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Wie verdünnt man Vorwärts- und Rückwärtsprimer für einen Mastermix?


Ich entschuldige mich für die sehr naive Frage, aber ich beginne gerade in einem Biologielabor der High School und bin sehr verwirrt. Wenn ich Vorräte von 100μM für Vorwärts- und Rückwärtsprimer getrennt habe, kann ich diese sehr leicht auf 10μM verdünnen. Aber was ist, wenn ich einen Mastermix erstellen möchte? Ich habe 1000μL von 10μM für jeden Primer, vorwärts und rückwärts (nicht gemischt). Würde ich einfach 500μl meines Vorwärtsprimers und 500μl meines Rückwärtsprimers für eine Mischung von 1000μl hinzufügen, in der beide Konzentrationen immer noch 10μM sind?


Würde ich einfach 500μl meines Vorwärtsprimers und 500μl meines Rückwärtsprimers für eine Mischung von 1000μl hinzufügen, in der beide Konzentrationen immer noch 10μM sind?

Nein. Wenn Sie Ihre 10 μM-Lösung halbieren, halbiert sich die Konzentration. Das Mischen gleicher Teile von 10 μM Primer ergibt einen Mastermix, bei dem jeder Primer 5 μM . enthält

Im Allgemeinen werden diesen Reaktionen jedoch im großen Überschuss Primer zugesetzt, sodass 5 μM Primer in Ordnung sein können.


Vorbereitung eines PCR-Mastermix

Heute musste ich die richtigen Konzentrationen für einen PCR-Mastermix herausfinden.

Wir werden zwei Primer-Sets verwenden, also 2 Master-Mixes herstellen, die in 10 Röhrchen gehen.

Wir haben drei verschiedene DNA-Proben: BW (Kontrolle), 9916Bxx und 9916Bx. Beim dritten führen wir drei Tests mit 1x DNA, 1/10x DNA und 1/100x durch. Dazu muss die DNA verdünnt werden.

Der erste Schritt bei der Herstellung eines Mastermixes ist das Verdünnen der Primer. Sie kommen in 100 μM Vorratskonzentrat, und wir müssen es auf 10 μM verdünnen, damit Sie 10 μl des Vorwärts- und 10 μl des Rückwärtsgangs in 80 μl H2O geben. Dann nimmst du 1μL des neu verdünnten Primers und gibst ihn in deinen Mastermix. Sie haben 1μL / 50μL, also am Ende 0,2μM Primer. Sie müssen auch 25 μl des Taq-Mixes, 1 μl der Template-DNA und 23 μl H2O hinzufügen, um einen Gesamt-Mastermix von 50 μl herzustellen. Wir werden dies auch für die andere Grundierung tun. JEDOCH, wenn Sie den Mastermix erstellen, können Sie die DNA noch nicht einfügen.

Wir werden die beiden Mastermixe so lange herstellen, bis sie ein Volumen von 49 μL haben und keine Template-DNA aufweisen. Dann geben wir 49 μl in jedes Röhrchen, insgesamt 10 Röhrchen. In die ersten 3 jedes Sets von 5 Röhrchen wird die DNA 1x hinzugefügt. Dies bedeutet, dass Sie einfach 1 μL der DNA hinzufügen. Für 1/10x nimmst du 10μL der 1x DNA, füge sie zu 90μL Wasser hinzu, um 1/10x zu erhalten. Davon nimmst du 10μl und gibst sie 1/100x in 90μl Wasser.

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Unsere Top 10 Tipps für eine konsistente qPCR

qPCR erfordert ein gewisses Maß an technischer Finesse, um konsistente Daten über Experimente hinweg sicherzustellen. Die größten Herausforderungen beim Einstieg in diese Technik sind Kontaminationsprobleme oder Inkonsistenzen zwischen den Replikaten. Die Kosten für die Durchführung von qPCR sind viel höher als bei Endpunkt-PCR, daher kann es auch für Ihr Laborbudget entscheidend sein, jedes Experiment richtig zu machen.

Nachfolgend finden Sie unsere Top-10-Tipps, die Ihnen helfen, jedes Mal konsistente qPCR-Daten zu erhalten!

1. Mischen Sie die Reagenzien immer gut vor Gebrauch

qPCR-Reagenzien umfassen Farbstoffe, Nukleotide und Enzyme, die sich im Gefrierschrank oder Kühlschrank absetzen können. Stellen Sie sicher, dass Sie Ihre einzelnen Reagenzien gründlich mischen, bevor Sie Ihren Mastermix vorbereiten. Pipettieren Sie Ihren Mastermix ebenfalls gründlich, bevor Sie ihn in Ihre Platte oder Röhrchen aliquotieren, um eine ungleichmäßige Verteilung der Reagenzien zwischen den Reaktionen zu vermeiden.

2. Lagern Sie Primer in einem Puffer, um ihre Stabilität zu schützen

Wenn Ihre Grundierungen ankommen, vermeiden Sie es, den Masterstock in Wasser zu resuspendieren. Der pH-Wert von Wasser kann niedrig sein (insbesondere wenn es mit DEPC behandelt wurde), was mit der Zeit zu einer Verschlechterung der Grundierung führt. Verwenden Sie stattdessen eine gepufferte Lösung mit neutralem pH-Wert, um Ihre Primer vor Säurehydrolyse zu schützen. Tris-EDTA (TE) ist eine häufige Wahl. Die EDTA (1 mM) hemmt die potenzielle DNAse-Aktivität, und wenn Sie die Primer für Arbeitsstammlösungen verdünnen, sollte die EDTA ausreichend verdünnt werden, um keine Beeinträchtigungen zu verursachen Taq Polymerase-Aktivität.

3. Aliquotieren Sie die Primer

Sobald Sie einen Masterstock (normalerweise 100-200 mM) haben, sollten Sie Arbeitsstocks herstellen, um mehrere Einfrier-/Auftauzyklen Ihrer ursprünglichen Primerlösung zu vermeiden. Bereiten Sie diese Arbeitsmaterialien (10-20 mM) in TE-Puffer in Mengen vor, die Ihren Anforderungen entsprechen. Beschränken Sie sich auf drei Einfrier-/Auftauzyklen dieser Arbeitsbestände. Wiederholtes Einfrieren/Auftauen kann zum Abbau des Primers führen, was sich negativ auf Ihre qPCR-Ergebnisse auswirken kann, z. reduzierte qPCR-Effizienz und reduzierte Empfindlichkeit.

