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Gene und Proteine ​​mit einer deutlich unausgewogenen Zusammensetzung


Laut Wikipedia beträgt die mediane Größe eines proteinkodierenden Gens 26.288 bp, was es (aus statistischen Überlegungen) ermöglicht, dass die Nukleotide C, G, A, T in etwa gleichen Mengen in einem Strang vorkommen. Aber vielleicht ist das falsch, deshalb möchte ich fragen:

Gibt es und welche spezifischen Protein-kodierenden Gene haben ein signifikantes Ungleichgewicht der Mengen an C, G, A, T in einem Strang?

Damit verbunden ist die Frage, ob es größere Proteine ​​(mit bis zu 27.000 Aminosäuren wie die Titine) mit einem signifikanten Ungleichgewicht der Mengen der 20 verschiedenen Aminosäuren gibt?

Könnte es sein, dass aus einem Ungleichgewicht des Gens ein Ungleichgewicht des Proteins folgt?


Füttere deine Gene: Wie unsere Gene auf die Lebensmittel reagieren, die wir essen

Was sollen wir essen? In den Medien gibt es viele Antworten, die sich alle auf ihre Interpretation der neuesten medizinischen Literatur stützen, um Empfehlungen für die gesündeste Ernährung zu geben. Aber was wäre, wenn Sie diese Frage auf molekularer Ebene beantworten könnten – was wäre, wenn Sie herausfinden könnten, wie unsere Gene auf die Lebensmittel, die wir essen, reagieren und was dies mit den zellulären Prozessen macht, die uns gesund machen – oder nicht? Genau das haben Biologen der Norwegischen Universität für Wissenschaft und Technologie getan.

Wenn Sie Ihre Gene fragen könnten, welche Lebensmittel für Ihre Gesundheit am besten sind, hätten sie eine einfache Antwort: ein Drittel Protein, ein Drittel Fett und ein Drittel Kohlenhydrate. Das ist, was neueste genetische Forschungen der Norwegischen Universität für Wissenschaft und Technologie (NTNU) zeigen, das beste Rezept, um Ihr Risiko für die meisten lebensstilbedingten Krankheiten zu begrenzen.

Nahrung beeinflusst die Genexpression

Die NTNU-Forscher Ingerid Arbo und Hans-Richard Brattbakk haben leicht übergewichtige Menschen mit verschiedenen Diäten gefüttert und deren Auswirkungen auf die Genexpression untersucht. Genexpression bezieht sich auf den Prozess, bei dem Informationen aus der DNA-Sequenz eines Gens in eine Substanz wie ein Protein übersetzt werden, die in der Struktur oder Funktion einer Zelle verwendet wird.

„Wir haben herausgefunden, dass eine Ernährung mit 65 % Kohlenhydraten, die der durchschnittliche Norweger oft in einigen Mahlzeiten isst, dazu führt, dass eine Reihe von Genklassen Überstunden machen“, sagt Berit Johansen, Professorin für Biologie an der NTNU. Sie betreut die Doktoranden des Projekts und forscht seit den 1990er Jahren zur Genexpression.

„Dies betrifft nicht nur die Gene, die Entzündungen im Körper verursachen, was wir ursprünglich untersuchen wollten, sondern auch Gene, die mit der Entwicklung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, einigen Krebsarten, Demenz und Typ-2-Diabetes in Verbindung stehen – alle wichtigen lebensstilbezogenen Faktoren Krankheiten“, sagt sie.

Häufige Ernährungsempfehlungen und chronische Krankheiten

Diese Ergebnisse untergraben die meisten der Grundlagen für die Diäten, von denen Sie gehört haben, dass sie Sie retten werden. Ernährungsempfehlungen gibt es im Überfluss, und es gibt große Unterschiede, wie wissenschaftlich begründet sie sind. Aber erst jetzt erforschen Forscher den Zusammenhang zwischen Ernährung, Verdauung und den Auswirkungen auf die Gesundheit und das Immunsystem – und können daher nicht nur sagen, welche Lebensmittel am gesündesten sind, sondern auch warum.

„Sowohl Low-Carb- als auch High-Carb-Diäten sind falsch“, sagt Johansen. „Aber eine Low-Carb-Diät ist der richtigen Ernährung näher. Eine gesunde Ernährung sollte nicht mehr als ein Drittel Kohlenhydrate (bis zu 40 Prozent der Kalorien) in jeder Mahlzeit enthalten, sonst stimulieren wir unsere Gene zur Initiation die Aktivität, die eine Entzündung im Körper hervorruft."

Dies ist nicht die Art von Entzündung, die Sie als Schmerz oder Krankheit empfinden würden, sondern es ist, als ob Sie mit einer chronischen leichten grippeähnlichen Erkrankung kämpfen würden. Ihre Haut ist etwas gerötet, Ihr Körper speichert mehr Wasser, Sie fühlen sich wärmer und Sie sind mental nicht ganz oben. Wissenschaftler nennen dies metabolische Entzündung.

Eine Diät in Pulverform

Johansen und ihre Kollegen führten zwei Studien durch. Die erste bestand darin, zu bestimmen, welche Art von Forschungsmethoden sie verwenden würden, um die gestellten Fragen zu beantworten. In der Pilotstudie (28 Tage) aßen fünf adipöse Männer echte Nahrung, während in der zweiten Studie 32 leicht übergewichtige Männer und Frauen (hauptsächlich Studenten) speziell hergestellte Pulvernahrung aßen.

Die Teilnehmer der letztgenannten Studie wurden nach dem Zufallsprinzip sechs Tage lang einer Diät mit 65 Prozent der Kalorien aus Kohlenhydraten zugeteilt, der Rest der Kalorien aus Protein (15 Prozent) und Fett (20 Prozent), dann eine Woche ohne Diät. Dann kamen die sechs Tage einer Diät mit der Hälfte der Kohlenhydrate und doppelt so viel Protein und Fett wie bei der ersten Diät. Vor und nach jeder Diät wurden Bluttests durchgeführt.

Die Nahrungsmenge, die jede Person zu sich nahm, wurde so berechnet, dass ihr Gewicht stabil blieb und gleiche Portionen gleichmäßig über sechs Mahlzeiten über den Tag verteilt verzehrt wurden.

Die Forscher hatten Hilfe bei der Entwicklung von Diäten von Fedon Lindberg, einem auf Innere Medizin spezialisierten Arzt, der sich für niedrigglykämische Diäten einsetzt, Inge Lindseth, einer Osloer Diätassistentin, die sich auf Diabetes spezialisiert hat, und Ann-Kristin de Soysa, einer Diätassistentin, die mit Fettleibigkeit arbeitet Patienten im St. Olavs Hospital in Trondheim.

"Wir wollten genau wissen, was die Probanden in Bezug auf Makro- und Mikronährstoffe bekommen", sagt Johansen. -"Eine Tomate enthält beispielsweise keine gleichbleibende Menge an Nährstoffen oder Antioxidantien Um mit den gesundheitlichen Auswirkungen umgehen zu können, mussten wir die Nährstoffe genau abrechnen. Deshalb haben wir uns für die Hauptstudie für die pulverförmige Ernährung entschieden."

Lösung des Steuerungsproblems

Diätstudien, die verschiedene Diäten mit unterschiedlichen Fettmengen vergleichen, werden oft mit dem Argument kritisiert, dass nicht die restliche Nahrungsaufnahme, sondern der Unterschied in der Menge an Omega-3-Fettsäuren die gesundheitlichen Auswirkungen verursacht.

Die Forscher gingen dieses Problem an, indem sie in beiden Diäten die gleiche Menge an Omega-3 und Omega-6 zu sich nahmen, obwohl die Fettmenge in den getesteten Diäten im Allgemeinen unterschiedlich war. Die Forscher mieden auch ein weiteres häufiges Problem: die natürliche Variation der Genexpression zwischen Menschen.

„Jeder unserer Studienteilnehmer konnte seine eigene Kontrollperson sein“, sagt Johansen der Rest begann mit der anderen Diät."

Bluttests wurden vor und nach jeder Diätperiode durchgeführt. Alle Messungen der Veränderungen der Genexpression wurden so durchgeführt, dass der Unterschied in der Genexpression jedes Individuums mit dieser Person allein verglichen wurde. Anschließend wurden die Ergebnisse zusammengestellt.

Johnson sagt, dass die Studien zu zwei wichtigen Ergebnissen geführt haben. Eine davon ist die positive Wirkung vieler Mahlzeiten über den Tag verteilt und die Details über die Qualität und Zusammensetzung der Bestandteile einer optimalen Ernährung, darunter Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren. Zweitens habe eine kohlenhydratreiche Ernährung, unabhängig davon, ob eine Person zu viel isst oder nicht, Konsequenzen für die Gene, die die Zivilisationskrankheiten beeinflussen, sagt sie.

Eine Möglichkeit, die genetische Temperatur zu messen

Während der gesamten Studie untersuchten die Forscher, inwieweit verschiedene Gene normal arbeiteten oder Überstunden machten. Ein aggregiertes Maß der Ergebnisse all dieser genetischen Aktivität wird als Genexpression bezeichnet. Es kann fast als Maß für die genetische Temperatur des Gesundheitszustands des Körpers angesehen werden.

"Wir sprechen davon, eine riesige Menge an Informationen zu sammeln", sagt Johansen.

„Und es ist zum Beispiel nicht so, dass es ein Gen für Entzündungen gibt. Wir suchen also, ob es irgendwelche Gengruppen gibt, die Überstunden machen. In dieser Studie haben wir gesehen, dass eine ganze Gruppe von Genen an der Entwicklung von Entzündungsreaktionen im Körper leisten als Gruppe Überstunden."

Es waren nicht nur Entzündungsgene, die Überstunden machten, wie sich herausstellen sollte. Einige Cluster von Genen, die als überaktiv aufgefallen sind, werden mit den häufigsten Zivilisationskrankheiten in Verbindung gebracht.

"Gene, die an Typ-2-Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Alzheimer und einigen Krebsarten beteiligt sind, reagieren auf die Ernährung und werden durch eine kohlenhydratreiche Ernährung hochreguliert oder aktiviert", sagt Johansen.

Johansen ist kein Krebsforscher und behauptet nicht, dass es möglich ist, das Risiko einer Krebsdiagnose durch Essen zu eliminieren. Sie hält es jedoch für erwähnenswert, dass die Gene, die wir mit einem Krankheitsrisiko in Verbindung bringen, durch die Ernährung beeinflusst werden können.

„Wir sagen nicht, dass man Alzheimer verhindern oder verzögern kann, wenn man sich richtig ernährt, aber es scheint sinnvoll, die Kohlenhydrate in unserer Ernährung zu reduzieren“, schlägt sie vor.

„Wir brauchen mehr Forschung dazu“, fügt Johansen hinzu. „Es scheint klar, dass die Zusammensetzung und Quantität unserer Ernährung entscheidenden Einfluss auf die Symptome einer chronischen Erkrankung haben kann. Es ist wichtig, zwischen Qualität und Quantität der Ernährung zu unterscheiden, beide haben eindeutig sehr spezifische Auswirkungen.“

Das Wettrüsten des Körpers

Johansen argumentiert, dass die Ernährung der Schlüssel zur Kontrolle unserer persönlichen genetischen Anfälligkeit für Krankheiten ist. Bei der Auswahl unserer Nahrung entscheiden wir, ob wir unseren Genen die Waffen zur Verfügung stellen, die Krankheiten verursachen. Das Immunsystem funktioniert, als ob es die Überwachungsbehörde und die Polizei des Körpers wäre. Wenn wir zu viele Kohlenhydrate zu uns nehmen und der Körper reagiert, mobilisiert das Immunsystem seine Kräfte, als ob Bakterien oder Viren in den Körper eindringen würden.

"Gene reagieren sofort auf das, womit sie arbeiten müssen. Es ist wahrscheinlich, dass Insulin dieses Wettrüsten kontrolliert", sagt Johansen. „Aber es ist nicht so einfach wie die Regulierung des Blutzuckers, wie viele glauben. Der Schlüssel liegt in der sekundären Rolle des Insulins in einer Reihe anderer Mechanismen Insulin sezernieren Die Sekretion von Insulin ist ein Abwehrmechanismus als Reaktion auf zu viel Glukose im Blut, und ob diese Glukose aus Zucker oder aus nicht süßen Kohlenhydraten wie Stärke (Kartoffeln, Weißbrot, Reis usw.) stammt, spielt keine Rolle ist nicht wirklich wichtig."

Vermeiden Sie die Fettfalle!

Der Professor warnt davor, in die Fettfalle geraten zu sein. Es ist einfach nicht gut, ganz auf Kohlenhydrate zu verzichten, sagt sie. „Die Fett-Eiweiß-Falle ist genauso schlimm wie die Kohlenhydrat-Falle. Es geht wie immer um die richtige Balance.“

Sie sagt, wir müssen auch darauf achten, Kohlenhydrate, Proteine ​​und Fette in fünf bis sechs kleineren Mahlzeiten zu sich zu nehmen, nicht nur zur Hauptmahlzeit beim Abendessen.

„Es ist wichtig, über den Tag verteilt mehrere kleine und mittelgroße Mahlzeiten zu sich zu nehmen. Überspringen Sie weder das Frühstück noch das Abendessen. Ein Drittel jeder Mahlzeit sollte aus Kohlenhydraten, ein Drittel Protein und ein Drittel Fett bestehen. So lautet das Rezept um entzündliche und andere krankheitsverstärkende Gene in Schach zu halten", erklärt Johansen.

Veränderung geht schnell

Johansen hat jedoch einige ermutigende Worte für diejenigen von uns, die eine kohlenhydratreiche Ernährung zu sich genommen haben. "Es dauerte nur sechs Tage, um die Genexpression jedes der Freiwilligen zu ändern", sagt sie, "damit ist der Einstieg einfach. Wenn Sie jedoch die Wahrscheinlichkeit einer Lebensstilkrankheit verringern möchten, muss diese neue Diät dauerhaft sein." Veränderung."

Johansen betonte, dass die Forscher offensichtlich noch nicht alle Antworten auf den Zusammenhang zwischen Ernährung und Nahrung haben. Aber die Trends in den Ergebnissen sowie die neuere wissenschaftliche Literatur machen deutlich, dass die Empfehlung für die Menschen lauten sollte, ihre Ernährungsgewohnheiten zu ändern.

