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Warum ist eine Trypsinverdauung für Proteomstudien erforderlich?


Ich weiß, dass Trypsin für Proteomstudien verwendet wird, aber ich verstehe nicht, warum die Trypsinverdauung notwendig / wichtig ist.


Der Trypsinverdau ermöglicht es Ihnen, Proteine ​​in kleinere Polypeptide zu zerschneiden, deren Massen durch Massenspektrometrie bestimmt und dann in mögliche Aminosäuresequenzen zurückübersetzt werden können. Trypsin spaltet nach bestimmten Aminosäuren. Insgesamt können Sie damit Proteine ​​identifizieren.


Quantitative proteomische Analyse von Trypsin-behandelten extrazellulären Vesikeln zur Identifizierung der real-vesikulären Proteine

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind Vesikel in Nanogröße, die von einer Lipiddoppelschicht umgeben sind und von den meisten Zellen in das extrazelluläre Milieu abgegeben werden. Obwohl verschiedene EV-Isolierungsmethoden etabliert wurden, isolieren die meisten der aktuellen Methoden EVs mit kontaminierten nicht-vesikulären Proteinen. Durch Anwendung der markierungsfreien quantitativen proteomischen Analysen von SW480-abgeleiteten EVs menschlicher Dickdarmkrebszellen identifizierten wir Trypsin-sensitive und Trypsin-resistente vesikuläre Proteine. In weiteren systembiologischen und Protein-Protein-Interaktionsnetzwerkanalysen basierend auf ihrer zellulären Lokalisation haben wir die Trypsin-sensitiven und Trypsin-resistenten vesikulären Proteine ​​in zwei Untergruppen eingeteilt: 363 Kandidaten für echte vesikuläre Proteine ​​und 151 kontaminierte nicht-vesikuläre Proteine. Darüber hinaus zeigten die Proteininteraktionsnetzwerkanalysen, dass Kandidaten für real-vesikuläre Proteine ​​hauptsächlich aus der Plasmamembran (46,8 %), Zytosol (36,6 %), Zytoskelett (8,0 %) und der extrazellulären Region (2,5 %) stammen. Auf der anderen Seite stammen die meisten der kontaminierten nicht-vesikulären Proteine ​​aus dem Kern, dem Golgi-Apparat, dem endoplasmatischen Retikulum und den Mitochondrien. Darüber hinaus wurden ribosomale Proteinkomplexe und T-Komplex-Proteine ​​als kontaminierte nicht-vesikuläre Proteine ​​klassifiziert. Zusammenfassend ist unser Trypsin-verdauter proteomischer Ansatz bei EVs ein wichtiger Fortschritt bei der Identifizierung echter vesikulärer Proteine, die dazu beitragen könnten, die EV-Biogenese und den Proteinladungssortierungsmechanismus während der EV-Freisetzung zu verstehen, zuverlässigere diagnostische Markerproteine ​​für EV zu identifizieren und entschlüsseln pathophysiologische Rollen von EVs.


Hintergrund

Die teegrüne Blattzikade Empoasca (Matsumurasca) onukii Matsuda (Hemiptera: Cicadellidae) ist ein wichtiger Insektenschädling der Teepflanze Kamelie sinensis (L.) O. Kuntze (Theaceae) in Tee produzierenden Ländern in Asien [1,2,3]. E. onukii wurde zuvor als zwei Arten identifiziert, E. onukii und E. vitis. Eine kürzlich durchgeführte detaillierte Studie zu morphometrischen Merkmalen legt nahe, dass E. onukii und E. vitis gehören tatsächlich zur gleichen Art [3]. E. onukii schädigt Teepflanzen, indem es Teeknospen, Blätter und zarte Triebe mit einem nadelartigen Mandrin durchsticht, um den Saft zu saugen, was typischerweise zu einem Syndrom namens Trichterbrand führt, das den Ertrag und die Qualität der Teeblätter dramatisch reduziert [1]. Allein in China könnten die jährlichen wirtschaftlichen Verluste durch dieses Insekt 50 % erreichen [4]. Derzeit ist die Geschäftsführung von E. onukii Der Befall beruht hauptsächlich auf der Anwendung chemischer Pestizide. Chemische Pestizide können jedoch zu Pestizidresistenzen führen und schädliche Auswirkungen auf die Umwelt und die menschliche Gesundheit haben [5,6,7,8]. Biologische Kontrollen von E. onukii wurden ebenfalls berichtet, aber sie zeigen einen sehr begrenzten Erfolg [9,10,11]. Kenntnisse der Biochemie und Physiologie des Aufnahmesystems von E. onukii könnte die Entwicklung neuer Managementstrategien für diesen schweren Insektenschädling anregen.

Phytophage Hemipteren-Insekten haben stechend-saugende Mundwerkzeuge für die Saftfütterung entwickelt. Es gibt drei Arten von Pflanzensaft-Fütterungsverhalten: Phytophage Speichelscheidenfütterung, osmotische Pumpenfütterung und Zellbruchfütterung [12, 13]. Studien zur Stilettaktivität legen nahe, dass E. onukii ist ein typischer Zellruptur-Feeder, der über seinen Mandrin Enzyme in Pflanzengewebe absondert und sich dann von Mesophyll- oder Stammparenchymzellen ernährt [1, 14]. Die durchdringende Saugfütterung erfordert die Injektion von Verdauungsenzymen, die von der Speicheldrüse (SG) abgesondert werden, in die Pflanzen zur extraoralen Verdauung. Daher würde eine detaillierte Untersuchung der Speichelproteinzusammensetzungen zum Verständnis der Physiologie des Verdauungssystems von Hemipteren-Insekten beitragen und möglicherweise zur Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung dieser Schadinsekten führen.

Speichelproteinprofile wurden sowohl auf transkriptomischer als auch auf proteomischer Ebene für eine Vielzahl von Hemipteren-Insekten untersucht, einschließlich Stinkwanzen, Blattläuse, Zikaden und Zikaden [15,16,17,18,19,20,21,22,23]. Das proteomische Profiling des Speichels hat gezeigt, dass Speichel von hemipteren Insekten hauptsächlich verschiedene Enzymfamilien enthält, einschließlich Oxidoreduktasen, Hydrolasen, Transferasen, Ca 2+ -bindende Proteine ​​und Proteasen/Peptidasen [15, 18, 20, 24, 25]. Die meisten dieser frühen Studien identifizierten jedoch aufgrund des Mangels an genomischer Information nur Protease-Gruppen, aber keine Protease-Spezies.

Die transkriptomische Analyse in Verbindung mit proteomischem Profiling ist eine effektive Strategie, um funktionelle Proteine ​​in der SG und im Darm von Hemipteren zu identifizieren [21, 26]. Zum Beispiel Proteasen im SG und im Darm von zwei verheerenden pentatomiden Stinkwanzen, Halyomorpha halys und Nezara viridula, wurden untersucht, um in jedem Gewebe stark exprimierte Proteasen zu identifizieren [21, 26]. Darüber hinaus wurde die Kartierung von SG-Transkripten von H. halys zu den Proteinprofilen von wässrigem Speichel, dem Speichel, der in die Wirtspflanzen abgesondert wird, ergaben 22 reichlich vorhandene Verdauungsproteasen. Darüber hinaus wurde die Mehrheit dieser Protease-Transkripte in der Hauptspeicheldrüse (PSG) von . stark akkumuliert H. halys und N. vididula. Diese Ergebnisse zeigten, dass bei beiden Stinkwanzen PSGs die Hauptquellen für die Freisetzung von Proteasen in den Speichel waren [21].

Obwohl Proteasen und Nukleasen, die an extraoralen Verdauungsaktivitäten beteiligt sind, bereits in der SG und im Darm einiger Hemipteren-Insekten untersucht wurden, ist das Wissen über die Zusammensetzung von Proteasen in Verdauungsgeweben von E. onukii ist noch begrenzt. Wir haben zuvor Transkriptom-Sequenzierungsdaten aus dem Darm von . analysiert E. onukii, und mutmaßliche Transkripte, die Proteine ​​von Verdauungsproteasen, Entgiftungsenzymen und Immunantwortfaktoren kodieren, wurden identifiziert [27]. In der vorliegenden Studie haben wir unsere Untersuchung auf transkriptomische und proteomische Analysen des SG und des Darms von . ausgeweitet E. onukii um die gewebespezifische Expression von Proteasen zu untersuchen. Darüber hinaus haben wir auch die Häufigkeit von Proteasen in der SG und im Darm mehrerer Hemipteren verglichen, um gemeinsame Proteasen bei allen Arten zu bewerten. Die Ergebnisse dieser Studie werden nicht nur Informationen zum weiteren Verständnis der Interaktion zwischen E. onukii und Teepflanzen, sondern helfen auch bei der Untersuchung von aromatischen Veränderungen in Teepflanzen nach einem Befall mit E. onukii. Identifizierung und Analyse der Verdauungsproteasen im SG und im Darm von E. onukii wird auch die Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung dieses wichtigen Schädlings unterstützen.


Posttranslationale Modifikationen, die die Enzymaktivität modulieren

Ryan R. Dyer, . Renã A.S. Robinson, in Methoden der Enzymologie, 2019

5.1 Schrotflinten-Proteomik

Shotgun Proteomics ist die Analyse komplexer Peptidgemische (Yates, 1998). Eine typische Shotgun-Analyse umfasst die experimentelle Aufarbeitung der interessierenden Proteine, die Trennung durch Flüssigchromatographie (LC), die Analyse durch Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) und die Datenanalyse mit bioinformatischer Software. Typische MS- und MS/MS-Analyse identifiziert vollständiges Peptid Masse zu laden (m/z) Verhältnisse und m/z Verhältnisse von Peptidfragmenten, die eine Bestimmung der Peptidsequenz ermöglichen (Zhang, Fonslow, Shan, Baek &. Yates, 2013). Für die relative Quantifizierung von Cystein-PTMs wurde eine Vielzahl von Schrotflinten-Proteomik-Strategien entwickelt. Die Isotopenmarkierung umfasst die chemische Modifizierung von Zielpeptiden mit Reagenzien, die so synthetisiert wurden, dass sie leichte oder schwere Isotope enthalten. Da diese Markierungen chemisch identisch sind, aber unterschiedliche Massen aufweisen, kann der Massenunterschied innerhalb von MS nachgewiesen werden und somit experimentelle Gruppen in einer gepoolten Probe unterscheiden (Hsu, Huang, Chow & Chen, 2003). Isobare Tags wie Tandem-Massen-Tag (TMT) beinhalten die Anlagerung mehrerer isobarer chemischer Gruppen, die während der MS/MS-Analyse einzigartige Massenionen erzeugen (Thompson et al., 2003). Wie in Abb. 2 A gezeigt, besteht TMT aus drei Gruppen: einer proteinreaktiven Gruppe zur Anlagerung an primäre Amine (oder Proteinthiole, gezeigt in Abb. 2 B), einem Massenreporter, um während der MS-Analyse ein einzigartiges Massenion zu erzeugen, und einen Massennormalisierer, um sicherzustellen, dass jedes Tag die gleiche exakte Masse besitzt (Thompson et al., 2003). TMT-Reagenzien basieren auf der Lage schwerer Isotope innerhalb ihrer Molekülstruktur. Während der MS-Analyse wird nur die Massenreportergruppe gespalten und nachgewiesen, sodass jeder Tag eine einzigartige Reporterionenmasse erreicht, indem er die Anzahl der schweren Isotope in der Massenreportergruppe erhöht, während die Anzahl der schweren Isotope in der Massennormalisierungsgruppe verringert wird ( Dayon et al ., 2008). Isotopenmarkierung und isobare Markierung ermöglichen somit eine relative Quantifizierung über mehrere experimentelle Gruppen in einer einzigen Probe. Schrotflinten-proteomische Methoden, die auf Cystein-PTMs abzielen, haben diese Techniken integriert.

Abb. 2 . Aufbau von Tandem-Masse-Tags (TMT). TMT besteht aus einem Massenreporter, einem Massennormalisierer und einer aminreaktiven Gruppe (A). Cys-reaktive TMT-Reagenzien wie JodoTMT (B) ersetzen die reaktive Amingruppe durch eine reaktive Thiolgruppe.


Proteomische Studien von Stammzellen

Stammzellen sowohl embryonalen als auch adulten Ursprungs sind aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften der unbegrenzten Selbsterneuerung und Differenzierung in Richtung bestimmter Abstammungslinien, sobald sie die richtigen Signale erhalten, in der regenerativen Medizin vielversprechend. Proteomics ist eine Reihe von Technologieplattformen, die durch Fortschritte in der Massenspektrometrie und Bioinformatik angetrieben werden und die Proteinidentifizierung, die relative Quantifizierung von Proteinen und Peptiden, ihre subzelluläre Lokalisierung und Studien posttranslationaler Modifikationen und Protein-Protein-Wechselwirkungen umfassen. Die Stammzellbiologie wurde von diesen Ansätzen beeinflusst und hat sich in der Post-Genomik-Ära entwickelt. Neben vielen Herausforderungen in der Stammzellbiologie besteht ein dringender Bedarf an der Implementierung proteomischer Anwendungen. Jüngste Arbeiten zu Stammzellen mit Hilfe von Proteomik haben gezeigt, dass Transkriptomanalysen keinen vollständigen Leitfaden für die Entwicklung von Stammzellen liefern, und Proteininteraktionen, die nur mit proteomischen Ansätzen systematisch entdeckt werden können, haben zu wichtigen neuen Konzepten zu Prozessen geführt, die die Entwicklung und die Stammzellpluripotenz regulieren . In diesem Kapitel werden wir aktuelle proteomische Studien an embryonalen und adulten Stammzellen mit einem Schwerpunkt auf embryonalen Stammzellen überprüfen.

1. Einleitung

1.1. Stammzellen und Proteomik

Stammzellen jeglicher Art werden durch zwei unterschiedliche Eigenschaften definiert. Die erste ist die unbestimmte Selbsterneuerung, ein Merkmal, das für eine Aufrechterhaltung in einem Gewebe und/oder Organismus über einen längeren Zeitraum sorgt. Der zweite ist die Fähigkeit, sich in eine Reihe verschiedener Tochterzelltypen zu differenzieren, im Gegensatz zu Nicht-Stammzellen, die einer einzigen Abstammungslinie verpflichtet sind. Adulte somatische Stammzellen finden sich in den meisten Organen und Geweben in adulten Organismen und es wird angenommen, dass sie bei der langfristigen Gewebeerhaltung und/oder -reparatur wirken. Im Gegensatz dazu werden embryonale Stammzellen (ESCs) aus Embryonen gewonnen und sind einzigartig in ihrer Erhaltungsfähigkeit in vitro in einem pluripotenten Zustand, d.h., in der Lage, alle drei Keimblätter und einen ganzen Organismus zu rekapitulieren.

Sowohl adulte als auch embryonale Stammzellen haben die Analyse vor besondere Herausforderungen gestellt. Adulte Stammzellen sind in der Regel selten, schwer zu reinigen oder in Kultur zu halten. Aus diesem Grund stellen adulte Stammzellen eine größere technische Herausforderung für groß angelegte Transkriptom- und Proteomanalysen dar. Im Gegensatz dazu werden ESCs in Kultur leicht zu großen Zahlen gezüchtet und wurden für umfangreiche Analysen durch Transkriptionsprofilerstellung und andere genomweite Techniken verwendet. Außerdem lassen sich ESCs leicht manipulieren in vitro, was sie zu idealen Werkzeugen macht, um die Eigenschaften und Merkmale von Stammzellen mit einer Vielzahl von Techniken zu untersuchen. In der gegenwärtigen postgenomischen Ära, in der Transkriptom-Kartierung mittels DNA-Mikroarray-Technologie alltäglich ist (Ivanova et al., 2002, Ramalho-Santos et al., 2002), bietet die alleinige Betrachtung des Transkriptoms eine unvollständige und verzerrte Interpretation des zugrunde liegenden Stammes Zellbiologie (Evsikov und Solter, 2003: Fortunel et al., 2003). Inhärente Probleme, die mit einem solchen Transkriptionsprofilierungsansatz verbunden sind, umfassen erstens, dass die Analyse offensichtlich auf Gene beschränkt ist, die auf dem Mikroarray vorhanden sind, und es ist möglich, dass es "Stemness"-Gene gibt, die noch nicht identifiziert wurden und zweitens nicht in den verwendeten Chips vertreten sind , Veränderungen auf mRNA-Ebene sind möglicherweise nicht proportional zu Veränderungen in der Proteinexpression (Gygi et al., 1999a). , was es praktisch unmöglich macht, die funktionelle Ausgabe dieser Systeme allein auf der Grundlage von Genexpressions- und/oder Genomdaten vorherzusagen.

Der Begriff „Proteom“ wurde ursprünglich von Wilkins geprägt et al. (Wilkins et al., 1996), um die Gesamtmenge der Proteine ​​zu beschreiben, die in einer bestimmten Population exprimiert werden, auch bekannt. Zelle, Gewebe, Organelle, Organismus oder pathologischer Zustand. Der Begriff „Proteomik“ bezieht sich auf eine Reihe von Techniken, die sich gut zur Identifizierung von Proteomen eignen, wurde jedoch erweitert, um groß angelegte Techniken einzuschließen, die in der Lage sind, Proteine ​​zu identifizieren und sowohl ihre Strukturen als auch ihre Funktionen auf genomweiter Ebene zu analysieren. Die Proteomik umfasst eine Vielzahl von Techniken, angefangen von Hefe-Zwei-Hybrid-Screens zur Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen (Rual et al., 2005), Antikörper-basierten Proteinchips zur Identifizierung von Proteinen (MacBeath, 2002) und Hochdurchsatz-Kristallographie-Screens ( Stevens et al., 2001), um eine Strukturanalyse bereitzustellen. Alle diese Techniken (siehe Zusammenfassung in Abbildung 1) liefern unschätzbare Einblicke in das Proteom und seine Funktion in einer Zelle, aber die vielleicht am weitesten verbreitete Gruppe von Techniken dreht sich um die Massenspektrometrie (MS), die weiter unten diskutiert wird (auch besprochen in Aebersold und Mann (2003) und Cravatt et al.


