension befindet, bevor ich mtDNA aus den Mitochondrien extrahiere.


Zentrifugieren Sie die Suspension in Cäsiumchlorid-Lösung bei einem bestimmten g-Wert, der dazu führt, dass sich die Mitochondrien am Boden des Zentrifugenröhrchens absetzen, aber die nukleäre DNA hinterlässt, die eine Schicht nahe der Oberseite des Zentrifugenröhrchens bildet. Dies liegt daran, dass die Kern-DNA weniger dicht ist als die Mitochondrien. Mit einer Nadelspritze einen kleinen Teil der zentrifugierten Suspension ganz unten aus dem Zentrifugenröhrchen entnehmen. Dieser Extrakt enthält höchstwahrscheinlich keine nukleäre DNA. Hoffe das hilft :).


Abteilungsleiter, forensische Prüfer, Biologen, DNA-Techniker, DNA-Programmspezialisten, Management- und Programmanalysten und Vertragsangestellte.

Die Analyse von Desoxyribonukleinsäure (DNA) kann in Körperflüssigkeitsflecken und anderen biologischen Geweben vorkommen, die aus Beweismitteln gewonnen wurden. Die DNA-Testergebnisse aus Beweisproben werden mit DNA aus Referenzproben von bekannten Personen verglichen. Solche Analysen können Opfer und Verdächtige miteinander, mit Beweismitteln oder einem Tatort in Verbindung bringen. Das FBI kann je nach Bedarf nukleare, Y-Chromosom- und/oder mitochondriale DNA-Tests an Beweisproben durchführen.

Serologie

Die DCU führt serologische Untersuchungen durch, um Körperflüssigkeiten wie Blut und Sperma auf Beweismitteln nachzuweisen und zu charakterisieren.

Kern-DNA

Nukleare DNA (nDNA) ist die diskriminierendste und wird typischerweise analysiert, um Körperflüssigkeiten, Hautzellen, Knochen und Haare mit Gewebe an ihren Wurzelenden zu enthalten. Die Stärke von nDNA-Tests liegt in der Fähigkeit, eine Person als Quelle der DNA aus einem Beweisstück zu identifizieren oder eine Person als Mitwirkenden des DNA-Beweises auszuschließen.

Der Y-Chromosom-DNA-Test ist eine Form des nuklearen DNA-Tests, der spezifisch für das männliche Chromosom, auch als Y-Chromosom bekannt, ist. Diese Art von Tests kann bei sexuellen Übergriffen, Vermissten und Geheimdienstfällen nützlich sein. Das Y-Chromosom wird als kompletter Satz vom Vater auf den Sohn übertragen, daher hat jeder in der väterlichen Linie das gleiche Y-Chromosom-Profil. Da mehrere Verwandte das gleiche Y-Chromosom-Profil aufweisen, sind eindeutige Identifizierungen aus der Y-Chromosom-Analyse nicht möglich.

Mitochondriale DNA

Mitochondriale DNA (mtDNA) ist eine Form von DNA, die in einem vollständigen Satz von der Mutter auf das Kind übertragen wird, daher hat jeder in der mütterlichen Linie das gleiche mtDNA-Profil. Diese Art von DNA-Test kann bei Beweismitteln wie natürlich ausgefallenen Haaren, Haarfragmenten, Knochen und Zähnen nützlich sein. Die MtDNA-Analyse ist hochsensibel und kann es Wissenschaftlern ermöglichen, Informationen aus Beweisstücken im Zusammenhang mit Erkältungsfällen, vermissten Personen, Proben von Massenkatastrophen und kleinen Beweisstücken mit wenig biologischem Material zu erhalten. Da jedoch mehrere Personen das gleiche mtDNA-Profil aufweisen können, sind eindeutige Identifizierungen aus der mtDNA-Analyse nicht möglich.

Analysen

Die DCU bietet eine Verwandtschaftsanalyse, bei der es sich um einen Vergleich handelt, der durchgeführt wird, um die mögliche familiäre Verwandtschaft zwischen einem Beweiselement und einem bekannten Element mithilfe eines Softwareprogramms zu bestimmen. Die DCU bietet auch kriminelle Vaterschaftstests als Teil der kriminellen, nachrichtendienstlichen und vermissten Fallarbeit an. Gegebenenfalls werden DNA-Ergebnisse aus Beweisen in Bezug auf Kriminalfälle und vermisste Personen in das National DNA Index System (NDIS) hochgeladen.


Abstrakt

Mitochondriale Dysfunktion ist ein Kennzeichen des Alterns, und die Erhaltung der Mitochondrien kann zu einer erhöhten Gesundheitsspanne führen. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Signalübertragung vom Zellkern zu den Mitochondrien (NM-Signalübertragung) bei der Regulierung der mitochondrialen Funktion und des Alterns eine entscheidende Rolle spielt. Ein wichtiger Initiator der NM-Signalgebung ist die nukleäre DNA-Schädigung, die sich mit zunehmendem Alter anhäuft und zur Entwicklung altersassoziierter Erkrankungen beitragen kann. DNA-Schadens-abhängige NM-Signalgebung stellt ein Netzwerk dar, das nukleäre Sirtuine umfasst und die genomische Stabilität und die mitochondriale Integrität kontrolliert. Die pharmakologische Modulation des NM-Signalwegs ist ein vielversprechender neuer Ansatz für die Prävention und Behandlung altersassoziierter Erkrankungen.


Einzigartige Natur

Obwohl der größte Teil des genetischen Materials einer Zelle im Zellkern enthalten ist, besitzen die Mitochondrien ihre eigene zirkuläre DNA. Sie haben ihre eigene Maschinerie für die Proteinsynthese und vermehren sich durch Spaltung, ähnlich wie es Bakterien tun können. Es wird vermutet, dass Mitochondrien aufgrund der Unabhängigkeit von der nuklearen DNA und Ähnlichkeiten mit Bakterien durch Endosymbiose aus Bakterien entstanden sind. Mitochondriale DNA ist auf der Matrix lokalisiert, die auch eine Vielzahl von Enzymen sowie Ribosomen für die Proteinsynthese enthält.

Dieses Molekül wurde bei der Replikation gefangen. Die Pfeile zeigen die Punkte an, an denen die Replikation ablief, als die Moleküle für die Elektronenmikroskopie fixiert wurden. Das Genom des menschlichen Mitochondriums besteht beispielsweise aus einem zirkulären DNA-Molekül mit 16.569 Basenpaaren und einer Länge von etwa 5 µm. Die RNA und die von dieser DNA kodierten Polypeptide sind nur ein kleiner Bruchteil (ca. 5%) der Anzahl der RNA-Moleküle und Proteine, die das Mitochondrium benötigt.

Die Größe des mitochondrialen Genoms variiert zwischen den Organismen erheblich. Mitochondrien von Säugetieren haben typischerweise etwa 16.500 bp DNA, während die mitochondriale DNA von Hefe ungefähr fünfmal größer ist und die mitochondriale DNA von Pflanzen sogar noch größer ist. Ein Vergleich von Hefe- und menschlicher mitochondrialer DNA zum Beispiel legt nahe, dass der größte Teil der zusätzlichen DNA, die in den Hefe-Mitochondrien vorhanden ist, aus nicht-kodierenden Sequenzen besteht.


CRISPR-Bearbeitung von Mitochondrien: Vielversprechende neue Biotechnologie?

Quelle: Wikipedia

Obwohl das CRISPR/Cas9-System bei der Bearbeitung des Kerngenoms weit verbreitet ist, war es problematisch, es zur Bearbeitung des mitochondrialen Genoms zu verwenden. Die Haupthürden waren das Fehlen geeigneter Bearbeitungsstellen in der kleinen mtDNA und die traditionelle Schwierigkeit, die Leit-RNA in die mitochondriale Matrix zu importieren, wo auf Nukleoide zugegriffen werden kann.

Zwei kürzlich veröffentlichte Papiere deuten darauf hin, dass an beiden Fronten bedeutende Fortschritte erzielt werden. Der erste Artikel, veröffentlicht in der Zeitschrift WISSENSCHAFT CHINA Biowissenschaften, verwendeten CRISPR-Techniken, um Insertions-/Deletionsereignisse (InDel) an mehreren mikrohomologen Regionen der mtDNA zu induzieren. Diese InDel-Ereignisse wurden speziell durch Doppelstrangbrüche (DSB) ausgelöst. Die Autoren fanden heraus, dass die InDel-Mutagenese durch sgRNA-Multiplexing und einen DSB-Reparaturinhibitor namens Iniparib signifikant verbessert wurde, was auf eine Neuverdrahtung von DSB-Reparaturmechanismen zur Manipulation von mtDNA hindeutet. Im zweiten Artikel, veröffentlicht in der Zeitschrift Trends in der Molekularen Medizingeben die Forscher einen globalen Überblick über die jüngsten Fortschritte bei verschiedenen Formen der nuklearen und mitochondrialen Genombearbeitung.

Um mehr Einblick in einige dieser neuen Entwicklungen zu erhalten, habe ich mich an Payam Gammage gewandt, einen Experten für mitochondriale Bearbeitung mit einer nachgewiesenen Erfolgsbilanz bei der Perfektionierung einer etwas anderen Bearbeitungstechnologie auf der Grundlage von Zinkfingernukleasen (ZFNs). Diese Nukleasen sind in der Lage, doppelsträngige Mitochondrien zur Spaltung an genauen Basenpaarstellen anzugreifen und können daher heteroplasmatische Mitochondrien mit fehlerhaften Nukleoiden eliminieren. Vor kurzem hat Payam entdeckt, dass 25 der 30 am meisten mutierten Gene, die bei Krebs gefunden wurden, in mtDNA gefunden werden. Diese Mutationen treten bei etwa 60 % aller Tumoren an bestimmten Loci auf und verlängern, zumindest bei Dickdarmkrebs, die Lebenserwartung der Patienten sogar um

neun Jahre im Vergleich zu wtDNA. Über 70 % der kolorektalen Karzinome haben mindestens eine mtDNA, die bei Heteroplasmiekonzentrationen von mehr als 5 % gefunden wird.

Während Nukleasen schädliche Mutationen herausfiltern können, indem sie die richtigen Mitochondrien auswählen, muss eine Technologie, die sozusagen neue Varianten einspielen kann, noch perfektioniert werden. Während die in den obigen Artikeln beschriebenen Methoden für die CRISPR-Bearbeitung vielversprechend klingen, bezog sich Payam auf drei Hauptanliegen, die ihnen etwas Wind aus den Segeln nehmen.