Andernfalls werden immer mehr Menschen von chronischen Zivilisationskrankheiten betroffen sein.

Die neue Lebensmittelbilanz

Die meisten von uns denken, dass es in Ordnung ist, Lebensmittel zu haben, die man essen oder nicht essen kann, egal ob es sich um Kohlenhydrate oder Fette handelt. Woher wissen wir also, was wir auf unseren Teller legen sollen?

Müssen wir jetzt sowohl Kalorien zählen als auch unser Essen wiegen?

„Natürlich kann man so vorsichtig sein“, sagt Johansen. „Aber man wird schon viel erreichen, wenn man nur einige grundlegende Entscheidungen trifft. Wenn man gekochtes Wurzelgemüse wie Kartoffeln und Karotten reduziert und das Weißbrot durch ein paar Vollkornscheiben wie Roggenbrot ersetzt oder selbst backt Knäckebrot reduzieren Sie die Menge an schlechten Kohlenhydraten in Ihrer Ernährung deutlich. Denken Sie außerdem daran, zu jeder Mahlzeit, auch zum Frühstück, Eiweiß und Fett zu sich zu nehmen!"

Salat enthält auch Kohlenhydrate

Johansen erklärt, dass viele von uns nicht wissen, dass alle Früchte und Gemüse, die wir essen, auch zu Kohlenhydraten zählen – und dass wir nicht nur auf süße Kohlenhydrate achten sollten.

„Salat besteht aus Kohlenhydraten“, sagt Johansen. „Aber man muss viel Grün essen, um viele Kalorien zu sich zu nehmen. Gedämpfter Brokkoli ist eine tolle Alternative zu Salzkartoffeln. Obst ist gut, aber man muss aufpassen, dass man nicht große Mengen der hochglykämischen Früchte auf einmal isst Zeit. Abwechslung ist wichtig."

Am besten reduzierst du Kartoffeln, Reis und Nudeln und gönnst dir ein paar der guten Sachen, die schon lange in der Hundehütte im Kühlschrank liegen.

„Anstelle von leichten Produkten sollten wir echte Mayonnaise und Sauerrahm essen“, sagt Johansen, „und echte Sahne in der Sauce haben und fetten Fisch essen Mahlzeit oder über den Tag verteilt. Fett ist doppelt so kalorienreich wie Kohlenhydrate und Proteine, daher müssen wir dies bei der Planung unserer Portionsgrößen berücksichtigen. Fett ist auch anders. Wir sollten nicht zu viel gesättigtes tierisches Fett essen. aber einfach ungesättigte Pflanzenfette und mehrfach ungesättigte Meeresfette sind gut."

Jungbrunnen-Gene

Johansens Forschung zeigt auch, dass manche Gene nicht hochreguliert werden, sondern eher das Gegenteil – sie beruhigen statt beschleunigen.

„Es war interessant, die Verringerung der genetischen Aktivität zu sehen, aber wir waren wirklich froh zu sehen, welche Gene beteiligt waren. Ein Satz von Genen wird mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen in Verbindung gebracht. Sie wurden als Reaktion auf eine ausgewogene Ernährung herunterreguliert, im Gegensatz zu a kohlenhydratreiche Ernährung", sagt sie. Ein weiteres Gen, das von den getesteten Diäten signifikant unterschiedlich exprimiert wurde, ist eines, das in der internationalen Forschungsliteratur allgemein als "Jugendgen" bezeichnet wird.

„Wir sind hier nicht wirklich über den Jungbrunnen gestolpert“, lacht Johansen, „aber wir sollten diese Ergebnisse ernst nehmen. Wichtig für uns ist, dass wir nach und nach die Mechanismen des Krankheitsverlaufs für viele unserer schwerwiegende lebensstilbedingte Störungen."

Johansens Forschung wurde von NTNU und der Zentralnorwegischen Gesundheitsbehörde unterstützt. Weitere wichtige Partner waren Mette Langaas, Statistikerin und außerordentliche Professorin für Mathematik an der NTNU, Dr. Bard Kulseng vom Regional Center for Morbid Obesity am St. Olavs Hospital und Martin Kuiper, Professor für Systembiologie an der NTNU.


Mechanismen für den Domainerwerb

Proteine ​​können durch verschiedene Mechanismen neue Domänen erwerben. Die Genfusion, bei der zwei benachbarte Gene verbunden werden, ist ein Hauptmechanismus für die Bildung von Multidomänenproteinen in Bakterien [7]. Die Mechanismen für den Domänengewinn in Eukaryoten sind jedoch vielfältiger, hauptsächlich aufgrund ihrer komplexen Exon-Intron-Genstrukturen. Obwohl die Genfusion bei Eukaryoten ebenfalls wichtig ist, beinhaltet sie typischerweise nicht die direkte Verbindung von Exons aus benachbarten Genen. Stattdessen werden Spleißmuster so modifiziert, dass ein fusioniertes Gen von den noch getrennten Exons transkribiert wird (Abbildung 1a). Interessanterweise scheint die Rate der Genfusion erheblich höher zu sein als der umgekehrte Prozess, die Genspaltung, bei der sich ein einzelnes Gen in zwei teilt [5].

Mögliche Mechanismen zur Gewinnung von Proteindomänen. Farbige Blöcke stellen Exons dar, wobei Rot, Blau und Grün Exons anzeigen, die für verschiedene Domänen kodieren. Durchgezogene schwarze Linien stellen Introns dar und rote Linien zeigen intergenische Regionen an. (ein) Genfusion. Die nichtkodierende Region zwischen zwei Genen wird so modifiziert, dass die Exons des ersten Gens mit dem zweiten gespleißt werden. (B) Exon-Erweiterung. Die einem Exon folgende nicht-kodierende Region wird Teil des Exons und kodiert für eine neue Domäne. (C) Exon-Rekombination. Die Exons zweier Gene werden direkt verbunden. (D) Intron-Rekombination. Ein Exon eines Gens wird in das Intron eines anderen Gens eingefügt. (e) Retroposition. Eine Retrotransposon-Sequenz (RT, lila) vermittelt das Kopieren von sich selbst und einer benachbarten Genregion über ein mRNA-Zwischenprodukt, gefolgt von der Insertion in ein anderes Gen.

Ein anderer Mechanismus für den Domänengewinn beinhaltet die Erweiterung eines Exons in eine nicht-kodierende Region (Abbildung 1b). Man könnte annehmen, dass dieser Mechanismus äußerst selten ist, da die Expression einer zuvor nicht kodierenden Sequenz wahrscheinlich nicht zu einem funktionellen Polypeptid führt. Buljan et al. haben sich speziell mit diesem Mechanismus befasst, wie wir später besprechen werden.

Andere Mechanismen für den Gewinn von Proteindomänen beinhalten die Rekombination. Beispielsweise könnten Exons aus zwei verschiedenen Genen direkt verbunden werden (Abbildung 1c). Alternativ könnten Exons von einem Gen in die Introns eines anderen eingefügt werden (Abbildung 1d). Intronische Rekombination wird oft als Exon-Shuffling bezeichnet und als einer der Hauptgründe für die Vielfalt der Domänenarchitekturen in komplexen Eukaryoten vermutet [8]. Eine wichtige Rolle für die Intronrekombination bei Domänenumlagerungen wird durch die Beobachtungen gestützt, dass es signifikante Korrelationen zwischen Domänengrenzen und Exongrenzen gibt und dass die meisten Exons, die Domänen entsprechen, von Introns symmetrischer Phase umgeben sind (d. h. Introns werden eingefügt an den gleichen Positionen in Bezug auf Codontripletts) [9].

Retrotransposons sind genetische Elemente, die sich an anderen genomischen Stellen replizieren und inserieren können. Dies bietet einen weiteren möglichen Mechanismus für den Gewinn von Proteindomänen, da Retrotransposons auch Regionen von Genen kopieren und in andere Gene einfügen können (Abbildung 1e). Da die Retroposition über ein mRNA-Zwischenprodukt erfolgt, fehlen einer inserierten Region insbesondere die Introns des Gens, von dem sie stammt.


Netzwerkbiologie zur Aufdeckung funktioneller und struktureller Eigenschaften des pflanzlichen Immunsystems

In den letzten zwei Jahrzehnten haben Fortschritte in der Netzwerkwissenschaft die Entdeckung wichtiger Systemeinheiten in verschiedenen biologischen Netzwerken erleichtert. Diese graphenbasierte Technik hat zahlreiche neue Eigenschaften eines Systems offenbart, die es uns ermöglichen, mehrere komplexe biologische Prozesse einschließlich des pflanzlichen Immunsystems zu verstehen. Mit der Akkumulation von Multiomics-Datensätzen kann ein umfassendes Verständnis von Pflanzen-Pathogen-Interaktionen durch die Analyse und effiziente Integration mehrdimensionaler qualitativer und quantitativer Beziehungen zwischen den Komponenten von Wirten und ihren Mikroben erreicht werden. Dieser Aufsatz beleuchtet vergleichende Netzwerktopologieanalysen in Pflanzen-Pathogen-Co-Expressionsnetzwerken und Interaktomen, skizziert dynamische Netzwerkmodellierung für zellspezifische immunregulatorische Netzwerke und diskutiert die neuen Grenzen der Einzelzellsequenzierung sowie der Multiomik-Datenintegration, die für die Feinheiten des pflanzlichen Immunsystems zu entwirren.


Genomweite Analyse der Sojabohnen-HD-Zip-Genfamilie und Expressionsprofilierung unter Salinitäts- und Trockenheitsbehandlungen

Hintergrund: Homöodomänen-Leucin-Zipper (HD-Zip)-Proteine, eine Gruppe von Homöobox-Transkriptionsfaktoren, sind an verschiedenen Aspekten des normalen Pflanzenwachstums und der Entwicklungsprozesse sowie an Umweltreaktionen beteiligt. Bis heute wurde keine Gesamtanalyse oder Expressionsprofilierung der HD-Zip-Genfamilie in Sojabohne (Glycine max) berichtet.

Methoden und Erkenntnisse: Eine Untersuchung des Sojabohnen-Genoms ergab 88 mutmaßliche HD-Zip-Gene. Diese Gene wurden basierend auf phylogenetischer Analyse in vier Unterfamilien I bis IV eingeteilt. In jeder Unterfamilie waren die Bestandteile der Genstruktur und des Motivs relativ konserviert. Insgesamt waren 87 von 88 Genen ungleich auf 20 Chromosomen mit 36 ​​segmentalen Duplikationsereignissen verteilt, was darauf hindeutet, dass die segmentale Duplikation für die Erweiterung der HD-Zip-Familie wichtig ist. Die Analyse der Ka/Ks-Verhältnisse zeigte, dass die duplizierten Gene der HD-Zip-Familie nach den Duplikationsereignissen grundsätzlich einer reinigenden Selektion mit restriktiver funktioneller Divergenz unterzogen wurden. Die Analyse der Expressionsprofile zeigte, dass 80 Gene in 14 Geweben unterschiedlich exprimiert werden und 59 HD-Zip-Gene unter Salzgehalt und Trockenstress unterschiedlich exprimiert werden, wobei 20 paraloge Paare nahezu identische Expressionsmuster zeigen und drei paraloge Paare sich unter Trockenstress signifikant diversifizieren. Die quantitative Echtzeit-RT-PCR (qRT-PCR)-Analyse von sechs paralogen Paaren von 12 ausgewählten Sojabohnen-HD-Zip-Genen unter Dürre- und Salzstress bestätigte ihre stressinduzierbaren Expressionsmuster.

Schlussfolgerungen: Diese Studie bietet einen gründlichen Überblick über die Sojabohnen-HD-Zip-Genfamilie und bietet eine neue Perspektive auf die Evolution dieser Genfamilie. Die Ergebnisse zeigen, dass Gene der HD-Zip-Familie an vielen Pflanzenreaktionen auf Stressbedingungen beteiligt sein können. Darüber hinaus bietet diese Studie eine solide Grundlage, um die biologische Rolle der HD-Zip-Gene beim Wachstum und der Entwicklung von Sojabohnen aufzudecken.

Interessenkonflikt-Erklärung

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Figuren

Abbildung 1. Phylogenetische Beziehungen, Genstruktur und…

Abbildung 1. Phylogenetische Beziehungen, Genstruktur und Motivzusammensetzungen von Sojabohnen-HD-Zip-Genen.

Abbildung 2. Chromosomenorte von Sojabohnen HD-Zip…

Abbildung 2. Chromosomale Lokalisationen von Sojabohnen-HD-Zip-Genen.

Farbige Kästchen vor den Gennamen…

Abbildung 3. Phylogenetische Bäume von HD-Zip in voller Länge…

Abbildung 3. Phylogenetische Bäume von HD-Zip-Domänenproteinen voller Länge aus Sojabohnen, Arabidopsis und Reis.

Abbildung 4. Differentielle Expression von Sojabohnen HD-Zip…

Abbildung 4. Differentielle Expression von Sojabohnen-HD-Zip-Genen unter Salzgehalt und Trockenstress.

Abbildung 5. Hierarchisches Clustering von Ausdrucksprofilen…

Abbildung 5. Hierarchisches Clustering von Expressionsprofilen von Sojabohnen-HD-Zip-Genen in verschiedenen Geweben.