Vor- und Nachteile der verschiedenen Methoden, die beim Proteomic-Profiling und Protein-Interaktom-Mapping verwendet wurden, werden hervorgehoben. A. Zweidimensionale Elektrophorese (2-DE) gefolgt von Massenspektrometrie (MS)-Analyse wurde weit verbreitet verwendet, um verschiedene Populationen von Stammzellen mit differenzierteren Zelltypen zu vergleichen. B. iTRAQ (isobare Tags für relative und absolute Quantifizierung) und ICAT (isotope kodierte Affinitäts-Tags) sind zwei chemische Markierungsansätze, die vor der Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS)-Analyse im Vergleich von gereinigten Stammzellpopulationen verwendet wurden. C. SILAC (Stable Isotope Labeling with Aminosäuren in Culture) ist ein Ansatz zur metabolischen Markierung, der in proteomischen Profilen und quantitativen phosphoproteomischen Studien verwendet wurde. D. Die affinitätsbasierte Reinigung von Proteinkomplexen gefolgt von einer MS/MS-Analyse wurde in Protein-Interaktom-Studien häufig verwendet. E. Die Verwendung funktioneller Proteinarrays ist ein sehr vielversprechender Ansatz, der hauptsächlich in Hefeprotein-Interaktomstudien verwendet wurde.

1.2. Massenspektrometrie (MS)-basierte Plattformen für die Proteomikforschung

MS funktioniert, indem sie relativ kleine Moleküle ionisiert und dann ihr Masse-zu-Ladungs-Verhältnis misst (m/z). Während die traditionelle MS selbst in der Lage ist, die Masse hochreiner kleiner Moleküle zu bestimmen, kann sie mit komplizierteren Molekülen (wie Peptiden) oder Mischungen von Proben kaum etwas anderes tun. Um das Spektrum der durch MS identifizierbaren Substanzen weiter zu vergrößern, können zwei miteinander kombiniert werden (als MS/MS bezeichnet), bei denen zunächst die Molekülmasse eines Peptids gemessen wird (in MS1) und dann mit elektroneutralen Gasen beschossen wird Fragmentierung verursachen. Die m/z Verhältnisse dieser resultierenden kleineren Fragmente werden dann im zweiten Analysator (MS2) gemessen, und nach der Computeranalyse kann die Aminosäuresequenz des Peptids bestimmt werden (siehe Abbildung 2). Somit kann praktisch jedes einzelne Peptid in einem relativ gereinigten Zustand unter Verwendung von Tandem-MS identifiziert werden. Für die Analyse eines ganzen Proteins oder sogar mehrerer Proteine ​​sind weitere Manipulationen erforderlich, um die Mischung zu reinigen, um die Komplexität jeglicher spezifischer Eingaben in die MS zu reduzieren. Dies wird normalerweise zuerst durch Reinigen einer Probe durch einfache SDS-PAGE-Elektrophorese und anschließendes Ausschneiden der relevanten Bande(n) oder einer ganzen Spur eines Gels erreicht, das dann in kleinere Fragmente zerlegt wird. Diese Gelfragmente werden dann verdaut vor Ort mit einer Protease (typischerweise Trypsin) und die Peptide werden gewonnen. Um die Probe vor der Analyse durch MS weiter zu fraktionieren, werden die Proben entweder einer eindimensionalen Flüssigkeitschromatographie (LC, typischerweise eine Umkehrphasen-LC, die sich aufgrund der Hydrophobizität trennt) oder einer mehrdimensionalen (LC/LC) unterzogen, wobei die Auswahl auf der Komplexität basiert des Erstmusters. Im Anschluss an LC oder LC/LC, aber vor dem Auftragen auf den Massenanalysator, werden die Peptide ionisiert, normalerweise durch Elektrospray-Ionisierung, bei der ein Potenzial über eine feine Nadel angelegt wird, durch die das Eluat von der LC-Säule fließt, wodurch ein feines Spray entsteht, das bildet Tröpfchen, die die Probe enthalten, und Wärme, die vor dem Eintritt in das MS angewendet wird, ermöglicht eine Desolvatisierung und Ionisierung. Die MS/MS-Analyse gewährleistet die Identifizierung der Peptidgröße und Aminosäuresequenz.


Proteinextrakte werden aus Stammzellen jeglicher Art hergestellt und zunächst durch SDS-PAGE fraktioniert. Einzelne Bänder oder die ganze Bahn werden dann einer vor Ort Verdauung mit Trypsin. Nach dem Trypsinverdau wird das Produkt zur weiteren Trennung der Mischung entweder einer eindimensionalen (LC) oder mehrdimensionalen (LC/LC) Flüssigkeitschromatographie unterzogen. Die Elution von LC wird dann durch Elektrospray-Ionisation ionisiert, und jeder Eluen-Peak durchläuft zuerst ein MS (typischerweise MS2) zur Massenbestimmung. Jeder Peak wird dann in MS1 ​​getrennt und gelangt in eine Kollisionskammer, wo er weiter fragmentiert und anschließend in MS2 analysiert wird, was bei der Bestimmung der Peptidsequenz hilft.

Nach Beendigung dieses Prozesses wird ein kompliziertes Proteingemisch auf ein Fragmentionenspektrum und Molekulargewicht für jedes Peptid reduziert. Die Bioinformatik ist dann notwendig, um jedes spezifische Spektrum in ein Peptid und Protein zu übersetzen, aus dem es ursprünglich entstanden ist. Die beteiligten Algorithmen sind vielfältig und komplex, basieren aber auf dem Vergleich mit dem theoretischen Spektrum bekannter Proteine ​​aus einer Datenbank und de novo Sequenzierung, bei der jedes Fragmentspektrum direkt in ein spezifisches Peptid übersetzt wird, oder ein hybrider Ansatz, der beide kombiniert (Übersicht in (Nesvizhskii et al., 2007). Jedes Peptid wird dann auf ein Protein basierend entweder auf einem deterministischen (d.h., ein vorgegebener Algorithmus wie in (Resing et al., 2004: Tabb et al., 2002) oder Wahrscheinlichkeiten einer Übereinstimmung (Price et al., 2007). Das Ergebnis ist eine Identifizierung aller möglichen Proteine ​​in einer gegebenen Probe.

Die Verwendung von LC-gekoppelten Tandem-MS/MS hat zwei allgemeine Ansätze ermöglicht. Die erste wird als „Shot-Gun“-Proteomik bezeichnet, bei der eine einzelne Probe, wie eine Zelllinie, ein Gewebe oder eine hochgereinigte Zellpopulation analysiert wird, um alle exprimierten Peptide/Proteine ​​zu bestimmen. Dies wird auch als expressionsbasierte Proteomik bezeichnet. Die zweite ist die Affinitätsreinigung, bei der eine einzelne Proteinspezies aus einer Zelle gereinigt wird, mit dem Ziel, assoziierte Moleküle zu identifizieren (siehe Abbildung 1D). Obwohl beide Methoden weit verbreitet sind, hat die Affinitätsreinigung einzigartige Einblicke in die Netzwerkeigenschaften von Organismen (Gavin et al., 2002) und Stammzellen (siehe Abschnitt 2) geliefert und wird daher oft als funktionelle Proteomik bezeichnet (Kocher und Superti- Furga, 2007). Im Allgemeinen basiert die Affinitätsreinigung auf zwei Techniken. Erstens kann eine Affinitätsreinigung an nativen Proteinen unter Verwendung von Antikörpern durchgeführt werden, um ein einzelnes Protein und seine assoziierten Proteine ​​zu isolieren (Uhlen und Ponten, 2005). Der Hauptnachteil besteht darin, dass der Antikörper oft das limitierende Reagens sein kann, was es schwierig macht, seltene Proteine ​​oder große Mengen an Komplexen zu reinigen. Die zweite beinhaltet das Anbringen eines spezifischen Peptid-Tags an eine interessierende cDNA, was eine leichte Reinigung und Elution des interessierenden markierten Proteins ermöglicht (Rigaut et al., 1999). Diese Verfahren ermöglichen typischerweise auch das Eluieren der affinitätsmarkierten Komplexe von der Säule durch proteolytische Spaltung an einer spezifischen Erkennungssequenz (z. B. TAP-Tag in Fig. 3A). Eine Variation dieser Tag-basierten Technik basiert auf dem metabolischen Tagging mit Biotin (de Boer et al., 2003). Es werden Zellen erzeugt, die die E coli abgeleitete BirA-Ligase, die Biotin an eine spezifische Peptiderkennungssequenz binden kann. cDNAs werden dann so konstruiert, dass sie die Erkennungssequenz enthalten, sodass sie effizient biotinyliert werden können in vivo und gefangen in vitro aufgrund der starken Affinität von Biotin für Streptavidin (siehe Abbildung 3B). Der vorherrschende Vorteil metabolischer Tagging-Methoden ist die außergewöhnlich hohe Affinität von Streptavidin zu Biotin (KD ≈ 10 −15 , im Gegensatz zu einem KD ≈ 10 –9 für Calmodulin-bindendes Protein). Unter Verwendung beider Markierungsansätze werden die Markierungen oft kombiniert, um eine Tandemreinigung zu ermöglichen, wodurch die Reinheit des Komplexes und die Spezifität der anschließend identifizierten Interaktionen erhöht werden. Mit dieser Affinitätsreinigungs-MS-Methode sind mehrere Vorteile verbunden: Erstens kann sie unter relativ physiologischen Bedingungen durchgeführt werden zweitens stört sie typischerweise nicht relevante PTMs, die oft entscheidend für die Organisation und/oder Aktivität von Komplexen sind und auch Drittens von MS identifiziert, kann es verwendet werden, um dynamische Veränderungen in der Zusammensetzung von Proteinkomplexen zu untersuchen, wenn es in Kombination mit quantitativen Proteomik-Techniken wie iTRAQ und SILAC verwendet wird (siehe unten).


A. Tandem-Affinitätschromatographie: Ein interessierendes Protein wird zuerst so konstruiert, dass es ein Protein A-Tag (ausgefüllter Kreis), eine Tabak-Echo-Virus-Erkennungsstelle (TEV, ausgefülltes Dreieck) und ein Calmodulin-Bindungspeptid (CBP)-Tag (ausgefüllte Ellipse) enthält ). Extrakte werden aus Zellen hergestellt, die das markierte Protein exprimieren, das assoziierte Proteine ​​und Verunreinigungen enthalten sollte. Diese Komplexe werden an eine IgG-Säule gebunden und gewaschen, um den Großteil der Verunreinigungen zu entfernen. TEV-Protease wird dann verwendet, um die halbgereinigten Proteinkomplexe zu eluieren, die anschließend auf einer Calmodulin-Säule absorbiert werden. Nach weiterem Waschen werden gereinigte Proteinkomplexe, die das interessierende Protein und seine assoziierten Proteine ​​enthalten, durch Calciumchelation (EGTA) eluiert und unter Verwendung von LC-MS/MS identifiziert.


B. Metabolisches Tagging für die Affinitätschromatographie: Zunächst werden Stammzellen so konstruiert, dass sie die E coli abgeleitete Biotin-Ligase BirA, die Biotin an eine definierte Erkennungssequenz bindet, dargestellt mit einem ausgefüllten Stern. Die interessierenden Proteine ​​werden dann mit einer Biotinylierungsstelle und einem FLAG-Epitop (dargestellt als ausgefüllter Kreis) konstruiert. Innerhalb der Stammzelle wird das Biotin (blauer Kreis) von BirA hinzugefügt. Proteinextrakte werden hergestellt und auf eine FLAG-Antikörpersäule aufgetragen, und nach dem Waschen werden halbgereinigte Komplexe mit FLAG-Peptid eluiert. Das Eluat wird dann auf eine Streptavidinsäule aufgetragen, und nach dem Waschen werden das gereinigte interessierende Protein und seine assoziierten Proteine ​​durch Denaturierung eluiert und durch LC-MS/MS identifiziert.

Neben der Identifizierung großer Proteinarrays und Proteinkomplexe ist die Proteomik auch quantitativer geworden. d.h., ermöglichen den direkten Vergleich der Proteingehalte zwischen zwei Proben (Oda et al., 1999: Ong et al., 2003). Obwohl es eine Reihe von Techniken gibt (in Abbildung 1A–C zusammengefasst), werden zwei am häufigsten verwendet: ICAT (isotope kodierte Affinitäts-Tags Gygi et al. 1999b) und iTRAQ (isobare Tags für relative und absolute Quantifizierung) (Ross et al. , 2004). Kurz gesagt werden Proteine ​​aus zwei Zellpopulationen mit verschiedenen Chemikalien mit unterschiedlichen Isotopenzusammensetzungen markiert (d.h., Wasserstoff vs. Deuterium im Fall von ICAT oder einem analogen Vier-Isotopen-Tag in iTRAQ) und die Proben werden dann erneut gemischt und quantitative Proteingehalte können bestimmt werden. Die Vorteile dieser Techniken bestehen darin, dass beide die Quantifizierung praktisch jeder Probe ermöglichen und sehr große Proben möglich sind, obwohl Probleme mit der Markierungseffizienz und Übermarkierung Schwierigkeiten verursachen können. Im Gegensatz dazu verwendet SILAC (stable isotope labeling with amino acid in culture Chen et al. 2000: Ong et al., 2002: Zhu et al., 2002) einen ähnlichen Ansatz, bei dem zwei Zellpopulationen mit isotopisch unterschiedlichen Aminosäuren markiert werden in vivo und dann analysiert, wodurch die Unterschiede zwischen den beiden Zellpopulationen bewertet werden können. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass Markierungseffizienz und Übermarkierung kein Thema mehr sind, obwohl es ein schwieriges Verfahren ist, auf größere Verfahren im Proteom-Maßstab hochzuskalieren. Die Entwicklung dieser MS-basierten Technikplattformen hat die proteomischen Studien von Stammzellen stark vorangebracht, die in den nächsten beiden Abschnitten ausführlich diskutiert werden.

2. Proteomische Studien an embryonalen Stammzellen (ESCs)

2.1. Das ESC-Proteom

Seit ihrer Entdeckung vor über 25 Jahren (Evans und Kaufman, 1981) sind embryonale Stammzellen der Maus (mESCs) ein unschätzbares Werkzeug zur Beantwortung genetischer Fragen (Thomas und Capecchi, 1987). Mit der Etablierung humaner embryonaler Stammzellen (hESCs Thomson et al. 1998) werden neue Möglichkeiten der Gewebereparatur oder des Gewebeersatzes aktiv erforscht. Um die transkriptomischen Analysen von ESCs zu ergänzen, die eine genomweite RNA-Expressionssignatur der Stammheit definieren (Ivanova et al., 2002: Ramalho-Santos et al., 2002), bietet die Stammzell-Proteomik ein hervorragendes Werkzeug, um ESCs auf Proteinebene zu charakterisieren und abzuleiten eine Protein-Pluripotenz-Signatur, die neue ESC-spezifische Benchmarks offenbaren kann.

Die proteomische Analyse embryonaler Stammzellen wurde mit MS-basiertem Protein-Profiling von undifferenzierten und differenzierten ESCs untersucht. Eine Suche nach humanen (Linie HES-2) und Maus- (Linie D3) ESC-spezifischen Proteinen führte zu 1.775 nicht-redundanten Proteinen in hESCs, 1.532 in differenzierten hESCs, 1.871 in mESCs und 1.552 in differenzierten mESCs mit einer falsch positiven Rate von <0,2%. Der Vergleich der Datensätze unterschied 191 Proteine, die ausschließlich in menschlichen und Maus-ESCs identifiziert wurden, von denen viele nicht charakterisierte Proteine ​​sind und potenzielle neue ESC-spezifische Marker oder funktionelle Proteine ​​darstellen (Van Hoof et al., 2006). Elliottet al. verwendeten 2D-Gele mit mehreren pH-Gradienten und unterschiedlichen Acrylamidkonzentrationen, um ungefähr 600∼1000 Proteinflecken von Maus-R1-ESCs auf silbergefärbten Gelen aufzulösen und stellt den ersten Schritt zur Erstellung einer umfassenden ESC-2D-Proteindatenbank dar (Elliott et al., 2004). Naganoet al. unter Verwendung einer automatisierten 2D-LC-MS/MS im Mikromaßstab analysierte man die Gesamtproteine ​​in Maus-E14-1-ESCs (Nagano et al., 2005). Sie stellten einen Katalog aus ∼1800 Proteinen zusammen, der viele Komponenten enthält, die von ESC-spezifischen Genen und Stammesgenen abgeleitet sind, die durch die Transkriptomanalyse definiert wurden (Ramalho-Santos et al., 2002), und eine Reihe von Komponenten, wie Oct4 und UTF1, die werden speziell in ESCs ausgedrückt. Wichtig war, dass sie ESC-spezifische Transkriptionsfaktoren mit geringer Häufigkeit (10 4 bis 10 5 Kopien/Zelle) entdeckten und herausfanden, dass 36% der Gesamtproteine ​​im Zellkern lokalisiert waren, was mit dem hohen Verhältnis von Kern zu Zytoplasma der ESC-Kolonien übereinstimmt.