Die Vorbereitung von Aliquots hilft Ihnen auch bei einer Primer-Kontamination. Wenn Sie versehentlich ein Fläschchen mit Primer kontaminieren, können Sie es wegwerfen und ein neues nehmen, ohne sich Sorgen über eine Kontamination des Master-Fläschchens machen zu müssen.

4. Verwenden Sie für geringe Volumina kalibrierte Pipetten

Wenn Sie bei der Quantifizierung absolute Genauigkeit benötigen, verwenden Sie zur Vorbereitung Ihrer Standardkurven und qPCR-Reaktionen Pipetten, die für das Pipettieren mit geringem Volumen (wie P2 oder P10) kalibriert sind.

Die Verwendung der richtigen Pipetten gewährleistet die Reproduzierbarkeit zwischen den Replikaten. Dies ist wichtig, wenn Sie die qPCR-Effizienz basierend auf Standardkurven messen, da Sie sicher sein müssen, dass Sie die qPCR-Effizienz tatsächlich messen und nicht Ihre Pipettierfähigkeiten. Stellen Sie außerdem sicher, dass Ihre Pipetten genau sind, bevor Sie beginnen!

5. Führen Sie eine Standardkurve für jedes neue Primerpaar durch

Gehen Sie nicht davon aus, dass jeder Satz Primer, den Sie bestellen, genauso gut funktioniert wie der letzte. Die qPCR-Effizienz kann durch eine Reihe von Faktoren beeinflusst werden. Die beste Vorgehensweise besteht darin, eine 5-Punkt-Standardkurve mit 10-facher Verdünnung für jedes neue Primerpaar zu erstellen und sicherzustellen, dass Sie mit Kontroll-DNA eine qPCR-Effizienz von mindestens 90 % erzielen.

6. Befolgen Sie die Drei-Zimmer-Regel

Eine der größten Kontaminationsquellen ist die Verwendung derselben Pipetten für alle Teile des qPCR-Workflows, d. h. DNA-Extraktion, PCR und PCR-Produkthandhabung nach dem Lauf. Dies ist nicht ratsam, selbst wenn Sie ständig aerosolbeständige Spitzen verwenden. Verwenden Sie für die qPCR immer einen Satz Pipetten, der ausschließlich für die Einrichtung der qPCR-Reaktion bestimmt ist.

Zusätzlich zur Verwendung dieser speziellen Pipetten sollten Sie sie von dem Raum fernhalten, der für die DNA/RNA-Extraktion verwendet wird. Die ideale Einrichtung besteht aus drei Räumen, einer für die Nukleinsäureextraktion, einer für die Reaktionseinrichtung (mit einer Haube mit einer UV-Lampe zur Vorbehandlung von Pipetten und Kunststoffen zwischen den Benutzern) und einer für den qPCR-Cycler.

Dies ist der sicherste Weg, das Kontaminationsrisiko Ihrer Negativkontrollen zu minimieren.

7. Überprüfen Sie die Radfahrbedingungen noch einmal

Dies ist wichtig, wenn Sie ein gemeinsam genutztes Instrument verwenden. Auch wenn Sie Ihre eigene Vorlagendatei eingerichtet haben, überprüfen Sie Ihren Laufzyklus, bevor Sie auf Start klicken. Möglicherweise hat jemand ohne Ihr Wissen kleine Änderungen an Ihrer Zyklusvorlage (z. B. Glühtemperatur, Heißstart-Aktivierungszeit) vorgenommen.

8. Verdünnen Sie die Vorlage (weniger kann mehr sein)

Abhängig von den interessierenden Genen könnte es sein, dass Sie tatsächlich mit zu viel Vorlage beginnen. qPCR ist so empfindlich, dass weniger Template oft eine genauere Messung liefert.

Idealerweise möchten Sie, dass Ihre Proben die Zyklusschwelle zwischen den Zyklen 20-30 überschreiten. Proben, die den Schwellenwert vor Zyklus 15 überschreiten, fallen bei den meisten Geräten in die Standard-Basislinieneinstellung, und dies führt zu einer Subtraktion des Fluoreszenzsignals von anderen Proben im Lauf. Sie können dies beheben, indem Sie die Grundlinieneinstellung anpassen, aber wenn Sie mit Ihrem Instrument nicht vertraut sind, müssen Sie möglicherweise den technischen Kundendienst um Hilfe bitten.

Wenn die Probe aus dem Reinigungsschritt Inhibitoren enthielt (z. B. Guanidinsalze oder Ethanol), minimiert die Verdünnung der Probe deren Auswirkungen auf die Ergebnisse und erhöht Ihre Chancen, Ihr Ziel genau zu quantifizieren.

Der beste Ansatz für eine neue Probe besteht darin, eine Standardkurve zu erstellen – sogar nur eine 3-Punkt-Verdünnungsreihe –, um die Templatkonzentration zu bestimmen, die zu einem C . führtQ innerhalb des Bereichs Ihrer qPCR-Effizienz-Standardkurve.

9. Machen Sie Verdünnungen frisch

Nukleinsäuren haften an Kunststoff. Wenn Sie also eine Verdünnungsreihe für zukünftige Läufe aufbewahren möchten, müssen Sie verhindern, dass die Nukleinsäuren an den Röhrchenwänden absorbiert werden und sich so im Laufe der Zeit verdünnen.

Sie können dies erreichen, indem Sie eine Trägernukleinsäure wie tRNA verwenden oder speziell behandelte Kunststoffartikel verwenden, die keine Nukleinsäuren binden. Mehrere Hersteller bieten Röhrchen mit geringer Retention oder mit Silikon behandelte Röhrchen an, um dieses Problem zu umgehen.

Wenn Sie Verdünnungen in unbehandelten Röhrchen aufbewahren, sollten Sie vor der Verwendung die konzentriertesten Verdünnungen auf einem Nanodrop erneut überprüfen, um sicherzustellen, dass sie der erwarteten Konzentration entsprechen.

10. Stellen Sie sicher, dass Ihre Daten publikationswürdig sind – Kennen Sie die MIQE-Richtlinien!

Es macht nicht viel Sinn, Zeit, Geld und Energie für die Einrichtung von qPCR aufzuwenden, wenn Sie Ihre Daten nicht veröffentlichen können. Im Jahr 2009 erstellte eine Gruppe britischer Forscher eine Checkliste mit den Mindestinformationen, die für die Veröffentlichung von qPCR-Daten erforderlich sind. Ihr Ziel war es, qPCR-Ansätze zu rationalisieren, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse, die Integrität der wissenschaftlichen Literatur, die Konsistenz zwischen den Labors zu erreichen und die experimentelle Transparenz zu erhöhen (1).