Abbildung 6. Ausdrucksanalyse von 12 ausgewählten…

Abbildung 6. Expressionsanalyse von 12 ausgewählten HD-Zip-Genen unter Trockenheits- und Salzstress unter Verwendung von…


Der Zusammenhang zwischen C:N:P-Stöchiometrie und Wachstum

Wachstum ist direkt mit Fitness verbunden, da Organismen wachsen müssen, um sich fortzupflanzen. Während Strategien zur Lebensgeschichte eine reiche Reihe von Charakteren beinhalten, die durch vielfältige selektive Zwänge erzeugt werden ( 100 ), 5 ) hat argumentiert, dass die spezifische Wachstumsrate ein zentraler integrierender Parameter der gesamten Strategie der Lebensgeschichte ist. (Die spezifische Wachstumsrate ist die Änderungsrate der Masse pro Masseneinheit im Folgenden μ. Um die Diskussionen im Folgenden zu verdeutlichen, sei μm bezeichnen das maximale μ, das eine bestimmte Spezies in einem bestimmten Lebensstadium bei einer Standardtemperatur erreichen kann. Wir nehmen an, dass μm ist ein genetisch bestimmtes Merkmal, das für das Entwicklungsprogramm einer bestimmten Art charakteristisch ist. Weiterhin sei μ′ das realisierte μ zu einem gegebenen Zeitpunkt μ′ kann unter μ . reduziert werdenm durch Ressourcenbedingungen.) 5 ) legt auch nahe, dass eine relativ unerforschte Reihe von Kompromissen im Zusammenhang mit schnell wachsenden Lebensstilen (hohe μm) ist wahrscheinlich. Wir vermuten, dass einige dieser Kompromisse die strengen stöchiometrischen Anforderungen eines schnellen Wachstums widerspiegeln ( 106 37 ). In der Tat, wenn es klare Verbindungen zwischen C:N:P und μ . gibtm, dann gäbe es auch Verbindungen zwischen der Evolution der Lebensgeschichte, dem physiologischen Bedarf an wichtigen Elementen und sogar Ökosystemprozessen. Welche Beweise gibt es für Beziehungen zwischen C:N:P und μ?

Autotrophe sind durch eine stark variable C:N:P-Zusammensetzung gekennzeichnet. Diese Variation hat sowohl interspezifische als auch intraspezifische Komponenten. Bei einer breiten Palette von autotrophen Organismen von Algen über Bäume bis hin zu Kakteen ( 74 ) nehmen der prozentuale N und der prozentuale Anteil P der photosynthetischen Biomasse mit zunehmender Größe des Organismus ab, eine Veränderung, die mit abnehmendem μ . einhergehtm. Eine genauere Analyse dieser Trends zeigt, dass als μm steigt, Prozent P steigt schneller als Prozent N und wächst daher schnell, kleine Autotrophe haben niedrige N:P. Somit gibt es auf interspezifischer Ebene eine große Variation von C:N:P, gekoppelt an Allometrie und μm. Viele Variationen von C:N:P in Autotrophen treten auch auf physiologischer Ebene auf, da Pflanzen in der Lage sind, Energie und Nährstoffe über den unmittelbaren Bedarf hinaus zu speichern und in einer Strategie des unausgeglichenen Wachstums ihre Wachstumsrate flexibel anzupassen (μ ′) auf Umgebungsbedingungen ( 16 69 ). Tatsächlich kann eine Algenart, wenn sie unter weitreichenden Bedingungen gezüchtet wird, fast so viel Variation in C:N:P aufweisen, wie in dem von Nielsen und Kollegen untersuchten Datensatz vorhanden ist ( 74 ). Faustregeln für autotrophes C:N:P sind: Biomasse N:P verfolgt N:P des Nährstoffangebots ( 86 ) bei fester Zufuhrrate von Nährstoff X, Biomasse C:X steigt mit Lichtintensität und/oder pCO2 Zunahme (50 87 96 21) und unter Bedingungen von X-begrenztem Wachstum steigt die Biomasse C:X steil an, wenn μ′ abnimmt (48 32 1 988). Es entsteht ein Bild von enormen Variationen von C:N:P an der Basis von Nahrungsnetzen ( 38 ).

Im Gegensatz zu der extremen Plastizität von C:N:P, die von Autotrophen in Laborkulturen gezeigt wird, entwickeln Metazoen eines bestimmten Lebensstadiums ein ausgeglichenes Wachstum und scheinen die Elementzusammensetzung innerhalb engerer Grenzen zu regulieren, selbst wenn sie Lebensmittel mit großen Variationen in C:N verzehren: P-Zusammensetzung ( 4 105 ). Beachten Sie jedoch, dass die physiologische Akkumulation von großen Energiespeicherverbindungen (Fette, Wachsester und Lipide, denen N und P fehlen) bei Tieren mit solchen Speicherfähigkeiten zu zeitlichen Schwankungen des Biomasse-C:Nährstoff-Verhältnisses führen kann. Im Allgemeinen behalten die meisten Tiere jedoch eine relativ enge Homöostase in der C:N:P-Stöchiometrie bei. Wenn das Nährstoffelement X im Verhältnis zum Bedarf im Überschuss vorliegt, erhöhen die Verbraucher die spezifische Verlustrate dieses Elements (über Ausscheidung oder Egestion 114 27 ). Wenn Tiere mit Futter mit niedrigem Nährstoffgehalt (hoher C:X im Verhältnis zu ihrem Körper) herausgefordert werden, können die Tiere eine Wachstumseinbuße erleiden (μ′ sinkt) und ihr Biomasse-C:X steigt nur mäßig an ( 27 ). Im Gegensatz zur gedämpften Plastizität von Metazoen-C:N:P innerhalb einer Art gibt es beträchtliche (bisher nicht beachtete) Variationen in der Biomasse-C:N:P-Stöchiometrie zwischen verschiedenen Taxa, sogar innerhalb taxonomischer Ordnungen. Zooplankton von Krustentieren allein variiert um mehr als das Fünffache im Körper-P-Gehalt (Abb. 1c) und reicht von ∼ 0,5% P bei erwachsenen Copepoden bis ∼ 2,6% P insbesondere bei Anomopoden ( 4 56 66 ). Pflanzenfressende Insekten in terrestrischen Systemen weisen eine ähnliche Schwankungsbreite des N- und P-Gehalts auf (38). Darüber hinaus scheint eine Variation der C:N:P-Stöchiometrie von Zooplankton mit μ . verbunden zu seinm: in der Studie von Main und Kollegen ( 66 ) hatten schnell wachsende Taxa und/oder Lebensstadien einen leicht erhöhten N-Anteil, aber einen viel stärker erhöhten P-Anteil und als Ergebnis einen niedrigen Körper-N:P. In einer vergleichenden Studie zu Taxa innerhalb der Daphnia pulex Artenkomplex, 38 ) zeigte, dass Individuen aus der Arktis (wo die Vegetationsperiode kurz ist und die Selektion nach Wachstumsrate streng sein sollte) im Vergleich zu Individuen aus gemäßigten Lebensräumen einen höheren μ .-Wert aufwiesenm und Körperprozentsatz P, waren ineffiziente Wiederverwerter von P und waren anfälliger für P-Mangel-Diäten. In beiden Zooplanktonstudien sehen wir einen auffallenden Zusammenhang zwischen Wachstum und P-Stoffwechsel.

Es ist wichtig anzumerken, dass dieses Paradigma der Nährstoffzusammensetzung hauptsächlich für die Untersuchung von Süßwasser-Zooplankton entwickelt wurde. Der Regulierungsgrad des Elementgehalts, seine allometrischen und taxonomischen Korrelate sowie die Kopplung von μ- und C:N:P-Stöchiometrie in anderen Organismengruppen ist noch sehr wenig bekannt. Gibt es einen Grund zu der Annahme, dass ähnliche Muster auch für andere Organismengruppen gelten sollten? Übereinstimmende Muster wären zu erwarten, wenn die im Zooplankton beobachteten Muster mit grundlegenden zellulären Mechanismen verbunden sind, die mit anderen Biota geteilt werden. Um festzustellen, ob dies der Fall ist, müssen wir mögliche zugrunde liegende Mechanismen berücksichtigen, die die Assoziation der C:N:P-Stöchiometrie mit der Wachstumsrate antreiben.


Inhalt

Rationales Design Bearbeiten

Beim rationalen Proteindesign nutzt ein Wissenschaftler detaillierte Kenntnisse über die Struktur und Funktion eines Proteins, um gewünschte Veränderungen vorzunehmen. Dies hat im Allgemeinen den Vorteil, kostengünstig und technisch einfach zu sein, da ortsgerichtete Mutageneseverfahren gut entwickelt sind. Ihr größter Nachteil besteht jedoch darin, dass häufig keine detaillierten strukturellen Kenntnisse eines Proteins verfügbar sind, und selbst wenn vorhanden, kann es sehr schwierig sein, die Auswirkungen verschiedener Mutationen vorherzusagen, da Strukturinformationen meistens ein statisches Bild einer Proteinstruktur liefern. Programme wie [email protected] und Foldit nutzen jedoch Crowdsourcing-Techniken, um Einblicke in die Faltungsmotive von Proteinen zu gewinnen. [2]

Computergestützte Proteindesignalgorithmen zielen darauf ab, neue Aminosäuresequenzen zu identifizieren, die energiearm sind, wenn sie an die vordefinierte Zielstruktur gefaltet werden. Während der zu durchsuchende Sequenz-Konformationsraum groß ist, ist die größte Herausforderung für das computergestützte Proteindesign eine schnelle, aber genaue Energiefunktion, die optimale Sequenzen von ähnlichen suboptimalen unterscheiden kann.

Ausrichtung mehrerer Sequenzen Bearbeiten

Ohne strukturelle Informationen über ein Protein ist die Sequenzanalyse oft nützlich, um Informationen über das Protein aufzuklären. Diese Techniken beinhalten das Alignment von Zielproteinsequenzen mit anderen verwandten Proteinsequenzen. Dieses Alignment kann zeigen, welche Aminosäuren zwischen Spezies konserviert sind und für die Funktion des Proteins wichtig sind. Diese Analysen können helfen, Hotspot-Aminosäuren zu identifizieren, die als Zielstellen für Mutationen dienen können. Das multiple Sequenz-Alignment verwendet Datenbanken wie PREFAB, SABMARK, OXBENCH, IRMBASE und BALIBASE, um Zielproteinsequenzen mit bekannten Sequenzen zu kreuzen. Mehrere Sequenz-Alignment-Techniken sind unten aufgeführt. [3] [ Seite benötigt ]

Dieses Verfahren beginnt mit der paarweisen Ausrichtung von Sequenzen unter Verwendung von k-Tupel- oder Needleman-Wunsch-Verfahren. Diese Verfahren berechnen eine Matrix, die die paarweise Ähnlichkeit zwischen den Sequenzpaaren darstellt. Ähnlichkeitsbewertungen werden dann in Entfernungsbewertungen umgewandelt, die verwendet werden, um einen Leitbaum unter Verwendung des Nachbarverbindungsverfahrens zu erzeugen. Dieser Leitbaum wird dann verwendet, um ein multiples Sequenz-Alignment zu erhalten. [3] [ Seite benötigt ]

Clustal Omega Bearbeiten

Dieses Verfahren ist in der Lage, bis zu 190.000 Sequenzen unter Verwendung des k-Tupel-Verfahrens auszurichten. Die nächsten Sequenzen werden mit dem mBed geclustert und k-bedeutet Methoden. Ein Leitbaum wird dann unter Verwendung des UPGMA-Verfahrens konstruiert, das vom HH-Ausrichtungspaket verwendet wird. Dieser Führungsbaum wird verwendet, um mehrere Sequenz-Alignments zu erzeugen. [3] [ Seite benötigt ]

MAFFT Bearbeiten

Dieses Verfahren verwendet eine schnelle Fourier-Transformation (FFT), die Aminosäuresequenzen in eine Sequenz umwandelt, die aus Volumen- und Polaritätswerten für jeden Aminosäurerest besteht. Diese neue Sequenz wird verwendet, um homologe Regionen zu finden. [3] [ Seite benötigt ]

K-Ausrichtung Bearbeiten

Dieses Verfahren verwendet den angenäherten String-Matching-Algorithmus von Wu-Manber, um mehrere Sequenz-Alignments zu erzeugen. [3] [ Seite benötigt ]

Mehrfachsequenzvergleich durch Log-Erwartung (MUSCLE) Bearbeiten

Dieses Verfahren verwendet Kmer- und Kimura-Abstände, um mehrere Sequenz-Alignments zu erzeugen. [3] [ Seite benötigt ]

T-Kaffee Bearbeiten

Dieses Verfahren verwendet baumbasierte Konsistenzzielfunktionen für die Ausrichtungsentwicklung. Diese Methode hat sich als 5-10% genauer als Clustal W erwiesen. [3] [ Seite benötigt ]

Koevolutionäre Analyse Bearbeiten

Die koevolutionäre Analyse wird auch als korrelierte Mutation, Kovariation oder Kosubstitution bezeichnet. Diese Art von rationalem Design beinhaltet wechselseitige evolutionäre Veränderungen an evolutionär interagierenden Loci. Im Allgemeinen beginnt dieses Verfahren mit der Erzeugung eines kuratierten multiplen Sequenz-Alignments für die Zielsequenz. Dieses Alignment wird dann einer manuellen Verfeinerung unterzogen, die das Entfernen von Sequenzen mit hohen Lücken sowie von Sequenzen mit geringer Sequenzidentität beinhaltet. Dieser Schritt erhöht die Qualität der Ausrichtung. Als nächstes wird das manuell verarbeitete Alignment für weitere koevolutionäre Messungen unter Verwendung verschiedener korrelierter Mutationsalgorithmen verwendet. Diese Algorithmen führen zu einer Koevolutionsbewertungsmatrix. Diese Matrix wird durch Anwenden verschiedener Signifikanztests gefiltert, um signifikante Koevolutionswerte zu extrahieren und Hintergrundrauschen auszulöschen. Koevolutionäre Messungen werden weiter ausgewertet, um ihre Leistung und Stringenz zu beurteilen. Schließlich werden die Ergebnisse dieser koevolutionären Analyse experimentell validiert. [3] [ Seite benötigt ]

Strukturvorhersage Bearbeiten

De novo Die Proteinsynthese profitiert von der Kenntnis vorhandener Proteinstrukturen. Diese Kenntnis der bestehenden Proteinstruktur hilft bei der Vorhersage neuer Proteinstrukturen. Methoden zur Vorhersage der Proteinstruktur fallen in eine der vier folgenden Klassen: von Anfang an, fragmentbasierte Methoden, Homologiemodellierung und Protein-Threading. [3] [ Seite benötigt ]