Kürzlich haben Graumann et al. fraktionierte das SILAC-markierte ESC-Proteom durch 1D/IEF (isoelektrische Fokussierung), gefolgt von einer hochauflösenden Analyse auf einem linearen Ionenfallen-Orbitrap-Instrument (LTQ-Orbitrap) mit einer Massengenauigkeit im Sub-ppm-Bereich, was zu einer sicheren Identifizierung und Quantifizierung von mehr als 5.000 . führte verschiedene Proteine ​​(Graumann et al., 2007). Dies ist das größte bisher bekannte quantifizierte Proteom und enthält prominente Stammzellmarker wie Oct4, Nanog, Sox2, Utf1 und eine embryonale Version von Ras (ERas). Die bioinformatische Analyse des ESC-Proteoms zeigt eine breite Verteilung zellulärer Funktionen mit einer Überrepräsentation von Proteinen, die an der Proliferation beteiligt sind. Außerdem haben Graumann et al. verglichen das Proteom mit einer kürzlich veröffentlichten Karte der Chromatinzustände von Promotoren in ESCs (Mikkelsen et al., 2007) und fanden eine hervorragende Korrelation zwischen Proteinexpression und dem Vorhandensein aktiver und repressiver Chromatinmarkierungen.

Ein interessantes Merkmal des ESC-Proteoms in der Nagano-Studie (Nagano et al., 2005) und einer anderen Studie in D3-ESCs (Nunomura et al., 2005) besteht darin, dass es die für differenzierte Zellen charakteristischen Zelloberflächenmarker und Signalmoleküle beibehält . Dies steht nicht im Widerspruch zu der Vorstellung, dass Interaktionen zwischen Zelloberflächenproteinen und extrazellulären Liganden der Schlüssel zur Initiierung der ESC-Differenzierung zu einer spezifischen Abstammungslinie sind. Obwohl es früher möglich war, dass ein kleiner Teil der Zellen während der Kultivierungsbedingungen zu einer Vielzahl von Zelllinien differenziert wurde, ist es verlockend, anzunehmen, dass das ESC-Proteom mit mehreren Proteinkomponenten ausgestattet ist, die für eine Reihe differenzierter Zelltypen einzigartig sind, wodurch Zellen um auf verschiedene externe Signale zu reagieren, die zur Differenzierung zu bestimmten Abstammungslinien führen, eine Eigenschaft der Pluripotenz der ESCs. Bisher ist relativ wenig darüber bekannt, wie Stammzellen auf eine bestimmte Zelllinie programmiert werden. Dies ist ein wichtiger Forschungsbereich, der eine gezielte Differenzierung beinhaltet, um die Abstammungsbindung dieser pluripotenten Zellen zu beeinflussen in vitro. Die Manipulation extrazellulärer Signale und die Überexpression von Transkriptionsfaktoren können ESCs dazu bringen, sich auf einen bestimmten Zelltyp festzulegen, aber letztendlich sind es die Veränderungen in der nuklearen Expression, die die Differenzierung bis zu einer bestimmten Abstammungslinie lenken. Dementsprechend wurde die nukleare Proteomik – Studien kollektiver Aktionen und Interaktionen von Proteinen im Zellkern – vorgeschlagen (Barthelery et al., 2007), um nukleare Proteine ​​sowohl in undifferenzierten als auch in differenzierenden Zellen zu inventarisieren und ihre Dynamik während der zellulären phänotypischen Bindung zu entschlüsseln. Dies bietet die Möglichkeit, unbekannte Transkriptionsfaktoren und zusätzliche nukleäre Effektoren zu identifizieren, die für die Aufrechterhaltung des zellulären Phänotyps entscheidend sind. Darüber hinaus bietet es Erkenntnisse darüber, welches Kernprofil benötigt wird, um das zelluläre Schicksal mit begrenzten Imprinting-Nebenwirkungen zu programmieren oder umzuprogrammieren (Barthelery et al., 2007).

2.2. Das ESC-Epiproteom

Um biologisch relevante Proteine ​​zu identifizieren, die für die Selbsterneuerung und Pluripotenz von Stammzellen wichtig sind, reichen die umfangreichen Kataloge und Benchmarks von Proteindatenbanken nicht aus. Viele biochemische Stoffwechselwege werden eher durch Veränderungen in PTMs wie Phosphorylierung als durch Veränderungen der Proteinhäufigkeit selbst gesteuert. Studien haben nun gezeigt, dass epigenetische Mechanismen wie kovalente Modifikationen von Histonen und DNA-Methylierung von entscheidender Bedeutung für die pluripotente Natur von ESCs sind und dass diese Mechanismen auch die Differenzierung regulieren (Atkinson und Armstrong, 2008). Die epigenetische Natur der ESCs (das ESC-„Epigenom“) hat sich als einzigartig erwiesen und ihre Eigenschaften sind stark mit der globalen Permissivität der Genexpression und Pluripotenz verbunden (Niwa, 2007). In Analogie zum Epigenom wurde ein neuer Begriff „Epiproteom“ geprägt, der eine Proteinlandschaft von PTMs und Histonvarianten widerspiegelt (Dai und Rasmussen, 2007).

Die Phosphorylierung ist ein kritischer PTM, der an der Modulation der Proteinfunktion beteiligt ist. Um einen Einblick in intrazelluläre Signale zu gewinnen, die die ESC-Selbsterneuerung und -differenzierung steuern, wurde eine multivariate Systemanalyse von proteomischen Daten durchgeführt, die aus der kombinatorischen Stimulation von mESCs (Linie CCE) durch Fibronektin, Laminin, LIF und fgf4 generiert wurden (Prudhomme et al., 2004). Die Phosphorylierungszustände von 31 intrazellulären Signalnetzwerkkomponenten wurden über 16 verschiedene Stimulusbedingungen zu drei Zeitpunkten durch quantitatives Western-Blotting erhalten, und Computermodellierung wurde verwendet, um zu bestimmen, welche Komponenten am stärksten mit der Zellproliferation und den Differenzierungsratenkonstanten korrelierten, die aus Messungen der Oct4-Expression erhalten wurden Ebenen. Die Studie identifizierte eine Reihe von Signalnetzwerkkomponenten, die am kritischsten mit der Differenzierung, der Proliferation von undifferenzierten sowie differenzierten Zellen verbunden sind.

Eine groß angelegte proteomische Analyse von hESCs (BG01- und BG03-Linien) wurde auch unter Verwendung von PowerBlot- und Kinexus-Western-Blot-Assays in Verbindung mit Immunfluoreszenz durchgeführt (Schulz et al., 2007). Die Studie identifizierte über 600 Proteine, die in undifferenzierten hESCs exprimiert wurden, einschließlich einer Reihe potenzieller neuer Stammzellmarker, und hob über 40 potenzielle Proteinisoformen und/oder PTMs hervor, darunter 22 Phosphorylierungsereignisse in Zellsignalmolekülen. Vor kurzem wurde eine Nukleosom-ELISA-Methode entwickelt, um den Status von PTMs und Histonvarianten (bezeichnet als „epiproteomische Signatur“), die im gesamten zellulären Nukleosomenpool vorhanden sind, quantitativ zu beurteilen (Dai und Rasmussen, 2007). Die Ergebnisse zeigen, dass die Bewertung der Steady-State-Spiegel von PTMs und MakroH2A eine epiproteomische Signatur ergibt, die zwischen ESCs, EC-Zellen und MEFs unterscheiden kann. Darüber hinaus ändern sich epiproteomische Nukleosomensignaturen als Reaktion auf die Exposition von Zellen gegenüber kleinen Molekülen wie RA und TSA und im Verlauf der ESC-Differenzierung. Dies weist darauf hin, dass die epiproteomischen Signaturen für die Untersuchung der Stammzelldifferenzierung, der Chromatinfunktion, der zellulären Identität und der epigenetischen Reaktionen auf pharmakologische Wirkstoffe nützlich sind.

Die direkte Analyse einer großen Zahl von Peptiden mittels 2D-LC-MS/MS ermöglichte die systematische Identifizierung von Peptiden, die PTMs tragen (Witze et al., 2007). Naganoet al. identifizierten Protein-PTMs in einer Reihe von ESC-Proteinen, darunter fünf Lys-Acetylierungsstellen und eine einzelne Phosphorylierungsstelle (Nagano et al., 2005). Die Phosphorproteomanalyse von undifferenzierten und differenzierten mESCs (Linie J1) mittels Phosphoprotein-Affinitätsreinigung gefolgt von 2D-LC-MS/MS zeigte, dass viele Chromatin-remodellierende Proteine ​​möglicherweise durch Phosphorylierung reguliert werden (Puente et al., 2006). Interessanterweise zeigte die Affymetrix-Mikroarray-Analyse, dass die Genexpressionsniveaus dieser Probenproteine ​​zwischen den verglichenen Proben eine minimale Variabilität aufwiesen (Puente et al., 2006). Diese Ergebnisse heben zusammen die entscheidende Rolle hervor, die epigenetische Faktoren bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz von ESCs spielen (Bibikova et al., 2008) und betonen die Notwendigkeit und den Wert der Proteomanalyse.

2.3. Das ESC-Protein-Interaktionsnetzwerk

Die expressionsbasierten Studien des ESC-Proteoms und Epiproteoms liefern ein umfassendes Inventar von Proteinen sowie deren PTMs, von denen einige als ESC-Marker verwendet werden können. Allerdings reichen solche Proteinlisten nicht aus, um biologische Prozesse zu beschreiben. Lebenswichtige zelluläre Funktionen erfordern die koordinierte Wirkung einer großen Anzahl von Proteinen, die zu einer Reihe von Multiproteinkomplexen unterschiedlicher Zusammensetzung und Struktur zusammengesetzt sind. Die Analyse von Proteinkomplexen und komplizierten Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken ist ein Schlüssel zum Verständnis praktisch aller komplexen biologischen Systeme, einschließlich Stammzellen (Levchenko, 2005).

Um zu verstehen, wie Pluripotenz in ESCs programmiert und aufrechterhalten wird, haben wir einen proteomischen Ansatz verwendet, um Proteinkomplexe zu isolieren, und ein Proteininteraktionsnetzwerk um den Pluripotenzfaktor Nanog konstruiert (Wang et al., 2006). Der Ansatz nutzt die außergewöhnliche Affinität von Streptavidin für Biotin und vermeidet die Abhängigkeit von Antikörpern mit inhärent geringerer Affinität für die Reinigung (siehe Abbildung 3B). Es wurde berichtet, dass ein einstufiger Einfang von Streptavidin markierter Transkriptionsfaktoren ausreicht, um spezifisch assoziierte Proteine ​​mit minimaler unspezifischer Kontamination zu isolieren (de Boer et al., 2003). In diesem System dienen BirA-exprimierende ESCs als Empfänger für andere markierte cDNAs. Ein Konstrukt, das den Pluripotenzfaktor mit einem FLAG-Tag sowie einem Peptid-Tag trägt, der als Substrat für in vivo Biotinylierung wurde in ESCs exprimiert (siehe Abbildung 4A). Das markierte Protein wurde aus Kernextrakten mit Streptavidin-Kügelchen zusammen mit seinen potentiellen Interaktionspartnern gewonnen. Zur Tandem-Reinigung wurden die Kernextrakte zuerst einer Immunpräzipitation mit Anti-FLAG-Antikörpern unterzogen und die gewonnenen Proteinkomplexe wurden weiter durch Streptavidin-Kügelchen gereinigt. Proteinkomplexe, die entweder aus einer einstufigen Streptavidin- oder einer Tandem-Reinigung gewonnen wurden, wurden einer Mikrosequenzierung durch LC-MS/MS unterzogen (siehe Fig. 4B).


A. Etablierung eines Biotinylierungssystems in ESCs. Eine stabile ESC-Linie, die das bakterielle BirA-Enzym exprimiert, wurde zuerst durch Transfektion mit einem BirA-exprimierenden Plasmid etabliert, das das Neomycin-Resistenzgen (neor) und die G418-Selektion trägt. Ein zweites Plasmid, das Nanog-cDNA mit einem N-terminalen Flag-Biotin-Dual-Tag (FLBIO .) enthält ) und ein Puromycin-Resistenz-(puror)-Gen wurde eingeführt und Zellen mit Puromycin selektiert. Die resultierenden stabilen Linien sind sowohl gegen G418 als auch gegen Puromycin resistent und exprimieren FLAG-markiertes, biotinyliertes Nanog, das durch Anti-FLAG- und Streptavidin-Antikörper/-Beads immunpräzipitiert werden kann. B. Zwei komplementäre Affinitätsreinigungsstrategien für die Reinigung von Proteinkomplexen. Einzelne Streptavidin-Immunpräzipitation und Tandem-Affinitätsreinigung (Anti-Flag-Immunpräzipitation gefolgt von Streptavidin-Pulldown) wurden parallel durchgeführt, die gereinigten Proteinkomplexe wurden auf SDS-PAGE fraktioniert und LC-MS/MS unterzogen, um Komponenten der Proteinkomplexe zu identifizieren.

Wir haben uns zunächst auf die Variante des Homöobox-Nanog-Proteins konzentriert, da wir seine Rolle bei der Aufrechterhaltung des pluripotenten Zustands von Zellen im frühen Mausembryo und der Förderung der Pluripotenz von mESCs (Chambers et al., 2003: Mitsui et al., 2003) berücksichtigten. Durch Affinitätsreinigung von Nanog-assoziierten Proteinkomplexen gefolgt von LC-MS/MS wurden Komponenten von Nanog-Proteinkomplexen (und damit direkte und/oder indirekte Nanog-Interaktionspartner) identifiziert.Viele der identifizierten Kandidaten waren andere Transkriptionsfaktoren oder Komponenten von Transkriptionskomplexen, von denen einige bereits in früheren Studien mit ESC-Funktionen in Verbindung gebracht wurden. Eine Reihe von Romanen (z.B., Dax1 , Rif1 , Nac1 und Zfp281 ) und bekannt (z.B., Oct4) wurden kritische Faktoren sowohl physikalisch als auch funktionell für die Assoziation mit dem Köder Nanog validiert und (zusammen mit einem anderen wohlbekannten ESC-Marker Rex1) zur Reinigung einer zweiten Reihe von Komplexen verwendet. Die resultierenden Datensätze wurden verwendet, um ein komplexes Netzwerk interagierender Proteine ​​zu generieren, das in Abbildung 5A prägnant dargestellt ist. Diese iterative „bottom-up“-Strategie zeigt ein enges, stark vernetztes Proteinnetzwerk, das stark an nuklearen Faktoren angereichert ist, die individuell für die Aufrechterhaltung der ESC-Eigenschaften benötigt werden und die ESC-Differenzierung mitreguliert (Wang et al., 2006). Darüber hinaus ist das Netzwerk mit mehreren Korepressorwegen verbunden, was sowohl ein Mittel zur Regulierung verschiedener Sätze von Zielgenen als auch einen ausfallsicheren Mechanismus bietet, um die Differenzierung in verschiedene Linien zu verhindern, eine Voraussetzung für Pluripotenz. Darüber hinaus sind nachgelagerte Gen-Targets mehrerer zentraler Pluripotenzfaktoren (z.B., Nanog , Oct4 ), die aus früheren Studien identifiziert wurden (Boyer et al., 2005: Loh et al., 2006), dienen auch als vorgelagerte Regulatoren im Netzwerk (siehe Abbildung 5B), was darauf hindeutet, dass das ESC-Interaktionsnetzwerk ein in sich abgeschlossenes, äußerst dichtes Zellmodul für Pluirpotenz. Schließlich unterstreicht die Identifizierung einer Reihe von Netzwerkproteinen, die nicht streng spezifisch für ESCs sind und nicht durch transkriptionales Profiling identifiziert werden können, die Bedeutung und den Vorteil von Proteomstudien in ESCs.


A. Proteine ​​mit roten Markierungen sind markierte Köder für die Affinitätsreinigung. Grüne und rote Linien zeigen bestätigte Wechselwirkungen durch Coimmunpräzipitation oder veröffentlichte Daten an. Gepunktete Linien zeigen eine mögliche Assoziation an. Grüne Kreise kennzeichnen Proteine, deren Knockout zu Defekten in der Proliferation und/oder zum Überleben der inneren Zellmasse oder zu anderen Aspekten der frühen Entwicklung führt Blaue Kreise kennzeichnen Proteine, deren Reduktion durch RNAi (oder shRNA) zu Defekten in der Selbsterneuerung und/oder Differenzierung von . führt ESCs Gelbe Kreise sind Proteine, deren Knockout zu späteren Entwicklungsdefekten führt. Weiße Kreise bezeichnen Proteine, für die keine Daten zum Funktionsverlust vorliegen. Innerhalb des Netzwerks sind auch drei wichtige Chromatin-modifizierende Komplexe angegeben, deren Komponenten mit schwarzen Sternen (Polycomb-Repressionskomplex 1), roten Sternen (NuRD-Komplex) bzw. einem blauen Stern (SWI/SNF-Komplex) markiert sind.


B. Ziele von Pluripotenzfaktoren sind im Netzwerk stark vertreten. Die linken Felder zeigen die Targets von Nanog, Oct4 und Sox2 in hESCs (Boyer et al., 2005) und Targets von Nanog und Oct4 in mESCs (Loh et al., 2006). Die rechte Tabelle fasst die Targets von Nanog und Oct4 aus den beiden ChIP-Studien (links) zusammen, die im Proteinnetzwerk (Mitte) vorhanden sind. Hinweis: X m, h zeigt an, dass Gen X sowohl in Maus- (m) als auch in menschlichen (h) ESCs als Targets von Nanog und/oder Oct4 identifiziert wurde. Schattiert sind die Ziele von Nanog und Oct4.