Der erste Punkt ist, dass die Biowissenschaften Papier befasst sich nicht vollständig mit dem Thema, sgRNA auf Mitochondrien zu richten. Zweitens wurde zuvor eine Doppelstrangbruch-Religation auf sehr niedrigem Niveau in Säugetier-Mitos beschrieben. Cas9-Protein, das ohne gRNA in hohen Konzentrationen exprimiert wird, führt zu einer unspezifischen Doppelstrang-Induktion. Und drittens kann der von den Forschern verwendete DSB-Reparaturhemmer möglicherweise nicht das tun, was traditionell angenommen wurde. Mit anderen Worten, obwohl früher angenommen wurde, dass es die PARP (Poly(ADP-Ribose)-Polymerase hemmt), wurde später gezeigt, dass es auf verschiedenen Wegen funktioniert. Darüber hinaus ist PARP nicht einmal in den Mitochondrien lokalisiert.

Ein interessanter neuer Ansatz zur präzisen, zerstörungsfreien mitochondrialen Bearbeitung, der keine CRISPR-Techniken erfordert, wurde kürzlich von David Liu von Harvard und dem Broad Institute des MIT entdeckt. Sie werden seinen Namen vielleicht nicht wiedererkennen, obwohl er oft als der eigentliche Erfinder von CRISPR bezeichnet wurde, weil die höheren Mächte des modernen und fortschrittlichen Nobelkomitees der Meinung waren, dass er nicht in die Rechnung passte. Lius Methode beruht auf einem bakteriellen Toxin, DddA, das die Desaminierung von Cytosinen in doppelsträngiger DNA katalysiert. Durch die Zugabe eines Uracil-Glykosylase-Inhibitors und TALEN-ähnlichen Proteinen schuf Liu RNA-freie DddA-abgeleitete Cytosin-Basen-Editoren (DdCBEs), die C•G-zu-T•A-Umwandlungen in humaner mtDNA mit hoher Zielspezifität und Produktreinheit katalysieren können .

Um das Potenzial von DdCBEs weiter zu erforschen, bearbeitete Lius Gruppe erfolgreich fünf mitochondriale Gene: MT-ND1, MT-ND2, MT-ND4, MT-ND5 und MT-ATP8. Jeder, der etwas von dieser Technologie in die Hand nehmen möchte, kann auf die Plasmide zugreifen, die Liu bei Addgene hochgeladen hat. Zum Beispiel gibt es ein ND4-Konstrukt an der Stelle namens ND4-DdCBE-rechte Seite TALE, das ein pCMV-Rückgrat aufweist und in Säugerzellen exprimiert wird. Während die vollständige mitochondriale Bearbeitung spezifischer Basenpaare dem einfachen Spalten von mtDNA weit überlegen ist, bleibt die volle Allgemeingültigkeit des Ansatzes abzuwarten. Die Korrektur von Mutanten ist nur dann möglich, wenn die Fehler innerhalb der spezifischen Umwandlungen liegen, die der Editor durchführen kann.

Die Verfügbarkeit dieser Art von Technologie wirft die Frage auf, ob neue und vorteilhafte Formen der persistenten mitochondrialen Heteroplasmie geschaffen werden können oder nicht. Zum Beispiel kann es möglich sein, somatisch heteroplasmatische Mitochondrien einzuführen oder zu erzeugen, die besser an den Sauerstoffgehalt in großer Höhe angepasst sind oder eine verbesserte Thermogenese aufweisen. Jedenfalls ist es unwahrscheinlich, dass diese Manipulationen jemals vererbt werden könnten, wenn sie nicht in die Keimzellen gelangen. Abgesehen von Embryo-Champions mit drei Elternteilen, wäre das künstliche Einführen oder anderweitige Modifizieren der Mitochondrien im Ei der letzte (und gefährlichste) Ort, an dem jemand anfangen sollte, klinisch herumzumachen.

Kürzlich wurde festgestellt, dass ein merkwürdiges Wirbeltier namens Tuatara trotz einer Sequenzdivergenz von etwa 10 % zwei unabhängige Mitochondrienlinien beibehält. Dies ist im Tierreich ziemlich unbekannt, abgesehen von einigen zweischaligen Mollusken, von denen bekannt ist, dass sie unterschiedliche männliche und weibliche Mitochondrien biparental vererben. Große Unterschiede wurden für Kontrollregionen und Replikationsursprünge in der Tuataran mtDNA berichtet. Forscher schlagen vor, dass zwei divergente mt-Genome einem ungewöhnlich kältetoleranten Reptil einen adaptiven Vorteil verleihen können.

Beim Menschen besteht bei mehreren neurologischen und seltenen Erkrankungen ein großer Bedarf an mitochondrialer Bearbeitung. Zum Beispiel wurde Autismus mit einer G8363A-Transfer-RNA(Lys)-Mutation in Verbindung gebracht. Andere Studien haben kürzlich einen mitochondrialen Mangel gezeigt, der eine Missense-Mutation des ND6-Gens (ND6P25L) beinhaltet, die zu Mäusen mit ausgesprochen autistischen Endophänotypen führt. ND6 ist eine Untereinheit der NADH-Dehydrogenase, die Teil des respiratorischen Komplexes I ist. Obwohl Autismus notorisch mit Widersprüchen behaftet ist, wenn es darum geht, ursächliche Gene aus nuklearen GWAS-Studien zu ermitteln, kann die mitochondriale Bearbeitung in Tiermodellen ein direkterer Weg sein, um eine bessere Definition zu erhalten, und letztendlich heilen viele dieser Leiden, die eine signifikante zugrunde liegende mitochondriale Komponente haben.


Materialen und Methoden

DNA wurde extrahiert (12) und Bibliotheken wurden erstellt (3) aus Denisova 8 und Denisova 4. Die Bibliotheken wurden zur direkten Sequenzierung und zur Anreicherung von mtDNA verwendet (14). mtDNA-Genome wurden verwendet, um eine Bayessche Phylogenie (22, 23), Wattersons , paarweise Nukleotidunterschiede und Daten basierend auf der Verkürzung der Zweige abzuschätzen. Nukleare DNA-Sequenzen wurden verwendet, um Divergenzen entlang der Abstammungslinien zu Genomen mit hoher Abdeckung abzuschätzen und zu berechnen D-Statistik (24). Sehen SI-Anhang für Details.


Identifizierung abnormaler nuklearer und mitochondrialer Gene in Speiseröhrenkrebszellen

Urheberrecht: © Liu et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License vertrieben wird.

Dieser Artikel wird erwähnt in:

Abstrakt

Einführung

Das Plattenepithelkarzinom des Ösophagus (ESCC) ist eine der häufigsten bösartigen Erkrankungen weltweit, insbesondere in China, wo es die vierthäufigste krebsbedingte Mortalitätsursache ist (1). Im Gegensatz zu umfassend untersuchten Krebsarten wie Brust- und Dickdarmkrebs bleibt das Ergebnis des ESCC in den letzten Jahrzehnten unverändert, mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von 15–25 % (2). Im Allgemeinen beschränkt sich das Verständnis der genomischen Anomalien bei dieser Krankheit jedoch auf Berichte aus kleinen Kohorten (3–5). Fortschritte in der Next-Generation-Sequencing (NGS)-Technologie erleichtern die Identifizierung neuer krankheitsassoziierter Gene und versprechen, die klinische Routinediagnostik von Erbkrankheiten zu verändern. Seit den ersten Berichten im Jahr 2009 (6,7) hat NGS die Entdeckung von >50 neuen Krankheitsgenen in Forschungsumgebungen unterstützt. Daher besteht eine zwingende Notwendigkeit, genomische Anomalien, die ESCC durch NGS zugrunde liegen, umfassend zu identifizieren, einschließlich Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs), Insertionen/Deletionen (INDELs), Strukturvariationen (SVs) und anderen Informationsvariationen (8, 9), um die molekularen Grundlagen aufzuklären und die Entwicklung wirksamer zielgerichteter Therapien zu unterstützen.

In eingehenden Untersuchungen an Mitochondrien wurde mitochondriale DNA (mtDNA) an der Basalmembran der Mitochondrien identifiziert, die eine Art besonderes und einzigartiges genetisches Material darstellt, da sie sich außerhalb der Kerne befindet (10). Obwohl mtDNA eine unabhängige genetische Funktion hat, werden die meisten Proteine ​​(einschließlich der äußeren mitochondrialen Membran und der Matrixproteine) immer noch vom Kerngenom (nDNA) kodiert, darunter

1.500 Proteine ​​spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der mitochondrialen Funktionen (11). Die vorliegende Studie führte eine Hochdurchsatzsequenzierung an zwei ESCC-Zelllinien durch, um die gemeinsamen Merkmale der genomischen Variation in ESCC-Zellen zu bestimmen, ESCC-assoziierte abnormal exprimierte nDNA und mtDNA zu identifizieren und ihre Wechselwirkungen zu bestimmen, die eine wichtige Rolle beim Auftreten und der Entwicklung von ESCC . spielen , und liefert damit eine Richtung für die ESCC-Grundlagenforschung und eine wichtige experimentelle Grundlage für die klinische Behandlung von ESCC-Gen-Targeting-Therapien.

Materialen und Methoden

Zellgewinnung und Kultur

Die Ec9706-Zelllinie wurde vom National Key Laboratory of Molecular Oncology, Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing, China) bereitgestellt und die Eca109-Zelllinie wurde vom Labor, School of Pharmacy, Zhengzhou University (Zhengzhou, China) bereitgestellt. Die in flüssigem Stickstoff kryokonservierten Ec9706- und Eca109-Zellen wurden schnell entfernt und in ein Wasserbad bei 37 °C für 1 bis 2 Minuten Auftauen gegeben. Die Zellsuspension wurde dann mit einer geeigneten Menge RPMI-1640-Medium verdünnt, das 10 % fötales Rinderserum enthielt (beide von Beijing Solarbio Science and Technology Co., Ltd., Beijing, China). Nach Zentrifugation bei 173 x g bei Raumtemperatur für 5 min wurde der Überstand entfernt und Medium zugegeben dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt. Die Zellen wurden in einer geeigneten Menge Kulturmedium verdünnt, das 10 % fötales Rinderserum enthielt, die Zellen wurden in Kulturflaschen für die Kultur bei 37ºC und 5 % CO 2 ausgesät. Das Kulturmedium wurde am nächsten Tag ersetzt und anschließend wurden die Zellen routinemäßig kultiviert.