Diese Liste wird als MQE-Richtlinie bezeichnet und sollte Ihre ursprüngliche Manuskripteinreichung bei einer Zeitschrift ergänzen. Die vollständige Offenlegung aller verwendeten Reagenzien, Sequenzen und Analysemethoden ist erforderlich, damit andere Forscher die Ergebnisse reproduzieren können. Weiterhin ist vorgesehen, dass MIQE-Angaben entweder in Kurzform oder als Online-Ergänzungsmaterial veröffentlicht werden.


Ask TaqMan Folge 13 – So funktioniert TaqMan

TaqMan Genotyping Assays (TaqMan® SNP Genotyping Assays und TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays) bestehen aus voroptimierten PCR-Primerpaaren und zwei Sonden zur Alleldiskriminierung .

  • Ein Paar unmarkierter Primer
  • Zwei TaqMan-Sonden (eine mit einem FAM-Farbstoff-Label und eine mit einem VIC-Farbstoff-Label) am 5’-Ende und Minor-Groove-Binder (MGB) und nichtfluoreszierende Quencher (NFQ) am 3’-Ende.

TaqMan-Genotypisierungsassays werden verwendet, um spezifische Allele in genomischer DNA (gDNA) zu amplifizieren und nachzuweisen. Die folgende Abbildung zeigt den TaqMan SNP Genotyping Assay-Prozess.

  1. Genomische DNA wird in ein Reaktionsgemisch bestehend aus TaqMan® Genotyping Master Mix, Vorwärts- und Rückwärtsprimern und zwei TaqMan® MGB-Sonden eingebracht.
  2. Jede TaqMan MGB-Sonde bindet spezifisch an eine komplementäre Sequenz, falls vorhanden, zwischen den Vorwärts- und Rückwärtsprimerstellen. Wenn die Sonde intakt ist, unterdrückt die Nähe des Quencher-Farbstoffs zum Reporter-Farbstoff die Reporter-Fluoreszenz.
  3. Die Exonuklease-Aktivität der AmpliTaq Gold® DNA Polymerase spaltet nur Sonden, die mit dem Ziel hybridisiert sind. Die Spaltung trennt den Reporterfarbstoff vom Quencherfarbstoff, wodurch die Fluoreszenz durch den Reporter erhöht wird. Die Zunahme der Fluoreszenz tritt nur auf, wenn die amplifizierte Zielsequenz komplementär zur Sonde ist. Somit zeigt das durch die PCR-Amplifikation erzeugte Fluoreszenzsignal an, welche Allele sich in der Probe befinden.

TaqMan® Copy Number Assays werden zusammen mit einem TaqMan® Copy Number Reference Assay in einer Duplex-Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Der Kopienzahl-Assay weist das interessierende Zielgen oder die interessierende genomische Sequenz nach, und der Referenz-Assay weist eine Sequenz nach, von der bekannt ist, dass sie in zwei Kopien in einem diploiden Genom vorhanden ist.

A. Ein TaqMan® Copy Number Assay, ein TaqMan® Copy Number Reference Assay, TaqMan® Genotyping Master Mix und eine gDNA-Probe werden in einem einzigen Well oder Röhrchen gemischt.

B. Die gDNA-Matrize wird denaturiert und jeder Satz von Assay-Primern annealt an seine spezifischen Zielsequenzen. Jede TaqMan®-Sonde bindet spezifisch an ihre komplementäre Sequenz zwischen den Vorwärts- und Rückwärtsprimer-Bindungsstellen. Wenn jede Oligonukleotidsonde intakt ist, bewirkt die Nähe des Quencher-Farbstoffs zum Reporter-Farbstoff, dass das Reporter-Farbstoff-Signal gelöscht wird.

C. Während jeder PCR-Runde werden die Ziel- und Referenzsequenzen gleichzeitig durch AmpliTaq® Gold DNA Polymerase amplifiziert. Dieses Enzym hat eine 5'-Nukleaseaktivität, die Sonden spaltet, die an jede Amplikonsequenz hybridisiert sind. Wenn eine Oligonukleotidsonde durch die AmpliTaq Gold DNA Polymerase 5'-Nukleaseaktivität gespalten wird, wird der Quencher vom Reporterfarbstoff getrennt, wodurch die Fluoreszenz des Reporters erhöht wird. Die Akkumulation von PCR-Produkten kann in Echtzeit durch Überwachung des Fluoreszenzanstiegs jedes Reporterfarbstoffs bei jedem PCR-Zyklus nachgewiesen werden.

Dieses Verfahren der relativen Quantifizierung wird verwendet, um die relative Kopienzahl des interessierenden Ziels in einer gDNA-Probe zu bestimmen, normalisiert auf die bekannte Kopienzahl der Referenzsequenz.


Standortgerichtete Mutagenese

Die ortsgerichtete Mutagenese (SDM) ist eine Methode, um spezifische, gezielte Veränderungen in doppelsträngiger Plasmid-DNA zu erzeugen. Es gibt viele Gründe, spezifische DNA-Änderungen (Insertionen, Deletionen und Substitutionen) vorzunehmen, einschließlich:

  • Um Veränderungen der Proteinaktivität zu untersuchen, die als Ergebnis der DNA-Manipulation auftreten.
  • Um Mutationen (auf DNA-, RNA- oder Proteinebene) auszuwählen oder zu screenen, die eine gewünschte Eigenschaft haben
  • Um Restriktionsendonuklease-Stellen oder -Tags einzuführen oder zu entfernen


Methodenübersicht:

SDM ist ein in vitro Verfahren, das speziell entwickelte Oligonukleotid-Primer verwendet, um eine gewünschte Mutation in einem doppelsträngigen DNA-Plasmid zu verleihen. Früher eine von Kunkel (Kunkel, 1985) entwickelte Methode, die einen Stamm mit einem Mangel an dUTPase und Uracil-Deglycosylase nutzt, so dass der Empfänger E coli die Uracil-enthaltende Wildtyp-DNA abbaut, wurde häufig verwendet. Derzeit gibt es eine Reihe von im Handel erhältlichen Kits, die ebenfalls spezifische Modifikationen erfordern und/oder einzigartig sind E coli Stämme (zum Beispiel die Phusion ® Site-Directed Mutagenesis von Thermo und das GeneArt ® System von Life). Die am weitesten verbreiteten Verfahren erfordern keine Modifikationen oder einzigartigen Stämme und bauen Mutationen in das Plasmid durch inverse PCR mit Standardprimern ein. Für diese Methoden können Primer entweder in überlappender (QuikChange ®, Agilent) oder Rücken-an-Rücken-Orientierung (Q5 ® Site-Directed Mutagenesis Kit) entworfen werden (Abbildung 1). Ein überlappendes Primerdesign führt zu einem Produkt, das rezirkularisiert, um ein Double-nicked-Plasmid zu bilden. Trotz dieser Kerben kann dieses kreisförmige Produkt direkt in . umgewandelt werden E coli, wenn auch mit einer geringeren Effizienz als Non-nicked-Plasmide. Back-to-Back-Primer-Design-Methoden haben nicht nur den Vorteil der Transformation von Non-nicked-Plasmiden, sondern ermöglichen auch eine exponentielle Amplifikation, um deutlich mehr des gewünschten Produkts zu erzeugen (Abbildung 2). Da sich die Primer nicht überlappen, sind außerdem die Deletionsgrößen nur durch das Plasmid und Insertionen nur durch die Beschränkungen der modernen Primersynthese begrenzt. Derzeit können mit dieser Methode durch Aufspaltung der Insertion zwischen den beiden Primern routinemäßig Insertionen bis zu 100 bp in einem Schritt erzeugt werden.

Bevor Primer entworfen werden, ist es wichtig zu bestimmen, welcher Mutagenese-Workflow verwendet werden soll. Hier präsentieren wir einen Vergleich von drei kommerziell erhältlichen Kits (Abbildung 3) und eine kurze Beschreibung wichtiger Funktionen.

Bevor Sie Ihr nächstes SDM-Experiment planen, lesen Sie unbedingt unsere Liste wichtiger experimenteller Überlegungen.

Kunkel, T. A. (1985) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 82(2):488-492. PMID: 3881765

Abbildung 1: Die ortsspezifische Mutagenese verläuft in weniger als 2 Stunden.

Die Verwendung eines Mastermixes, eines einzigartigen Multi-Enzym-KLD-Enzymmixes und einer schnellen Polymerase stellt sicher, dass die Mutagenesereaktion bei den meisten Plasmiden in weniger als zwei Stunden abgeschlossen ist.

Abbildung 2: Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit Übersicht.

Dieses Kit wurde für den schnellen und effizienten Einbau von Insertionen, Deletionen und Substitutionen in doppelsträngige Plasmid-DNA entwickelt. Der erste Schritt ist eine exponentielle Amplifikation unter Verwendung von Standardprimern und einer Mastermix-Formulierung von Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase. Der zweite Schritt beinhaltet die Inkubation mit einer einzigartigen Enzymmischung, die eine Kinase, eine Ligase und DpnI enthält. Zusammen ermöglichen diese Enzyme eine schnelle Zirkularisierung des PCR-Produkts und die Entfernung der Matrizen-DNA. Der letzte Schritt ist eine hocheffiziente Transformation in chemisch kompetente Zellen (mitgeliefert).

Abbildung 3: Primer-Design für das Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit

Substitutionen, Deletionen und Insertionen werden durch die Verwendung speziell entwickelter Vorwärts- (schwarz) und Rückwärts- (rot) Primer in die Plasmid-DNA eingebaut. Im Gegensatz zu Kits, die auf linearer Amplifikation basieren, sollten sich Primer, die für das Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit entwickelt wurden, nicht überlappen, um sicherzustellen, dass die Vorteile der exponentiellen Amplifikation realisiert werden. A) Substitutionen werden erzeugt, indem die gewünschte(n) Nukleotidänderung(en) (mit * gekennzeichnet) in der Mitte des Vorwärtsprimers eingebaut werden, einschließlich mindestens 10 komplementärer Nukleotide auf der 3'-Seite der Mutation(en). Der reverse Primer ist so konzipiert, dass die 5´ Enden der beiden Primer Rücken an Rücken aneinanderlagern. B) Deletionen werden konstruiert, indem standardmäßige, nicht mutagene Vorwärts- und Rückwärtsprimer entworfen werden, die die zu deletierende Region flankieren. C) Insertionen von weniger als oder gleich 6 Nukleotiden werden in das 5'-Ende des Vorwärtsprimers eingebaut, während der Rückwärtsprimer Rücken an Rücken mit dem 5'-Ende der komplementären Region des Vorwärtsprimers anlagert. D) Größere Insertionen können erzeugt werden, indem die Hälfte der gewünschten Insertion in die 5´ Enden beider Primer eingebaut wird. Die maximale Größe der Insertion wird weitgehend durch Beschränkungen der Oligonukleotidsynthese bestimmt.

Typ wählen:

Dieses Produkt ist durch ein oder mehrere Patente, Warenzeichen und/oder Urheberrechte geschützt, die sich im Besitz von New England Biolabs, Inc (NEB) befinden oder von ihr kontrolliert werden.

Während NEB seine Produkte für verschiedene Anwendungen entwickelt und validiert, kann die Verwendung dieses Produkts erfordern, dass der Käufer für bestimmte Anwendungen zusätzliche geistige Eigentumsrechte Dritter erwerben muss.

Für weitere Informationen zu kommerziellen Rechten wenden Sie sich bitte an das Global Business Development Team von NEB unter [email protected]

Dieses Produkt ist nur für Forschungszwecke bestimmt. Dieses Produkt ist nicht für therapeutische oder diagnostische Zwecke bei Mensch oder Tier bestimmt.


  • Sterile Filterpipettenspitzen
  • Sterile 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (CLS430909)
    • PCR-Röhrchen und -Platten, wählen Sie eines aus, das dem gewünschten Format entspricht:
    • Einzelne dünnwandige 200-μl-PCR-Gefäße (Z374873 oder P3114)
    • Platten
      - 96-Well-Platten (Z374903)
      - 384-Well-Platten (Z374911)
    • Plattendichtungen
      - ThermalSeal RTS™ Siegelfolien (Z734438)
      - ThermalSeal RT2RR™-Folie (Z722553)

    Im unten angegebenen Beispiel können die Primerkonzentrationen gemäß den Ergebnissen von Optimierungsverfahren (Primerkonzentrationsoptimierung, Primeroptimierung unter Verwendung von Temperaturgradienten und Assayoptimierung und -validierung) eingestellt werden.


    Protokoll zur Anreicherung von mRNAs, ausgenommen Globin-mRNA, aus Vollblut-Gesamt-RNA

    Dieses Protokoll beschreibt die Anreicherung von Poly(A)-mRNA gefolgt von einer Globin-mRNA- und rRNA-Abreicherung (Abschnitt 1 und 2). Die angereicherte RNA enthält nur mRNA (außer Globin) und keine nicht-kodierende RNA. Die angereicherte RNA wird dann als Input für die gerichtete RNA-Bibliotheksvorbereitung für die Sequenzierung auf einem Illumina-Instrument verwendet (Abschnitt 3).