Das ultimative Ziel der funktionellen Proteomik in Stammzellen ist es, die molekulare Funktion einer ganzen Zelle zu entschlüsseln, indem ein Konstruktions-Masterplan erstellt wird, der alle molekularen Maschinen, ihre Funktionen zur Aufrechterhaltung der Stammzelleigenschaften, ihre Reaktionen auf äußere Reize während der Differenzierung und ihre Interkonnektivität beschreibt. Unsere oben beschriebenen Arbeiten zum Proteininteraktionsnetzwerk in mESCs sind der erste Schritt in diese Richtung. Darüber hinaus bietet es einen Rahmen für die Untersuchung der Kombinationen von Faktoren, die eine optimale Reprogrammierung differenzierter Zellen in einen ES-Zellzustand ermöglichen können (Wang und Orkin, 2008).

2.4. Das ESC-Transkriptionsregulationsnetzwerk

Groß angelegte transkriptomische und proteomische Analysen von ESCs ergänzen einander und haben eine Grundlage für ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Stammzellbiologie gelegt. Jedoch existieren fehlende Verbindungen, wie z. B. Gentranskription, möglicherweise nicht direkt anzeigend oder proportional zu Proteintranslationsauslesen (Expression), und umgekehrt spezifizieren Proteinexpression und Multiproteinkomplexe selbst nicht die Zielgenregulierung des Proteins/der Proteine. Ein umfassendes Verständnis der Etablierung des pluripotenten Zustands in ESCs erfordert den Aufbau eines erweiterten transkriptionalen Regulationsnetzwerks, in dem viele wichtige Transkriptionsfaktoren neben Nanog , Oct4 und Sox2 und ihren Interaktionspartnern (Wang et al., 2006) direkt an ihre Zielgene binden.

Jüngste Studien haben begonnen, Transkriptionsnetzwerke aufzuklären, die die drei zentralen ESC-Transkriptionsfaktoren Nanog, Oct4 und Sox2 umgeben, die die ESC-Pluripotenz kontrollieren. Unter Verwendung von ChIP-Chip-Analyse (Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Microarray-Hybridisierung zur Identifizierung von Bindungsstellen im Genom-weiten Maßstab) haben Boyer et al. zeigten, dass Oct4, Sox2 und Nanog zusammenarbeiten, um die hESC-Pluripotenz und Selbsterneuerung durch autoregulatorische und Feedforward-Schleifen zu regulieren. Diese drei Transkriptionsfaktoren wirken, indem sie Pluripotenzgene einschließlich sich selbst aktivieren und wichtige Entwicklungsgene möglicherweise teilweise mit Hilfe von Polycomb-Proteinen unterdrücken (Boyer et al., 2006: Lee et al., 2006). Unter Verwendung von ChIP gefolgt von Paired-End-Ditags (ChIP-PET) haben Loh et al. untersuchten Zielgene von Nanog und Oct4 in mESCs und fanden heraus, dass beide wesentlich überlappende Zielgene regulieren (Loh et al., 2006). Die Kreuzuntersuchung der Zielgene von Nanog und Oct4 zwischen hESCs und mESCs ergab jedoch eine begrenzte Überlappung zwischen den beiden Datensätzen, was entweder auf unterschiedliche Kontrollmechanismen zwischen den beiden Spezies oder inhärente Variationen zwischen den beiden Technologieplattformen hindeutet. Das Ergebnis dieser Studien war der hohe Überlappungsgrad zwischen den Genen, die von Paaren oder allen drei Transkriptionsfaktoren anvisiert werden. Es blieben jedoch Fragen zu klären, wie andere Faktoren als die drei im Proteininteraktionsnetzwerk (siehe Abbildung 5A) zur Aufrechterhaltung der Stammzellidentität beitragen und wie die Multiproteinkomplexe die Zielgenregulation spezifizieren.

Obwohl weder Expressions- noch Transkriptionsfaktor-Bindungsstudien für sich allein ausreichen, um eine regulatorische Beziehung zwischen einem Transkriptionsfaktor und seinen Zielen zu etablieren, hat die Integration dieser Methoden zwei unabhängige Beweisquellen für die Vorhersage neuer transkriptionaler Netzwerke, die die ESC-Selbsterneuerung und das Commitment regulieren, mit hoher Zuverlässigkeit geliefert (Walker et al., 2007: ). Unter Verwendung eines modifizierten ChIP-Chip-Verfahrens (bezeichnet als Bio-ChIP-Chip) in Kombination mit Affinitätsreinigung und LC-MS/MS (bezeichnet als Bio-SAIP-MS), um das derzeitige Proteininteraktionsnetzwerk zu erweitern (siehe Abbildung 6), haben Kim et al. systematisch Zielgene von insgesamt 9 Proteininteraktionsnetzwerkfaktoren (Nanog, Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nac1, Zfp281, Dax1 und Rex1) untersucht und ein erweitertes transkriptionales regulatorisches Netzwerk in mESCs konstruiert (Kim et al., 2008). Dieses Netzwerk enthält neben Nanog, Sox2 und Oct4 viele weitere zentrale Pluripotenzfaktoren, die autoregulatorische und Feedforward-Regelkreise bilden. Klf4 dient insbesondere als Upstream-Regler größerer Feedforward-Schleifen, die Nanog, Sox2 und Oct4 sowie c-Myc enthalten. Noch wichtiger ist, dass kombinierte Analysen von bioChIP-Chip-Daten mit Genexpressionsdaten zeigten, dass die Mehrheit der gemeinsamen Ziele von über 4 Faktoren in ESCs hoch aktiv sind und bei der Differenzierung unterdrückt werden. Bei Targets, die durch weniger Faktoren gebunden sind, sind sowohl aktive als auch reprimierte Gene vorhanden und das Gleichgewicht verschiebt sich in Richtung Geninaktivität mit reduzierter Faktor-Co-Occupation. Das Extrem ist, dass verschiedene Ziele eines einzelnen Faktors weitgehend inaktiv oder unterdrückt sind. Darüber hinaus weist das Regulierungsnetzwerk auch darauf hin, dass c-Myc und drei andere Faktoren (Nanog, Oct4, Sox2) unterschiedliche Rollen in ESCs spielen. d.h., c-Myc ist weitgehend an der Stimulierung der Zellproliferation und der Regulierung der chromosomalen Zugänglichkeit beteiligt, während Oct4 / Sox2 / Nanog ESC-Faktoren positiv regulieren und die Differenzierung negativ regulieren (Kim et al., 2008). Dies bietet einen potenziellen Mechanismus, der für die unterschiedliche Regulation von Transkriptionsfaktorzielen in ESCs verantwortlich sein könnte und bietet mechanistische Einblicke in die 4-Faktoren (Oct4, Klf4, Sox2 und c-Myc) vermittelte somatische Zellreprogrammierung (Lewitzky und Yamanaka, 2007). .


Die ESCs, die BirA allein (als Kontrolle) und BirA plus biotinylierte Transkriptionsfaktoren (bioTF) exprimieren, können zur Isolierung von Proteinkomplexen mittels Streptavidin (SA) Immunpräzipitation (IP) gekoppelt mit LC-MS/MS (genannt bio SAIP-MS) verwendet werden und Aufbau eines Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks währenddessen können dieselben ESCs ausgesetzt werden in vivo Biotinylierungs-vermittelte Chromatin-Immunpräzipitation und Microarray (genannt Bio-ChIP-Chip) zur Identifizierung von Protein-DNA-Interaktionen und zum Aufbau eines transkriptionalen regulatorischen Netzwerks.

Unsere Demonstration von in vivo Biotinylierung von markierten Proteinen und Streptavidin-Affinitätserfassung zur Identifizierung globaler Ziele mehrerer Faktoren, die an der transkriptionellen Kontrolle der Pluripotenz in ESCs beteiligt sind, unterstreicht die Leistungsfähigkeit proteomischer Ansätze zur systematischen Definition der Protein-Protein-Interaktion und der Protein-DNA-Interaktionsnetzwerke, die in ESCs. Insbesondere die Affinitätsreinigung von Biotin-markierten Proteinkomplexen gekoppelt mit LC-MS/MS ( bio SAIP-MS) und der bio ChIP-Chip-Methode macht die Abhängigkeit von Antikörpern mit niedriger Affinität überflüssig und ermöglicht die Erzeugung von zwei unabhängigen datenreichen Ressourcen mit denselben Biotin-markierten Zelllinien und ähnlichen Verfahren (siehe Abbildung 6), was den Weg für hocheffiziente, groß angelegte proteomische Studien in ESCs ebnet.

3. Proteomische Studien an adulten Stammzellen

3.1. Aktueller Stand der adulten Stammzell-Proteomik

Somatische Stammzellen wurden in adulten Organismen identifiziert und werden durch ihre dualen Eigenschaften der Selbsterneuerung und Differenzierung definiert. Im Gegensatz zu ESCs sind adulte somatische Stammzellen jedoch in ihrer Fähigkeit eingeschränkt, Zelltypen innerhalb einer definierten Abstammungslinie hervorzubringen. In den letzten 20 Jahren wurde eine große Menge an Arbeiten zusammengestellt, um diese Zellen weiter zu definieren, rigorose Isolationsstrategien zu entwickeln und ihre in vitro und in vivo Funktionen und erstellen Transkriptionsprofile. Während diese Studien das Feld stark vorangebracht haben, erfordert ein vollständiges Verständnis der Mechanismen, die die Selbsterneuerung und die Wirksamkeit in adulten Stammzellen regulieren, die Integration mehrerer Hochdurchsatz-Plattformen zur Bewertung von Transkriptomen, Proteomen und Protein-Interaktomen. Im Gegensatz zu ESCs haben sich jedoch nur relativ wenige Studien an das Proteomic-Profiling und die Proteininteraktionskartierung adulter Stammzellen gewagt. Die meisten Studien im Bereich der adulten Stammzell-Proteomik haben sich auf drei Zelltypen konzentriert: hämatopoetische Stammzellen (HSCs), neurale Stammzellen (NSCs) und mesenchymale Stammzellen (MSCs). Es gibt viele inhärente Herausforderungen bei der Durchführung proteomischer Studien mit adulten Stammzellen. Mit Ausnahme von NSCs, die deutlich erweitert werden können in vitro Ohne Verlust der Stammzelleigenschaften können die meisten adulten Stammzelltypen nicht in Kultur gehalten oder vermehrt werden, ohne dass ihre Wirksamkeit verändert wird. Somit sind der Anzahl der verfügbaren Input-Zellen Grenzen gesetzt und im Gegensatz zur Entwicklung der globalen Nukleinsäure-Amplifikation für das Transkriptions-Profiling fehlt derzeit ein wirksames Protein-Amplifikationsverfahren.

Viele der anfänglichen Proteomik-Bemühungen von in vitro expandierte adulte Stammzellen haben die 2-dimensionale Gelelektrophorese (2-DE) als Front-End-Fraktionierungsmethode vor der Massenspektrometrie (MS)-Analyse verwendet (siehe Abbildung 1A). Dieser Ansatz weist mehrere Einschränkungen auf, darunter ein begrenztes Auflösungsvermögen, eine schlechte Darstellung sehr großer oder kleiner, basischer oder hydrophober Proteine, der Bedarf an relativ großen Probenmengen und statistische Probleme (verschiedene Analysealgorithmen erzeugen unterschiedliche Ergebnisse). Kombinierte Datensätze aus diesen Proteomic-Profiling-Studien zeigen, dass die größte konservierte Gruppe von Proteinen in adulten Stammzellen am Energiestoffwechsel beteiligt ist (Baharvand et al., 2007). Diese Datensätze sind jedoch weitgehend durch die verwendete Methodik verzerrt und können folglich einfach die am häufigsten vorkommenden Proteine ​​darstellen, die unter diesen Zelltypen allgemein exprimiert werden.

Im Anschluss an diese ersten Studien haben mehrere Gruppen die Entwicklung ausgefeilterer und unvoreingenommener proteomischer Techniken genutzt, um neue Einblicke in die Biologie von adulten Stammzellen zu gewinnen. Die Entwicklung einer sensitiven iTRAQ-Methodik in Kombination mit einer MS-Analyse (siehe Abbildung 1B) hat den Vergleich gereinigter Populationen hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen mit nur 1x10 6 Input-Zellen ermöglicht. Interessanterweise legen die Ergebnisse dieser Studie nahe, dass HSCs im Gegensatz zu ihren differenzierteren Vorläufer-Gegenstücken an anaerobe Umgebungen angepasst sind (Unwin et al., 2006). Diese Unterschiede wurden nicht beobachtet, wenn die Transkriptome derselben Populationen verglichen wurden (Unwin et al., 2006), was stark darauf hindeutet, dass Transkriptionsprofile allein nicht ausreichend gewesen wären, um diesen neuen Aspekt der HSC-Biologie abzuleiten. Darüber hinaus hat sich iTRAQ bei der Definition einer schlecht charakterisierten Population hämatopoetischer Vorläuferzellen (Lineage – c-Kit + Sca-1 – ) als hauptsächlich erythroide Natur erwiesen (Spooncer et al., 2007). Auf dem Gebiet der MSC wurde die 2-dimensionale Flüssigkeitschromatographie (2D-LC) oder die LC/LC-Fraktionierung gefolgt von der Tandem-MS/MS verwendet, um zu zeigen, dass die osteogene Differenzierung von Stammzellen aus der Fokussierung der Genexpression in funktionellen Clustern resultiert und nicht einfach aus die induzierte Expression neuer Gene (Salasznyk et al., 2005).

Es wurde auch gezeigt, dass PTMs die Schicksalsentscheidungen von adulten Stammzellen signifikant beeinflussen können. Ein quantitativer Phosphoproteomics-Ansatz, erleichtert durch die SILAC-Technologie (siehe Abbildung 1C), wurde verwendet, um den Einfluss der Wachstumsfaktor-Signalgebung auf die MSC-Differenzierung zu untersuchen. Insbesondere wurde festgestellt, dass der Mechanismus, durch den zwei verwandte Wachstumsfaktoren (EGF und PDGF) die Differenzierung von MSCs unterschiedlich beeinflussten, durch Tyrosinphosphorylierung vermittelt wird (Kratchmarova et al., 2005).

Wie bereits in diesem Aufsatz hervorgehoben, hat die kürzliche Charakterisierung eines funktionellen Protein-Interaktom- und Transkriptionsregulationsnetzwerks in mESCs (Kim et al., 2008: Wang et al., 2006) wichtige neue Konzepte für Prozesse hervorgebracht, die die Entwicklung und die Stammzellpluripotenz regulieren. Während diese Art von komplizierten Netzwerken in adulten Stammzellen noch nicht identifiziert wurde, haben erste Bemühungen in Richtung dieses Ziels einen Proteomik-Ansatz verwendet, um kritische Protein-Protein-Wechselwirkungen zu identifizieren, die die Selbsterneuerung und Differenzierung regulieren. Eine elegante Studie von Lessard et al. hat eine wesentliche Änderung der Untereinheitszusammensetzung eines SWI/SNF-ähnlichen Chromatin-Remodeling-Komplexes während der Differenzierung von NSCs zu postmitotischen Neuronen charakterisiert (Lessard et al., 2007). Neurale Stamm- und Vorläuferzellen exprimieren die Untereinheitsproteine ​​BAF45a und BAF53a als Teil des SWI/SNF-Chromatin-Remodeling-Komplexes, die durch BAF45b, BAF45c und BAF53b ersetzt werden, wenn die Vorläufer den Zellzyklus verlassen. Wichtig ist, dass die wesentliche Natur dieser Untereinheitsänderung für die neurale Differenzierung funktionell validiert wurde. Zusammengenommen verdeutlichen die bisher erzielten Proteomic-Profiling- und Protein-Interaktom-Studien an adulten Stammzellen die Tatsache, dass diese Methoden zu neuen Erkenntnissen in die zugrunde liegende Zellbiologie führen können und werden, die mit anderen Mitteln nicht entdeckt würden.

3.2. Zukünftige Richtungen der Proteomik von adulten Stammzellen

Das Gebiet der adulten Stammzell-Proteomik hat eine vielversprechende Zukunft. Mit der Verfügbarkeit neuer, verbesserter und empfindlicherer Methoden wird die begrenzte Anzahl erhältlicher adulter Stammzellen eine geringere Barriere darstellen. Ein vielversprechender Ansatz für eine Vielzahl von Anwendungen in proteomischen Studien mit adulten Stammzellen ist die Verwendung von Protein-Mikroarrays oder -Chips (siehe Abbildung 1E). Diese haben das Potenzial, Protein-Protein-Wechselwirkungen, Protein-Phospholipid-Wechselwirkungen, niedermolekulare Targets und Substrate von Proteinkinasen zu identifizieren, während sie eine relativ geringe Menge an Ausgangsmaterial benötigen (Baharvand et al., 2007). Die Art von funktionellen Protein-Mikroarrays, die zuvor in Hefe zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen verwendet wurden, und die spezifisch gezeigt wurden, um Calmodulin-bindende Proteine ​​zu identifizieren (Zhu et al., 2001), sind besonders wertvoll für die Charakterisierung des adulten Stammzellprotein-Interaktoms.