DNA-Extraktion

Genomische DNAs wurden gemäß den Anweisungen des DNA-Extraktionskits (Shanghai Genmed Pharmaceutical Technology Co., Ltd., Shanghai, China) extrahiert.

Die Konzentration und Reinheit der aus jeder Probe extrahierten genomischen DNA wurde dreimal mittels Ultraspuren-Spektrophotometrie (Multiskan MK3 Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) mit reinem Wasser als Kontrolle bestimmt und der Durchschnitt der drei Für die Berechnung wurden Messungen verwendet. Für reine genomische DNA sollte das Verhältnis von Extinktion bei 260 nm/Extinktion bei 280 nm nahe 1,8 liegen (>1,9, was auf RNA-Kontamination hinweist <1,6, was auf Protein- oder Phenol-Verunreinigung hinweist).

Hochdurchsatz-Sequenzierung

Der Hochdurchsatz-Sequenzierungsprozess wurde von Genewiz, Inc. (Beijing, China) durchgeführt. Der Arbeitsablauf des Experiments ist in 1 dargestellt. Genomische DNA wurde getestet und durch Ultraschall zufällig in handhabbare Fragmente zerlegt, um die Konstruktion einer Insert-Bibliothek zu erleichtern. Bei der Neusequenzierung des menschlichen Genoms wurden normalerweise Paired-End-Bibliotheken mit einer Spannengröße von 400–500 bp verwendet. Die DNA-Matrizenfragmente der konstruierten Bibliotheken wurden an die Oberfläche von Fließzellen hybridisiert und amplifiziert, um Cluster zu bilden, und dann mit dem Illumina HiSeq X-Sequenzierungssystem (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) sequenziert. Derzeit wird bei der Hochdurchsatz-Sequenzierung des gesamten Genoms eine Leselänge von 150 bp Paired-End-Sequenzierungsstrategie verwendet.

Abbildung 1.

Workflow der Hochdurchsatzsequenzierung.

Erkannte SNPs und INDELs wurden mit einer Sammlung umfassender funktioneller Annotationsdatenbanken annotiert, darunter 1000 Genomes Project, Cosmic, GWAS, PolyPhen-2, VISIFT, NHLBI, ClinVar, NCI60, YH-Genom, Gen-/Proteinstruktur, Keimbahnvariationen (dbSNP https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/) und funktionelle Elemente (Transkriptionsbindungsstellen, microRNA-Targets, konservierte Elemente). Strukturelle Variationen wurden erkannt und durch die chromosomalen Positionen annotiert. Auch Kopienzahlvariationen (CNV) wurden anhand der Lesetiefe berechnet und detailliert zusammengefasst.WGC024118D und WGC024119D waren die Sequenzierungs-IDs von Ec9706- bzw. Eca109-Zellen.

Datenanalyse

Die Probe bestand die Probenqualitätskontrolle und lieferte mit durchschnittlich 117,222 G Rohdaten nach Illumina-Passfilterung (PF) genügend hochwertige Sequenzierungsdaten. Der Durchgangsfilter war eine standardmäßige Standardverarbeitung von Illumina HiSeq-Sequenzern, um alle Lesevorgänge zu entfernen, die nicht der vom Illumina-Keuschheitsfilter gemessenen Gesamtqualität entsprechen. Die Keuschheit eines Basisrufs wurde als das Verhältnis der hellsten Intensität geteilt durch die Summe der hellsten und zweithellsten Intensitäten berechnet. Cluster haben den Filter bestanden, wenn nicht mehr als ein Base-Call in den ersten 25 Zyklen eine Keuschheit von <0,6 aufwies.

Ein umfassendes Annotationspaket mit 10 verschiedenen Datenbanken, darunter 1000 Genomes Project (http://www.internationalgenome.org), dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/), Cosmic ( http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic), GWAS (https://www.ebi.ac.uk/gwas/), PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2 /), VISIFT (http://sift.jcvi.org/), NCI60 (http://genome-www.stanford.edu/nci60/index.shtml), ClinVar (https://www.ncbi.nlm. nih.gov/clinvar/), YHgenome (http://www.yhdatabase.com/) und National Heart, Lung, and Blood Institute (https://www.nhlbi.nih.gov) wurde verwendet, um die bioinformatische Analyse von identifizierten SNPs, INDELs, CNVs und SVs aus den Sequenzierungsdaten.

Ergebnisse

Zusammenfassung der bioinformatischen Analyse

Die PF-Sequenzierungs-Reads wurden mit dem Burrows-Wheeler-Aligner (12) auf die humane Genomversion 19 (hg19) kartiert. Im Durchschnitt wurden 98,99 % der gesamten Genomregionen sequenziert und in diesem Probensatz wurde eine 39,35-fache kartierbare Reads-Abdeckung erreicht (Tabelle I).

Tabelle I.

Analyse der Datenabdeckung.

Tabelle I.

Analyse der Datenabdeckung.

Stichprobe der Qualitätskontrollstatistik WGC024118D WGC024119D
Paired-End-Leselänge 150*2 150*2
Gesamte effektive Datenausbeute (GB) 116.434 118.01
Gesamtzahl der Lesevorgänge (M) 776.23 786.73
Lese-Mapping-Rate 99.04% 98.70%
Korrekt gepaarte Mapping-Leserate 96.97% 96.81%
No-Mismatch-Mapping-Leserate 61.04% 60.11%
Rate nicht übereinstimmender Ausrichtungsbasen 0.77% 0.74%
Mittlere Abdeckungssequenzierungstiefe 39.1 39.6
Referenzgenomabdeckung 98.99% 98.99%
Referenzgenomabdeckung ≥4X 98.53% 98.53%
Referenzgenomabdeckung ≥10X 97.21% 97.28%
Referenzgenomabdeckung ≥20X 90.00% 90.49%
Duplizierungsrate der Polymerase-Kettenreaktion 8.62% 8.64%

SV-Erkennung und -Anmerkung

Die Kategorien von SV umfassen Insertionen, Duplikationen, Deletionen, Inversionen, wiederkehrende mobile Elemente und andere Umordnungen, die typischerweise als solche definiert werden, die 50 oder mehr Basenpaare abdecken ( 2 ). Insgesamt wurden 187 Strukturvarianten identifiziert, darunter sieben interchromosomale Translokationen, drei intrachromosomale Translokationen, keine Inversion, 177 große Insertionen oder Deletionen. Obwohl viele SVs nachgewiesen wurden, kann die Mehrheit der SVs häufig vorkommende SVs sein, die in normalen Proben vorhanden sind, oder aufgrund der Einschränkungen von NGS falsche Nachweise (Abb. 3).

Figur 2.

Nachweisergebnisse von partiellen Einzelnukleotidpolymorphismen. Das '+' oder '-' vor der Sequenz zeigt die Ausrichtung der Sequenzausrichtung für jede gelesene Fehlpaarung oder Insertion/Deletion in das hg19-Referenzgenom an sind braun Basen von niedriger Qualität (<20 phred Score) sind in Kleinbuchstaben und grau, wenn sie übereinstimmen das Referenzgenom.

Figur 3.

Strukturvariationsorte innerhalb der Chromosomen. Bei der Sequenzierung der Nestgeneration betrugen die Loci mit Strukturvariation auf Chr 1–12 ≥ 5 % und die Strukturvariation auf Chr 13–22, X und Y 3 %. Chr., Chromosom.

CNV und Anmerkung

Wie in 4 dargestellt, zeigten >40% Gene Zuwachs- oder Verlust-CNVs, und die Hauptform von CNV in WGC024118Ds war Verlust und in WGC024119D war es Zuwachs. Fast die Hälfte der Gene auf Chromosom 9 (Chr 9) und 11 in WGC024118D und WGC024119Ds hatten einen Gewinn oder Verlust, und fast die Hälfte der Gene auf Chr 10 in diesen beiden Proben hatte einen Gewinn oder Verlust.

Figur 4.

CNVs im Genom von Ec9706 (WGC024118D) und Eca109 (WGC024119D). (A) CNVs im gesamten Genom Der CNV-Änderungstrend im gesamten Genom besteht darin, dass Loci mit Gewinn oder Verlust >40% der gesamten Sequenzstellen ausmachen, die Hauptform von CNV in WGC024118D Verlust ist und für WGC024119D Gewinn ist. Rot zeigt Verlust an, Grün zeigt Verstärkung an und Blau zeigt eine Sequenz an, die der Referenz hg19 entspricht. (B) CNVs in WGC024118D und (C) WGC024119D. Fast alle Loci auf Chr 4, 17 und 18 in WGC024118D haben Gewinn oder Verlust von mehr als der Hälfte der Loci auf Chr 3, 9, 11, 13, 14, 19 und 20 in WGC024118D und Chr 1, 5, 7, 9 , 11, 20 und Y in WGC024119D haben Gewinn oder Verlust von fast der Hälfte der Loci auf Chr 6, 10, 22, X und Y in WGC024118D und Chr 3, 8, 10, 12, 13, 15 und 16 in WGC024119D haben Gewinn oder Verlust wenige Loci auf Chr 8, 12, 15, 16 und 17 in WGC024118D und Chr 4 und 22 in WGC024119D haben Gewinn oder Verlust, wobei eine nahezu normale Sequenz beibehalten wird. Rot zeigt Verstärkung an, Grün zeigt Verlust an und Blau zeigt normale Sequenz an. Chr., Chromosom.

Funktionale Anmerkungen von kurz INDEL

Loci mit INDEL in diesen beiden ESCC-Zelllinien traten überwiegend im Upstream, Downstream, Exon und Intron sowie unter den Genen auf, von denen Inter-Gen-INDEL die Mehrheit ausmachte (Tabelle II).

Tabelle II.

Zusammenfassung der Ergebnisse der INDEL-Erkennung.

Tabelle II.

Zusammenfassung der Ergebnisse der INDEL-Erkennung.