Von Anfang an Bearbeiten

Diese Methoden beinhalten eine freie Modellierung, ohne strukturelle Informationen über die Vorlage zu verwenden. Von Anfang an Methoden zielen darauf ab, die nativen Strukturen von Proteinen entsprechend dem globalen Minimum seiner freien Energie vorherzusagen. einige Beispiele für von Anfang an Methoden sind AMBER, GROMOS, GROMACS, CHARMM, OPLS und ENCEPP12. Allgemeine Schritte für von Anfang an Methoden beginnen mit der geometrischen Darstellung des interessierenden Proteins. Als nächstes wird ein potentielles Energiefunktionsmodell für das Protein entwickelt. Dieses Modell kann entweder unter Verwendung von molekularmechanischen Potentialen oder von der Proteinstruktur abgeleiteten Potentialfunktionen erstellt werden. Nach der Entwicklung eines Potenzialmodells werden Energiesuchtechniken einschließlich molekulardynamischer Simulationen, Monte-Carlo-Simulationen und genetischer Algorithmen auf das Protein angewendet. [3] [ Seite benötigt ]

Fragmentbasiertes Bearbeiten

Diese Verfahren verwenden Datenbankinformationen bezüglich Strukturen, um homologe Strukturen mit den erzeugten Proteinsequenzen abzugleichen. Diese homologen Strukturen werden unter Verwendung von Bewertungs- und Optimierungsverfahren zu kompakten Strukturen zusammengesetzt, mit dem Ziel, die niedrigste potenzielle Energiebewertung zu erreichen. Webserver für Fragmentinformationen sind I-TASSER, ROSETTA, ROSETTA @ home, FRAGFOLD, CABS fold, PROFESY, CREF, QUARK, UNDERTAKER, HMM und ANGLOR. [3] : 72

Homologiemodellierung Bearbeiten

Diese Verfahren basieren auf der Homologie von Proteinen. Diese Methoden werden auch als vergleichende Modellierung bezeichnet. Der erste Schritt bei der Homologiemodellierung ist im Allgemeinen die Identifizierung von Matrizensequenzen bekannter Struktur, die zu der Abfragesequenz homolog sind. Als nächstes wird die Abfragesequenz an der Vorlagensequenz ausgerichtet. Nach dem Alignment werden die strukturell konservierten Regionen unter Verwendung der Template-Struktur modelliert. Darauf folgt die Modellierung von Seitenketten und Schleifen, die sich von der Vorlage unterscheiden. Schließlich wird die modellierte Struktur einer Verfeinerung und Qualitätsbewertung unterzogen. Server, die für Homologiemodellierungsdaten verfügbar sind, sind hier aufgelistet: SWISS MODEL, MODELLER, ReformAlign, PyMOD, TIP-STRUCTFAST, COMPASS, 3d-PSSM, SAMT02, SAMT99, HHPRED, FAGUE, 3D-JIGSAW, META-PP, ROSETTA und I-TASSER. [3] [ Seite benötigt ]

Protein-Threading Bearbeiten

Protein-Threading kann verwendet werden, wenn kein zuverlässiges Homolog für die Abfragesequenz gefunden werden kann. Diese Methode beginnt mit dem Abrufen einer Abfragesequenz und einer Bibliothek von Vorlagenstrukturen. Als nächstes wird die Abfragesequenz über bekannte Vorlagenstrukturen gefädelt. Diese Kandidatenmodelle werden unter Verwendung von Bewertungsfunktionen bewertet. Diese werden basierend auf potentiellen Energiemodellen sowohl der Abfrage- als auch der Vorlagensequenz bewertet. Die Übereinstimmung mit dem Modell mit der niedrigsten potentiellen Energie wird dann ausgewählt. Methoden und Server zum Abrufen von Threading-Daten und zum Durchführen von Berechnungen sind hier aufgeführt: GenTHREADER, pGenTHREADER, pDomTHREADER, ORFEUS, PROSPECT, BioShell-Threading, FFASO3, RaptorX, HHPred, LOOPP-Server, Sparks-X, SEGMER, THREADER2, ESYPREDITS ., LI , RAPTOR, COTH, MUSTER. [3] [ Seite benötigt ]

Weitere Informationen zum rationalen Design finden Sie unter ortsgerichtete Mutagenese.

Gezielte Evolution Bearbeiten

In der gerichteten Evolution wird zufällige Mutagenese, z.B. B. durch fehleranfällige PCR oder Sequenzsättigungsmutagenese, auf ein Protein angewendet, und ein Selektionsregime wird verwendet, um Varianten mit gewünschten Merkmalen zu selektieren. Weitere Mutations- und Selektionsrunden werden dann angewendet. Diese Methode ahmt die natürliche Evolution nach und liefert im Allgemeinen bessere Ergebnisse als rationales Design. Ein zusätzlicher Prozess, der als DNA-Shuffling bezeichnet wird, mischt und vergleicht Teile erfolgreicher Varianten, um bessere Ergebnisse zu erzielen. Solche Prozesse ahmen die Rekombination nach, die während der sexuellen Fortpflanzung natürlich auftritt. Die Vorteile der gerichteten Evolution bestehen darin, dass sie keine vorherige strukturelle Kenntnis eines Proteins erfordert und auch nicht in der Lage ist, vorherzusagen, welche Auswirkungen eine bestimmte Mutation haben wird. Tatsächlich sind die Ergebnisse von Experimenten zur gerichteten Evolution oft insofern überraschend, als erwünschte Veränderungen oft durch Mutationen verursacht werden, von denen erwartet wurde, dass sie keine Wirkung haben. Der Nachteil besteht darin, dass sie ein Hochdurchsatz-Screening erfordern, das nicht für alle Proteine ​​durchführbar ist. Große Mengen rekombinanter DNA müssen mutiert und die Produkte auf gewünschte Merkmale gescreent werden. Die große Variantenvielfalt erfordert oft eine teure Roboterausrüstung, um den Prozess zu automatisieren. Darüber hinaus können nicht alle gewünschten Aktivitäten einfach überprüft werden.

Die natürliche Darwinsche Evolution kann im Labor effektiv nachgeahmt werden, um Proteineigenschaften für verschiedene Anwendungen, einschließlich der Katalyse, zuzuschneiden. Es gibt viele experimentelle Technologien, um große und vielfältige Proteinbibliotheken herzustellen und um gefaltete, funktionelle Varianten zu screenen oder auszuwählen. Gefaltete Proteine ​​treten überraschend häufig im Zufallssequenzraum auf, ein Vorkommen, das bei der Entwicklung selektiver Binder und Katalysatoren ausgenutzt werden kann. Obwohl sie konservativer als die direkte Selektion aus dem tiefen Sequenzraum ist, ist die Neugestaltung bestehender Proteine ​​durch zufällige Mutagenese und Selektion/Screening eine besonders robuste Methode zur Optimierung oder Veränderung vorhandener Eigenschaften. Es stellt auch einen hervorragenden Ausgangspunkt dar, um ehrgeizigere Engineering-Ziele zu erreichen.Die Verbindung experimenteller Evolution mit modernen Computermethoden ist wahrscheinlich die umfassendste und fruchtbarste Strategie zur Erzeugung funktioneller Makromoleküle, die der Natur unbekannt sind. [4]

Die Hauptherausforderungen beim Design hochwertiger Mutantenbibliotheken haben in der jüngsten Vergangenheit erhebliche Fortschritte gezeigt. Dieser Fortschritt erfolgte in Form besserer Beschreibungen der Auswirkungen von Mutationsladungen auf Proteinmerkmale. Auch computergestützte Ansätze haben große Fortschritte im unzählig großen Sequenzraum zu handhabbareren Screening-Größen gezeigt und so intelligente Mutantenbibliotheken geschaffen. Die Bibliotheksgröße wurde auch durch die Identifizierung von nützlichen Schlüsselresten unter Verwendung von Algorithmen für die systematische Rekombination auf besser durchsuchbare Größen reduziert. Schließlich wurde mit der Entwicklung genauerer statistischer Modelle und Algorithmen zur Quantifizierung und Vorhersage gekoppelter Mutationseffekte auf Proteinfunktionen ein bedeutender Schritt vorwärts in Richtung eines effizienten Reengineerings von Enzymen gemacht. [5]

Im Allgemeinen kann die gerichtete Evolution als ein iterativer zweistufiger Prozess zusammengefasst werden, der die Erzeugung von Proteinmutantenbibliotheken und Hochdurchsatz-Screening-Prozesse umfasst, um nach Varianten mit verbesserten Merkmalen zu selektieren. Diese Technik erfordert keine Vorkenntnisse über die Proteinstruktur und die Funktionsbeziehung. Die gerichtete Evolution verwendet zufällige oder fokussierte Mutagenese, um Bibliotheken mutierter Proteine ​​zu erzeugen. Zufällige Mutationen können entweder durch fehleranfällige PCR oder durch Ortssättigungsmutagenese eingeführt werden. Mutanten können auch unter Verwendung der Rekombination mehrerer homologer Gene erzeugt werden. Die Natur hat eine begrenzte Anzahl von nützlichen Sequenzen entwickelt. Die gerichtete Evolution ermöglicht es, unentdeckte Proteinsequenzen mit neuartigen Funktionen zu identifizieren. Diese Fähigkeit hängt von der Fähigkeit des Proteins ab, Substitutionen von Aminosäureresten zu tolerieren, ohne die Faltung oder Stabilität zu beeinträchtigen. [3] [ Seite benötigt ]

Methoden der gerichteten Evolution können grob in zwei Strategien eingeteilt werden, asexuelle und sexuelle Methoden.

Asexuelle Methoden Bearbeiten

Asexuelle Methoden erzeugen keine Querverbindungen zwischen elterlichen Genen. Einzelne Gene werden verwendet, um Mutantenbibliotheken unter Verwendung verschiedener mutagener Techniken zu erstellen. Diese asexuellen Methoden können entweder eine zufällige oder eine fokussierte Mutagenese erzeugen.

Zufällige Mutagenese Bearbeiten

Zufällige mutagene Verfahren erzeugen zufällige Mutationen im gesamten interessierenden Gen. Zufällige Mutagenese kann die folgenden Arten von Mutationen einführen: Transitionen, Transversionen, Insertionen, Deletionen, Inversion, Missense und Nonsense. Beispiele für Verfahren zur Herstellung von Zufallsmutagenese sind unten.

Fehleranfällige PCR Bearbeiten

Die fehleranfällige PCR nutzt die Tatsache, dass der Taq-DNA-Polymerase die 3'- bis 5'-Exonuklease-Aktivität fehlt. Dies führt zu einer Fehlerrate von 0,001-0,002 % pro Nukleotid pro Replikation. Diese Methode beginnt mit der Auswahl des Gens oder des Bereichs innerhalb eines Gens, das mutiert werden soll. Als nächstes wird das erforderliche Fehlerausmaß basierend auf der Art und dem Ausmaß der Aktivität berechnet, die man erzeugen möchte. Dieses Fehlerausmaß bestimmt die anzuwendende fehleranfällige PCR-Strategie. Nach der PCR werden die Gene in ein Plasmid kloniert und in kompetente Zellsysteme eingeführt. Diese Zellen werden dann auf gewünschte Merkmale gescreent. Plasmide werden dann für Kolonien isoliert, die verbesserte Merkmale aufweisen, und werden dann als Matrizen in der nächsten Mutageneserunde verwendet. Die fehleranfällige PCR zeigt Verzerrungen für bestimmte Mutationen im Vergleich zu anderen. Wie zum Beispiel Verzerrungen für Übergänge über Transversionen. [3] [ Seite benötigt ]

Die Fehlerraten bei der PCR können auf folgende Weise erhöht werden: [3] [ Seite benötigt ]

  1. Erhöhen Sie die Konzentration von Magnesiumchlorid, das die nicht komplementäre Basenpaarung stabilisiert.
  2. Fügen Sie Manganchlorid hinzu, um die Basenpaarspezifität zu reduzieren.
  3. Erhöhte und unausgewogene Zugabe von dNTPs.
  4. Zugabe von Basenanaloga wie dITP, 8 oxo-dGTP und dPTP.
  5. Erhöhen Sie die Konzentration der Taq-Polymerase.
  6. Verlängerungszeit verlängern.
  7. Zykluszeit erhöhen.
  8. Verwenden Sie weniger genaue Taq-Polymerase.

Siehe auch Polymerase-Kettenreaktion für weitere Informationen.

Rolling Circle fehleranfällige PCR Bearbeiten

Diese PCR-Methode basiert auf der Rolling-Circle-Amplifikation, die der Methode nachempfunden ist, die Bakterien verwenden, um zirkuläre DNA zu amplifizieren. Dieses Verfahren führt zu linearen DNA-Duplexen. Diese Fragmente enthalten Tandem-Wiederholungen zirkulärer DNA, die als Konkatamere bezeichnet werden und in Bakterienstämme umgewandelt werden können. Mutationen werden eingeführt, indem zuerst die Zielsequenz in ein geeignetes Plasmid kloniert wird. Als nächstes beginnt der Amplifikationsprozess unter Verwendung von Zufalls-Hexamer-Primern und 29-DNA-Polymerase unter fehleranfälligen Rolling-Circle-Amplifikationsbedingungen. Zusätzliche Bedingungen zur Erzeugung einer fehleranfälligen Rolling-Circle-Amplifikation sind 1,5 pM Matrizen-DNA, 1,5 mM MnCl&sub2;2 und eine Reaktionszeit von 24 Stunden. MnCl2 wird in die Reaktionsmischung gegeben, um zufällige Punktmutationen in den DNA-Strängen zu fördern. Mutationsraten können durch Erhöhung der MnCl .-Konzentration erhöht werden2, oder durch Verringern der Konzentration der Matrizen-DNA. Die fehleranfällige Rolling-Circle-Amplifikation ist im Vergleich zur fehleranfälligen PCR aufgrund ihrer Verwendung von universellen Zufalls-Hexamer-Primern anstelle von spezifischen Primern vorteilhaft. Auch die Reaktionsprodukte dieser Amplifikation müssen nicht mit Ligasen oder Endonukleasen behandelt werden. Diese Reaktion ist isotherm. [3] [ Seite benötigt ]

Chemische Mutagenese Bearbeiten

Chemische Mutagenese beinhaltet die Verwendung chemischer Mittel, um Mutationen in genetische Sequenzen einzuführen. Beispiele für chemische Mutagene folgen.