Eines der Hauptprobleme, mit denen die Proteomik von adulten Stammzellen konfrontiert ist, d.h., Zellheterogenität, wird ironischerweise stark von der proteomischen Arbeit selbst unterstützt. Es wurde gezeigt, dass die Isolierung einer als angereichert angesehenen hämatopoetischen Stamm-/Vorläuferpopulation (humane Nabelschnurblut-CD34 + -Zellen) immer noch zu einer signifikanten proteomischen Heterogenität zwischen den Proben führt (Zenzmaier et al., 2005). Adulte Stammzellpopulationen erweitert in vitro sind ebenfalls nicht immun gegen dieses Problem, da gezeigt wurde, dass menschliche Knochenmark-MSC-Linien unterschiedliche Selbsterneuerungs- und Abstammungsdifferenzierungskapazitäten aufweisen (Colter et al., 2001). Die Proteomik kann diese Probleme durch eine weitere Charakterisierung von Zelloberflächenantigenen lösen, die spezifisch auf verschiedenen adulten Stammzelltypen exprimiert werden, was eine noch größere prospektive Isolationsfähigkeit und damit homogenere Zellpopulationen ermöglichen wird. Dies wurde im HSC-Bereich erkannt, wo Transkriptom-Profiling die Identifizierung der SLAM-Familie von Zelloberflächenmarkern ermöglichte (Kiel et al., 2005), die verbesserte Mittel zur HSC-Isolierung aufweisen. Wenn Transkriptomdaten hierzu mäßige Erfolge erzielen können, besteht ein enormes Potenzial, neue Biomarker durch Membranproteomik zu identifizieren. Darüber hinaus wird die Verwendung von Abstammungs-spezifischen fluoreszierenden Reportern die Isolierung homogenerer Zellpopulationen ermöglichen. Diese Strategie wurde erfolgreich in Proteomstudien eingesetzt, die die Differenzierung von mESCs zu mesodermalen/Hämangioblasten-Linien mit anschließender Profilerstellung mit iTRAQ untersuchten (Williamson et al., 2007).

4. Abschließende Bemerkungen

Die Proteomik-Studien an embryonalen sowie adulten Stammzellen werden die Charakterisierung dieser Zellen auf der Transkriptionsebene (Transkriptom) ergänzen und Gentranskription und zelluläre Phänotypen verbinden. Die wahre Herausforderung besteht nun darin, die Proteomik in das gesamte Spektrum der biologischen und biomedizinischen Forschung zu integrieren. In den nächsten zehn Jahren wird die Charakterisierung des Proteoms und Interaktoms von Stammzellen durch die Identifizierung von Proteinbestandteilen, die Quantifizierung der Proteinkonzentration, die Zerlegung von Proteininteraktionsnetzwerken und die Entschlüsselung von Transkriptionsschaltkreisen eine Fülle wertvoller Informationen liefern. Diese Daten werden eine integrierte Analyse auf Systemebene und die Modellierung der Mechanismen ermöglichen, die die Selbsterneuerung und Potenz von Stammzellen regulieren.Kombinierte Fortschritte in der Stammzellbiologie und MS sind vielversprechend, um Komponenten oder Wege zu sezieren, die entweder die Proliferation und Selbsterneuerung stimulieren oder die Differenzierung zu bestimmten Zellen oder Geweben induzieren. Letztendlich wird dies einen Rahmen für das Verständnis der zugrunde liegenden Biologie von Stammzellen bieten und eine präzise Manipulation und Realisierung des vollen klinischen therapeutischen Nutzens dieser einzigartigen Zellen ermöglichen.


Diskussion

Eichelmuscheln produzieren begrenzte Mengen an wasserunlöslichem Klebstoff an einer versperrten Stelle, was die Analyse dieses Materials notorisch erschwert. Der Körper der Entenmuschel ist von kalzifizierten Parietal- (Seitenschale) und opercularen Platten begrenzt, die die Grenzfläche bei Eichelmuscheln verdecken, wo die radiale Ausdehnung der adhäsiven Grenzfläche in einer mit ihrem Häutungszyklus korrelierten Weise stattfindet [50, 51]. Außerdem ist dieser Grenzflächenbereich selbst nur wenige Mikrometer dick und liegt bei einigen Arten unter einer verkalkten Grundplatte. Während der Klebstoff selbst hauptsächlich aus Protein besteht [52], wurde auch das Vorhandensein von Kohlenhydraten und Lipiden in dieser kritischen Region festgestellt [14, 53–55]. Auf der Grundlage der konfokalen Mikroskopie lebender Seepocken [8, 14, 55] und neuer Ansätze zum Aufbrechen der Klebstoffgrenzfläche [6] wurden kürzlich neue Details zur Bildung und Zusammensetzung von Seepocken-Kleber bekannt.

Direkte Beobachtung der sich ausdehnenden Klebstoffgrenzfläche in lebenden adulten Eichelmuscheln (insbesondere A. amphitrit) hat einen komplexen raumzeitlichen Prozess aufgezeigt [8, 14, 26, 55]. Die Entwicklung und Ablagerung von Lipiden, Proteinen und Kohlenhydraten erfolgt zu verschiedenen Zeitpunkten während des Häutungszyklus. Eine epidermale Schicht, die sich an der radialen Vorderkante befindet (und Dutzende von Mikrometern von der Grenzfläche entfernt) und sich zur Mitte der Seepocken erstreckt, spielt eine entscheidende Rolle bei der Bereitstellung der Bausteine ​​für die mehrschichtige Grenzfläche [14], einschließlich Protein Lieferung. Darüber hinaus trägt die Zufuhr von Lipiden und reaktiven Sauerstoffspezies zur Vorderkante zur Oberflächenreinigung bei, einem wichtigen Vorbereitungsschritt für die Adhäsion [14]. Ein gut beschriebenes Kapillarnetzwerk mit verteilten Kanälen, die nahe an der Eintrittskante enden, wird traditionell die Rolle zugewiesen, Zement [25, 26] oder Häutungsflüssigkeit [26] direkt an die Eintrittskantenschnittstelle zu liefern. Last et al. (2012) zeigten, dass der Häutungsprozess, einschließlich der Entwicklung der Kapillarnetzwerke und der Mineralisierung, mit einer erhöhten Adhäsion einherging, zeigten jedoch später auch, dass eine Proteinschicht vorhanden ist und an die Grenzfläche abgegeben wird, bevor das Kapillarnetzwerk fertiggestellt ist [55]. Die Experimente von Saroyan et al. schlugen vor, dass die Rolle des Kapillarnetzwerks mit der Sklerotisierung zusammenhängt [25], obwohl direkte biophysikalische Beweise für die Zusammensetzung der Chemie im Kapillarnetzwerk für Eichelmuscheln fehlen. Obwohl der Prozess der Klebstoffbildung der Eichel-Seepocken nicht vollständig verstanden ist, ist es wichtig, die Komposition des Klebstoffs selbst und dies auf effiziente Weise mit minimalem Einsatz an Ausgangsmaterial – ein vorrangiges Ziel der aktuellen Untersuchung.

Jüngste Fortschritte wurden bei der Auflösung des Klebstoffs mit HFIP erzielt und führten zur Identifizierung neuer Proteine ​​[6, 17], aber verbesserte Methoden werden die Verarbeitung von Proben aus einzelnen Organismen und die Untersuchung von Seepocken-Kleber in Bezug auf biophysikalische oder Umweltbedingungen ermöglichen. In dieser Arbeit wurden PCT-Methoden entwickelt, um den hydratisierten, dicken Klebstoff zu verarbeiten, der oft von Seepocken produziert wird, wenn sie auf Silikonsubstraten wachsen [36]. Hochdruck unterstützt bei der Solubilisierung von Seepocken-Grenzflächenproteinen, was zur Identifizierung und Charakterisierung zusätzlicher Proteine ​​an der Grenzfläche führt. Die PCT-Methode bietet erhebliche methodische Verbesserungen, indem der Klebstoff in Gegenwart eines konzentrierten Lösungsmittels einem hohen Druck ausgesetzt wird, wobei Harnstoff am effektivsten ist, was zur zuverlässigsten Identifizierung (dh konsistent über mehrere Replikate) der größten Anzahl von Proteinen führte . Es hat sich gezeigt, dass erhöhter Druck die Proteolyseeffizienz erhöht und die Aufschlusszeit im Vergleich zu Umgebungsdruckbedingungen verkürzt, was bedeutet, dass PCT-Methoden in weniger als 8 Stunden abgeschlossen werden können – eine massive Reduzierung der Zeit, die erforderlich ist, um Seepockenklebstoff mit In-Gel-Methoden für Proteomik (üblicherweise über mindestens 2-3 Tage [57]). Auch der Durchsatz wird gesteigert, da 16 Proben gleichzeitig und mit deutlich weniger Ausgangsmaterial verarbeitet werden können (

1–2 mg Klebstoff) zur Analyse. Neben der Reduzierung von Volumen und Zeit des Arbeitsaufwands während der Verarbeitung führte die PCT-Methode zur Identifizierung eines Großteils der bereits bekannten Proteine, die bereits den Klebstoff bilden, und zur Entdeckung neuer Proteine ​​an der Grenzfläche.

Rund 80 % der A. amphitrit Auch in dieser Studie mit PCT wurden adhäsive Proteine ​​gefunden, die zuvor mit HFIP und gelbasierten Methoden [6] identifiziert wurden. Ein Großteil der Proteine ​​wurde mit einer hohen Anzahl von minimalen Peptiden identifiziert (5), obwohl

30% wurden nur identifiziert, wenn der Schwellenwert unter 4 minimale Peptide fiel. Die an der Grenzfläche gefundenen Proteine ​​können in drei vorhergesagte funktionelle Hauptgruppen unterteilt werden: Bulk-Strukturproteine, Enzyme und Pheromone. Sechsundzwanzig der zuvor identifizierten Proteine, von denen vorhergesagt wurde, dass sie Bulk-Proteine ​​sind, wurden weiter in 6 Untergruppen gruppiert (19-, 43-, 52-, 57-, 100- und 105-ähnliche Proteine). Von diesen wurde die Mehrheit (23) mittels PCT identifiziert. Diese nicht identifizierten Proteine ​​waren ein einziges Vorkommen von AaCP19-ähnlichen (AaCP19-9) und 2 Vorkommen von AaCP43-ähnlichen (AaCP43-5 und -6) Proteinen. AaCP19-9 und AaCP43-5 wurden nur durch Transkriptomik identifiziert und wurden nicht mit Proteomik im Adhäsiv identifiziert. Mit dem Clustering-Algorithmus in Scaffold wurden AaCP19-7 und -8 zusammengeclustert, was die ähnliche Sequenz zwischen den beiden Proteinen hervorhebt. Von den siebzehn Enzymen, die an der Oberflächengrenzfläche identifiziert wurden [6, 17, 27], Peroxinectin- (AaPxt), Lysyloxidase- (AaLOx), Serin-Protease-Inhibitor- (AaPI), Peroxidase- (AaPx) und Peptidase- (AaPep)-ähnliche Proteine ​​wurden in der vorliegenden Studie identifiziert, Molkensäureproteine ​​(AaWAP) jedoch nicht. Auch im Klebstoff wurden drei Variationen von MULTIFUNCin (AaMulti), einem Ansiedlungsaggregationspheromon [16], gefunden [6, 17], von denen hier zwei (AaMulti-1 und -2) identifiziert wurden.

Es zeigte sich, dass die in Verbindung mit PCT untersuchten Lösungsmittelbedingungen einen großen Einfluss auf die Proteinidentifikation haben. Methanol und HFIP sind beide organische Lösungsmittel, während Harnstoff ein chaotropes Mittel ist. Organische Lösungsmittel und Chaotrope helfen auf unterschiedliche Weise bei der Proteinsolubilisierung: Organische Lösungsmittel stabilisieren hydrophobe Regionen, die unter wässrigen Bedingungen interagieren, während Chaotrope Proteininteraktionen stören und das resultierende ungefaltete Protein über Wasserstoffbrückenbindungen und elektrostatische Wechselwirkungen stabilisieren [58]. Die Solubilisierung von Zement über PCT in 8 M Harnstoff führte zu der größten Anzahl von Spektren pro Probe, was darauf hindeutet, dass diese Behandlung das größte Ausmaß an adhäsiver Solubilisierung und anschließend die höchste Identifizierung sowohl von Spektren als auch von Proteinen lieferte (74). Die 60%-Methanol-Bedingung hatte die zweitgrößte Gruppe von identifizierten Proteinen (46) mit nur 3 identifizierten einzigartigen Proteinen im Vergleich zu der 8 M-Harnstoff-Bedingung. Im Allgemeinen hatten diese beiden Bedingungen relativ ähnliche Aminosäure-, Peptid- und Proteinprofile. Von den 22 Proteinen, die in der 100% HFIP-Bedingung identifiziert wurden, waren nur zwei für diese Bedingung einzigartig. HFIP führte auch zu Unterschieden in der Art der Aminosäuren sowie den beobachteten Peptid- und Protein-Molekulargewichtsprofilen, was darauf hindeutet, dass die Proteolyse beeinflusst wurde. Insbesondere war das durchschnittliche Peptidmolekulargewicht bei Verwendung von 100 % HFIP im Vergleich zu 60 % MeOH oder 8 M Harnstoff signifikant größer, jedoch war das durchschnittliche Proteinmolekulargewicht viel kleiner. Unter allen untersuchten Bedingungen zeigen diese Daten, dass 8 M Harnstoff die optimale Zement-Solubilisierungstechnik mit PCT war, während das verdünnte HFIP die schlechteste Leistung erbrachte und die Zugabe von HFIP zu Harnstoff oder Methanol für die Proteinidentifizierung schädlich war. Obwohl die 100% HFIP-Bedingung zu den wenigsten Peptid-/Proteinidentifikationen führte, führte diese Bedingung zu einer hohen Solubilisierung von AaCP19- und AaCP43-ähnlichen Proteinen, die schwer zu solubilisieren sind und als integraler Bestandteil der Adhäsionsfunktion von Seepocken angesehen werden [6]. Unterschiede in der Proteinidentifizierung aus HFIP-Extrakten in dieser Arbeit mit PCT zu früheren gelbasierten Methoden [6] können auf die Abnahme der Proteasefunktion und auf die analysierten Probenarten zurückgeführt werden. Hier wurde nur der verdickte Klebstoff untersucht, während zuvor mehrere Probentypen (verdickter Klebstoff, auf Glasperlen aufgebrachter Klebstoff und „Plaques“ – bestehend aus der basalen Kutikula und der darunter liegenden harten Zementschicht) der HFIP unterzogen wurden. Aus der Perspektive des Aufbaus eines vollständigeren Proteinprofils von Seepockenklebstoffen liefert PCT mit 8 M Harnstoff die meisten Informationen, obwohl auch klar ist, dass verschiedene Lösungsmittel in der Lage sind, verschiedene Proteine ​​und Proteingruppen zu solubilisieren. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Klebstoff Proteine ​​enthält, die ein breites Spektrum physikalischer und chemischer Eigenschaften umfassen. Daher liefert ein „one-size-fits-all“-Probenvorbereitungsprotokoll möglicherweise kein repräsentatives Profil des Klebstoffs, was möglicherweise erklärt, warum die hier vorgestellten Identifizierungen bis heute die „tiefsten“ sind.

Die Anwendung von PCT auf den Seepockenklebstoff ermöglichte die Identifizierung mehrerer neuer Proteine ​​an der A. amphitrit Schnittstelle. Nur eines dieser neuartigen Proteine ​​wurde in der 100% HFIP-Bedingung (AaCP105-5) identifiziert, ein nicht überraschendes Ergebnis, da HFIP zum Auflösen und Charakterisieren verwendet wurde A. amphitrit zuvor adhäsive Proteine. Die Mehrzahl der neuen Proteine ​​wurde unter Verwendung von Harnstoff als Lösungsmittel identifiziert, obwohl zwei (AaHem und AaSP-4) nur im Methanolzustand identifiziert wurden.

Um diese neuen Proteine ​​zu charakterisieren, wurden Sequenzen oder Domänen identifiziert, die zu öffentlich verfügbaren Daten homolog sind. Die Charakterisierung von Seepocken-Adhäsionsproteinen hat sich oft darauf verlassen, angereicherte Aminosäuren zu identifizieren, um die Funktion abzuleiten [6, 23], aber das Wachstum öffentlich verfügbarer Daten hat hier eine auf Sequenzähnlichkeit basierende Analyse möglich gemacht. Von den 81 Proteinen, die in dieser Studie identifiziert wurden, blieben 8 ohne jegliche zugewiesene mutmaßliche Funktion oder Identität zurück. Diese Proteine ​​haben keine Sequenzähnlichkeit mit irgendwelchen bekannten Proteinen oder irgendeinem der anderen Schnittstellenproteine. Sequenzähnlichkeit und vorherige Analyse [6, 17] führten uns dazu, die verbleibenden 73 Interface-Proteine ​​in drei mutmaßliche funktionelle Kategorien einzuteilen – Strukturproteine, Enzyme oder Pheromone. Ein Protein, AaCP43-7, wurde der AaCP43-ähnlichen Strukturproteinfamilie hinzugefügt, da es eine signifikante Homologie zu der Teilsequenz von AaCP43-2 aufwies, die zuvor von unserer Forschungsgruppe (GenBank: AQA26374.1) beim NCBI hinterlegt worden war. Fünf Proteine ​​wurden auch der strukturellen Proteingruppe hinzugefügt, da sie Sequenzähnlichkeit mit den AaCP105-ähnlichen (AaCP105-3 bis -5) und AaMuc-ähnlichen (AaMuc-1 und -2) Familien aufwiesen. Eine neue Proteinfamilie wurde identifiziert, AaCP34, bei der die 5 Mitglieder ähnliche Sequenzen aufwiesen. Die AaCP34-ähnlichen Proteine ​​hatten keine homologen Sequenzen oder Domänen zu anderen bekannten Proteinen.