Besonderheit WGC024118D WGC024119D
Hohes Vertrauen INDEL-Nr. 740783 766563
Streichung 392984 408253
Einfügen 347799 358310
Heterozygoten 386393 409200
Homozygote 327829 330279
dbSNP 455370 (61.5%) 465321 (60.7%)
1000 Genome Projekt 237781 (32.1%) 239886 (31.3%)
N / A 17882 18327
3′UTR 6195 6354
5′UTR 810 865
3′ UTR5, UTR3 6 3
Stromabwärts 5402 5600
Exonisch 615 645
Exonisch, Spleißen 3 2
Intergene 403796 419365
Intronic 270105 277821
ncRNA 3′UTR 127 128
ncRNA 5′UTR 23 26
ncRNA 5′UTR, ncRNA 3′UTR 1 1
ncRNA exonisch 1241 1299
ncRNA-Intronik 29459 30801
ncRNA-Spleißen 13 14
Spleißen 91 95
Upstream 4851 5049
Stromaufwärts, stromabwärts 163 168
Exon-Frameshift-Löschung 99 108
Exon-Frameshift-Einfügung 87 89
Exon-Deletion ohne Frameshift 189 194
Exon-Einfügung ohne Frameshift 148 158
Exon Stopgain SNV 7 8
Exon-Stoploss SNV 1 2
Exon unbekannt 87 88

[i] INDEL, Insertions-/Deletions-UTR, untranslatierte Region SNV, Einzelnukleotidvariante NA, keine Annotation.

Wie in Tabelle III gezeigt, lagen die Basen mit kurzer Insertion oder Deletion zwischen 1–20 nt, und die mutierten mitochondrialen Proteine ​​umfassen mitochondriale Proteine ​​der Elektronenatmungskette, wie NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase-Untereinheit S5 (NDUFS5), Cytochrom-P450-Familie 27 Unterfamilie A Mitglied 1 (CYP27A1), Fettsäuremetabolismus-assoziierte Proteine, wie 3-Hydroxyisobutyryl-CoA Hydrolase (HIBCH), Acyl-CoA Dehydrogenase Familienmitglied 9 (ACAD9), ATP Energieerzeugung-assoziierte Proteine, wie ATP Synthase Mitochondriale F1-Komplex-Assembly-Faktor 1 (ATPAF1), und diese Proteine ​​sind alle nDNA-kodierende intramitochondriale Transportproteine.

Tabelle III.

Genetisches Screening von nuklearer DNA mit INDEL.

Tabelle III.

Genetisches Screening von nuklearer DNA mit INDEL.

Chr Start Ende Referenzsequenz Sequenzänderung QUALITÄT Änderungsverhältnis (%) Variationstyp Genstandort Gen Name (Beschreibung)
Chr 1 39500839 39500839 C 841.73 100 Streichung Stromabwärts NDUFS5 NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase-Untereinheit S5, (nukleares Gen, das mitochondriales Protein kodiert, Transkriptvariante 2)
Chr 1 45804431 45804431 T 819.73 100 Einfügen Intronic MUTYH mutY DNA Glycosylase, (nukleares Gen, das mitochondriales Protein kodiert, Transkriptvariante α3)
Chr 2 191091321 191091334 CAAAAAAAAAAAAA 1600.73 100 Streichung Intronic HIBCH 3-Hydroxyisobutyryl-CoA-Hydrolase (nukleares Gen, das mitochondriales Protein kodiert, Transkriptvariante 2)
Chr 2 219652424 219652424 CCTCTTACCTG 3035.73 100 Einfügen Intronic CYP27A1 Cytochrom P450 Familie 27 Unterfamilie A Mitglied 1 (nukleares Gen, das mitochondriales Protein kodiert)
Chr 3 179339343 179339343 GGTCTCGG 1811.73 100 Einfügen Intronic NDUFB5 NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase-Untereinheit B5 (nukleares Gen, das mitochondriales Protein kodiert, Transkriptvariante 1)
Chr 3 128614563 128614563 CTC 2388.73 100 Einfügen Intronic ACAD9 Acyl-CoA-Dehydrogenase-Familienmitglied 9 (nukleares Gen, das mitochondriales Protein kodiert, Transkriptvariante 1)
Chr 4 106312189 106312189 C 806.73 100 Einfügen Intronic PPA2 Pyrophosphatase (anorganisch) 2 (nukleares Gen, das mitochondriales Protein kodiert, Transkriptvariante 1)
Chr 4 89197868 89197875 GACTAGB 1078.74 100 Streichung Intronic PPM1K Proteinphosphatase, Mg 2+ /Mn 2+ abhängig, 1K (nukleares Gen, das mitochondriales Protein kodiert)
Chr 1 29538224 29538225 CT 1835.73 100 Streichung Intronic MECR Mitochondriale trans-2-Enoyl-CoA-Reduktase (nukleares Gen, das mitochondriales Protein kodiert)
Chr 1 47107042 47107042 g 1521.73 100 Einfügen Intronic ATPAF1 ATP-Synthase mitochondrialer F1-Komplex-Assembly-Faktor 1 (nukleares Gen, das mitochondriales Protein kodiert)

Funktionale Annotationen von SNP

Wie in Tabelle IV dargestellt, befinden sich die Loci mit SNP-Merkmalen in diesen beiden ESCC-Zelllinien im stromaufwärts, stromabwärts gelegenen Exon und Intron und innerhalb von Genen. Die Mehrzahl der Loci mit SNP-Merkmal war in Genen und in Exons lokalisiert.

Tabelle IV.

Zusammenfassung der SNP-Erkennungsergebnisse.

Tabelle IV.

Zusammenfassung der SNP-Erkennungsergebnisse.

Besonderheit WGC024118D WGC024119D
Hoch-Vertrauens-SNP-Nr. 3851527 3861523
Heterozygoten 1938738 1944372
Homozygote 1911032 1915229
dbSNP 3685859 (95.7%) 3694088 (95.7%)
1000 Genome Projekt 3520593 (91.4%) 3520791 (91.2%)
3′UTR 25886 25946
5′UTR 5578 5570
5′UTR, 3′UTR 10 12
Stromabwärts 23646 23744
Exonisch 23196 23198
Exonisch, Spleißen 6 7
Intergene 2255882 2264134
Intronic 1327100 1327665
ncRNA 3′UTR 615 618
ncRNA 5′UTR 97 105
ncRNA exonisch 9941 10103
ncRNA-Intronik 156029 156787
ncRNA-Spleißen 52 55
Spleißen 71 68
Upstream 22691 22772
Stromaufwärts, stromabwärts 727 739
Exon nicht synonym SNV 10720 10774
Exon Stopgain SNV 98 92
Exon-Stoploss SNV 15 13
Exon synonym SNV 11962 11915
Exon unbekannt 407 411

[i] SNP, Einzelnukleotidpolymorphismus UTR, untranslatierte Region SNV, Einzelnukleotidvariante.

Darüber hinaus waren die mitochondrialen Proteingene mit SNP-Eigenschaften hauptsächlich in Exons lokalisiert (Tabelle IV), einschließlich nDNA-kodierender intramitochondrialer Transportproteine, wie der mitochondrialen trans-2-Enoyl-CoA-Reduktase (MECR), die mit dem Fettsäuremetabolismus assoziiert ist Proteine ​​wie 3-Hydroxymethyl-3-methylglutaryl-CoA-Lyase (HMGCL), HIBCH und MECR, ATP-Energieerzeugungs-assoziierte Proteine ​​wie ATPAF1 und Succinat-Dehydrogenase-Komplex. Alle diese Proteine ​​sind nDNA-kodierte intramitochondriale Transportproteine.

Diskussion

Onkogene und Tumorsuppressorgene spielen eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Entwicklung von Tumoren. Veränderungen der mtDNA in Tumorgewebe haben ein zunehmendes Forschungsinteresse gefunden. Es wurde zuvor darauf hingewiesen, dass verschiedene solide Tumoren und hämatologische Malignome unterschiedliche mtDNA-Mutationen, -Deletionen und Mikrosatelliten-Instabilitäten an verschiedenen Stellen aufweisen, die mit dem Auftreten einer Vielzahl von Tumoren in Verbindung gebracht werden können (13). In den letzten Jahren vermuten immer mehr Forscher, dass die Interaktionen zwischen mtDNA und nDNA am tumorigenen Prozess beteiligt sind (14). Im Vergleich zu nDNA hat mtDNA eine höhere Mutationsrate aufgrund der schlechten Korrekturfähigkeit der mtDNA-replizierenden DNA-Polymerase und der Umgebung mit hohen Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Darüber hinaus weist mtDNA hologische Merkmale auf, bei denen sich Mutationen entlang der matriarchalen Linie kontinuierlich akkumulieren und die Akkumulation von Mutationen das Risiko einer Tumorentstehung erhöht (9). Darüber hinaus weist mtDNA mehr Polymorphismen auf (15), die als signifikante Sequenzunterschiede zwischen verschiedenen Rassen und in verschiedenen Regionen auftreten. Es ist bekannt, dass die Funktion der mtDNA an der Tumorentstehung bei Kopf-Hals-Tumoren (16), Blasenkrebs (10), Brustkrebs (17) und Lungenkrebs (11) beteiligt ist. Hu et al. (18) identifizierten auch Magenkrebs- und Speiseröhrenkrebs-assoziierte Gene durch Ganzgenom-Sequenzierung, einschließlich p53, Janus-Kinase 3, BRCA2, Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2, F-Box und WD-Repeat-Domäne mit 7, mutS-Homolog 3, Patched 1, Neurofibromin 1, ErbB-2-Rezeptor-Tyrosinkinase 2 und Checkpoint-Kinase 2 und identifizierte Anzahl neuer potenzieller krebsassoziierter Gene, einschließlich KISS1-Rezeptor, Anti-Müller-Hormon, Motoneuron und Pankreas-Homöobox 1, WNK-Lysin-defiziente Proteinkinase 2, THAP-Domäne mit 12 Darüber hinaus wurde berichtet, dass bestimmte Chromosomen Mutationen in >30% der Tumorgene aufweisen, einschließlich MACRO-Domäne, die 2 enthält, fragile Histidin-Triade (FHIT) und Parkin-RBR-E3-Ubiquitin-Proteinligase (18). Allerdings wurde bisher selten über die Anwendung der Sequenzierung des gesamten Genoms zum Nachweis mitochondrialer Veränderungen in ESCC-Zelllinien berichtet. Daher war die Identifizierung von nDNA- und mtDNA-Mutationen mit dem Auftreten und der Entwicklung von ESCC verbunden, und die Untersuchung ihrer Auswirkungen auf das Auftreten und die Entwicklung von ESCC ist wichtig für die Entwicklung neuer ESCC-Gen-Targeting-Therapien.