    Dieses Protokoll erfordert die folgenden NEBNext-Produkte:

    • NEBNext Poly(A) mRNA Magnetisches Isolationsmodul (NEB #E7490)
    • NEBNext Globin- und rRNA-Depletion-Kit (Mensch/Maus/Ratte) mit RNA-Probenreinigungsperlen (NEB #E7755)
    • NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep für Illumina mit Probenreinigungsperlen (NEB #E7765)

    Anforderungen an RNA-Proben

    RNA-Integrität:
    Beurteilen Sie die Größe und Qualität der eingegebenen RNA, indem Sie die RNA-Probe auf einem Agilent Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip laufen lassen, um die RNA-Integritätszahl (RIN) zu bestimmen. Für die Poly(A)-mRNA-Anreicherung ist hochwertige RNA mit RIN-Score >7 erforderlich.

    RNA-Probe:
    Die RNA-Probe sollte frei von Salzen (z. B. Mg 2+ oder Guanidiniumsalzen) oder organischen Stoffen (z. B. Phenol und Ethanol) sein. RNA muss frei von DNA sein. gDNA ist eine häufige Kontaminante in RNA-Präparationen. Es kann aus der Interphase organischer Extraktionen übertragen werden oder wenn die Silica-Matrix von Festphasen-RNA-Reinigungsverfahren überladen ist. Wenn die Gesamt-RNA-Probe eine gDNA-Kontamination enthalten kann, behandeln Sie die Probe mit DNase I (nicht in diesem Kit enthalten), um alle DNA-Spuren zu entfernen. Nach der Behandlung sollte die DNase I aus der Probe entfernt werden. Jegliche restliche DNase I kann die für die Anreicherung notwendigen Oligos abbauen.

    Eingabebetrag:

    Dieses Protokoll wurde mit 100 ng Human-Vollblut-Gesamt-RNA (DNA-frei) in maximal 50 &mgr;l nukleasefreiem Wasser getestet, quantifiziert durch eine RNA-spezifische farbstoffunterstützte fluorometrische Methode (Qubit ® ) und qualitätsgeprüft durch Bioanalyzer .

    Bewahren Sie alle Puffer auf Eis auf, sofern nicht anders angegeben.

    1.0. Poly(A)-mRNA-Anreicherung mit dem NEBNext Poly(A)-mRNA-Magnetisolationsmodul (NEB #E7490)

    1.1. Verdünnen Sie die Gesamt-RNA mit nukleasefreiem Wasser auf ein Endvolumen von 50 &mgr;m in einem nukleasefreien 0,2 ml PCR-Röhrchen und halten Sie es auf Eis.

    1.2. Um die Oligo (dT)-Kügelchen zu waschen, geben Sie die Komponenten aus der folgenden Tabelle in ein 1,5 ml nukleasefreies Röhrchen. Bei der Vorbereitung mehrerer Bibliotheken können Beads für bis zu 10 Proben für nachfolgende Waschvorgänge in ein einzelnes 1,5-ml-Röhrchen gegeben werden (verwenden Sie Magnet NEB #S1506 für 1,5-ml-Röhrchen). Der Zweck dieses Schrittes besteht darin, die Kügelchen aus dem Lagerpuffer in den Bindungspuffer zu bringen. Der 2X Binding Buffer muss für diesen Schritt nicht verdünnt werden.

    NEBNext RNA-Bindungspuffer (2X)

    Volle Lautstärke

    1.3. Waschen Sie die Perlen, indem Sie sechsmal auf- und abpipettieren.

    1.4. Stellen Sie das Röhrchen auf den Magneten und inkubieren Sie bei Raumtemperatur, bis die Lösung klar ist (

    1.5. Entfernen und verwerfen Sie den gesamten Überstand aus dem Röhrchen. Achten Sie darauf, die Perlen nicht zu stören.

    1.6. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Magnetständer.

    1.7. Geben Sie 100 &mgr;m RNA-Bindungspuffer (2X) zu den Kügelchen und waschen Sie durch sechsmaliges Auf- und Abpipettieren. Wenn Sie mehrere Bibliotheken vorbereiten, fügen Sie 100 &mgr;l RNA-Bindungspuffer (2X) pro Probe hinzu. Der Binding Buffer muss nicht verdünnt werden.

    1.8. Stellen Sie die Röhrchen auf den Magneten und inkubieren Sie bei Raumtemperatur, bis die Lösung klar ist (

    1.9. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand aus dem Röhrchen. Achten Sie darauf, die Perlen nicht zu stören.

    1.10. Geben Sie 50 &mgr;m RNA-Bindungspuffer (2X) zu den Kügelchen und mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren, bis die Kügelchen homogen sind. Wenn Sie mehrere Bibliotheken vorbereiten, fügen Sie 50 &mul RNA-Bindungspuffer (2X) pro Probe hinzu.

    1.11. Fügen Sie jeder RNA-Probe aus Schritt 1.1 50 &mgr;m Beads hinzu. Mischen Sie gründlich durch sechsmaliges Auf- und Abpipettieren. Dieser Bindungsschritt entfernt den größten Teil der Nicht-Ziel-RNA.

    1.12. Legen Sie das Röhrchen in einen Thermocycler und schließen Sie den Deckel. Erhitzen Sie die Probe bei 65°C für 5 Minuten und abkühlen auf 4°C mit dem beheizten Deckel auf &ge 75°C eingestellt. Dieser Schritt wird die RNA denaturieren und die Bindung der mRNA an die Kügelchen erleichtern.

    1.13. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Thermocycler, wenn die Temperatur 4°C erreicht.

    1.14. Durch sechsmaliges Auf- und Abpipettieren gründlich mischen. Stellen Sie das Röhrchen auf die Werkbank und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit die mRNA an die Perlen binden kann.

    1.15. Stellen Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur auf den Magnetständer, bis die Lösung klar ist (

    1.16. Entfernen und verwerfen Sie den gesamten Überstand. Achten Sie darauf, die Perlen nicht zu stören.

    1.17. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Magnetständer.

    1.18. Um ungebundene RNA zu entfernen, werden 200 &mgr;m Waschpuffer in das Röhrchen gegeben. Pipettieren Sie das gesamte Volumen vorsichtig 6-mal auf und ab, um gründlich zu mischen.