Weitere 7 Proteine ​​wurden der Kategorie der Strukturproteine ​​hinzugefügt, da ihre mutmaßlichen Identitäten darauf hindeuten, dass sie eine Art adhäsive Funktion erfüllen könnten. Zwei Proteine ​​(AaTitin) zeigten eine schwache bis mäßige Homologie zu einem vorhergesagten Titin-Protein (NCBI Accession Number: XP_015810555.1). Titin ist ein riesiges Protein, das den Muskelfasern Elastizität verleiht [59]. Die AaTitin-Proteine ​​haben keine konservierten Domänen und sind kleine Proteine ​​(vorhergesagtes MW = 33 & 20 kDa). Ihre Sequenzähnlichkeit mit einem vorhergesagten titinähnlichen Protein (XP_015810555.1) scheint von sich wiederholenden Valinresten herzurühren. Eine weitere Gruppe von drei Proteinen (AaGlut) zeigt teilweise Homologie zu einem Protein, das als vorhergesagtes Glutenin von . bezeichnet wird Plutella xylostella, die Diamantrückenmotte (XP_011568564.1), obwohl Glutenin ein pflanzliches Protein ist, das Weizenteig Elastizität verleiht [60]. Die AaGlut-ähnlichen Proteine ​​enthalten keine Homologie zu irgendwelchen konservierten Domänen, aber die P. xylostella Glutenin-ähnliches Protein hat eine mutmaßliche Glutenin_hmw-Superfamiliendomäne, was darauf hindeutet, dass eine konvergente Evolution [61] stattgefunden hat, um diesem Protein elastomere Eigenschaften zu verleihen. Ein anderes Protein (AaFas) enthält zwei sich wiederholende vorhergesagte Fasziklindomänen und weist eine Homologie zu multiplen transformierenden Wachstumsfaktor-β-induzierten Protein ig-h3-ähnlichen Proteinen auf, die oft vier sich wiederholende Fasziklindomänen enthalten [62]. Ig-h3-ähnliche Proteine ​​sind kollagenähnlich und können in faserreiches Gewebe sezerniert werden, und ihre Facsiclin-Domänen können bei der Integrinbindung wirken [63]. Es wurde gezeigt, dass AaCP19- und AaCP43-ähnliche Proteine ​​repetitive komplexe und einfache Domänen und Homologie zu Seidenproteinen aufweisen, was darauf hindeutet, dass von diesen Proteinen gebildete Nanofibrillen für die Adhäsion von Seepocken wichtig sein können [6, 64].

Vier der Schnittstellenproteine ​​haben Homologie zu und teilen Domänen mit Proteinen, die an der Immunität von Wirbellosen beteiligt sind (AaHem: Hämocytin AaVit-1 und -2: Vitellogenin AaβGBPP: β-1,3-Glucan-bindender Proteinvorläufer). Hämocytin fungiert als wirbelloses Lektin, das an Kohlenhydrate bindet und die Hämagglutination als Reaktion auf Krankheitserreger oder Fremdstrukturen fördert [65, 66]. Vitellogenin ist ein multifunktionales Protein, das neben seiner primären Rolle bei der Nährstoffversorgung sich entwickelnder Embryonen an Kohlenhydrate bindet und die Gerinnung über eine konservierte von-Willebrand-Faktor-Domäne (vWD) fördert [67, 68]. Die Vitellogenine der Seepocken enthalten vWD und viele der anderen konservierten Domänen [38], die in allen Vitellogenin-Sequenzen zu finden sind [69]. β-1,3-Glucan-bindendes Protein initiiert Immunantworten von Krebstieren nach Bindung an β-1,3-Glucan [70–72], ein Kohlenhydrat, das in Pilz- und Algenzellwänden vorkommt. Es wurde früher vorgeschlagen, dass die Proteinaggregations- und Vernetzungsprozesse, die während immunologischer Reaktionen stattfinden, evolutionär in der Adhäsionspolymerisation von Seepocken umfunktioniert wurden [27]. Die Fähigkeit dieser Proteine, an Kohlenhydrate zu binden, ist auch von Interesse, da der proteinhaltige Klebstoff in direktem Kontakt mit einer kohlenhydrat- und chitinreichen Kutikulaschicht steht [55], jedoch wurden bisher keine chitinbindenden Proteine ​​massenspektrometrisch an der Oberfläche gefunden . Vier Transkripte, die Chitin-bindende GO-Terme enthalten, wurden aus der Prosomaregion von identifiziert T. japonica formosana [22], aber ob sich diese Proteine ​​in der adhäsiven Region befinden, wurde nicht untersucht. Hier wurde gefunden, dass AaCP105-1 und -3 und AaHem mutmaßliche Chitin-bindende Domänen (ChtBD2, der CBM_14-Superfamilie) enthalten. Diese immunbezogenen Proteine ​​können daher zusammen mit den Proteinen der AaCP105-Familie an der Grenzfläche wirken, indem sie an die Kutikulaschicht binden und die Proteinaggregation fördern.

Über ein Viertel der identifizierten Proteine ​​weisen eine Homologie auf, die auf eine potenzielle enzymatische Funktion schließen lässt. Diese Enzyme umfassen Peroxinectine, Lysyloxidasen, Peroxidasen, eine Peptidase und Serinproteasen und Inhibitoren. Das Vorhandensein dieser Enzyme an der Grenzfläche wurde bereits erwähnt, ebenso wie die Aktivität von Peroxidasen und Lysyloxidasen [6, 17, 25, 28]. Eine Oxidation tritt während der kutikulären Sklerotisierung bei Arthropoden auf [73, 74] und kann während der Härtung des Seepockenadhäsivs durch Oxidation von AaCP43-1 auftreten [17]. Acht potentielle Serinproteasen und sechs Proteaseinhibitoren wurden ebenfalls identifiziert. Serinproteasen und Inhibitoren regulieren die Phenoloxidasekaskade, die die Immunität von Wirbellosen durch die Proteaseaktivierung von Protyrosinasen, die an der Melanisierung beteiligt sind, kontrolliert [72, Tyrosinasen wurden jedoch weder in dieser Arbeit noch in früheren Proteomics-Analysen des Grenzflächenmaterials identifiziert [6, 17]. Proteasen sind auch am Abbau der Kutikula während der Häutung bei Insekten und Krebstieren beteiligt [75–78], entweder durch direkten Verdau der kutikulären Proteinmatrix oder durch Aktivierung anderer notwendiger Enzyme. Entenmuscheln bilden an der Basis eine neue Schicht gefalteter Kutikula, die sich bei radialem Wachstum ausdehnt. Wenn sich die Kutikula nicht mehr dehnen kann, kommt es zur Häutung und die alte Kutikula reißt, um Platz für die Expansion einer neuen Schicht gefalteter Kutikula zu schaffen [14, 55, 79, 80]. Die an der Oberflächengrenzfläche gefundenen Proteasen und Proteaseinhibitoren können daher, wie bereits vorgeschlagen [27], eine doppelte Rolle bei der Häutung und Adhäsion spielen.

Pheromone wurden auch in den Proteinen an der Oberflächengrenzfläche identifiziert, wie bereits berichtet [6, 17]. Die MULTIFUNCin-Glykoproteine ​​lokalisieren an der Seepocken selbst und sind chemische Kommunikationssignale innerhalb und zwischen den Arten, die sowohl siedelnde Seepockenlarven als auch Räuber anziehen [16]. AaMulti-5 hatte Homologie zu α2-Makroglobulin-Proteine ​​und enthielt mehrere Proteinase-Inhibitor- (A2M und ISOPREN_C2) und Rezeptor-(A2M_recep)-Domänen, gemeinsame Merkmale mit allen anderen AaMulti-Proteinen sowie den siedlungsinduzierenden Proteinkomplex (SIPC). α2-Makroglobulinproteine ​​sind im angeborenen Immunsystem aktiv [81] und führen Ferrier et al. (2016) zu vermuten, dass die Kommunikationsfunktion der orthologen Proteine ​​MULTIFUNCin und SIPC aus einer angestammten Immunfunktion hervorgegangen ist.

Drei der identifizierten Proteine ​​wiesen eine Homologie zu einer hinterlegten Sequenz auf, die als wasserbasiertes Siedlungspheromon identifiziert wurde (WSP GenBank: BAM34601.1). Dies ist wahrscheinlich dasselbe

30 kDa Protein beschrieben von Endo et al. [82], das im Gegensatz zu MULTIFUNCin und SIPC in die Wassersäule abgegeben wird [83]. Proteolytisch gespaltene Peptide von SIPC werden wahrscheinlich auch in die Wassersäule freigesetzt [84], aber die Aminosäuresequenz der WSP-Proteine ​​unterscheidet sich von der α2- Makroglobulin-ähnliche Pheromone, was darauf hinweist, dass WSP und SIPC verschieden sind. Die einzige in WSP gefundene Domäne ist Cupin_5 (cl01418), obwohl der Homologiegrad gering ist (E-Wert < 1.e-5). Cupin-Domänen enthaltende Proteine ​​haben eine Vielzahl von Funktionen und werden in Prokaryonten und Eukaryonten gefunden [85], was eine Vorhersage der Proteinfunktion basierend auf dem Vorhandensein dieser Domäne schwierig macht.

Es ist wichtig anzumerken, dass das aus Untermantelgewebe erzeugte Transkriptom [21] verwendet wurde, um eine Proteindatenbank für A. amphitrit und hat ungezielte Proteomik möglich gemacht [6, 17, 38], doch der Fortschritt wird durch einen Mangel an genomischer Information begrenzt. Viele der vom Massenspektrometer nachgewiesenen Peptide werden mehrdeutig mehreren Proteinen mit ähnlichen vorhergesagten Sequenzen zugeordnet, was zu vielen Proteinclustern führt. Ebenso weisen viele dieser Proteine ​​mit ähnlichen Sequenzen eine hohe Homologie auf, wenn ihre Sequenzen mit BLAST verglichen werden. In Ermangelung einer vollständigen Genomsequenz ist unbekannt, ob diese Proteine ​​Isoformen sind oder von einzigartigen Genen produziert werden. Die Proteindatenbank ist auch begrenzt, da sie aus Transkripten in nur einem Gewebe erstellt wurde und nicht alle genetischen Informationen von . enthält A. amphitrit. Zukünftige Bemühungen, ein Genom zu produzieren, würden bei allen proteomischen Analysen von A. amphitrit.


Die Werkzeuge der Proteomik

Norm Dovichi, Amanda Hummon | 16.04.2013

So wie Proteine ​​nach DNA und RNA die dritte Komponente im genetischen Informationsfluss sind, so stellt die Proteomik nach Genomik und Transkriptomik die zeitlich dritte Herausforderung in der umfassenden Analyse lebender Systeme dar. Es ist auch die komplexeste dieser Herausforderungen. Proteine ​​sind viel vielfältiger und schwieriger zu quantifizieren als Nukleinsäuren, und im Gegensatz zu DNA variiert ihre Expression sowohl zeitlich als auch räumlich.

Die Kenntnis der Proteinsequenz und -häufigkeit spielt in der Biotechnologie und Medizin viele wichtige Rollen. Eine wichtige Anwendung ist die Entdeckung von Biomarkern, für die die Verfügbarkeit von Patientenproben eine wesentliche Ressource ist. Die Hypothese hinter Biomarker-Studien ist, dass eine Krankheit wie Krebs verräterische Marker im Serum hinterlässt, die für Diagnose und Prognose verwendet werden können. Der vielleicht bekannteste Marker, das Prostata-spezifische Antigen (PSA), veranschaulicht die Komplexität dieses Gebiets. PSA wurde als prognostischer Indikator für Patienten nach der Behandlung von Prostatakrebs entwickelt. Seine anschließende weit verbreitete Verwendung als Screening für die allgemeine Bevölkerung wurde nicht ausreichend validiert und wird nun weitgehend abgeraten.

Proteomics wird auch verwendet, um zelluläre Netzwerke zu identifizieren, die bei Krankheiten dereguliert sind. Solche Studien vergleichen Primärgewebe von erkrankten und gesunden Personen und haben das Ziel, potenzielle therapeutische Angriffspunkte zu identifizieren.

Eine weitere Anwendung ist die Qualitätskontrolle rekombinanter Therapeutika. Diese proteinbasierten Medikamente werden in Zellkulturen hergestellt. Die Wirtszelle, bei der es sich oft um die Ovarienzelllinie des Chinesischen Hamsters (CHO) handelt, wird manipuliert, um das gewünschte Therapeutikum zu produzieren. Die Zellen oder Zellkultur werden dann geerntet, lysiert und durch eine Reihe von Affinitätsreinigungsschritten geführt. Restproteine ​​aus der Wirtszelllinie bleiben jedoch zurück, wenn auch in Spuren. Die Proteine ​​der Wirtszelle stellen potenzielle Allergene dar, und es ist wichtig, sowohl die Kontaminanten zu identifizieren als auch ihre Häufigkeit zu bestimmen.

Eine Klasse rekombinanter Therapeutika sind Antikörper, die aus polyklonalen Antikörpern gegen das Zielmolekül erzeugt werden. Antikörper stellen die Ausnahme von der Regel dar, dass die genomische Sequenz die Proteinsequenz innerhalb eines Organismus informiert. Das komplexe immunologische System mischt die Sequenz für Antikörper, sodass jede immunologische Zelle eine einzigartige genetische Sequenz für die von ihr produzierten Antikörper enthält. Als Ergebnis ist es notwendig, eine De-novo-Proteinsequenzbestimmung für Zielantikörper durchzuführen.

Schließlich schmücken posttranslationale Modifikationen Proteine ​​mit einer Vielzahl funktioneller Gruppen. Diese funktionellen Gruppen spielen eine vielfältige Rolle bei der Modulation der Funktion eines Proteins. Die Phosphorylierung ist die am häufigsten untersuchte posttranslationale Modifikation aufgrund der Verfügbarkeit robuster Werkzeuge, der gut verstandenen Rolle, die die Phosphorylierung bei der Modulation der Proteinfunktion spielt, und der einfachen Natur der Modifikation. Es ist nicht ungewöhnlich, Studien zu sehen, in denen der Phosphorylierungsstatus eines großen Teils des Proteoms untersucht wird. Im Gegensatz dazu wurde einer anderen wichtigen posttranslationalen Modifikation, nämlich der Glykosylierung, viel weniger Aufmerksamkeit geschenkt. Dieser Mangel an Aufmerksamkeit spiegelt nicht einen Mangel an Bedeutung wider, sondern vielmehr die Komplexität der Modifikation und den primitiven Status analytischer Werkzeuge.

Historische Perspektive

Obwohl sie als die jüngere Schwester der Genomik gilt, ist die Proteinsequenzanalyse tatsächlich älter als die DNA-Sequenzierung. Sie entstand Ende der 1940er/Anfang der 1950er Jahre mit Sangers Sequenzbestimmung von Insulin und Edmans Entwicklung der Isothiocyanat-Abbaureaktion. Diese Technologien sind arbeitsintensiv, langsam und erfordern große Mengen an Ausgangsmaterial. Es war ziemlich selten, die gesamte Sequenz eines Proteins mithilfe von Edmans Chemie zu bestimmen. Stattdessen wurde diese primitive Technologie verwendet, um die Sequenz eines kleinen Peptids zu generieren, das aus dem Protein hergestellt wurde und möglicherweise aus etwa einem Dutzend Aminosäuren besteht. Der genetische Code wurde dann verwendet, um Sonden für das entsprechende Gen zu erstellen. Aus Fragmenten des Genoms erstellte Bibliotheken würden auf das Zielgen gescreent, das dann sequenziert würde.

Wie wir in der Eröffnungsausgabe von The Analytical Scientist beschrieben haben, hat die Genomik in den letzten zwanzig Jahren ein explosionsartiges Wachstum und Reifung erfahren. Ein Erbe davon ist die vollständige Genomsequenz einer sehr großen Zahl von Organismen. Diese genetische Information wurde wiederum verwendet, um Datenbanken mit erwarteten Proteinsequenzen für diese Organismen zu füllen. Es ist nicht mehr erforderlich, Oligonukleotidsonden entsprechend der Sequenz eines Peptids zu synthetisieren und dann eine Bibliothek genetischer Fragmente zu screenen, um das interessierende Gen zu identifizieren. Stattdessen wird die Peptidsequenz in silico gegen die genetische Sequenz gescreent. Die Verfügbarkeit vollständiger Genome ist eine außerordentlich wertvolle Ressource für proteomische Studien.

Um das Potenzial der Verknüpfung von Gen- und Proteinsequenzen zu maximieren, wurden effiziente Methoden zur Generierung von Sequenzen aus kurzen Peptiden benötigt und in den 1970er Jahren wurde die Massenspektrometrie als ideales Werkzeug identifiziert. Die größte Herausforderung bestand darin, große, eher nichtflüchtige Proteine ​​oder Peptide zur Ionisierung und Analyse in die Gasphase zu bringen. Es wurden eine Reihe von Ansätzen untersucht, darunter Ultraschallzerstäubung und Sekundärionisations-Massenspektrometrie. Diese wurden 1988 durch die Entwicklung der Elektrospray-Ionisation von Fenn und MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionization) von Tanaka und Hillenkamp im Jahr 1988 abgelöst. Zusammen eröffneten diese Ansätze die Nutzung der Massenspektrometrie für proteomische Studien mit hohem Durchsatz.