Der Nachweis von SVs kann dazu beitragen, die Mechanismen der Genmutation bei Krebs zu untersuchen, die biologischen Unterschiede zu verstehen und neue therapeutische Angriffspunkte zu identifizieren. Die Komplexität und Mutationsmechanismen von SVs im gesamten ESCC-Genom sind jedoch noch unklar. Cheng et al (19) berichteten über Chromosomenanomalien bei malignen metastasierten ESCCs und die Funktion von SVs-abgeleiteten Zielgenen in diesen abnormalen Chromosomen sind vielfältig, was darauf hindeutet, dass die SVs-Karte des gesamten Genoms wichtig für die Prävention, Diagnose und Behandlung von ESCCs ist. In der vorliegenden Studie wurden viele SVs nachgewiesen, die meisten der SVs können jedoch übliche SVs sein, die in normalen Proben vorhanden sind, oder die falschen Nachweise aufgrund der Einschränkung von NGS. Die Kategorien struktureller Varianten umfassen Insertionen, Duplikationen, Deletionen, Inversionen, wiederkehrende bewegliche Elemente und andere Umordnungen. In der aktuellen Studie wurden insgesamt 187 SVs identifiziert, darunter sieben interchromosomale Translokationen, drei intrachromosomale Translokationen und 177 große Insertionen oder Deletionen. Die Loci mit SVs auf Chr 1–12 der beiden ESCC-Zelllinien waren 5 %, während diejenigen mit SVs auf Chr 13–22, X und Y ≤ 3 % betrugen. Die in dieser Studie nachgewiesenen SVs von mitochondrialen Genen können wichtige Informationen für weitere Studien zu den nDNA- und mtDNA-Mutationen und zur Rolle beim Auftreten und der Entwicklung von ESCC liefern.

Veränderungen der DNA-Kopienzahl in Tumorzellen sind genetische Schlüsselereignisse bei der Entwicklung und dem Fortschreiten menschlicher Krebserkrankungen (20). Diese Veränderungen sind typischerweise das Ergebnis genomischer Ereignisse, die Zuwächse und Verluste von Chromosomen oder chromosomalen Regionen bewirken. Verluste und Zuwächse von DNA können zu Veränderungen in der Expression von Tumorsuppressorgenen und Onkogenen beitragen. Daher kann die Identifizierung von Veränderungen der DNA-Kopienzahl in Tumorgenomen helfen, kritische Gene zu identifizieren, die mit Krebs in Verbindung stehen, und schließlich therapeutische Ansätze zu verbessern. Fehler während der Mitose und Meiose können zu Duplikationen oder Deletionen von Genen auf chromosomaler Ebene führen. Diese Unterschiede werden als CNV bezeichnet, die die Gesundheit tiefgreifend beeinträchtigen und zu verschiedenen Störungen führen können. In dieser Studie wurden CNVs basierend auf der Lesetiefe identifiziert. Miyawaki et al (21) untersuchten die wichtige Rolle des MYC- und FHIT-Gens CNV bei der Auswahl der optimalen Behandlungsstrategie in der Strategie bei resezierten ESCC-Patienten. Die Detektionsergebnisse von CNV der aktuellen Studie zeigten, dass >40% der Gene einen Gewinn oder Verlust zeigten. Fast die Hälfte der Loci auf Chr 9 und 11 in WGC024118D und WGC024119D zeigten einen Gewinn oder Verlust, und fast die Hälfte der Loci auf Chr 10 zeigte einen Gewinn oder Verlust, was darauf hindeutet, dass der Nachweis von CNV in ESCC für die Identifizierung der onkogenen Gengewinne des Genoms und in . wichtig ist Gene, die an der Tumorentstehung beteiligt sind.

Die Ergebnisse der SNPs- und INDELs-Sequenzierung zeigen die möglichen funktionellen Auswirkungen. Cao et al. (22) verwendeten die gesamte Exon-Sequenzierung und zeigten viele genetische Heterogenitäten innerhalb der ESCC. Xu et al. (23) untersuchten zuvor die Polymorphismen der ESCC-Phosphatase und des Tensin-Homolog-Gens in der chinesischen Han-Population und die Interaktionen zwischen den Genen. In ähnlicher Weise wurde der Nachweis einer kurzen Insertion und Deletion in Genen angewendet, um die Genmutationen von ESCC nachzuweisen (24, 25). Die Detektionsergebnisse von SNPs und INDELs in der aktuellen Studie zeigten potenzielle nachteilige Veränderungen, die potenziell wichtige Funktionen haben und mit der Genregulation verbunden sind, einschließlich Transkriptionsfaktorbindung, microRNA-Target, konservierte Elemente. Die Loci zwischen den Genen traten INDEL auf und hatten SNP-Merkmale, die die Mehrheit ausmachten, und diese von Genen kodierten Proteine ​​umfassen mitochondriale Proteine ​​der Atmungskette der Elektronen, wie CYP27A1, Proteine, die mit dem Fettsäurestoffwechsel assoziiert sind, wie HIBCH und ACAD9, nDNA- kodierend für intramitochondriale Transportproteine, wie MECR, und ATP-Energieerzeugungs-verwandte Proteine, wie ATPAF1. Die Sequenzierungsergebnisse zeigen auch, dass der Nachweis von SNPs und INDELs als Grundlage für die Entwicklung der Gentherapie dienen kann.

Unter bestimmten Bedingungen kann mtDNA durch mitochondriale Defekte auch Auswirkungen auf die nDNA haben, was zu entsprechenden Veränderungen der Genexpression führt. Dieser Vorgang wird als reverse Regulation bezeichnet (26). Diese umgekehrte Regulation ist mit Störungen der nDNA-Expression, mtDNA-Mutationen, der Atmungsfunktion und der Hemmung der mitochondrialen Proteinsynthese verbunden. Diese umgekehrte Regulation ist auch am Prozess der Apoptose beteiligt, bei dem mitochondriale Schäden die Permeabilität der mitochondrialen Membran erhöhen können direkt in die Zellkerne transportiert werden, wodurch die Expression bestimmter Gene in den Zellkernen induziert und die apoptotische Kaskade ausgelöst wird. Es wird auch vorgeschlagen, dass die umgekehrte Regulation auch mit dem ROS-Weg oder dem Verhältnis von ATP/ADP in Zusammenhang steht (26). In der vorliegenden Studie liefert die identifizierte nDNA-kodierte mtDNA mit SVs, CNV, SNPs und INDELs eine gute experimentelle Grundlage und Ideen, um die Zusammenhänge zwischen nDNA und mtDNA beim Auftreten und der Entwicklung von ESCC zu untersuchen.

Die Tumorentstehung hängt nicht nur von intranuklearem genetischem Material ab, sondern ist auch eng mit ektonukleärer mtDNA verbunden. Als Zentrum des biologischen Stoffwechsels und der Energieumwandlung sind mitochondriale Genomreplikation, Genexpression, Atmungskettenfunktion und Mitochondrien-assoziierte Zellfunktion untrennbar mit nDNA verbunden. nDNA- und mtDNA-Veränderungen führen zu entsprechenden Veränderungen der mitochondrialen Funktionen. Die Transkription, Replikation und Translation von mtDNA benötigt eine Vielzahl unterschiedlicher nDNA-Produkte, und die Störungen von nDNA-Produkten sind auch mit mtDNA-Mutationen und Biosynthesehemmung mitochondrialer Proteine ​​verbunden. Diese Veränderungen können zu verschiedenen Erkrankungen führen und spielen insbesondere bei der Entstehung und Entwicklung von Tumoren eine entscheidende Rolle. Somit können nDNA-kodierte mtDNA-Proteinvarianten in Ec9706 und Eca109, die in dieser Studie mittels Hochdurchsatz-Sequenzierung nachgewiesen wurden, eine sehr zuverlässige theoretische Grundlage und Datenunterstützung für die Gen-Targeting-Therapien von ESCC liefern.

In dieser Studie war die identifizierte mtDNA mit abnormaler Transkription, Duplikation und Translation in Ec9706- und Eca109-Zellen durch Hochdurchsatzsequenzierung eng mit den Störungen von nDNA-Produkten verbunden.Diese Studie zu dieser nDNA-assoziierten mtDNA und der Interaktion zwischen beiden ist wichtig für die Grundlagenforschung für ESCC, wies die Richtung auf und lieferte eine sehr zuverlässige theoretische Grundlage für die Gen-Targeting-Therapien von ESCC in der Klinik.

Danksagung

Diese Studie wurde durch den First Batch of Science and Technology Plan Projects of Zhengzhou im Jahr 2013 (Grant-Nr. 131PCXTD628), das Fundamental and Advanced Technology Research Project of Henan Province (Grant-Nr. 132300410409) und den Medical Science and Technology Plan Program Grant unterstützt der Provinz Henan (Zuschuss Nr. 201401009).

Verweise

Zhao P, Dai M, Chen W und Li N: Krebstrends in China. Jpn J Clin Oncol. 40:281–285. 2010. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI


MATERIALEN UND METHODEN

Arabidopsis thaliana Wachstum und Mutanten:

Arabidopsis-Pflanzen wurden durch Kältebehandlung (4°) und anschließendes Aussäen der Samen direkt in Topfmischung (Metro Mix 360) gezüchtet. Die Pflanzen wurden mit einer 8-Stunden-Tage-Länge bei 24° für 8 Wochen gezüchtet und dann auf eine 16-Stunden-Tage-Länge überführt. Zwei MSH1 Mutanten wurden für die Studie verwendet: msh1-1(A bdelnoor et al. 2003) und Salk_041951. Die RECA3 Die Mutantenlinie Sail_252_C06 wurde auch für genetische Analysen verwendet (The Arabidopsis Information Resource, http://www.Arabidopsis.org).

DNA-Gel-Blot und PCR-Assays:

Die gesamte genomische DNA wurde aus oberirdischen Geweben von Blütenpflanzen unter Verwendung des DNeasy Plant Mini Kits (Qiagen) extrahiert. Gesamt-RNA wurde mit TRIzol-Reagenz (Invitrogen) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem RNeasy Mini-Kit (Qiagen) gereinigt. DNA-Gel-Blot und Hybridisierungen waren wie zuvor beschrieben (Janska und Mackenzie 1993). Primer, die zur PCR-Amplifikation von Repeats verwendet werden, sind in den Begleitinformationen aufgeführt (Tabelle S1).

Quantitative PCR:

Gleiche DNA-Mengen wurden für die quantitative PCR unter Verwendung des SYBR GreenER-Kits für iCycler (Invitrogen) verwendet. Die quantitative PCR-Datensammlung und -analyse wurde mit der iCycler iQ-Software (Version 3.1 Bio-Rad) durchgeführt. Die Experimente wurden wiederholt, jede Probe wurde dreifach durchgeführt und die Ergebnisse wurden gemittelt. Primer, die für die Echtzeitanalyse von Regionen in den Molekülen B und D bzw. A und C verwendet wurden, waren RealBDF (5′-ATTCCATCCACTCCGGCTTAGCTT-3′) und RealBDR (5′-TCGCTGTGAAAGG TGGAATCCGTT-3′) und RealACF (5 -ATGTAGAGCCAACTGGAGAGCA-3′) und RealACR (5′-CGGAAAGCCCAAATTCTCCTGCAT-3′).