    1.19 Drehen Sie das Röhrchen kurz herunter, um die Flüssigkeit von der Wand und dem Deckel des Röhrchens aufzufangen.

    Hinweis: Es ist wichtig, das Röhrchen abzuschleudern, um eine Verschleppung des Waschpuffers in nachfolgenden Schritten zu verhindern.

    1.20. Stellen Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur auf das Magnetgestell, bis die Lösung klar ist (

    1.21. Entfernen und verwerfen Sie den gesamten Überstand aus dem Röhrchen. Achten Sie darauf, die Kügelchen mit der mRNA nicht zu stören.

    1.22. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Magnetständer.

    1.24. In jedes Röhrchen 11 &mgr;M nukleasefreies Wasser geben. 6 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren, um gründlich zu mischen.

    1.25. Legen Sie das Röhrchen in den Thermocycler. Schließen Sie den Deckel und erhitzen Sie die Proben bei 80°C für 2 Minuten, dann auf 25°C abkühlen mit dem auf &ge 90°C eingestellten beheizten Deckel, um die mRNA von den Kügelchen zu eluieren.

    1.26. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Thermocycler, wenn die Temperatur 25°C erreicht.

    1.27 Stellen Sie das Röhrchen sofort bei Raumtemperatur auf den Magneten, bis die Lösung klar ist (

    1.28. Sammeln Sie die gereinigte mRNA, indem Sie 10 &mgr;mul des Überstands in ein sauberes nukleasefreies PCR-Röhrchen überführen.

    1.29. Legen Sie die RNA auf Eis und fahren Sie mit der Globin- und rRNA-Depletion in Abschnitt 2 fort.

    2.0. Globin- und rRNA-Depletion mit dem NEBNext Globin- und rRNA-Depletion-Kit (NEB #E7750/E7755)

    2.1 Sondenhybridisierung an RNA

    2.1.2. Stellen Sie die folgende RNA/Sonden-Hybridisierungsreaktion auf Eis zusammen:

    RNA/SONDEN-HYBRIDISIERUNGSREAKTION

    (weiß) mRNA in nukleasefreiem Wasser (Schritt 1.29)

    (weiß) NEBNext Globin und rRNA Depletion Solution

    (weiß) NEBNext Sondenhybridisierungspuffer

    Volle Lautstärke

    2.1.3. Durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mindestens 10 Mal gründlich mischen. Hinweis: Es ist wichtig, in diesem Schritt gut zu mischen.

    2.1.4. Schleudern Sie das Röhrchen kurz in einer Mikrozentrifuge, um die Flüssigkeit an der Seite des Röhrchens aufzufangen.

    2.1.5. Stellen Sie das Röhrchen in einen vorgeheizten Thermocycler und führen Sie das folgende Programm mit dem auf 105 °C eingestellten beheizten Deckel durch. Dieses Programm wird ungefähr 15&ndash20 Minuten dauern:

    2.1.6. Das Röhrchen kurz in einer Mikrozentrifuge abzentrifugieren und auf Eis stellen. Fahren Sie sofort mit dem RNase H-Verdau fort.

    2.2. RNase H-Verdauung

    2.2.1. Stellen Sie die folgende RNase H-Verdauungsreaktion auf Eis zusammen:

    (weiß) NEBNext Thermostabile RNase H

    (weiß) RNase H Reaktionspuffer

    Volle Lautstärke

    2.2.2. Durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mindestens 10 Mal gründlich mischen.

    2.2.3. Zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz in einer Mikrozentrifuge.

    2.2.4. Inkubieren Sie das Röhrchen in einem vorgeheizten Thermocycler für 30 Minuten bei 50°C mit Deckel auf 55°C eingestellt.

    2.2.5. Das Röhrchen kurz in einer Mikrozentrifuge abzentrifugieren und auf Eis stellen. Fahren Sie sofort mit dem DNase I-Verdau fort.

    2.3. DNase I-Verdauung

    2.3.1. Stellen Sie die folgende DNase-I-Verdauungsreaktion auf Eis zusammen:

    DNASE I VERDAUUNGSREAKTION

    RNase H-behandelte RNA (Schritt 1.2.5)

    (weiß) DNase I Reaktionspuffer

    (weiß) NEBNext DNase I

    Volle Lautstärke

    2.3.2. Durch mindestens 10-maliges Auf- und Abpipettieren gründlich mischen.

    2.3.3. Zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz in einer Mikrozentrifuge.

    2.3.4. Inkubieren Sie das Röhrchen in einem vorgeheizten Thermocycler für 30 Minuten bei 37°C mit Deckel auf 40°C oder ausgeschaltet.

    2.3.5. Das Röhrchen kurz in einer Mikrozentrifuge abzentrifugieren und auf Eis stellen. Fahren Sie sofort mit dem RNA-Reinigungsschritt fort.

    2.4. RNA-Aufreinigung mit Agencourt RNAClean XP Beads oder NEBNext RNA Sample Purification Beads

    2.4.1. Vortexen Sie die Agencourt RNAClean XP Beads oder NEBNext RNA Sample Purification Beads, um sie zu resuspendieren.

    2.4.2. Füge 90 &mul (1,8X) Kügelchen zu der RNA-Probe aus Schritt 2.3.5 hinzu und mische gründlich durch mindestens 10-maliges Auf- und Abpipettieren.

    2.4.3. Inkubieren Sie das Röhrchen für 15 Minuten auf Eis um die RNA an die Kügelchen zu binden.

    2.4.4. Stellen Sie das Röhrchen auf ein magnetisches Gestell, um die Beads vom Überstand zu trennen.

    2.4.5. Nachdem die Lösung klar ist, entfernen und verwerfen Sie den Überstand vorsichtig. Achten Sie darauf, die Kügelchen, die die RNA enthalten, nicht zu stören.

    2.4.6. Geben Sie 200 &mgr;l frisch zubereitetes 80%iges Ethanol in das Röhrchen, während es sich im Magnetständer befindet. 30 Sekunden bei Raumtemperatur inkubieren und dann den Überstand vorsichtig entfernen und verwerfen. Achten Sie darauf, die Kügelchen, die die RNA enthalten, nicht zu stören.

    2.4.7. Wiederholen Sie Schritt 2.4.6 einmal für insgesamt zwei Wäschen.

    2.4.8. Entfernen Sie restliches Ethanol vollständig und trocknen Sie die Beads bis zu 5 Minuten lang an der Luft, während sich das Röhrchen mit geöffnetem Deckel auf dem Magnetständer befindet.