Für weit verbreitete Proteomikstudien waren drei weitere Fortschritte erforderlich. Erstens, wie wir in unserem Artikel in der Januar-Ausgabe von The Analytical Scientist festgestellt haben, erreichten genomische Sequenzdatenbanken in den 1990er Jahren eine angemessene Größe. Seitdem haben Studien zur Sequenzierung des gesamten Genoms für viele Organismen Datenbanken mit allen Proteinsequenzen gefüllt.

Zweitens, beginnend mit den Pionierleistungen von Yates und Kollegen um das Jahr 2000, automatisierte die Entwicklung effizienter Datenbanksuchmaschinen die Identifizierung dieser Proteinsequenzen. Zu diesem Zeitpunkt wussten wir, wonach wir suchten.

Und drittens wurde, beginnend mit der iTRAQ-Chemie (isobare Tags for Relative and Absolute Quantitation) von Aebersold und Kollegen im Jahr 2000, eine Reihe von Reagenzien und Werkzeugen entwickelt, um quantitative Proteomik durchzuführen, die es uns ermöglicht, Veränderungen der Proteinhäufigkeit zu verstehen, die mit Krankheit und Entwicklung einhergehen .

Proteomische Studien werden üblicherweise in Top-Down- und Bottom-Up-Studien unterteilt (siehe Abbildung 1). Top-down-Proteomik ionisiert und führt intakte Proteine ​​in ein hochauflösendes Massenspektrometer ein. Dieser Ansatz hat den Vorteil, dass alle posttranslationalen Modifikationen innerhalb des Proteins erfasst werden, hat jedoch den Nachteil, dass die resultierenden Daten für ein sehr großes Molekül ionisiert, fragmentiert und interpretiert werden müssen.

Abb 1: Schematische Darstellung der Proteomik

Die überwiegende Mehrheit der Proteomik basiert auf dem Bottom-up-Protokoll, bei dem die komplexe Mischung von Proteinen aus einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organismus enzymatisch zu einer sehr großen Mischung von Peptiden verdaut wird. Trypsin ist das proteolytische Enzym der Wahl. Dieses Enzym ist in hoher Reinheit erhältlich und relativ kostengünstig. Es schneidet Proteine ​​an Lysin- und Argininresten. Da diese Aminosäuren relativ häufig vorkommen, wird jedes Protein in viele Peptide zerlegt, die typischerweise fünf bis 30 Reste lang sind. Während dieser Massenbereich unter erheblichen Störungen durch die bei MALDI verwendete Matrix leidet, ist er sehr gut für die Analyse durch Elektrospray-Ionisation geeignet, die am häufigsten verwendet wird. Die Bestimmung des größten Teils der Peptidsequenz zusammen mit der Kenntnis der Masse des Elternions schränkt die Identifizierung bei Datenbanksuchen auf eine kleine Anzahl von Möglichkeiten ein.

Frühe proteomische Studien konzentrierten sich auf die Identifizierung von Proteinen in einer gegebenen Probe und lieferten im Wesentlichen eine Stückliste der vorhandenen Proteine. Ein Mindestmaß an quantitativer Information kann aus einer solchen Stückliste gewonnen werden, am häufigsten durch einfaches Zählen der Anzahl des Auftretens von Peptiden aus einem Zielprotein. In jüngerer Zeit wurde differenzielle Isotopenmarkierung verwendet, um Änderungen der Proteinhäufigkeit zwischen zwei oder mehr Proben zu bestimmen. Beispielsweise können Proteinmengen von normalen und erkrankten Geweben verglichen werden, um mit der Krankheit assoziierte Enzym- und Signalwege zu identifizieren.

Moderne Bottom-up-Proteomikstudien bestehen aus vier Stufen. Zunächst werden die Proteinproben verdaut und isotopenmarkiert. Zweitens wird das resultierende komplexe Peptidgemisch einer oder mehreren Trennrunden unterzogen. Drittens wird die Probe ionisiert und durch das Massenspektrometer analysiert. Viertens werden die resultierenden Daten analysiert und interpretiert. Im Folgenden betrachten wir die jüngsten Fortschritte in jedem dieser vier Bereiche.

Probenvorbereitung

Die Trypsinverdauung wird zwischen 30 Minuten und 24 Stunden durchgeführt. Es ist ein Kompromiss: Aufschlusszeiten am kürzeren Ende verkürzen die Analysezeit und minimieren die Selbstverdauung, jedoch auf Kosten einer unvollständigen Verdauung, die zu verpassten Spaltungen führt, während eine längere Aufschlusszeit zu einer vollständigeren Verdauung führt, jedoch auf Kosten von mehr Autodigestion und längere Gesamtanalysezeit. Trypsin kann auf einem festen Träger immobilisiert werden, was die Konzentration des in der Reaktion verwendeten Enzyms drastisch erhöht und gleichzeitig die Selbstverdauung des Enzyms minimiert (siehe Abbildung 2). Immobilisiertes Trypsin stellt eine Verbesserung des Probendurchsatzes ungefähr um eine Größenordnung bereit, was beispielsweise bei der Kontrolle der rekombinanten therapeutischen Proteinproduktion von Wert ist. Die Beschleunigung der Verdauung ist in der biopharmazeutischen Industrie besonders wichtig, wo eine schnelle proteomische Analyse für die Qualitätskontrolle von therapeutischen Proteinen, die in Zellkulturen hergestellt werden, von entscheidender Bedeutung ist. Ziel ist es, Informationen schnell genug bereitzustellen, um sie für die Prozesssteuerung nutzen zu können.

Abb. 2: Verfahren mit immobilisiertem Trypsin. Proteine ​​werden vor der Verdauung denaturiert, reduziert und gegebenenfalls alkyliert. Die Proteinverdaulösung, die das zu verdauende Protein enthält, wird hergestellt und dem immobilisierten Trypsinharz zugesetzt. Die Proteinverdaulösung wird 30 Minuten mit dem Harz inkubiert. Verdaute Peptide werden durch Zentrifugation entfernt und dann für die Downstream-Analyse vorbereitet.

Trennungen

Das Peptidgemisch, das im tryptischen Verdau eines komplexen Proteoms vorhanden ist, ist viel zu komplex für eine direkte Analyse durch Massenspektrometrie. Stattdessen muss die Mischung getrennt werden, um das Einsprühen der Probe in das Massenspektrometer zu vereinfachen. In den allermeisten Fällen wird diese Trennung durch Gradienten-Elution-Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie erreicht. Dieser Trennmodus verwendet Lösungsmittelsysteme, die mit der Elektrospray-Ionisation kompatibel sind und eine hervorragende Trennauflösung bieten.

Die Auflösung chromatographischer Trennungen verbessert sich dramatisch, wenn die Größe der Partikel der stationären Phase abnimmt. Mit abnehmender Partikelgröße steigt jedoch auch der für die Trennung erforderliche Druck. Die Entwicklung der Technologie für die routinemäßige Ultrahochdruck-Flüssigkeitschromatographie hat zu bemerkenswerten Verbesserungen bei der Trennung proteolytischer Peptide für die massenspektrometrische Analyse geführt.

Praktisch alle automatisierten proteomischen Analysen verwenden Flüssigchromatographie, um Peptide vor der Analyse zu trennen. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass sich die Kapillarelektrophorese in der Proteomanalyse als wertvoll erweisen könnte. Wir haben eine neuartige Elektrospray-Schnittstelle entwickelt, die eine umfangreiche Probenvorfraktionierung in Kombination mit schnellen kapillarelektrophoretischen Trennungen in Kombination mit Hochgeschwindigkeits- und hochauflösenden Massenspektrometern verwendet, dies bietet eine faszinierende Alternative. Im größten veröffentlichten Vergleich der Kapillarelektrophorese mit der UPLC-Trennung erreichten die beiden Techniken eine im Wesentlichen identische Anzahl von Proteinidentifikationen in einer identischen Analysezeit. In dieser Analyse, bei der es sich um die Untersuchung eines bakteriellen Sekretoms handelte, überlappten die beiden Techniken bei den von ihnen identifizierten Proteinen etwa fünfzig Prozent, was darauf hindeutet, dass sie komplementäre Teile des Proteoms untersuchen. Nebenbei zeigt diese Studie auch, dass keine einzelne Technik in der Lage ist, alle Komponenten innerhalb eines komplexen Proteoms aufzulösen, und dass viele Situationen von der Kombination von zwei oder mehr Techniken profitieren.

Massenanalysatoren

Abb 3: Die Orbitrap besteht aus einer äußeren, tonnenförmigen Elektrode und einer koaxialen inneren, spindelförmigen Elektrode, die ein elektrostatisches Feld mit quadrologarithmischer Potentialverteilung bilden. Der Bildstrom von dynamisch gefangenen Ionen wird detektiert, digitalisiert und mit der Fourier-Transformation in Frequenz- und dann Massenspektren umgewandelt. Um ein Video einer Orbitrap in Aktion zu sehen, besuchen Sie: planetorbitrap.com. Bild mit freundlicher Genehmigung von thermoscientific.com.

Die Entwicklung von Hochgeschwindigkeits- und hochauflösenden Massenanalysatoren hat die Proteomforschung revolutioniert. Eine Klasse von Instrumenten, die Orbitrap, ist in ihrer Leistung ziemlich auffällig (Abbildung 3). Diese Instrumente erreichen routinemäßig eine Massenauflösung von 100.000 (bei m/z = 400), erzeugen Tandemspektren bei 10 Hz und erreichen niedrige attomol-Nachweisgrenzen für Elternionen.

Dieser Forschungsbereich ist sehr umkämpft, und alle drei bis fünf Jahre erscheinen neue Generationen von Massenspektrometern. Wir werden zweifellos noch viele Jahrzehnte anhaltende Fortschritte in der Massenanalyse erleben.

Quantitative Proteomik

Frühe proteomische Studien befassten sich tief mit dem Proteom, mit dem Ziel, einen großen Teil des Proteoms zu entdecken, das aus der Translation offener Leserahmen im Genom vorhergesagt wurde. Solche Stücklisten sind jedoch von begrenztem Wert, da sie nicht direkt Auskunft über die Veränderung der Proteinabundanz zwischen Proben, beispielsweise aus gesundem und erkranktem Gewebe, geben.

Für die quantitative Proteomik wurden eine Reihe von Strategien entwickelt, viele weitere befinden sich in der Entwicklung. Die meisten Verfahren verwenden eine Isotopenmarkierung von primären Aminen, die an Lysinresten oder dem N-Terminus von Peptiden gefunden werden, oder von Schwefel an reduzierten Cysteinresten unter Verwendung spezifischer Reagenzien. Zwei oder mehr Proben werden mit unterschiedlichen Isotopenmarkierungen behandelt, die Proben werden dann gepoolt und unter Verwendung herkömmlicher chromatographischer und massenspektrometrischer Techniken analysiert. Software wird verwendet, um die Isotopensignatur aus den Massenspektren zu identifizieren. Reagenzien können so einfach wie Formaldehyd sein, das eine Isotopensignatur in die iTRAQ-Chemie einführt, bei der Reagenzien verwendet werden, die die Isotopensignatur erst nach Fragmentierung während der Tandem-Massenspektrometrie zeigen.

Alternativ können markierungsfreie Methoden verwendet werden, um die Proteinhäufigkeit zu quantifizieren. Dazu gehört die Spektralzählung, bei der die Anzahl der für ein Protein identifizierten Peptide eine überraschend einfache Schätzung für eine grobe Quantifizierung liefert. Eine wesentlich höhere Präzision bietet das Multiple Reaction Monitoring (MRM), auch bekannt als Selected Reaction Monitoring (SRM) (siehe Abbildung 4). Dieser Ansatz verwendet ein Triple-Quadrupol- oder ein Q-Trap-Instrument. Das Gerät ist so programmiert, dass es einen bestimmten Elternteil mit dem ersten Quadrupol isoliert, dieses Ion in einer Niederdruckzelle fragmentiert und dann die Intensität eines bestimmten Fragmentions überwacht. MRM/SRM bietet einen linearen Dynamikbereich von bis zu vier Größenordnungen und Nachweisgrenzen unterhalb der Attomole. Sie ist nur nützlich, wenn das Zielpeptid identifiziert wurde und diese Informationen für die Erstellung einer Kalibrierungskurve verfügbar sind.

Abb. 4: Multiple Reaction Monitoring (MRM). Basierend auf N. R. Kitteringham et al. ,J. Chromatogr. B, 877, 1229-1239 (2009).

Posttranslationale Modifikationen

Wie bereits erwähnt, weisen die meisten Proteine ​​nach der Translation hinzugefügte funktionelle Gruppen auf. Diese Modifikationen spielen eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Funktion des Proteins, des Zellstandorts und der Lebensdauer. Dreihundert verschiedene Arten posttranslationaler Modifikation sind beschrieben worden, von denen nur wenige auf Proteomebene im Detail untersucht wurden.

Die Phosphorylierungsanalyse hat die meiste Aufmerksamkeit erhalten, teilweise wegen der Bedeutung der Phosphorylierung in der Proteinfunktion, aber auch wegen der relativen Einfachheit der analytischen Herausforderung. Die meisten phosphoproteomischen Analysen verwenden Affinitätsreagenzien, wie Metallionen, die auf einer stationären Phase gehalten werden (die Technik ist als ionenvermittelte Affinitätschromatographie oder IMAC bekannt), um phosphorylierte Peptide aus tryptischen Verdauen selektiv anzureichern. Die eingefangenen Peptide werden eluiert und durch Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Die Analyse des Fragmentierungsspektrums wird zur Identifizierung von Phosphorylierungsstellen mit hohem Durchsatz verwendet.

Trotz der vielen Fortschritte in der Phosphorylierungsanalyse bleiben Herausforderungen bestehen. Auch stark saure Peptide werden von IMAC-Säulen eingefangen und, was vielleicht noch wichtiger ist, können Phosphatgruppen während der Fragmentierung abspalten oder wandern: beides verwirren die Analyse.

Gegenwärtige Techniken zeichnen sich durch die Identifizierung von Phosphorylierungsstellen aus, sind jedoch weniger nützlich, um das Ausmaß der Phosphorylierung an einer bestimmten Stelle festzustellen. Das Hauptproblem besteht darin, dass die phosphorylierten und nicht phosphorylierten Versionen eines Peptids in ihrer Ladung und damit in ihrer Ionisierungseffizienz variieren. Die Kalibrierung der Reaktionen der Ionen ist eine Herausforderung für Hochdurchsatzstudien.

Die Glykosylierung, eine ebenso wichtige posttranslationale Modifikation, stellt für aktuelle analytische Werkzeuge eine viel größere Herausforderung dar. Während Glykosylierungsmodifikationen recht einfach sein können, beispielsweise aus einer einzigen Sialinsäure bestehen, werden Glykane in einer verwirrenden Vielfalt von Strukturen hergestellt. Ihre Analyse erfolgt üblicherweise durch enzymatische Abspaltung des Glykans vom Peptid, gefolgt von einer massenspektrometrischen Analyse. Dies hat zwei Einschränkungen: Erstens geht die Beziehung zwischen der Glykosylierungsstelle und der Struktur des Glykans verloren und zweitens hat die Massenspektrometrie Schwierigkeiten, isomere Strukturen zu adressieren.

Schlussfolgerungen

Die Proteomik befindet sich in einem viel früheren Entwicklungsstadium und stellt eine viel größere analytische Herausforderung dar als die Genomik. Wir schätzen, dass die Proteomik zwei bis drei Jahrzehnte Entwicklungszeit benötigen wird, bevor die quantitative Analyse ganzer Proteome, einschließlich posttranslationaler Modifikationen, zur Routine wird.

Während es heute relativ einfach ist, tief in ein Proteom einzudringen, bleibt dies für die quantitative Analyse zeitaufwändig und teuer. Die Identifizierung posttranslationaler Modifikationen und die Bestimmung der relativen Häufigkeit dieser Modifikationen innerhalb einer einzelnen Probe stellen komplexe Herausforderungen dar.

Ein vielversprechender Bereich ist die In-situ-Proteomik. Es ist nun möglich, die mikroskopische Verteilung von Metaboliten und kleinen Peptiden mit MALDI-Bildgebung zu visualisieren (siehe Abbildung 5).

Abb. 5: Bildgebende Massenspektrometrie. Von Seeley & Caprioli, PNAS, 105, 18126 (2008)

Die Durchführung einer Proteomanalyse mit hoher räumlicher Genauigkeit über ein Gewebe hinweg ist jedoch eine gewaltige Aufgabe. Zu den Problemen zählen die ungleichmäßige Ablagerung der MALDI-Matrix auf dem Gewebe und die Verwendung eines relativ großen Laserstrahls, der das Signal über mehrere Zellen mittelt. Weitere Herausforderungen sind die Identifizierung detektierter Ionen und die bescheidene Sensitivität des Ansatzes.

Andere Faktoren, die die Proteomik von Hunden verursachen, sind oberflächlich trivial, bleiben jedoch ungelöst.Es gibt beispielsweise riesige Banken archivierten menschlichen Gewebes, die für eine Reihe von Krankheiten verfügbar sind, aber die meisten dieser Proben sind für die aktuelle Generation von Analysewerkzeugen schwer zu handhaben. Proben werden im Allgemeinen in Formalin fixiert oder eingefroren. Formalin vernetzt primäre Amine, und diese Vernetzungen sind ohne Probenverlust und -beschädigung schwer rückgängig zu machen. Und viele der gefrorenen Gewebebanken verwenden OCT-Medien (optimale Schneidtemperatur). Dieses enthält große Mengen Polyethylenglykol, das ein komplexes massenspektrales Hintergrundsignal erzeugt, das die Analyse von tryptischen Verdauen stört.