Natriumbisulfat ist wirksam bei der Mutation von G/C-reichen Genomsequenzen. Dies liegt daran, dass Natriumbisulfat die Desaminierung von unmethyliertem Cytosin zu Uracil katalysiert. [3] [ Seite benötigt ]

Ethylmethansulfonat alkyliert Guanidinreste. Diese Änderung verursacht Fehler bei der DNA-Replikation. [3] [ Seite benötigt ]

Salpetrige Säure bewirkt eine Transversion durch Desaminierung von Adenin und Cytosin. [3] [ Seite benötigt ]

Der duale Ansatz zur zufälligen chemischen Mutagenese ist ein iterativer zweistufiger Prozess. Zuerst geht es um die in vivo chemische Mutagenese des interessierenden Gens über EMS. Als nächstes wird das behandelte Gen isoliert und in einen unbehandelten Expressionsvektor kloniert, um Mutationen im Plasmidrückgrat zu verhindern. [3] [ Seite benötigt ] Diese Technik bewahrt die genetischen Eigenschaften des Plasmids. [3] [ Seite benötigt ]

Targeting von Glykosylasen auf eingebettete Arrays für die Mutagenese (TaGTEAM) Bearbeiten

Diese Methode wurde verwendet, um gezielte in vivo Mutagenese in Hefe. Dieses Verfahren beinhaltet die Fusion einer 3-Methyladenin-DNA-Glycosylase an die tetR-DNA-Bindungsdomäne. Es hat sich gezeigt, dass dies die Mutationsraten in Regionen des Genoms, die tetO-Stellen enthalten, um das 800-fache erhöht. [3] [ Seite benötigt ]

Mutagenese durch zufällige Insertion und Deletion Bearbeiten

Dieses Verfahren beinhaltet eine Längenänderung der Sequenz durch gleichzeitige Deletion und Insertion von Basenstücken beliebiger Länge. Es hat sich gezeigt, dass dieses Verfahren Proteine ​​mit neuen Funktionalitäten durch Einführung neuer Restriktionsschnittstellen, spezifischer Codons und vier Basencodons für nicht-natürliche Aminosäuren produziert. [3] [ Seite benötigt ]

Transposon-basierte Zufallsmutagenese Bearbeiten

Kürzlich wurde über viele Verfahren zur auf Transposonen basierenden Zufallsmutagenese berichtet. Diese Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden: PERMUTE – zufällige zirkuläre Permutation, zufällige Proteinverkürzung, zufällige Nukleotidtriplett-Substitution, zufällige Domäne/Tag/mehrere Aminosäureinsertion, Codon-Scanning-Mutagenese und Multicodon-Scanning-Mutagenese. Diese oben genannten Techniken erfordern alle das Design von Mini-Mu-Transposons. Thermo Scientific stellt Kits für das Design dieser Transposons her. [3] [ Seite benötigt ]

Zufällige Mutagenesemethoden, die die Länge der Ziel-DNA verändern Bearbeiten

Diese Verfahren beinhalten die Veränderung der Genlänge durch Insertions- und Deletionsmutationen. Ein Beispiel ist das Tandem Repeat Insertion (TRINS)-Verfahren. Diese Technik führt zur Erzeugung von Tandem-Wiederholungen zufälliger Fragmente des Zielgens über eine Rolling-Circle-Amplifikation und gleichzeitigen Einbau dieser Wiederholungen in das Zielgen. [3] [ Seite benötigt ]

Mutator-Stämme Bearbeiten

Mutatorstämme sind bakterielle Zelllinien, denen ein oder mehrere DNA-Reparaturmechanismen fehlen. Ein Beispiel für einen Mutatorstrang ist E. coli XL1-RED. [3] [ Seite benötigt ] Dieser untergeordnete Stamm von E. coli ist in den MutS-, MutD-, MutT-DNA-Reparaturwegen defizient. Die Verwendung von Mutatorstämmen ist bei der Einführung vieler Mutationstypen nützlich, jedoch zeigen diese Stämme aufgrund der Anhäufung von Mutationen im eigenen Genom der Stämme eine fortschreitende Krankheit der Kultur. [3] [ Seite benötigt ]

Fokussierte Mutagenese Bearbeiten

Fokussierte mutagene Verfahren erzeugen Mutationen an vorbestimmten Aminosäureresten. Diese Techniken erfordern ein Verständnis der Sequenz-Funktions-Beziehung für das interessierende Protein. Das Verständnis dieser Beziehung ermöglicht die Identifizierung von Resten, die für Stabilität, Stereoselektivität und katalytische Effizienz wichtig sind. [3] [ Seite benötigt ] Beispiele für Methoden, die eine fokussierte Mutagenese erzeugen, sind unten aufgeführt.

Site-Sättigungsmutagenese Bearbeiten

Die Site-Sättigungsmutagenese ist eine auf PCR basierende Methode, die verwendet wird, um Aminosäuren mit signifikanten Rollen in der Proteinfunktion anzusteuern. Die beiden gebräuchlichsten Techniken zur Durchführung sind die Einzel-PCR des gesamten Plasmids und die Überlappungs-Extension-PCR.

Die Einzel-PCR des gesamten Plasmids wird auch als ortsgerichtete Mutagenese (SDM) bezeichnet. SDM-Produkte werden einem Dpn-Endonuklease-Verdau unterzogen. Dieser Verdau führt zur Spaltung nur des Elternstrangs, da der Elternstrang ein GmATC enthält, das an N6 von Adenin methyliert ist. SDM funktioniert nicht gut für große Plasmide von über zehn Kilobasen. Außerdem ist dieses Verfahren nur in der Lage, zwei Nukleotide gleichzeitig zu ersetzen. [3] [ Seite benötigt ]

Die Überlappungsverlängerungs-PCR erfordert die Verwendung von zwei Primerpaaren. Ein Primer in jedem Set enthält eine Mutation. Eine erste PCR-Runde unter Verwendung dieser Primersätze wird durchgeführt und zwei doppelsträngige DNA-Duplexe werden gebildet. Dann wird eine zweite PCR-Runde durchgeführt, in der diese Duplexe denaturiert und wieder mit den Primersets verbunden werden, um Heteroduplexe zu erzeugen, in denen jeder Strang eine Mutation aufweist. Alle Lücken in diesen neu gebildeten Heteroduplexen werden mit DNA-Polymerasen gefüllt und weiter amplifiziert. [3] [ Seite benötigt ]

Sequenzsättigungsmutagenese (SeSaM) Bearbeiten

Sequenzsättigungsmutagenese führt zur Randomisierung der Zielsequenz an jeder Nukleotidposition. Dieses Verfahren beginnt mit der Erzeugung von DNA-Fragmenten variabler Länge, die mit universellen Basen versehen sind, über die Verwendung von Template-Transferasen an den 3'-Termini. Als nächstes werden diese Fragmente unter Verwendung einer einzelsträngigen Matrize auf die volle Länge verlängert. Die universellen Basen werden durch eine zufällige Standardbase ersetzt, was Mutationen verursacht. Es gibt mehrere modifizierte Versionen dieser Methode wie SeSAM-Tv-II, SeSAM-Tv+ und SeSAM-III. [3] [ Seite benötigt ]

Einzelprimerreaktionen parallel (SPRINP) Bearbeiten

Dieses Verfahren der Ortssättigungsmutagenese beinhaltet zwei separate PCR-Reaktionen. Die erste davon verwendet nur Vorwärtsprimer, während die zweite Reaktion nur Rückwärtsprimer verwendet. Dies vermeidet die Bildung einer Primer-Dimer-Bildung. [3] [ Seite benötigt ]

Mega-primerte und Ligase-freie fokussierte Mutagenese Bearbeiten

Diese mutagene Technik der Sättigungssättigung beginnt mit einem mutagenen Oligonukleotid und einem universellen flankierenden Primer. Diese beiden Reaktanten werden für einen anfänglichen PCR-Zyklus verwendet. Produkte aus diesem ersten PCR-Zyklus werden als Megaprimer für die nächste PCR verwendet. [3] [ Seite benötigt ]

Ω-PCR-Bearbeitung

Dieses mutagene Verfahren zur Ortssättigung basiert auf einer Überlappungsverlängerungs-PCR. Es wird verwendet, um Mutationen an einer beliebigen Stelle in einem zirkulären Plasmid einzuführen. [3] [ Seite benötigt ]

PFunkel-ominchange-OSCARR Bearbeiten

Dieses Verfahren verwendet eine benutzerdefinierte ortsgerichtete Mutagenese an einer oder mehreren Stellen gleichzeitig. OSCARR ist ein Akronym für einfache Eintopf-Methodik für Kassettenrandomisierung und Rekombination. Diese Randomisierung und Rekombination führt zur Randomisierung der gewünschten Fragmente eines Proteins. Omnichange ist eine sequenzunabhängige Multisite-Sättigungsmutagenese, die bis zu fünf unabhängige Codons auf einem Gen sättigen kann.

Trimer-Dimer-Mutagenese Bearbeiten

Dieses Verfahren entfernt redundante Codons und Stoppcodons.

Kassettenmutagenese Bearbeiten

Dies ist eine PCR-basierte Methode. Die Kassettenmutagenese beginnt mit der Synthese einer DNA-Kassette, die das interessierende Gen enthält, das auf beiden Seiten von Restriktionsstellen flankiert wird. Die Endonuklease, die diese Restriktionsstellen spaltet, spaltet auch Stellen im Zielplasmid. Die DNA-Kassette und das Zielplasmid werden beide mit Endonukleasen behandelt, um diese Restriktionsstellen zu spalten und klebrige Enden zu erzeugen. Als nächstes werden die Produkte dieser Spaltung miteinander ligiert, was zur Insertion des Gens in das Zielplasmid führt. Eine alternative Form der Kassettenmutagenese, die als kombinatorische Kassettenmutagenese bezeichnet wird, wird verwendet, um die Funktionen einzelner Aminosäurereste im interessierenden Protein zu identifizieren. Die rekursive Ensemble-Mutagenese verwendet dann Informationen aus der vorherigen kombinatorischen Kassetten-Mutagenese. Codon-Kassetten-Mutagenese ermöglicht es Ihnen, ein einzelnes Codon an einer bestimmten Stelle in doppelsträngiger DNA einzufügen oder zu ersetzen. [3] [ Seite benötigt ]

Sexuelle Methoden Bearbeiten

Sexuelle Methoden der gerichteten Evolution beinhalten in vitro Rekombination, die natürliche nachahmen in vivo Rekombination. Im Allgemeinen erfordern diese Techniken eine hohe Sequenzhomologie zwischen den Elternsequenzen. Diese Techniken werden oft verwendet, um zwei verschiedene Elterngene zu rekombinieren, und diese Methoden erzeugen Kreuzungen zwischen diesen Genen. [3] [ Seite benötigt ]

In vitro homologe Rekombination Bearbeiten

Die homologe Rekombination kann als entweder kategorisiert werden in vivo oder in vitro. In vitro homologe Rekombination imitiert natürliche in vivo Rekombination. Diese in vitro Rekombinationsverfahren erfordern eine hohe Sequenzhomologie zwischen den Elternsequenzen. Diese Techniken nutzen die natürliche Diversität der Elterngene, indem sie sie rekombinieren, um chimäre Gene zu erhalten. Die resultierende Chimäre zeigt eine Mischung aus elterlichen Eigenschaften. [3] [ Seite benötigt ]

DNA-Shuffling Bearbeiten

Dies in vitro Technik war eine der ersten Techniken im Zeitalter der Rekombination. Es beginnt mit der Verdauung homologer Elterngene in kleine Fragmente durch DNase1. Diese kleinen Fragmente werden dann von unverdauten Elterngenen gereinigt. Gereinigte Fragmente werden dann unter Verwendung einer Primer-losen PCR wieder zusammengesetzt. Diese PCR beinhaltet homologe Fragmente von verschiedenen Elterngenen, die füreinander priming sind, was zu chimärer DNA führt. Die chimäre DNA von Elterngröße wird dann unter Verwendung von endterminalen Primern in einer regulären PCR amplifiziert. [3] [ Seite benötigt ]

Zufällige Grundierung in vitro Rekombination (RPR) Bearbeiten

Dies in vitro Das homologe Rekombinationsverfahren beginnt mit der Synthese vieler kurzer Genfragmente, die Punktmutationen aufweisen, unter Verwendung von Zufallssequenz-Primern. Diese Fragmente werden unter Verwendung einer Primer-losen PCR zu Elterngenen voller Länge wieder zusammengesetzt. Diese reassemblierten Sequenzen werden dann mittels PCR amplifiziert und weiteren Selektionsprozessen unterzogen. Dieses Verfahren ist im Vergleich zum DNA-Shuffling vorteilhaft, da keine DNase 1 verwendet wird und somit keine Voreingenommenheit für die Rekombination neben einem Pyrimidinnukleotid besteht. Dieses Verfahren ist auch aufgrund seiner Verwendung von synthetischen Zufallsprimern vorteilhaft, die eine einheitliche Länge aufweisen und keine Verzerrungen aufweisen. Schließlich ist dieses Verfahren unabhängig von der Länge der DNA-Matrizensequenz und erfordert eine kleine Menge an Eltern-DNA. [3] [ Seite benötigt ]

Verkürzte metagenomische Gen-spezifische PCR Bearbeiten

Dieses Verfahren erzeugt chimäre Gene direkt aus metagenomischen Proben. Es beginnt mit der Isolierung des gewünschten Gens durch funktionelles Screening aus einer metagenomischen DNA-Probe. Als nächstes werden spezifische Primer entworfen und verwendet, um die homologen Gene aus verschiedenen Umweltproben zu amplifizieren. Schließlich werden chimäre Bibliotheken erzeugt, um die gewünschten funktionellen Klone durch Mischen dieser amplifizierten homologen Gene zu erhalten. [3] [ Seite benötigt ]

Gestaffelter Erweiterungsprozess (StEP) Bearbeiten

Dies in vitro Das Verfahren basiert auf dem Template-Switching, um chimäre Gene zu erzeugen. Dieses auf PCR basierende Verfahren beginnt mit einer anfänglichen Denaturierung der Matrize, gefolgt von einem Annealing der Primer und einer kurzen Verlängerungszeit. Alle nachfolgenden Zyklen erzeugen ein Annealing zwischen den kurzen Fragmenten, die in vorherigen Zyklen erzeugt wurden, und verschiedenen Teilen der Matrize. Diese kurzen Fragmente und die Matrizen lagern sich basierend auf der Sequenzkomplementarität zusammen. Dieser Prozess des Annealings von Fragmenten an Template-DNA ist als Template-Switching bekannt. Diese angelagerten Fragmente dienen dann als Primer für die weitere Verlängerung. Dieses Verfahren wird durchgeführt, bis die chimäre Gensequenz der parentalen Länge erhalten wird. Die Ausführung dieses Verfahrens erfordert nur flankierende Primer, um zu beginnen. Es ist auch kein Dnase1-Enzym erforderlich. [3] [ Seite benötigt ]