    Achtung: Übertrocknen Sie die Perlen nicht. Dies kann zu einer geringeren Gewinnung des RNA-Targets führen. Eluieren Sie die Proben, wenn die Perlen noch dunkelbraun und glänzend aussehen, aber alle sichtbare Flüssigkeit verdampft ist. Wenn die Perlen hellbraun werden und anfangen zu reißen, sind sie zu trocken.

    2.4.9. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Magnetständer. Eluieren Sie die RNA von den Perlen durch Zugabe von 7 &mgr;m Nuklease-freiem Wasser. Durch mindestens 10-maliges Auf- und Abpipettieren gründlich mischen und das Röhrchen kurz drehen.

    2.4.10. Inkubieren Sie das Röhrchen für 2 Minuten bei Raumtemperatur.

    2.4.11. Stellen Sie das Röhrchen auf das Magnetgestell, bis die Lösung klar ist (

    2.4.12. 5 &mgr;l des Überstands mit RNA entfernen und in ein nukleasefreies Röhrchen überführen.

    2.4.13. Stellen Sie das Röhrchen auf Eis und fahren Sie mit der Konstruktion der RNA-Seq-Bibliothek (Protokoll unten) oder einer anderen nachgeschalteten Anwendung fort. Alternativ kann die Probe bei -80°C gelagert werden.

    Hinweis: Der nächste Schritt liefert eine Fragmentierungsinkubationszeit, die zu einem RNA-Insert von

    200nt. Siehe Anhang (Abschnitt 4 des NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep for Illumina Manual) für Fragmentierungsbedingungen, wenn Sie Bibliotheken mit großen Inserts (>200 bp) vorbereiten.

    3.1.3. Inkubieren Sie die Probe für 15 Minuten bei 94&gradC in einem Thermocycler mit auf 105 °C eingestelltem Heizdeckel.

    3.1.4. Übertragen Sie das Röhrchen sofort für 1 Minute auf Eis.

    3.1.5 Führen Sie eine schnelle Drehung durch, um die gesamte Flüssigkeit von den Seiten des Röhrchens zu sammeln, und fahren Sie mit der Erststrang-cDNA-Synthese fort.

    3.2. cDNA-Synthese des ersten Strangs

    3.2.1. Bauen Sie die Erststrang-Synthesereaktion auf Eis zusammen, indem Sie die folgenden Komponenten zu den fragmentierten
    und geprimte RNA aus Schritt 3.1.5:

    ERSTE STRAND-SYNTHESE-REAKTION

    Fragmentierte und geprimte RNA (Schritt 3.1.5)

    (braun) NEBNext Strang-Spezifitätsreagenz

    (lila) NEBNext First Strang Synthesis Enzyme Mix

    Volle Lautstärke

    3.2.2. Durch 10-maliges Auf- und Abpipettieren gründlich mischen.

    3.2.3. Inkubieren Sie die Probe in einem vorgeheizten Thermocycler mit dem beheizten Deckel auf &ge 80°C wie folgt:

    Hinweis: Wenn Sie die Empfehlungen in Abschnitt 4 des NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep for Illumina Manual für Bibliotheken mit längeren Inserts (>200 Basen) befolgen, erhöhen Sie die Inkubation bei 42 °C von 15 Minuten auf 50 Minuten in Schritt 2 unten.

    3.2.4. Fahren Sie direkt mit der Zweitstrang-cDNA-Synthese fort.

    3.3. Zweitstrang-cDNA-Synthese

    3.3.1. Stellen Sie die Zweitstrang-cDNA-Synthesereaktion auf Eis zusammen, indem Sie die folgenden Komponenten zum Erststrang-Syntheseprodukt aus Schritt 3.2.4 hinzufügen.

    ZWEITE STRAND-SYNTHESE-REAKTION

    Erststrang-Syntheseprodukt (Schritt 3.2.4)

    (orange) NEBNext Second Strang Synthese Reaktionspuffer
    mit dUTP-Mix (10X)

    (orange) NEBNext Second Strang Synthesis Enzyme Mix

    Volle Lautstärke

    3.3.2. Halten Sie das Röhrchen auf Eis und mischen Sie gründlich, indem Sie mindestens 10 Mal auf- und abpipettieren.

    3.3.3. In einem Thermocycler für . inkubieren 1 Stunde bei 16°C mit dem beheizten Deckel auf &le 40°C eingestellt (oder ausgeschaltet).

    3.4. Reinigung doppelsträngiger cDNA mit SPRIselect Beads oder NEBNext Sample Purification Beads

    3.4.1. Vortex SPRIselect Beads oder NEBNext Sample Purification Beads zum Resuspendieren.

    3.4.2. Füge 144 &mul (1,8X) resuspendierte Kügelchen zu der Synthesereaktion des zweiten Strangs hinzu (

    80 &mgr;m). Mit einem Vortex-Mischer oder durch mindestens 10-maliges Auf- und Abpipettieren gut mischen.

    3.4.3. Inkubieren für 5 Minuten bei Raumtemperatur.

    3.4.4. Drehen Sie das Röhrchen kurz in einer Mikrozentrifuge, um alle Proben an den Seiten des Röhrchens zu sammeln. Stellen Sie das Röhrchen auf ein magnetisches Gestell, um die Beads vom Überstand zu trennen. Nachdem die Lösung klar ist, entfernen und verwerfen Sie den Überstand vorsichtig. Achten Sie darauf, die Perlen, die DNA enthalten, nicht zu stören. Achtung: Perlen nicht wegwerfen.

    3.4.5. Geben Sie 200 &mgr;mul frisch zubereitetes 80%iges Ethanol in das Röhrchen, während es sich im Magnetgestell befindet. 30 Sekunden bei Raumtemperatur inkubieren und dann den Überstand vorsichtig entfernen und verwerfen.

    3.4.6. Wiederholen Sie Schritt 3.4.5 einmal für insgesamt 2 Waschschritte.

    3.4.7. Trocknen Sie die Perlen bis zu 5 Minuten lang an der Luft, während sich das Röhrchen mit geöffnetem Deckel auf dem Magnetständer befindet.

    Achtung: Übertrocknen Sie die Perlen nicht. Dies kann zu einer geringeren Gewinnung des DNA-Ziels führen. Eluieren Sie die Proben, wenn die Perlen noch dunkelbraun und glänzend aussehen, aber alle sichtbare Flüssigkeit verdampft ist. Wenn die Perlen hellbraun werden und anfangen zu reißen, sind sie zu trocken.

    3.4.8. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Magnetständer. Eluieren Sie die DNA von den Kügelchen durch Zugabe von 53 &mgr;m 0,1X TE-Puffer (mitgeliefert) zu den Kügelchen. Mit einem Vortex-Mischer oder durch mindestens 10-maliges Auf- und Abpipettieren gut mischen. Das Röhrchen schnell drehen und 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Stellen Sie das Röhrchen auf das Magnetgestell, bis die Lösung klar ist.