Top-down-Proteomik – die Analyse intakter Proteine ​​– vereinfacht eine Reihe von Schritten in der Proteinanalyse. Es erfordert jedoch sehr hochauflösende Instrumente und Proteinproben in großer Menge. Fortschritte in der Instrumentierung, Probentrennung und Datenanalyse sind erforderlich, um die Top-Down-Proteomik zu einem Routinewerkzeug zu machen.

Wie wir zu Beginn dieses Manuskripts festgestellt haben, spielt die Proteomik in mehreren Bereichen der pharmazeutischen Forschung eine wichtige Rolle. Erstens bieten Unterschiede in der Proteinexpression zwischen gesunden und erkrankten Geweben Ziele für die Arzneimittelentwicklung. Zweitens erfordert die Herstellung und Qualitätskontrolle rekombinanter Therapeutika proteomische Techniken mit einem breiten dynamischen Bereich, um Verunreinigungen in Gegenwart von Therapeutika mit hoher Häufigkeit zu identifizieren. Schließlich wird die Charakterisierung der Proteinabundanzvarianz während der Entwicklung und des Krankheitsverlaufs ein tiefes Verständnis der grundlegenden Biologie von Gesundheit und Krankheit ermöglichen.


Pathogene Pilze

Die wichtigsten Pilzerreger des Menschen sind Candida albicans und Aspergillus fumigatus. C. albicans ist ein häufig vorkommender Erreger in der menschlichen Bevölkerung und insbesondere bei Patienten, die sich einer Krebs-Chemotherapie unterziehen. Eine aktuelle Übersichtsarbeit beschrieb die Anwendung der Proteomik zur Untersuchung von Diamorphismus, arzneimittelinduzierten Veränderungen der Kandidat Proteom, Wirt-Pathogen-Interaktionen und Immunproteomik (Rupp 2004). A. fumigatus ist ein opportunistischer Pilzerreger von immungeschwächten Patienten, verursacht etwa 4% aller Krankenhaustodesfälle in Europa und ist der häufigste Aspergillus Arten, die mit invasiver Aspergillose (IA) assoziiert sind (Brookman und Denning 2000, Brakhage und Langfelder 2002). Die mit IA verbundene Sterblichkeitsrate kann bis zu 60�% betragen. Insbesondere verursacht IA schwere Morbidität und Mortalität bei Organtransplantationspatienten (Knochenmark und solides Organ) und Leukämiepatienten. Darüber hinaus wird geschätzt, dass in den USA jährlich über 3.500 Todesfälle durch Aspergillose verursacht werden (Kontoyiannis und Bodey 2002). Ein wachsendes, wenn auch begrenztes Repertoire an Antimykotika steht zur Kontrolle der IA zur Verfügung und umfasst Wirkstoffe wie Voriconazol, Amphotericin B und die Echinocandine (Enoch et ਊl. 2006). Die Herausforderung für die Forschungsgemeinschaft besteht darin, viele aufkommende Technologien wie Strategien zur Genunterbrechung, Mikroarray-Analyse und funktionelle Proteomik zu nutzen, um unser Verständnis der Biologie von Aspergilli im Allgemeinen und A. fumigatus insbesondere im Hinblick auf die Identifizierung neuer antimykotischer Wirkstoff-Targets, zusätzlich zur Identifizierung von Enzymen mit biotechnologischem Potenzial. Der Zweck dieses Artikels ist es, allgemeine proteomische Konzepte zu skizzieren und ein Update zu den proteomischen Pilzstudien zu geben, wobei der Schwerpunkt auf denen liegt, die an A. fumigatus.


Diskussion

Trockenstress ist eine der größten Beschränkungen, die die weltweite Pflanzenproduktion einschränken. Dieser multidimensionale Stress verursacht Veränderungen in den physiologischen, morphologischen, biochemischen und molekularen Eigenschaften von Pflanzen. Viele Pflanzen haben komplizierte Resistenzmechanismen entwickelt, um Trockenstress zu tolerieren. Diese Mechanismen sind jedoch von Pflanzenart zu Art unterschiedlich. Fuchsschwanzhirse als extrem trockenheitstolerante und resistente Getreidepflanze wurde als neue Modellart für funktionelle Genomstudien und Dürretoleranzuntersuchungen vorgeschlagen [15, 32].

Immer mehr Forschungen an Fuchsschwanzhirse, die Trockenstress ausgesetzt sind, zeigen, dass funktionelle Proteine ​​eine Schlüsselrolle bei der Stressreaktion spielen [33, 34]. Frühere transkriptomische Studien legten nahe, dass ein ausgeklügeltes regulatorisches Netzwerk die Fuchsschwanzhirse als Reaktion auf Trockenheit positiv regulierte. Dieses Netzwerk umfasste mehrere biologische Prozesse und Wege, darunter Signaltransduktion, Transkriptionsregulation, Redoxregulation, Photosynthese und osmotische Anpassung [35]. Die Veränderungen der Proteinexpression sowie die physiologischen Variationen, die bei der Fuchsschwanzhirse unter Trockenstress auftreten, bedürfen jedoch noch umfangreicher und intensiver Forschung. In unserer Studie wurden 321 Proteine ​​identifiziert, die auf Trockenheit reagieren betonen.

LEA-Proteine ​​sind hoch hydrophil und thermisch stabil, die Ansammlung von LEA-Proteinen kann zelluläre Strukturen vor Verletzungen schützen, indem sie geordnete Strukturen innerhalb der Zelle aufrechterhält [36]. Aquaporine sind konservierte integrale Membranproteine, die an der Wasseraufnahme der Pflanzen beteiligt sind [37]. Die Abnahme von Aquaporin K3YUP4 unter Trockenheit kann vorteilhaft sein, um die Wasserdurchlässigkeit der Membran zu verringern und die zelluläre Wasserkonservierung zu fördern.

Das antioxidative Abwehrsystem von Pflanzen unter Trockenstress besteht aus ROS-bindenden Enzymen. Unter ihnen sind CAT, SOD, APX und GPx unerlässlich, um ROS zu entfernen und synergistisch zu wirken, um oxidativen Schäden durch Trockenstress entgegenzuwirken [38]. In unseren Ergebnissen stieg die Häufigkeit von 13 ROS-abfangenden Enzymen und die Aktivitäten von APX, POD, CAT und SOD (Tabelle 1A und Abb. 7), die alle die Trockenheitsresistenz bei Fuchsschwanzhirse erhöhen könnten

Die Fülle an ribosomalen Proteinen, Proteinchaperonen und Proteasen wurde alle signifikant verändert, die alle eine zentrale Rolle bei der Proteinsynthese und -modifikation spielen und bei der Stressanpassung helfen. Aus unseren Daten wurde identifiziert, dass 21 ribosomale Proteine ​​unter Trockenheit signifikant erhöht sind (Tabelle 1E, Fig. 5). Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei Gurken und Mais unter Stress berichtet [39]. HSPs und HSC70 wurden als signifikant akkumuliert identifiziert, was dazu beitragen könnte, die Proteinhomöostase aufrechtzuerhalten und die Rückfaltung denaturierter Proteine ​​unter Trockenheit zu fördern (Tabelle 1E) [40, 41]. Die vier Proteasen, die an der Proteinmodifikation und -korrektion beteiligt sein könnten, wurden auch unter Trockenheit akkumuliert identifiziert (Tabelle 1E). Diese unterschiedlichen Proteine ​​und Reaktionsmechanismen stimmen mit früheren Studien in Arabidopsis unter Salzstress [42].

Die Aufrechterhaltung der Photosyntheserate unter Trockenstress ist für die Trockenheitstoleranz von Nutzpflanzen essentiell [43]. Hier wurde die Zunahme von multiplen Lichtreaktions-bezogenen Proteinen und Calvin-Zyklus-bezogenen Proteinen (K3ZA91 und K3ZA66) identifiziert (Abb. 5) [44]. Früher wurde berichtet, dass Trockenstress zu einer Verringerung des internen CO . führen könnte2 Konzentration durch Stomataverschluss [44]. Der Anstieg des CO2 Assimilationsbezogene Proteine ​​können CO . erleichtern2 Konzentration und Assimilation und tragen ihrerseits dazu bei, eine höhere Photosyntheserate in Fuchsschwanzhirse unter Trockenstress aufrechtzuerhalten (Tabelle 1B) (Abb. 5).

Es wurde auch berichtet, dass der glykolytische Weg auf Trockenheit reagiert. In unseren Ergebnissen war die Expression von Fructokinase um das 1,6-fache hochreguliert, und die Mengen verwandter Enzyme waren alle erhöht, was auf einen möglicherweise erhöhten Kohlenhydratfluss in den TCA-Zyklus hindeutet (Tabelle 1C) (Abb. 5) [39, 45 , 46]. Dies wird durch den Anstieg der Pyruvat-Dehydrogenase und Citrat-Synthase, die wir beobachteten, weiter unterstützt . Die Ergebnisse deuten auf eine Beschleunigung des Kohlenstoffstoffwechsels hin, die mehr Energie für die Stressresistenz bereitstellen würde [28]. Die gesteigerte Energieproduktion führte zu einer verminderten Kohlenhydratsynthese, was zu einer Verringerung der Biomasse unter Trockenstress führte.

Die durch Kinase und Phosphatase regulierte reversible Proteinphosphorylierung ist grundlegend für viele Signalwege verschiedener stressbedingter biologischer Prozesse [47]. Unsere Studie wies die Variation von einer Serin/Threonin-Proteinphosphatase 2A und vier rezeptorähnlichen Proteinkinasen nach (Tabelle 1A). Die Serin/Threonin-Proteinphosphatase 2A ist in ihrer Rolle als Regulator für Mikrotubuli-assoziierte Proteine ​​(MAPs) von Bedeutung. Dies, zusammen mit dem Anstieg von α/β-Tubulin, legt nahe, dass die Phosphorylierung und die stabilisierenden Mikrotubuli Schlüsselfaktoren für die Trockenheitsreaktion von Fuchsschwanzhirse sind [48].

Auch die Fülle von Proteinen, die zu verschiedenen Stoffwechselwegen gehören, einschließlich Polyamin-Stoffwechsel, Lignin-Biosynthese, Fettsäure-Stoffwechsel, Aminosäure-Stoffwechsel, Hormon-Stoffwechsel und Nukleotid-Stoffwechsel (Tabelle 1F), waren unter Dürre betroffen [49]. Bei der abiotischen Stressreaktion werden Polyamine, ROS (H2Ö2) und NO wirken synergistisch bei der Förderung von ABA-Antworten in Schließzellen [21, 50, 51]. In unserer Studie wurde festgestellt, dass drei Schlüsselenzyme, die am PA-Stoffwechsel beteiligt sind, akkumuliert wurden (Tabelle 1F). Der Anstieg der PA-Synthetasen stimmte mit der Akkumulation von Polyaminen überein (Fig. 6).

Osmotisch regulierte Substanzen wie Prolin und GB könnten die Wasseraufnahme aus austrocknendem Boden verbessern und den Zellstoffwechsel schützen, indem sie den osmotischen Druck ausgleichen und den Zellturgor in Pflanzenzellen während der Trockenheit aufrechterhalten [52, 53]. Delta-1-Pyrrolin-5-Carboxylase-Synthetase (P5CS) (K3XEN1) und Betain-Aldehyd-Dehydrogenase (BADH) (K3YH74), die die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der Prolin- bzw osmotischen Stress durch Trockenheit behandeln (Tabelle 1F).

Lignin ist ein grundlegender Bestandteil der sekundären Pflanzenzellwand, wobei sich der Ligningehalt und die Zusammensetzung während abiotischer und biotischer Belastungen ändern [54]. Hier wurden drei Proteine, die mit der Lignin-Biosynthese in Verbindung stehen, wie Shikimat-O-Hydroxycinnamoyl-Transferase, Kaffeesäure-3-O-Methyltransferase und Cinnamoyl-CoA-Reduktase erhöht, während nur ein Protein, 4-Cumarat-CoA-Ligase, reduziert wurde Dürre (Tabelle 1F). Sehr langkettige Fettsäuren (VLCFAs) sind wichtige Bestandteile der Schutzbarriere an der Schnittstelle zwischen Pflanzen und Umwelt [55]. Es wurde festgestellt, dass die 3-Ketoacyl-CoA-Synthase (KCS), die für die VLCFA-Synthese verantwortlich ist, nach einer Dürrebehandlung etwa zweifach hochreguliert ist. Eine Cyclopropan-Fettsäure-Synthase wurde ebenfalls um das 2,3-Fache erhöht (Tabelle 1F). Frühere Hinweise deuten darauf hin, dass die Existenz eines Cyclopropanrings in Membranfettsäuren die Stabilität biologischer Membranen erhöhen könnte [56]. NsLTPs sind lösliche, kleine, basische Proteine ​​in Pflanzen, von denen berichtet wurde, dass sie an der Katalyse der Übertragung von Phospholipiden beteiligt sind und eine wichtige Rolle bei der Pflanzenabwehr und bei Stressreaktionen spielen [57]. Unsere Ergebnisse legen eine sehr wichtige Rolle des Fettstoffwechsels bei der Trockenheitstoleranz von Fuchsschwanzhirse nahe, was auch den dramatischen Anstieg von nsLTP (K3YAY4) unter Trockenheit erklären könnte. Weitere eingehende Studien werden helfen zu verstehen, wie Lipide in den Stressresistenzmechanismen in Fuchsschwanzhirse funktionieren.

Die Pflanzenhormone, insbesondere Jasmonsäure (JA) und Ethylen (ETH), sind wichtige Signalmoleküle und spielen eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung biotischer/abiotischer Stressreaktionen in Pflanzen [58]. In dieser Forschung wurden die Schlüsselenzyme Allenoxid-Synthase (AOS) (K3YRS9) und 1-Aminocyclopropan-1-carboxylat-Oxidase (ACO) (K3ZV70), die den ersten bzw. letzten Schritt der JA- bzw. ETH-Biosynthese katalysieren, erhöht im Überfluss unter Dürre (Tabelle 1F). Diese Ergebnisse bewiesen weiter, dass der Stoffwechselweg der Phytohormone auch an Stressreaktionsprozessen beteiligt ist.

Wir führten auch eine korrelierte Analyse der Transkriptomik−Proteomik durch, bei der die entsprechenden Transkripte von nur 23 differentiellen Proteinen in unserer Proteomikstudie identifiziert wurden (Zusatzdatei 7: Tabelle S6) [15]. Die schwache Korrelation zwischen den transkriptomischen und proteomischen Daten stimmte mit den Ergebnissen früherer Berichte über andere Arten überein. Da Proteinisoformen und ihre Häufigkeit nicht nur auf Transkriptionsebene reguliert werden, sondern auch auf posttranskriptioneller, translationaler und posttranslationaler Ebene. Die Ergebnisse bestätigten die früher etablierte Auffassung, dass Transkriptionsniveaus nicht direkt mit Proteinexpressionsniveaus korrelieren [14, 28, 39, 46] und die posttranskriptionelle Regulation eine entscheidende Rolle bei der Genexpression spielt [59].

Aus dieser Studie konnte geschlossen werden, dass die Proteine, die am Energiestoffwechsel und der Synthese von Schutzmaterialien beteiligt waren, offensichtlich verändert wurden und der Gehalt der meisten von ihnen dramatisch erhöht wurde. Diese Veränderungen tragen weiter dazu bei, Pflanzenzellen zu schützen, Schäden durch Wasserdefekte zu vermeiden und das Wachstum der Fuchsschwanzhirse bei Trockenheit aufrechtzuerhalten. Diese stimmten mit früheren proteomischen Studien von dürretoleranten Genotyp-Pflanzen unter Dürre überein [43].

Insgesamt hat das in dieser Forschung gewonnene Proteomic-Profiling umfassende Einblicke in die verschiedenen Mechanismen der Trockenheitstoleranz bei Fuchsschwanzhirse ermöglicht, und es sind detailliertere Studien erforderlich, um die Schlüsselproteine ​​und Signalwege von Pflanzen unter Stress zu bestimmen.


Trypsin spaltet ausschließlich C-terminal zu Arginin- und Lysinresten

Fast alle Großprojekte der massenspektrometrischen Proteomik verwenden Trypsin, um Proteinmischungen in leichter analysierbare Peptidpopulationen umzuwandeln. Beim Durchsuchen von Peptidfragmentierungsspektren in Sequenzdatenbanken kann es erforderlich sein, dass potenziell übereinstimmende Peptidsequenzen der tryptischen Spezifität entsprechen, nämlich ausschließlich C-terminal zu Arginin oder Lysin gespalten werden. In vielen veröffentlichten Berichten werden jedoch signifikante Zahlen von Proteinen durch nicht-tryptische Peptide identifiziert. Hier verwenden wir die Massengenauigkeit eines neuen Ionenfallen-Fourier-Transformations-Massenspektrometers in Subparts per Million, um im Vergleich zu typischen Ionenfallen-Experimenten ein mehr als 100-fach erhöhtes Vertrauen in die Peptididentifizierung zu erreichen und zeigen, dass Trypsin ausschließlich C-terminal zu Arginin spaltet und Lysin. Wir finden, dass nicht-tryptische Peptide nur als C-terminale Peptide von Proteinen und als Spaltprodukte von vollständig tryptischen Peptiden N-terminal zu einem internen Prolin vorkommen. Die Simulation einer geringeren Massengenauigkeit führte zu einer großen Anzahl von Proteinen, die fälschlicherweise mit nicht-tryptischen Peptidtreffern identifiziert wurden. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass solche Peptidtreffer in früheren Studien erneut untersucht werden sollten und dass die Peptididentifizierung auf einer strengen Trypsin-Spezifität basieren sollte.


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