Zufällige Chimeragenese auf transienten Templaten (RACHITT) Bearbeiten

Es wurde gezeigt, dass dieses Verfahren chimäre Genbibliotheken mit durchschnittlich 14 Crossovers pro chimärem Gen erzeugt. Es beginnt mit dem Alignment von Fragmenten von einem elterlichen oberen Strang auf den unteren Strang einer Uracil enthaltenden Matrize eines homologen Gens. 5'- und 3'-Überhanglappen werden gespalten und Lücken werden durch die Exonuklease- und Endonuklease-Aktivitäten von Pfu- und taq-DNA-Polymerasen gefüllt. Die Uracil enthaltende Matrize wird dann durch Behandlung mit einer Uracil-DNA-Glcosylase aus dem Heteroduplex entfernt, gefolgt von einer weiteren Amplifikation unter Verwendung von PCR. Dieses Verfahren ist vorteilhaft, da es Chimären mit relativ hoher Übergangsfrequenz erzeugt. Sie ist jedoch aufgrund der Komplexität und der Notwendigkeit der Erzeugung von einzelsträngiger DNA und Uracil, die einzelsträngige Matrizen-DNA enthalten, etwas eingeschränkt. [3] [ Seite benötigt ]

Synthetisches Mischen Bearbeiten

Das Mischen von synthetischen degenerierten Oligonukleotiden fügt den Mischverfahren Flexibilität hinzu, da Oligonukleotide mit optimalen Codons und nützlichen Mutationen eingeschlossen werden können. [3] [ Seite benötigt ]

In vivo Homologe Rekombination Bearbeiten

Die in Hefe durchgeführte Klonierung beinhaltet den PCR-abhängigen Wiederzusammenbau von fragmentierten Expressionsvektoren. Diese wieder zusammengesetzten Vektoren werden dann in Hefe eingeführt und kloniert. Die Verwendung von Hefe zur Klonierung des Vektors vermeidet Toxizität und Gegenselektion, die durch Ligation und Vermehrung in E. coli eingeführt würde. [3] [ Seite benötigt ]

Mutagenes organisiertes Rekombinationsverfahren durch homologe in vivo Gruppierung (MORPHIEREN) Bearbeiten

Dieses Verfahren führt Mutationen in spezifische Regionen von Genen ein, während andere Teile intakt bleiben, indem die hohe Häufigkeit der homologen Rekombination in Hefe genutzt wird. [3] [ Seite benötigt ]

Phagen-unterstützte kontinuierliche Evolution (PACE) Bearbeiten

Dieses Verfahren verwendet einen Bakteriophagen mit einem modifizierten Lebenszyklus, um sich entwickelnde Gene von Wirt zu Wirt zu übertragen. Der Lebenszyklus des Phagen ist so gestaltet, dass der Transfer mit der interessierenden Aktivität des Enzyms korreliert. Dieses Verfahren ist vorteilhaft, da es für die kontinuierliche Evolution des Gens nur minimale menschliche Eingriffe erfordert. [3]

In vitro nicht-homologe Rekombinationsmethoden Bearbeiten

Diese Verfahren basieren auf der Tatsache, dass Proteine ​​eine ähnliche strukturelle Identität aufweisen können, während ihnen eine Sequenzhomologie fehlt.

Exon schlurfen Bearbeiten

Exon-Shuffling ist die Kombination von Exons verschiedener Proteine ​​durch Rekombinationsereignisse, die an Introns auftreten. Beim orthologen Exon-Shuffling werden Exons aus orthologen Genen verschiedener Spezies kombiniert. Beim orthologen Domänen-Shuffling werden ganze Proteindomänen aus orthologen Genen verschiedener Spezies gemischt. Beim paralogen Exon-Shuffling werden Exons aus verschiedenen Genen derselben Spezies gemischt. Beim paralogen Domänen-Shuffling werden ganze Proteindomänen von paralogen Proteinen derselben Spezies gemischt. Funktionelles Homolog-Shuffling beinhaltet das Shuffling von nicht-homologen Domänen, die funktionell verwandt sind. Alle diese Prozesse erfolgen mit der Amplifikation der gewünschten Exons aus verschiedenen Genen unter Verwendung chimärer synthetischer Oligonukleotide. Diese Amplifikationsprodukte werden dann unter Verwendung einer Primer-losen PCR wieder zu Genen voller Länge zusammengesetzt. Während dieser PCR-Zyklen fungieren die Fragmente als Matrizen und Primer. Dies führt zu chimären Genen voller Länge, die dann einem Screening unterzogen werden. [3] [ Seite benötigt ]

Inkrementelle Verkürzung zur Erzeugung von Hybridenzymen (ITCHY) Bearbeiten

Fragmente von Elterngenen werden durch kontrollierte Verdauung durch Exonuklease III erzeugt. Diese Fragmente werden unter Verwendung von Endonuklease abgestumpft und werden ligiert, um Hybridgene zu erzeugen. THIOITCHY ist eine modifizierte ITCHY-Technik, die Nukleotidtriphosphat-Analoga wie &agr;-Phosphothioat-dNTPs verwendet. Der Einbau dieser Nukleotide blockiert die Verdauung durch Exonuklease III. Diese Hemmung der Verdauung durch Exonuklease III wird als Spiking bezeichnet. Spiking kann erreicht werden, indem zuerst Gene mit Exonuklease verkürzt werden, um Fragmente mit kurzen einzelsträngigen Überhängen zu erzeugen. Diese Fragmente dienen dann als Matrizen für die Amplifikation durch DNA-Polymerase in Gegenwart kleiner Mengen von Phosphothioat-dNTPs. Diese resultierenden Fragmente werden dann zusammenligiert, um Gene voller Länge zu bilden. Alternativ können die intakten Elterngene durch PCR in Gegenwart von normalen dNTPs und Phosphothioat-dNTPs amplifiziert werden. Diese Amplifikationsprodukte voller Länge werden dann einem Verdau durch eine Exonuklease unterzogen. Die Verdauung wird fortgesetzt, bis die Exonuklease auf ein α-pdNTP trifft, was zu Fragmenten unterschiedlicher Länge führt. Diese Fragmente werden dann zusammenligiert, um chimäre Gene zu erzeugen. [3] [ Seite benötigt ]

KRATZEND Bearbeiten

Dieses Verfahren erzeugt Bibliotheken von Hybridgenen, die multiples Crossover hemmen, indem DNA-Shuffling und ITCHY kombiniert werden. Diese Methode beginnt mit der Konstruktion zweier unabhängiger ITCHY-Bibliotheken. Die erste mit Gen A am N-Terminus. Und das andere mit Gen B am N-Terminus. Diese Hybridgenfragmente werden entweder unter Verwendung von Restriktionsenzymverdau oder PCR mit Terminusprimern über Agarosegelelektrophorese getrennt. Diese isolierten Fragmente werden dann zusammengemischt und unter Verwendung von DNase1 weiter verdaut. Verdaute Fragmente werden dann durch Primerlose PCR mit Template-Switching wieder zusammengesetzt. [3] [ Seite benötigt ]

Rekombinierte Erweiterung auf abgeschnittenen Vorlagen (RETT) Bearbeiten

Dieses Verfahren erzeugt Bibliotheken von Hybridgenen durch Matrizenwechsel von unidirektional wachsenden Polynukleotiden in Gegenwart von einzelsträngigen DNA-Fragmenten als Matrizen für Chimären. Dieses Verfahren beginnt mit der Herstellung von einzelsträngigen DNA-Fragmenten durch reverse Transkription von Ziel-mRNA. Genspezifische Primer werden dann an die einzelsträngige DNA angelagert. Diese Gene werden dann während eines PCR-Zyklus verlängert. Auf diesen Zyklus folgt ein Template-Switching und ein Annealing der kurzen Fragmente, die aus der früheren Primer-Extension erhalten wurden, an andere einzelsträngige DNA-Fragmente. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis einzelsträngige DNA voller Länge erhalten wird. [3] [ Seite benötigt ]

Sequenzhomologie-unabhängige Proteinrekombination (SHIPREC) Bearbeiten

Dieses Verfahren erzeugt eine Rekombination zwischen Genen mit geringer bis keiner Sequenzhomologie. Diese Chimären werden über eine Linkersequenz fusioniert, die mehrere Restriktionsstellen enthält. Dieses Konstrukt wird dann unter Verwendung von DNase1 verdaut. Die Fragmente werden unter Verwendung von S1-Nuklease stumpfendig gemacht. Diese Fragmente mit glatten Enden werden durch Ligation zu einer zirkulären Sequenz zusammengefügt. Dieses zirkuläre Konstrukt wird dann unter Verwendung von Restriktionsenzymen linearisiert, für die die Restriktionsschnittstellen in der Linkerregion vorhanden sind. Dies führt zu einer Bibliothek chimärer Gene, in der der Beitrag der Gene zum 5'- und 3'-Ende im Vergleich zum Ausgangskonstrukt umgekehrt wird. [3] [ Seite benötigt ]

Sequenzunabhängige ortsgerichtete Chimeragenese (SISDC) Bearbeiten

Dieses Verfahren führt zu einer Genbibliothek mit mehreren Kreuzungen von mehreren Elterngenen. Dieses Verfahren erfordert keine Sequenzidentität zwischen den Elterngenen. Dies erfordert eine oder zwei konservierte Aminosäuren an jeder Crossover-Position. Es beginnt mit dem Alignment von Elternsequenzen und der Identifizierung von Konsensusregionen, die als Crossover-Stellen dienen. Darauf folgt der Einbau spezifischer Tags, die Restriktionsstellen enthalten, gefolgt von der Entfernung der Tags durch Verdau mit Bac1, was zu Genen mit kohäsiven Enden führt. Diese Genfragmente werden gemischt und in einer geeigneten Reihenfolge ligiert, um chimäre Bibliotheken zu bilden. [3] [ Seite benötigt ]

Degenerierte Homo-Duplex-Rekombination (DHR) Bearbeiten

Dieses Verfahren beginnt mit dem Alignment homologer Gene, gefolgt von der Identifizierung von Polymorphismusregionen. Als nächstes wird der oberste Strang des Gens in kleine degenerierte Oligonukleotide aufgeteilt. Der untere Strang wird ebenfalls in Oligonukleotide verdaut, um als Gerüst zu dienen. Diese Fragmente werden in Lösung kombiniert, und die Oligonukleotide des oberen Strangs werden auf Oligonukleotide des unteren Strangs montiert. Lücken zwischen diesen Fragmenten werden mit Polymerase gefüllt und ligiert. [3] [ Seite benötigt ]

Zufällige multirekombinante PCR (RM-PCR) Bearbeiten

Dieses Verfahren beinhaltet das Mischen mehrerer DNA-Fragmente ohne Homologie in einer einzigen PCR. Dies führt zur Rekonstruktion kompletter Proteine ​​durch den Zusammenbau von Modulen, die für verschiedene Struktureinheiten kodieren. [3] [ Seite benötigt ]

Benutzerfreundliche DNA-Rekombination (USERec) Bearbeiten

Dieses Verfahren beginnt mit der Amplifikation von Genfragmenten, die rekombiniert werden müssen, unter Verwendung von Uracil-dNTPs. Diese Amplifikationslösung enthält auch Primer, PfuTurbo und Cx Hotstart DNA-Polymerase. Amplifizierte Produkte werden als nächstes mit USER-Enzym inkubiert. Dieses Enzym katalysiert die Entfernung von Uracilresten aus der DNA, wodurch einzelne Basenpaarlücken entstehen. Die mit USER-Enzym behandelten Fragmente werden gemischt und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert und einem Dpn1-Verdau unterzogen, um die Matrizen-DNA zu entfernen. Diese resultierenden Dingle-strängigen Fragmente werden einer Amplifikation unter Verwendung von PCR unterzogen und werden in E. coli transformiert. [3] [ Seite benötigt ]

Golden Gate Shuffling (GGS) Rekombination Bearbeiten

Dieses Verfahren ermöglicht es Ihnen, mindestens 9 verschiedene Fragmente in einem Akzeptorvektor zu rekombinieren, indem Sie ein Restriktionsenzym vom Typ 2 verwenden, das außerhalb der Restriktionsschnittstellen schneidet. Es beginnt mit der Subklonierung von Fragmenten in getrennten Vektoren, um auf beiden Seiten Bsa1-flankierende Sequenzen zu erzeugen. Diese Vektoren werden dann unter Verwendung des Typ-II-Restriktionsenzyms Bsa1 gespalten, das vier Nukleotid-Einzelstrangüberhänge erzeugt. Fragmente mit komplementären Überhängen werden hybridisiert und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Schließlich werden diese Konstrukte dann in E. coli-Zellen transformiert, die auf Expressionsniveaus gescreent werden. [3] [ Seite benötigt ]

Phosphorthioat-basierte DNA-Rekombinationsmethode (PRTec) Bearbeiten

Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Strukturelemente oder ganze Proteindomänen zu rekombinieren. Dieses Verfahren basiert auf der Phosphorothioat-Chemie, die die spezifische Spaltung von Phosphorothiodiester-Bindungen ermöglicht. Der erste Schritt im Prozess beginnt mit der Amplifikation von Fragmenten, die zusammen mit dem Vektorrückgrat rekombiniert werden müssen. Diese Amplifikation wird unter Verwendung von Primern mit phosphorthiolierten Nukleotiden an den 5'-Enden erreicht. Amplifizierte PCR-Produkte werden in einer Ethanol-Jod-Lösung bei hohen Temperaturen gespalten. Als nächstes werden diese Fragmente bei Raumtemperatur hybridisiert und in E. coli transformiert, die alle Kerben reparieren. [3] [ Seite benötigt ]