Bioinformatische Analysen:

BLAST und blast2seq (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi) wurden verwendet, um wiederholte Sequenzen innerhalb des mitochondrialen C24-Genoms mit einer Wortgröße von 50 Nukleotiden zu identifizieren. Dieser Prozess identifizierte 104 verschiedene Wiederholungen, Wiederholungen A–Z und AA–ZZ, in absteigender Reihenfolge des BLAST-Scores. Jedes Wiederholungsexemplar wurde nummeriert (z.B., Repeat A-1 und Repeat A-2) und unterscheiden sich durch die flankierenden Sequenzen. Die 33 größten der Zwischenklasse von Wiederholungen, von 108 bis 556 bp, sind in Abbildung 1A und Tabelle S2 angegeben. Die meisten Wiederholungen waren nur in zwei Kopien vorhanden, mit Ausnahme von H, V, FF, NN, OO und RR, die in drei Kopien und BB in vier Kopien vorhanden waren.

Um Wiederholungen in den mitochondrialen Sequenzen von Sorghum, Tabak und Mais zu identifizieren, wird die Software REPuter (K ​​urtz et al. 2001) verwendet und seine Ergebnisse wurden mit einem Perl-Skript verarbeitet, das entworfen wurde, um enge Erscheinungen der Wiederholungen zu filtern. Um mitochondriale Genome des Ökotyps zu kartieren, generierte ein in Perl geschriebenes Skript ein Netzwerk, dessen Knoten die Regionen zwischen den Wiederholungen sind und dessen Bögen Beweise für Verknüpfungen auf demselben Molekül anzeigen, wobei Informationen verwendet wurden, die aus der DNA-Gel-Blot-Analyse aus den wiederholten Regionen für jeden Ökotyp gewonnen wurden. Ein Schaltkreis in diesem Netzwerk entspricht einer Karte des mitochondrialen Genoms, und für jeden Ökotyp wurden zirkuläre Karten dieser Schaltkreise erstellt. Locus-Identifikatoren der Arabidopsis Genome Initiative sind MSH1 (At3g24320) und RECA3 (At3g10140).


Tiere.

Männliche Lewis (RT11) und DA (RT1A a,b) Ratten wurden von Harlan Sprague-Dawley (Indianapolis, IN) bezogen und im Alter von 7 bis 8 Wochen verwendet. Die Tiere wurden in einer pathogenfreien Einrichtung der Johns Hopkins Medical Institutions gehalten. Die Tiere wurden gemäß den NIH-Richtlinien und gemäß einem vom Animal Care Committee der Johns Hopkins University genehmigten Protokoll gepflegt.

Orthotope Lebertransplantation.

Die orthotope Lebertransplantation wurde gemäß einem zuvor beschriebenen Verfahren durchgeführt. 15 Die Lebertransplantate wurden vor der Reperfusion 1 Stunde in kalter (4 °C) Kochsalzlösung (0,9 %) konserviert. Die Leberarterie wurde nicht rekonstruiert. Drei Kombinationen wurden ausgewählt: (1) ein Modell der syngenen Lebertransplantation (Lewis in Lewis) (2) ein Modell der chronischen Allotransplantatakzeptanz (Lewis in DA) und (3) ein Modell der akuten Allotransplantatabstoßung und des Todes in 10 bis 12 Tagen (DA in Lewis). Das Überleben des Allotransplantats wurde durch das Überleben des Empfängers bestimmt und die Abstoßung wurde histologisch bestätigt.

Verwaltung von Enbrel.

Enbrel ist ein dimeres Fusionsprotein, das aus dem extrazellulären Liganden-bindenden Teil des menschlichen 75-kDa-TNF-Rezeptors besteht, der mit dem Fc-Teil von menschlichem IgG1 verbunden ist. Die Inaktivierung von TNF-&agr; wurde durch wiederholte intraperitoneale Injektion von 10 mg/kg Enbrel alle 2 Tage (Tage 0, 2, 4, 6, 8) nach orthotoper Lebertransplantation durchgeführt. Kontrolltiere erhielten gleichzeitig Kochsalzlösung. In ausgewählten Experimenten wurden Hepatozyten isoliert und Lebergewebe wurde von Enbrel-behandelten Ratten am Tag 10 nach der Transplantation geerntet.

Isolierung und Kultur von Hepatozyten.

Hepatozyten wurden aus transplantierten Lebern oder nicht-transplantierten Lewis-Ratten unter Verwendung einer 2-stufigen Collagenase-Perfusion nach dem von Seglen beschriebenen Verfahren isoliert. 16 Die Lebensfähigkeit der anfänglichen Zellsuspension von Hepatozyten lag typischerweise zwischen 80 und 90 % (Trypanblau). Isolierte Hepatozyten wurden entweder zur Isolierung der Mitochondrien oder in vitro TNF-α-Behandlung. Zum in vitro Assay wurden isolierte Hepatozyten in Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 50 nmol/L Dexamethason (Sigma, St. Louis, MO), 20 mmol/L HEPES, 0,5 mg/L Insulin (Sigma), 1 mmol . inokuliert /L Ascorbinsäure-2-phosphat und Penicillin/Streptomycin in einer Dichte von 1,5 × 10 5 Zellen/cm 2 . Alle Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C/5 % CO . gehalten2 für 3 Tage, und dann wurde das Medium 24 Stunden vor der Stimulation vollständig durch serumfreies und Dexamethason-freies Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium ersetzt. Zur Stimulation wurden Hepatozyten rekombinantem TNF-&agr; (BioSource International, Camarillo, CA) in verschiedenen Konzentrationen ausgesetzt und weitere 16 Stunden in Kultur gehalten.

ELISA-Assay zur Messung von 8-OHdG-Spiegeln in mtDNA in Hepatozyten.

Die Spiegel von 8-OHdG in mtDNA wurden durch ELISA gemessen. Kurz gesagt wurden Hepatozyten in 5 ml 50 mmol/l Tris-HCl (pH 7,4) mit 50 Hüben des Dounce-Homogenisators homogenisiert. Die Homogenate wurden bei 800 °C zentrifugiertg 10 Minuten lang, um die Kernfraktion auszufällen. Der Überstand wurde erneut bei 7.000 zentrifugiertg 10 Minuten lang, um die mitochondriale Fraktion zu erhalten. Die mtDNA wurde mit dem DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Santa Clara, CA) nach Herstellerangaben extrahiert. Kurz gesagt wurden 5 µg Nuklease P1 (Roche, Indianapolis, IN) zu 20 µg (für kultivierte Hepatozyten) oder 50 µg (für Hepatozyten aus Lebertransplantaten) isolierten mtDNA-Proben zugegeben. Nach dem Spülen mit Stickstoffdampf, um die künstliche Bildung von 8-OHdG zu verhindern, wurden die Gemische 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, um die DNA zu Nukleotiden zu verdauen. Dann 5 μL 500 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0), 10 mmol/L MgCl2und 0,6 Einheiten alkalische Phosphatase (New England Biolabs, Beverly, MA) wurden zu den Proben gegeben. Nach dem Spülen mit Stickstoffdampf wurden die Gemische 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, um die Nukleotide zu Nukleosiden zu hydrolysieren. Die Nukleosidproben wurden zur Bestimmung von 8-OHdG durch einen kompetitiven ELISA-Kit verwendet (8-OHdG-Check, Japan Institute for the Control of Aging, Shizuoka, Japan). Der Bestimmungsbereich betrug 0,125 bis 10 ng/mL bzw. 0,5 bis 200 ng/mL. Die 8-OHdG-Spiegel wurden als Mengen von 8-OHdG (ng) pro Milligramm mtDNA ausgedrückt.

Nachweis der mtDNA-Deletion durch Polymerase-Kettenreaktion.

Die gesamte mtDNA wurde aus Hepatozyten-abgeleiteten Mitochondrien extrahiert, wie zuvor beschrieben. Die Primer-Sets für die Amplifikation der gemeinsamen mtDNA-Deletion von 4.834-bp, von der berichtet wurde, dass sie eine der häufigsten Deletionen ist, 17 , 18 waren 5′-TTT CTT CCC AAA CCT TTC CT-3′ (7.837 bis 7.856-bp) und 5'-AAG CCT GCT AGG ATG CTT C-3' (13,108-13,126 bp). Die Primer-Sets für die Kontrollamplifikation von Wildtyp-mtDNA waren 5'-GGT TCT TAC TTC AGG GGC CAT C-3' (15.782-15.892 bp) und 5'-GTG GAA TTT TCT GAG GGT AGG C-3' (16.279- 16.300 bp). 13 Sequenz und Nummerierung basieren auf den vollständigen mitochondrialen Genomen der Ratte (GenBank-Zugangsnummer AJ 428514). Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) enthielt 0,2 mmol/L Desoxyribonukleotidtriphosphat, 0,2 µmol/L jedes Primers, 1,0 Einheiten Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA) und 1 µg Gesamt-DNA als Matrize in einer 50 µL Reaktionslösung . Die Temperaturwechselbedingung wurde mit einem Zyklus bei 94 °C für 3 Minuten und 6 Zyklen bei 94 °C für 1 Minute, 64 °C für 1 Minute (-1 °C/Zyklus), 72 °C für 1 Minute 30 Sekunden gestartet . Darauf folgten 34 Zyklen bei 94 °C für 1 Minute, 60 °C für 1 Minute, 72 °C für 1 Minute 30 Sekunden und 72 °C für die abschließende Verlängerung für 5 Minuten. PCR-Produkte wurden auf 1,5% Agarosegelen elektrophoretisiert und mit Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht. Die Identität des amplifizierten PCR-Produkts wurde durch Sequenzieren unter Verwendung des AB 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA) bestätigt.

Reverse Transkriptions-PCR-Analyse für TNF-α-mRNA in Lebertransplantaten.

Ganze Leberproben wurden bei –80°C eingefroren, bis sie für die RNA-Extraktion mit einem QIAamp Kit (Qiagen) homogenisiert wurden. Die TNF-&agr;-mRNA-Expression wurde durch reverse Transkriptions-PCR wie zuvor beschrieben analysiert. 19

Messung der ROS-Produktion.