Integron Bearbeiten

Dieses System basiert auf einem natürlichen ortsspezifischen Rekombinationssystem in E. coli. Dieses System wird Integron-System genannt und erzeugt ein natürliches Gen-Shuffling. Dieses Verfahren wurde verwendet, um ein funktionelles Tryptophan-Biosynthese-Operon in trp-defizienten E. coli zu konstruieren und zu optimieren, indem einzelne Rekombinationskassetten oder trpA-E-Gene zusammen mit regulatorischen Elementen mit dem Integron-System geliefert wurden. [3] [ Seite benötigt ]

Y-Ligation-basiertes Mischen (YLBS) Bearbeiten

Dieses Verfahren erzeugt einzelsträngige DNA-Stränge, die eine einzelne Blocksequenz entweder am 5'- oder 3'-Ende, komplementäre Sequenzen in einer Stammschleifenregion und eine D-Verzweigungsregion umfassen, die als Primer-Bindungsstelle für die PCR dient. Äquivalente Mengen von sowohl 5'- als auch 3'-Halbsträngen werden gemischt und aufgrund der Komplementarität in der Stammregion ein Hybrid gebildet. Hybride mit freien phosphorylierten 5'-Enden in 3'-Halbsträngen werden dann mit freien 3'-Enden in 5'-Halbsträngen unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in Gegenwart von 0,1 mM ATP ligiert. Die ligierten Produkte werden dann durch zwei Arten von PCR amplifiziert, um Prä-5'-Halb- und Prä-3'-Halb-PCR-Produkte zu erzeugen. Diese PCR-Produkte werden über Avidin-Biotin-Bindung an das 5'-Ende der Prims, die biotinmarkierte Stammsequenzen enthalten, in Einzelstränge umgewandelt. Als nächstes werden biotinylierte 5'-Halbstränge und nicht-biotinylierte 3'-Halbstränge als 5'- und 3'-Halbstränge für den nächsten Y-Ligationszyklus verwendet. [3] [ Seite benötigt ]

Semi-rationales Design verwendet Informationen über die Sequenz, Struktur und Funktion eines Proteins in Verbindung mit prädiktiven Algorithmen. Zusammen werden diese verwendet, um Zielaminosäurereste zu identifizieren, die am wahrscheinlichsten die Proteinfunktion beeinflussen. Mutationen dieser Schlüsselaminosäurereste erzeugen Bibliotheken mutierter Proteine, die mit größerer Wahrscheinlichkeit verbesserte Eigenschaften aufweisen. [6]

Fortschritte im semi-rationalen Enzym-Engineering und de novo-Enzymdesign bieten Forschern leistungsstarke und effektive neue Strategien zur Manipulation von Biokatalysatoren. Die Integration von sequenz- und strukturbasierten Ansätzen in das Bibliotheksdesign hat sich als guter Leitfaden für das Enzym-Redesign erwiesen. Im Allgemeinen sind aktuelle rechnerische De-novo- und Redesign-Methoden nicht mit weiterentwickelten Varianten in der katalytischen Leistung vergleichbar. Obwohl eine experimentelle Optimierung durch gerichtete Evolution möglich ist, werden weitere Verbesserungen der Genauigkeit von Strukturvorhersagen und eine größere katalytische Fähigkeit durch Verbesserungen der Designalgorithmen erreicht. Weitere funktionelle Verbesserungen können durch die Integration der Proteindynamik in zukünftige Simulationen einbezogen werden. [6]

Biochemische und biophysikalische Studien werden zusammen mit der Feinabstimmung prädiktiver Rahmenbedingungen nützlich sein, um die funktionelle Bedeutung einzelner Designmerkmale experimentell zu bewerten. Ein besseres Verständnis dieser funktionalen Beiträge wird dann Feedback für die Verbesserung zukünftiger Designs geben. [6]

Die gerichtete Evolution wird wahrscheinlich nicht als Methode der Wahl für das Protein-Engineering abgelöst werden, obwohl das computergestützte Proteindesign die Art und Weise, wie Protein-Engineering Bio-Makromoleküle manipulieren kann, grundlegend verändert hat. Kleinere, fokussiertere und funktionsreichere Bibliotheken können durch die Verwendung von Verfahren erzeugt werden, die prädiktive Rahmen für hypothesengesteuertes Protein-Engineering beinhalten. Neue Designstrategien und technische Fortschritte haben eine Abkehr von traditionellen Protokollen wie der gerichteten Evolution eingeleitet, die die effektivste Strategie zur Identifizierung leistungsstärkster Kandidaten in fokussierten Bibliotheken darstellt. Die Synthese ganzer Genbibliotheken ersetzt Shuffling- und Mutageneseprotokolle für die Bibliotheksvorbereitung. Auch hochspezifische Screening-Assays mit niedrigem Durchsatz werden zunehmend anstelle monumentaler Screening- und Selektionsbemühungen von Millionen von Kandidaten eingesetzt. Zusammen sind diese Entwicklungen bereit, das Protein-Engineering über die gerichtete Evolution hinaus in Richtung praktischer, effizienterer Strategien für die maßgeschneiderte Biokatalysatoren zu führen. [6]

Nachdem ein Protein eine gerichtete Evolution, ein Rationsdesign oder ein Semirationsdesign durchlaufen hat, müssen die Bibliotheken mutierter Proteine ​​gescreent werden, um zu bestimmen, welche Mutanten verbesserte Eigenschaften aufweisen. Phagen-Display-Methoden sind eine Option zum Screenen von Proteinen. Dieses Verfahren beinhaltet die Fusion von Genen, die die varianten Polypeptide kodieren, mit Phagen-Hüllprotein-Genen. Auf Phagenoberflächen exprimierte Proteinvarianten werden durch Bindung mit immobilisierten Zielen in vitro selektiert. Phagen mit ausgewählten Proteinvarianten werden dann in Bakterien amplifiziert, gefolgt von der Identifizierung positiver Klone durch einen enzymgekoppelten Immunadsorptionstest. Diese ausgewählten Phagen werden dann einer DNA-Sequenzierung unterzogen. [3] [ Seite benötigt ]

Zelloberflächen-Display-Systeme können auch verwendet werden, um mutierte Polypeptidbibliotheken zu screenen. Die mutierten Gene der Bibliothek werden in Expressionsvektoren eingebaut, die dann in geeignete Wirtszellen transformiert werden. Diese Wirtszellen werden weiteren Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz unterzogen, um die Zellen mit den gewünschten Phänotypen zu identifizieren. [3] [ Seite benötigt ]

Zellfreie Anzeigesysteme wurden entwickelt, um die in vitro Proteintranslation oder zellfreie Translation. Diese Methoden umfassen mRNA-Display, Ribosomen-Display, kovalente und nicht-kovalente DNA-Displays und in vitro Kompartimentierung. [3] : 53

Enzym-Engineering Bearbeiten

Enzym-Engineering ist die Anwendung der Modifizierung der Struktur eines Enzyms (und damit seiner Funktion) oder des Modifizierens der katalytischen Aktivität isolierter Enzyme, um neue Metaboliten zu produzieren, neue (katalysierte) Reaktionswege zu ermöglichen [7] oder von einige bestimmte Verbindungen in andere (Biotransformation). Diese Produkte sind nützlich als Chemikalien, Pharmazeutika, Kraftstoffe, Nahrungsmittel oder landwirtschaftliche Zusatzstoffe.

Ein Enzymreaktor [8] besteht aus einem Gefäß, das ein Reaktionsmedium enthält, das verwendet wird, um eine gewünschte Umsetzung auf enzymatischem Wege durchzuführen. In diesem Verfahren verwendete Enzyme sind in der Lösung frei.

Computermethoden wurden verwendet, um ein Protein mit einer neuartigen Faltung namens Top7 [9] und Sensoren für nichtnatürliche Moleküle zu entwerfen. [10] Die Entwicklung von Fusionsproteinen hat Rilonacept hervorgebracht, ein Arzneimittel, das die Zulassung der Food and Drug Administration (FDA) zur Behandlung des Cryopyrin-assoziierten periodischen Syndroms erhalten hat.

Eine andere Computermethode, IPRO, führte erfolgreich zum Umschalten der Cofaktor-Spezifität der Candida boidinii-Xylose-Reduktase. [11] Iterative Protein Redesign and Optimization (IPRO) entwickelt Proteine ​​neu, um native oder neuartige Substrate und Cofaktoren zu erhöhen oder ihnen Spezifität zu verleihen. Dies geschieht durch wiederholtes zufälliges Stören der Struktur der Proteine ​​um bestimmte Designpositionen herum, Identifizieren der energieärmsten Kombination von Rotameren und Bestimmen, ob das neue Design eine niedrigere Bindungsenergie als die vorherigen hat. [12]

Computergestütztes Design wurde auch verwendet, um komplexe Eigenschaften einer hochgeordneten Nanoproteinanordnung zu entwickeln. [13] Ein Proteinkäfig, E. coli Bacterioferritin (EcBfr), der natürlicherweise strukturelle Instabilität und ein unvollständiges Selbstorganisationsverhalten zeigt, indem er zwei Oligomerisierungszustände besetzt, ist das Modellprotein in dieser Studie. Durch computergestützte Analyse und Vergleich mit seinen Homologen wurde festgestellt, dass dieses Protein eine überdurchschnittliche dimere Grenzfläche auf seiner zweizähligen Symmetrieachse aufweist, hauptsächlich aufgrund der Existenz einer Grenzflächen-Wassertasche, die auf zwei wasserverbrückten Asparaginresten zentriert ist . Um die Möglichkeit zu untersuchen, EcBfr für eine modifizierte strukturelle Stabilität zu entwickeln, wird eine semiempirische Berechnungsmethode verwendet, um die Energieunterschiede der 480 möglichen Mutanten an der dimeren Grenzfläche relativ zum Wildtyp-EcBfr virtuell zu untersuchen. Diese Computerstudie konvergiert auch bei den wasserverbrückten Asparaginen. Das Ersetzen dieser beiden Asparagine durch hydrophobe Aminosäuren führt zu Proteinen, die sich zu alpha-helikalen Monomeren falten und sich zu Käfigen zusammenfügen, wie durch Circulardichroismus und Transmissionselektronenmikroskopie nachgewiesen wird. Sowohl die thermische als auch die chemische Denaturierung bestätigen, dass alle neu gestalteten Proteine ​​in Übereinstimmung mit den Berechnungen eine erhöhte Stabilität aufweisen. Eine der drei Mutationen verschiebt die Population zugunsten des Oligomerisierungszustands höherer Ordnung in Lösung, wie sowohl durch Größenausschlusschromatographie als auch durch native Gelelektrophorese gezeigt wird. [13]

EIN in silico Methode, PoreDesigner, [14] wurde erfolgreich entwickelt, um das bakterielle Kanalprotein (OmpF) umzugestalten, um seine Porengröße von 1 nm auf jede gewünschte Sub-nm-Dimension zu reduzieren. Transportexperimente an den engsten gestalteten Poren zeigten eine vollständige Salzabweisung beim Zusammenbau in biomimetischen Blockpolymer-Matrizen.


Einführung

Aneuploidie führt zu einem „unausgeglichenen“ Genom, in dem Chromosomen oder Chromosomenstücke fehlen oder überzählig sind. Die Erkrankung hat einen tiefgreifenden Einfluss auf die zelluläre und organismische Fitness (Übersicht in Torres et al., 2008 Williams und Amon, 2009). Beim Menschen ist Aneuploidie die häufigste Ursache für geistige Behinderung und spontane Fehlgeburten und ein Schlüsselmerkmal von Krebs, wobei schätzungsweise 70–90% aller menschlichen soliden Tumoren aneuploide Genome beherbergen (siehe Kasten 1 für ein Glossar der Begriffe) (Weaver und Cleveland, 2006 Duijf und Benezra, 2013). Neuere Studien haben auch einen Zusammenhang zwischen Aneuploidie und Altern aufgezeigt, insbesondere dass eine Zunahme der Aneuploidie mit vorzeitigem Altern und verkürzter Lebensdauer verbunden ist (Baker et al., 2004 Baker et al., 2008 Wijshake et al., 2012 Baker et al., 2013 ).

Aneuploid: Chromosomengehalt, der kein ganzes Vielfaches des haploiden komplement-unausgeglichenen Karyotyps ist.

Zentrosom: Zellorganelle, aus der Mikrotubuli nukleieren.

Euploid: verwandter Chromosomengehalt ausgeglichener Karyotyp.

Genkopienummer: wie oft ein Gen in einem Genom vorhanden ist.

Gendosiskompensation: die Veränderung der mRNA- oder Proteinexpression, um Variationen in der DNA-Kopienzahl zu kompensieren.

Reaktion auf Hitzeschock: Transkriptionsreaktion, die durch einen Temperaturanstieg ausgelöst wird.

Proteotoxizität: Behinderung der Zellfunktion durch abweichende oder falsch gefaltete Proteine.

Kontrollpunkt der Spindelmontage: Überwachungsmechanismus, der das Fortschreiten des Zellzyklus stoppt, bis alle Chromosomen an der Spindel befestigt sind.

Entfaltete Proteinantwort: Transkriptionsreaktion, die aus fehlgefalteten Proteinen im endoplasmatischen Retikulum resultiert.

Systematische Analysen von aneuploiden Hefe-, Maus- und Humanzellen sowie Studien an Krebszelllinien legen nahe, dass Aneuploidie chromosomenspezifische Effekte verursacht, die durch die erhöhte (oder verringerte) Kopienzahl einzelner Gene und/oder Kombinationen einer kleinen Zahl ausgelöst werden von Genen auf dem aneuploiden Chromosom (Tang und Amon, 2013). Veränderungen der Genkopienzahl von Regulatoren der Genexpression führen zu weiteren Störungen der Zellfunktion. Studien an aneuploiden knospenden Hefen, Säugetierzelllinien, Fliegen und Pflanzen haben eine Reihe von Phänotypen ergeben, die für Aneuploidie repräsentativ sind.Zu diesen Phänotypen gehören eine Zellzyklusverzögerung bei G1 (Torres et al., 2007 Stingele et al., 2012 Thorburn et al., 2013), metabolische Veränderungen (Williams et al., 2008 Li et al., 2010), genomische Instabilität ( Sheltzer et al., 2011 Zhu et al., 2012) und Proteotoxizität (Torres et al., 2007 Tang et al., 2011 Oromendia et al., 2012 Stingele et al., 2012). Darüber hinaus weisen die meisten bisher untersuchten aneuploiden Zellen eine mit langsamem Wachstum und Stress verbundene Transkriptionssignatur auf (Torres et al., 2007 Sheltzer et al., 2012 Stingele et al., 2012 Foijer et al., 2013). In Drosophila, erfolgt die Aktivierung der Stresskinase Jun N-terminale Kinase (JNK) in Epithelzellen nach Chromosomenfehlsegregation (Dekanty et al., 2012). In ähnlicher Weise verursacht eine Chromosomenfehlsegregation bei Säugetieren die Aktivierung der Stresskinase p38 und des stressinduzierten Transkriptionsfaktors p53 (Li et al., 2010 Thompson und Compton, 2010 Janssen und Medema, 2011). Es ist wichtig, die Ursprünge dieser Phänotypen zu verstehen, da dies Einblicke in die Auswirkungen der Chromosomenfehlsegregation und des daraus resultierenden unausgeglichenen Karyotyps auf die normale Zellphysiologie und Krankheitszustände geben könnte. Hier geben wir unsere Perspektive auf einen der auffälligsten Aneuploidie-assoziierten Phänotypen: Proteotoxizität, dh einen Zustand, in dem die Proteinqualitätskontrollmaschinerie der Zelle (Proteinchaperone, Autophagie oder das Ubiquitin-Proteasom-System) nicht -funktionell oder überfordert, was zu falsch gefalteten Proteinen führt. Wir werden zunächst zusammenfassen, wie Aneuploidie proteotoxischen Stress verursacht und dann diskutieren, wie dieser Aspekt der Aneuploidie zu menschlichen Krankheiten und dem Alterungsprozess beitragen könnte.


Gesundheitszustände im Zusammenhang mit genetischen Veränderungen

Multiple epiphysäre Dysplasie

Mehr als 20 Mutationen im KOMP Gen, das eine dominante multiple epiphysäre Dysplasie verursacht, wurden identifiziert. Diese Störung kann auch durch Mutationen in vier anderen Genen verursacht werden, jedoch haben die meisten Menschen Mutationen in den KOMP Gen.

Mutationen im KOMP Gene, die eine dominante multiple epiphysäre Dysplasie verursachen, verändern einen Proteinbaustein (Aminosäure) oder führen zu kleinen Additionen oder Deletionen von Aminosäuren im COMP-Protein. Alle identifizierten Mutationen sind in zwei Regionen des COMP-Proteins aufgetreten, die als Typ III- und C-terminale Domänen bezeichnet werden. KOMP Mutationen führen zur falschen Faltung des COMP-Proteins im endoplasmatischen Retikulum, einer Struktur in der Zelle, die an der Proteinverarbeitung und dem Proteintransport beteiligt ist. Das abnorme COMP-Protein kann das endoplasmatische Retikulum nicht verlassen, wodurch sich diese Zellstruktur vergrößert. Das endoplasmatische Retikulum wird schließlich so groß, dass es nicht mehr normal funktionieren kann und der Chondrozyten stirbt. Der vorzeitige Tod von Chondrozyten führt zu vermindertem Wachstum der langen Röhrenknochen und Minderwuchs.

Forscher glauben, dass das Fehlen von COMP-Protein in den Räumen zwischen den Chondrozyten zur Bildung von abnormalem Knorpel führt. Dieser abnorme Knorpel bricht wahrscheinlich leicht ab, was zu einer früh einsetzenden Arthrose führt.

Pseudoachondroplasie

Etwa 60 Mutationen im KOMP Gen wurden bei Personen mit Pseudoachondroplasie identifiziert. Eine bestimmte Mutation findet sich bei etwa 30 Prozent der Betroffenen. Diese Mutation führt zur Deletion einer einzelnen Aminosäure, genannt Asparaginsäure, im COMP-Protein. Diese Genmutation wird normalerweise als 469delD oder D469del geschrieben. Die meisten anderen KOMP Genmutationen beinhalten die Substitution einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure im COMP-Protein.

Mutationen im KOMP Gen, das Pseudoachondroplasie verursacht, führt auch zum Aufbau von COMP-Protein im endoplasmatischen Retikulum und schließlich zum Tod der Chondrozyten. Es ist nicht klar, warum einige Mutationen in der KOMP Gen verursachen Pseudoachondroplasie und andere Mutationen verursachen dominante multiple epiphysäre Dysplasie.


Diskussion

In dieser Studie haben wir eine Methode vorgeschlagen, um spezifitätsbestimmende Reste in Proteinen zu identifizieren. Wir haben es auf eine der größten Familie bakterieller Transkriptionsfaktoren angewendet und eine Reihe von mutmaßlichen spezifitätsbestimmenden Resten erhalten. Die Kartierung dieser Reste auf eine Proteinstruktur zeigte, dass die meisten identifizierten Reste zu zwei räumlichen Clustern gehören. Reste eines Clusters binden die DNA, während Reste des anderen Clusters eine Ligandentasche des Proteins bilden. Dieser Befund stimmt mit der Funktion von Transkriptionsfaktoren dieser Familie überein: Sie unterdrücken die Transkription durch Bindung der DNA und setzen die Transkription frei, wenn ein bestimmter Ligand vorhanden ist. (Umgekehrt binden einige Proteine ​​der Familie, z. B. PurR, die DNA nur, wenn der Ligand vorhanden ist). Paraloge Proteine ​​dieser Familie unterscheiden sich in den Liganden, die sie erkennen, und in den DNA-Stellen, an denen sie binden. Daher bestimmen vermutlich zwei Cluster von Resten, die durch unser Verfahren gefunden wurden, die Spezifität dieser beiden Erkennungsprozesse.

Unsere Analyse legte die Reste 15, 16 und 55 als primäre Determinanten der DNA-Bindungsspezifität nahe. Die Rolle der Positionen 15, 16 und 55 bei der spezifischen DNA-Erkennung geht aus einer Reihe von Mutantenexperimenten hervor [31, 32, 33]. Eine umfangreiche ortsgerichtete Mutagenese der zweiten Helix von LacI zeigte, dass die Reste 15 und 16 für die DNA-Bindungsspezifität essentiell sind [37]. Wenn TYR15 und GLN16 von LacI zu den an diesen Positionen in den Paralogen vorhandenen Resten (malI, rafR, cytR usw.) mutiert wurden, waren die Mutanten vorzugsweise Bindungsoperatoren der jeweiligen Paraloge. Wenn GalR so mutiert wurde, dass es die Reste von LacI in den Positionen 15 und 16 aufwies, war der mutierte GalR in ähnlicher Weise spezifisch Bindungsstellen von LacI. Diese Experimente unterstützen stark unser Ergebnis, dass die Positionen 15 und 16 für die Bestimmung der DNA-Bindungsspezifität in Proteinen der LacI-Familie verantwortlich sind. Ein weiterer Rest, der durch unsere Analyse gefunden wurde, ist Rest 55. Obwohl 55 DNA in der kleinen Furche bindet, erwies sich dieser Rest als kritisch für die DNA-Erkennung durch PurR [33]. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass eine Dreifachmutante (15, 16 und 55) eine höhere Spezifität und Affinität zu paralogen Operatoren aufweisen sollte.

Nach unserem besten Wissen waren Reste, die in der Ligandenbindungsdomäne identifiziert wurden (außer 146), noch nicht Gegenstand von Protein-Engineering-Studien. Obwohl gezeigt wurde, dass Mutationen mehrerer anderer Reste die Ligandenbindung stören, ist nicht klar, wie sie die Spezifität (im Gegensatz zur Affinität) der Ligandenerkennung beeinflussen. Es wurde gezeigt, dass die meisten Mutationen in der Region die Affinität drastisch reduzieren. Unsere Analyse schlägt Wege vor, eine rationale Neugestaltung der Ligandenbindungsspezifität durchzuführen. Man kann einige oder alle der umrissenen Reste von einem Paralog zu LacI "transplantieren" und die Bindungskonstanten der Mutante für verschiedene Liganden messen, die normalerweise von diesem Paralog gebunden werden. Die Hauptfrage unserer Studie ist, ob die Spezifität durch Änderung einer kleinen Menge der vorhergesagten Reste neu gestaltet werden kann.

Eine weitere mögliche Anwendung der mutmaßlichen Spezifitätsdeterminanten ist die gezieltere Vorhersage der DNA-Bindungsspezifität. Anstatt alle Wechselwirkungen zwischen DNA und Protein zu berücksichtigen, kann man sich auf die Wechselwirkungen konzentrieren, die durch die Spezifitätsdeterminanten gebildet werden. Dieser Ansatz ist Gegenstand unserer aktuellen Forschung.

Der wichtigste Teil des vorgestellten Algorithmus ist das Verfahren zur Berechnung der statistischen Signifikanz der gegenseitigen Informationen. Spezifitätsdeterminanten wurden als Reste mit sowohl hohem ich und sehr niedrig PI). Beachten Sie, dass die Auswahl nach hoch ich allein würde einen ganz anderen (und sehr großen) Satz von Resten ergeben (siehe Abb. 1, gefüllte Kreise). Die meisten dieser Rückstände haben keinen statistisch signifikanten Zusammenhang mit der Gruppierung (P(ich) 1). Diese Beobachtung unterstreicht die Bedeutung statistischer Tests in unserer Analyse.

Obwohl vielversprechend, hat unsere Analyse ihre Grenzen. Es stützt sich stark auf die Gruppierung von Proteinen nach Orthologie. Um die Orthologie aufzulösen, benötigt man (fast) vollständige Genome mehrerer eng verwandter Organismen. Dies macht unsere Analyse erheblich datenintensiv. Selbst wenn vollständige Genome verfügbar sind, kann die Orthologie möglicherweise nicht leicht aufgelöst werden, wenn sehr ähnliche Paraloge vorhanden sind oder wenn Genome zu stark voneinander abweichen. Unsere Analyse geht auch davon aus, dass Orthologe die gleiche Funktion und Spezifität haben. Dies gilt wahrscheinlich für evolutionär nahe Organismen, bei denen Orthologe nicht genug evolutionäre Zeit hatten, um in der Spezifität zu divergieren. Eine Möglichkeit, diese Fallstricke zu vermeiden, besteht darin, Proteine ​​zu verwenden, deren konservierte Spezifität experimentell verifiziert oder durch unabhängige genomische Positions- oder Regulierungsanalysen bestätigt wurde. Bei genomisch aufgelösten Orthologen muss man sich auf die statistische Signifikanz verlassen, PI). Wenn ein Datensatz mit falschen Orthologen oder Orthologen mit abweichender Spezifität "kontaminiert" ist, hätten keine Rückstände niedrige PI).

Unsere Analyse beruht auch auf der Annahme, dass die gleichen Reste die Spezifität von Paralogen bestimmen. Über die räumliche Lage der Spezifitätsdeterminanten ist wenig bekannt. Es ist jedoch bekannt, dass Reste des aktiven Zentrums eine sehr konservierte räumliche Position in den Familien homologer Proteine ​​haben. Aktive Sites haben die gleiche räumliche Position, selbst wenn die Ähnlichkeit zwischen den Sequenzen nur 10 % beträgt. Proteine ​​der TIM-Fass- und Flavodoxin-Faltung haben beispielsweise "Super-Sites", d. h. aktive Zentren an derselben räumlichen Stelle, obwohl die Aminosäuren, die die Stellen bilden, und die biochemische Funktion dieser Proteine ​​stark divergiert sind [38, 39]. Diese extreme Erhaltung der räumlichen Lage funktionell entscheidender Reste unterstützt die Annahme einer gemeinsamen Lage der Spezifitätsdeterminanten. Da die meisten Orthologe und nahen Paraloge eine hohe Sequenzähnlichkeit aufweisen, weisen Reste, die in den multiplen Sequenzausrichtungen übereinstimmen, wahrscheinlich eine gemeinsame räumliche Position auf. Die Erkennung von Molekülen unterschiedlicher Form (Liganden, Proteingrenzflächen) kann jedoch unterschiedliche Wechselwirkungen beinhalten und daher kann eine variable räumliche Lage der Spezifitätsreste nicht ausgeschlossen werden. Der direkteste Test unserer Annahme wäre, die oben vorgeschlagenen Experimente durchzuführen. Die Berechnung der statistischen Signifikanz ist auch ein interner Test unserer Methode. Wenn sich Sätze von Resten, die die Spezifitäten von Paralogen bestimmen, unterscheiden, wird unsere Methode eine Überlappung zwischen diesen Sätzen mit niedrigem identifizieren PI). Wenn sich die Sätze nicht überlappen, hätten keine Reste im Wesentlichen niedrige PI).

Wie aus Tabelle 2 der ergänzenden Informationen ersichtlich ist, kann unser Verfahren im Gegensatz zu anderen Verfahren bestimmte Substitutionen innerhalb einer Gruppe von Orthologen tolerieren. Es wird jedoch angenommen, dass alle Aminosäuren in ihren Eigenschaften gleich verschieden sind. Mit anderen Worten, Substitutionen ichL und ichh werden gleich behandelt, während die Änderung der physikalischen Eigenschaften von Aminosäuren in Wirklichkeit von der Art der Substitutionen abhängt. Wir entwickeln derzeit eine Methode zur Identifizierung von Spezifitätsdeterminanten mit unterschiedlicher räumlicher Lage, die auch physikalische Eigenschaften von Aminosäuren berücksichtigt.

Hier haben wir eine Methode vorgeschlagen, um Reste zu finden, die die Spezifität der Proteinerkennung bestimmen. Die Methode basiert auf der Unterscheidung zwischen orthologen und paralogen Proteinen und nutzt mehrere vollständige Bakteriengenome, um sie zu identifizieren. Das Verfahren erfordert keine gelöste 3D-Struktur eines Proteins, um Spezifitätsdeterminanten vorherzusagen. Die Analyse einer großen LacI-Familie bakterieller Transkriptionsfaktoren ergab zwei Gruppen von Resten als mutmaßliche DNA-bindende und Liganden-bindende Spezifitätsdeterminanten. Vorhersagen der DNA-bindenden Reste werden durch die früheren experimentellen Ergebnisse stark gestützt. Die Ergebnisse unserer Analyse deuten auf gezielte Protein-Engineering-Experimente hin, die auf eine rationale Neugestaltung der Proteinspezifität abzielen.


Schau das Video: Transcription and Translation: From DNA to Protein - Explained in Tamil (Januar 2022).