Eine fluoreszierende Sonde, 2', 7'-Dichlorfluorescindiacetat (DCFH-DA Sigma), wurde zur Bestimmung der intrazellulären ROS-Bildung in kultivierten Hepatozyten verwendet. Dieser Assay ist eine zuverlässige Methode zur Messung von intrazellulären ROS wie Wasserstoffperoxid (H2Ö2), Hydroxylradikal (OH−) und Hydroperoxide. 20-22 DCFH-DA wurde in absolutem Ethanol in einer Konzentration von 5 mmol/l gelöst. Hepatozyten wurden auf kollagenbeschichteten Deckgläsern in 6-Well-Kulturplatten gezüchtet. Am Kulturtag 4 wurde TNF-α in verschiedenen Konzentrationen oder Medien (Kontrolle) gleichzeitig mit DCFH-DA (5 µmol/L) in Kulturmedium verabreicht. Nach 2 Stunden Inkubation bei 37 °C wurden die Hepatozyten mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Fluoreszenzbilder wurden durch Mikroskopie aufgenommen.

Histopathologische Analyse.

Schnitte von 4 µm wurden aus formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Geweben für die 8-OHdG-Färbung oder gefrorenem Gewebe für die TNF-α-Färbung hergestellt. Jeder repräsentative Schnitt wurde mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) gefärbt, und immunhistochemische Färbungen wurden mit der Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex-Methode unter Verwendung von Vectastain ABC-Kits (Vector Laboratories, Burlingame, CA) durchgeführt. Die folgenden Antikörper wurden verwendet: monoklonaler anti-8-OHdG-Antikörper (Institute for the Control of Aging, Japan) (1:100) monoklonaler anti-TNF-α (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN) in einer Konzentration von 5 µg /ml. Die Antikörper wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Antigengewinnung des Paraffinschnitts wurde durch eine Mikrowelle erreicht. Doppelfärbung von 8-OHdG und terminale Desoxynukleotidyltransferase-vermittelte Nick-End-Markierung (TUNEL)-Färbung wurden auch durch Immunfluoreszenzfärbungen unter Verwendung von Gefrierschnitten durchgeführt. Die TUNEL-Färbung erfolgte mit dUTP-FITC nach den Angaben des Herstellers (Vor Ort Kit zum Nachweis von Zelltod, Roche). Nach der TUNEL-Färbung wurden die Schnitte mit monoklonalem anti-8-OHdG-Antikörper (Japan Institute for the Control of Ageing) und Ziegencyanin-2-konjugiertem anti-Ziegen-IgG (1:500) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) inkubiert.

Statistiken.

Die Ergebnisse wurden als Mittelwerte ± SEM von n-unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Die Analyse wurde durch ANOVA durchgeführt, wobei P kleiner als 0,05 als signifikant angesehen wurde.


Ergebnisse

Wirkung von EtBr auf das Zellwachstum

Die Reaktion von Zellen auf einen selektiven Inhibitor der mtDNA-Replikation, EtBr, variiert bekanntlich in Abhängigkeit von seinen Konzentrationen und den verwendeten Zelllinien (Desjardins et al., 1985 King und Attardi, 1989). Daher wurden Ax-2-Zellen in axenischem Wachstumsmedium gezüchtet, das verschiedene Konzentrationen von EtBr enthielt, um ihre Wirkung auf das Wachstum zu testen. Wie in Abb. 1 gezeigt, war die Wachstumsrate von der EtBr-Konzentration abhängig: In Gegenwart von mehr als 40 µg/ml EtBr trat kein Wachstum auf, gefolgt vom Zelltod nach 1-2 Wochen Kultur. Bei 30 &mgr;g/ml EtBr zeigten die Zellen ein etwas verzögertes Wachstum und hörten nach 36 Stunden Schüttelkultur auf, sich zu teilen, während der nur zweimal die Zellteilung stattfand (Abb. 1). Die reduzierte Wachstumsrate und der nachfolgende Wachstumsstillstand wurden durch die Zugabe von Uridin oder Pyruvat zum Wachstumsmedium nicht wiederhergestellt (Daten nicht gezeigt). Übrigens hatten niedrigere Konzentrationen (0,1-5 µg/ml) von EtBr eine geringe Wirkung auf das Zellwachstum.

Wirkung von EtBr auf das Wachstum von Dictyostelium discoideum Ax-2-Zellen. Exponentiell wachsenden Zellen (2 × 10 5 Zellen/ml) in axenischem Wachstumsmedium (PS-Medium) wurden verschiedene Konzentrationen von EtBr zugesetzt, gefolgt von Zellzählungen unter einem Hämozytometer. (•) Kontrolle (nicht EtBr-behandelte Zellen) (○) Zellen behandelt mit 10 µg/ml EtBr, (▴) 20 µg/ml EtBr, (▵) 30 µg/ml EtBr, (▪) 40 µg /ml EtBr und (□) 50 µg/ml EtBr. Ähnliche Ergebnisse wurden durch Zellzählungen in drei unabhängigen Experimenten erhalten.

Wirkung von EtBr auf das Wachstum von Dictyostelium discoideum Ax-2-Zellen. Exponentiell wachsenden Zellen (2 × 10 5 Zellen/ml) in axenischem Wachstumsmedium (PS-Medium) wurden verschiedene Konzentrationen von EtBr zugesetzt, gefolgt von Zellzählungen unter einem Hämozytometer. (•) Kontrolle (nicht EtBr-behandelte Zellen) (○) Zellen behandelt mit 10 µg/ml EtBr, (▴) 20 µg/ml EtBr, (▵) 30 µg/ml EtBr, (▪) 40 µg /ml EtBr und (□) 50 µg/ml EtBr. Ähnliche Ergebnisse wurden durch Zellzählungen in drei unabhängigen Experimenten erhalten.

Erstellung von ρ Δ Zellen

Um ungefähr die Menge an mtDNA in Ax-2-Zellen, die mit verschiedenen Konzentrationen von EtBr behandelt wurden, abzuschätzen, wurden die Zellen 40 Stunden nach der Exposition gegenüber EtBr mit DAPI gefärbt, um die mtDNA zu messen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass Zellen, die niedrigeren (0,1-25 µg/ml) oder höheren Konzentrationen (40-50 µg/ml) von EtBr ausgesetzt waren, DAPI-gefärbte Mitochondrien aufwiesen, wie diejenigen in unbehandelten Zellen. In Gegenwart von 30 µg/ml EtBr zeigten jedoch Zellen, die sich etwa zwei Generationen lang geteilt hatten, eine deutlich reduzierte Anfärbung der Mitochondrien mit DAPI im Gegensatz zur normalen Anfärbung von Kernen, was auf eine selektive Abnahme von mtDNA hindeutet (Abb. 2C). Zwischen 30 µg/ml EtBr-behandelten und unbehandelten Ax-2-Zellen gab es keine signifikanten Unterschiede in der Kerngröße und dem Verhältnis von mehrkernigen zu einkernigen Zellen.

Färbungen von Ax-2-Zellen, die 40 Stunden mit 30 μg/ml EtBr behandelt wurden, und von unbehandelten Zellen mit DAPI (A, C) und MitoTracker Orange (B, D). In unbehandelten Ax-2-Zellen werden DAPI-Färbungen in Kernen (A, Pfeilspitzen) und Mitochondrien als granuläre Strukturen (A, Pfeile) festgestellt. In EtBr-behandelten Zellen ist jedoch die DAPI-Färbung der Mitochondrien fast verschwunden, obwohl die Färbung der Kerne erhalten bleibt (C). Allerdings wird eine stärkere Färbung durch MitoTracker Orange in einer begrenzten Anzahl von Mitochondrien (D, Pfeile), die in EtBr-behandelten Zellen enthalten sind, im Vergleich zu unbehandelten Zellen (B) in der vegetativen Wachstumsphase beobachtet. Balken, 10 µm.

Färbungen von Ax-2-Zellen, die 40 Stunden mit 30 μg/ml EtBr behandelt wurden, und von unbehandelten Zellen mit DAPI (A, C) und MitoTracker Orange (B, D). In unbehandelten Ax-2-Zellen werden DAPI-Färbungen in Kernen (A, Pfeilspitzen) und Mitochondrien als granuläre Strukturen (A, Pfeile) festgestellt. In EtBr-behandelten Zellen ist jedoch die DAPI-Färbung der Mitochondrien fast verschwunden, obwohl die Färbung der Kerne erhalten bleibt (C). Allerdings wird eine stärkere Färbung durch MitoTracker Orange in einer begrenzten Anzahl von Mitochondrien (D, Pfeile), die in EtBr-behandelten Zellen enthalten sind, im Vergleich zu unbehandelten Zellen (B) in der vegetativen Wachstumsphase beobachtet. Balken, 10 µm.

Es wurde gezeigt, dass das mitochondriale Membranpotential in ρ 0 Zellen, die aus mehreren Zelllinien stammen, vorübergehend reduziert ist, wie durch die Färbung der Zellen mit MitoTracker Orange überwacht wird. Um herauszufinden, ob Mitochondrien in Ax-2-Zellen, die 40 Stunden lang mit 30 µg/ml EtBr behandelt wurden, ein Membranpotential hatten, wurden sie mit MitoTracker vital gefärbt. Das Ergebnis zeigte, dass einige der Mitochondrien, die in den EtBr-behandelten Zellen enthalten waren, im Vergleich zu denen in nicht behandelten Ax-2-Zellen (Fig. 2B) eine stärkere Färbung zeigten (Fig. 2D), was darauf hindeutet, dass in einer begrenzten Anzahl von Mitochondrien ihr Membranpotential erhöht durch EtBr-Behandlung in Dictyostelium Zellen.

Um zu bestätigen, dass die Menge an mtDNA als Reaktion auf die Behandlung von Ax-2-Zellen mit 30 μg/ml EtBr selektiv verringert wird, wurde eine Southern-Blot-Analyse unter Verwendung einer nuklearen DNA-spezifischen Sonde durchgeführt (Dd-Falle1 Dictyostelium Homolog von Falle1) und eine mtDNA-spezifische Sonde (mitochondriale rps4). Dazu wurden zelluläre Gesamt-DNAs aus der gleichen Anzahl von EtBr (40 Stunden)-behandelten Zellen und unbehandelten Zellen hergestellt, mit mehreren Restriktionsenzymen verdaut und nach Southern-Blottings verglichen (Fig. 3). Hier ist es wichtig zu beachten, dass mtDNA in den EtBr-behandelten Zellen selektiv reduziert wird, was mit dem in 2 gezeigten Ergebnis der DAPI-Färbung übereinstimmt. Die EtBr-Behandlung schien wenig Einfluss auf die Menge an nuklearer DNA zu haben. Aus densitometrischen Messungen der erhaltenen Autoradiogramme wurde die Menge an mtDNA in den EtBr-behandelten Zellen auf etwa 1/4 der in nicht behandelten Ax-2-Zellen geschätzt. Man kann den reduzierten Wert der mtDNA in der EtBr-behandelten Zelle gut erklären, sofern die Synthese von mtDNA während zweier Zellverdopplungen in Gegenwart von 30 µg/ml EtBr selektiv und vollständig durch EtBr gehemmt wird. Aus einer anderen Sicht ist es höchstwahrscheinlich, dass eine bestimmte Menge an mtDNA (vermutlich mehr als 1/4 der ursprünglichen mtDNA) benötigt wird, um die zellulären Aktivitäten einschließlich des Wachstums aufrechtzuerhalten. Mit anderen Worten, es könnte unmöglich sein, Zellen ohne mtDNA (ρ 0 Zellen) mit zu erzeugen Dictyostelium Zellen. Daher wurden die EtBr-behandelten Zellen mit etwa 1/4 mtDNA in weiteren Experimenten als ρ -Zellen verwendet.

Southern-Blot-Analyse von Gesamt-DNAs, die aus Ax-2-Zellen extrahiert wurden, und Zellen, die 40 Stunden lang mit 30 &mgr;g/ml EtBr behandelt wurden.Die DNAs wurden mit den angegebenen Restriktionsenzymen verdaut und einer Elektrophorese unterzogen. Nach dem Transfer der größenfraktionierten DNA-Fragmente auf Nylonmembranen wurden sie mit der 32 P-markierten (A) nuklearen DNA-spezifischen Sonde hybridisiert Dd-Falle1 oder (B) mtDNA-spezifische Sonde rps4, gefolgt von einer Autoradiographie.

Southern-Blot-Analyse von Gesamt-DNAs, die aus Ax-2-Zellen extrahiert wurden, und Zellen, die 40 Stunden lang mit 30 &mgr;g/ml EtBr behandelt wurden. Die DNAs wurden mit den angegebenen Restriktionsenzymen verdaut und einer Elektrophorese unterzogen. Nach dem Transfer der größenfraktionierten DNA-Fragmente auf Nylonmembranen wurden sie mit der 32 P-markierten (A) nuklearen DNA-spezifischen Sonde hybridisiert Dd-Falle1 oder (B) mtDNA-spezifische Sonde rps4, gefolgt von einer Autoradiographie.

Ultrastrukturelle Merkmale von ρ Δ Zellen

Elektronenmikroskopische Beobachtungen von ρ -Zellen und vegetativ wachsenden Ax-2-Zellen zeigten einige charakteristische Unterschiede zwischen ihnen. Wie erwartet, war der auffälligste Unterschied die Morphologie der Mitochondrien in ρ-Zellen, viele der Mitochondrien zeigten eine deutliche strukturelle Transformation, um eine Art Vakuole zu bilden, die das nahe gelegene Zytoplasma einhüllte ( 4B , D). Wir haben zuvor berichtet, dass eine etwas ähnliche mitochondriale Transformation in differenzierenden Präsporenzellen kurz vor der PSV-Bildung auftrat (Matsuyama und Maeda, 1998). Nicht behandelte Ax-2-Zellen enthielten normal geformte Mitochondrien mit retikulären Zisternen und einer elektronenundurchlässigen Matrix, wie in 4A,C gezeigt. Übrigens haben Kobilinsky und Beattie (Kobilinsky und Beattie, 1977) über die EtBr (10 μg/ml)-induzierte mitochondriale Transformation in . berichtet D. discoideum Ax-3-Zellen.

Elektronenmikroskopische Aufnahmen, die eine deutliche strukturelle Transformation von Mitochondrien in ρ Δ-Zellen zeigen. (A,C) Vegetativ wachsende Ax-2-Zellen haben normal geformte Mitochondrien, während (B,D) ρ Δ-Zellen deutlich transformierte Mitochondrien mit einer Art von Vakuolen (Pfeile) aufweisen, die das nahe Zytoplasma umhüllen. Mt, Mitochondrien N, Kern. Balken, 1 µm.

Elektronenmikroskopische Aufnahmen, die eine deutliche strukturelle Transformation von Mitochondrien in ρ Δ-Zellen zeigen. (A,C) Vegetativ wachsende Ax-2-Zellen haben normal geformte Mitochondrien, während (B,D) ρ Δ-Zellen deutlich transformierte Mitochondrien mit einer Art von Vakuolen (Pfeile) aufweisen, die das nahe Zytoplasma umhüllen. Mt, Mitochondrien N, Kern. Balken, 1 µm.

Verminderte mtDNA verursacht eine verzögerte Differenzierung und abnormale Morphogenese

Wenn Ax-2-Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet, gewaschen und auf Agar inkubiert wurden, bildeten sie nach 6 Stunden Aggregationsströme und nach 12 Stunden Inkubation bei 22 °C Hügel (Fig. 5A). Anschließend wurde an der Spitze jedes Hügels eine Spitze gebildet, die sich verlängerte und nach 16-stündiger Inkubation eine wandernde Schnecke bildete. Darauf folgte die Bildung eines Fruchtkörpers nach etwa 26 Stunden Inkubation. Im Gegensatz dazu zeigten ρ-Zellen eine verzögerte und etwas abnorme Morphogenese, große Aggregationsströme wurden nach 16-stündiger Inkubation gebildet, gefolgt von ihrer Unterteilung in kleinere Zellmassen (Fig. 5A). Nach einer längeren Inkubationszeit (etwa 48 Stunden) bildeten ρ -Zellen unregelmäßig geformte Schnecken, entwickelten sich jedoch nicht zu Fruchtkörpern (Fig. 5B). Ein weiteres Experiment zeigte, dass Ax-2-Zellen, die in der Wachstumsphase mit niedrigeren Konzentrationen (15, 20 oder 25 µg/ml) EtBr 40 Stunden lang behandelt wurden, nach DAPI-Färbung fast die gleiche Menge an mtDNA aufwiesen wie die von unbehandelten Ax-2-Zellen , und dass sie nach dem Hungern eine normale Entwicklung aufwiesen. Auch wenn Ax-2-Zellen geerntet und entweder auf 1,5% Nicht-Nährstoff-Agar oder in BSS, die beide 30 &mgr;g/ml EtBr enthielten, ausgehungert wurden, zeigten sie eine normale Entwicklung ohne jeglichen Verlust an mtDNA.

Entwicklung von ausgehungerten Ax-2-Zellen und ρ Δ-Zellen auf Agar. Ax-2-Zellen und ρ-Zellen wurden zweimal in BSS gewaschen und auf 1,5% Nicht-Nährstoff-Agar mit einer Dichte von 5 × 10 6 Zellen/cm 2 ausplattiert. Darauf folgte eine Inkubation für die angegebenen Zeiten bei 22°C. (A) Unbehandelte Ax-2-Zellen bildeten nach 6 Stunden Aggregationsströme und nach 12 Stunden Inkubation Hügel. Anschließend wurde an der Spitze jedes Hügels eine Spitze gebildet, verlängert und nach 16-stündiger Inkubation eine wandernde Schnecke konstruiert. Darauf folgte die Bildung eines Fruchtkörpers nach etwa 26 Stunden Inkubation. Im Gegensatz dazu zeigten ρ Δ -Zellen eine verzögerte und etwas abnorme Morphogenese, große Aggregationsströme wurden nach 16-stündiger Inkubation gebildet, gefolgt von ihrer Unterteilung in kleinere Zellmassen (A). (B) Grobmorphologie der endgültigen Strukturen: Fruchtkörper, abgeleitet von unbehandelten Zellen und unregelmäßig geformte Nacktschnecken, abgeleitet von ρ Δ-Zellen. Die ρ Δ-Zellen stoppten ihre Entwicklung im Schneckenstadium und bildeten nie Fruchtkörper. Stangen, 1 mm.

Entwicklung von ausgehungerten Ax-2-Zellen und ρ Δ-Zellen auf Agar. Ax-2-Zellen und ρ-Zellen wurden zweimal in BSS gewaschen und auf 1,5% Nicht-Nährstoff-Agar mit einer Dichte von 5 × 10 6 Zellen/cm 2 ausplattiert. Darauf folgte eine Inkubation für die angegebenen Zeiten bei 22°C. (A) Unbehandelte Ax-2-Zellen bildeten nach 6 Stunden Aggregationsströme und nach 12 Stunden Inkubation Hügel. Anschließend wurde an der Spitze jedes Hügels eine Spitze gebildet, verlängert und nach 16-stündiger Inkubation eine wandernde Schnecke konstruiert. Darauf folgte die Bildung eines Fruchtkörpers nach etwa 26 Stunden Inkubation. Im Gegensatz dazu zeigten ρ Δ -Zellen eine verzögerte und etwas abnorme Morphogenese, große Aggregationsströme wurden nach 16-stündiger Inkubation gebildet, gefolgt von ihrer Unterteilung in kleinere Zellmassen (A). (B) Grobmorphologie der endgültigen Strukturen: Fruchtkörper, abgeleitet von unbehandelten Zellen und unregelmäßig geformte Nacktschnecken, abgeleitet von ρ Δ-Zellen. Die ρ Δ-Zellen stoppten ihre Entwicklung im Schneckenstadium und bildeten nie Fruchtkörper. Stangen, 1 mm.

Eine auffallendere Differenzierungsverzögerung wurde bei -Zellen beobachtet, die unter submersen Bedingungen hungerten. Die meisten ρ Δ-Zellen zeigten keine Anzeichen von Zellaggregation und blieben auch nach 12-stündiger Inkubation als runde Einzelzellen zurück, während unbehandelte Ax-2-Zellen Aggregationskompetenz erlangten und nach 7-stündiger Inkubation zu aggregieren begannen, worauf die Bildung von engen Hügeln während 12-24 Stunden Inkubation (Fig. 6). Im Gegensatz dazu bildeten ρ Δ -Zellen nach 24 Stunden große Aggregationsströme, die dann während weiterer 4 Stunden Inkubation in kleinere Hügel unterteilt wurden, hauptsächlich wie auf Agar (Fig. 6).


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