    3.4.9. 50 &mgr;l des Überstands entfernen und in ein sauberes nukleasefreies PCR-Röhrchen überführen.

    Note: If you need to stop at this point in the protocol samples can be stored at &ndash20°C.

    3.5. End Prep of cDNA Library

    3.5.1. Assemble the End Prep reaction on ice by adding the following components to the second strand synthesis product from
    Step 3.4.9.

    Second Strand cDNA Synthesis Product (Step 3.4.9)

    (green) NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer

    (green) NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix

    Total Volume

    If a master mix is made, add 10 µl of master mix to 50 µl of cDNA for the End Prep reaction.

    3.5.2. Set a 100 &mul or 200 &mul pipette to 50 &mul and then pipette the entire volume up and down at least 10 times to mix thoroughly. Perform a quick spin to collect all liquid from the sides of the tube.

    Note: It is important to mix well. The presence of a small amount of bubbles will not interfere with performance.

    3.5.3. Incubate the sample in a thermocycler with the heated lid set at &ge 75°C as follows.

    3.5.4. Proceed immediately to Adaptor Ligation.

    3.6. Adaptor Ligation

    Note: If you are selecting for libraries with larger insert size (>200 nt) follow the size selection recommendations in Appendix, Section 4 of the NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep for Illumina Manual.

    3.7.1. Add 87 &mul (0.9X) resuspended SPRIselect Beads or NEBNext Sample Purification Beads and mix well on a vortex mixer or by pipetting up and down at least 10 times.

    3.7.2. Inkubieren für 10 minutes at room temperature.

    3.7.3. Quickly spin the tube in a microcentrifuge and place the tube on a magnetic rack to separate beads from the supernatant. After the solution is clear (

    5 minutes), discard the supernatant that contains unwanted fragments. Caution: do not discard beads.

    3.7.4. Add 200 &mul of freshly prepared 80% ethanol to the tube while in the magnetic rack. Incubate at room temperature for 30 seconds, and then carefully remove and discard the supernatant.

    3.7.5. Repeat Step 3.7.4 once for a total of 2 washing steps.

    3.7.6. Briefly spin the tube and put the tube back in the magnetic rack.

    3.7.7. Completely remove the residual ethanol, and air-dry beads until the beads are dry for up to 5 minutes while the tube is on the magnetic rack with the lid open.

    Caution: Do not over-dry the beads. This may result in lower recovery of DNA target. Elute the samples when the beads are still dark brown and glossy looking, but when all visible liquid has evaporated. When the beads turn lighter brown and start to crack they are too dry.

    3.7.8. Remove the tube from the magnetic rack. Elute DNA target from the beads by adding 17 &mul 0.1X TE (provided) to the beads. Mix well on a vortex or by pipetting up and down. Quickly spin the tube and incubate for 2 minutes at room temperature. Place the tube in the magnet until the solution is clear.

    3.7.9. Without disturbing the bead pellet, transfer 15 &mul of the supernatant to a clean PCR tube and proceed to PCR enrichment.

    Note: If you need to stop at this point in the protocol, samples can be stored at &ndash20°C.

    3.8. PCR Enrichment of Adaptor Ligated DNA

    Check and verify that the concentration of your oligos is 10 &muM on the label.

    Use Option A for any NEBNext Oligos kit where index primers are supplied in tubes. These kits have the forward and reverse primers supplied in separate tubes.

    Use Option B for any NEBNext Oligos kit where index primers are supplied in a 96-well plate format. These kits have the forward and reverse primers (i7 and i5) combined.

    3.8.1. Set up the PCR reaction as described below based on the type of oligos (PCR primers) used.

    3.8.1A. Forward and Reverse Primers Separate

    Adaptor Ligated DNA (Step 2.11.9)

    (blue) NEBNext Ultra II Q5 ® Master Mix

    Universal PCR Primer/i5 Primer*,**

    Total Volume

    * NEBNext Oligos must be purchased separately from the library prep kit. Refer to the corresponding NEBNext Oligo kit manual
    for determining valid barcode combinations.

    ** Use only one i7 primer/ index primer per sample. Use only one i5 primer (or the universal primer for single index kits) per sample.

    3.8.1B. Forward and Reverse Primers Combined

    Adaptor Ligated DNA (Step 2.11.9)

    (blue) NEBNext Ultra II Q5 Master Mix

    Index (X) Primer/i7 Primer Mix*

    Total Volume

    * NEBNext Oligos must be purchased separately from the library prep kit. Refer to the corresponding NEBNext Oligo kit manual
    for determining valid barcode combinations.

    ** Use only one i7 primer/ index primer per sample. Use only one i5 primer (or the universal primer for single index kits) per sample

    3.8.2. Mix well by gently pipetting up and down 10 times. Quickly spin the tube in a microcentrifuge.

    3.8.3. Place the tube on a thermocycler with the heated lid set to 105°C and perform PCR amplification using the following PCR cycling conditions (refer to Table 3.8.3A and Table 3.8.3B):

    * The number of PCR cycles should be adjusted based on RNA input.

    ** It is important to limit the number of PCR cycles to avoid overamplification.
    If overamplification occurs, a second peak

    1,000 bp will appear on the Bioanalyzer trace (See Figure 5.2 of the NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep for Illumina Manual).

    Table 3.8.3B: Recommended PCR cycles based on total RNA input amount:

    * The PCR cycles are recommended based on high quality human whole blood total RNA. To prevent over-amplification, the number of cycles may require optimization based on the sample quality and the fraction of globin mRNA. For RNA where globin mRNA is > than 50% of the transcripts (once rRNA is removed), follow the higher cycle recommendation for that input.

    3.9. Purification of the PCR Reaction using SPRIselect Beads or NEBNext Sample Purification Beads

    3.9.1. Vortex SPRIselect Beads or NEBNext Sample Purification Beads to resuspend.

    3.9.2. Add 45 &mul (0.9X) of resuspended beads to the PCR reaction (

    50 &mul). Mix well on a vortex mixer or by pipetting up and down at least 10 times.

    3.9.3. Inkubieren für 5 minutes at room temperature.

    3.9.4. Quickly spin the tube in a microcentrifuge and place the tube on a magnetic rack to separate beads from the supernatant. After the solution is clear (about 5 minutes), carefully remove and discard the supernatant. Be careful not to disturb the beads that contain DNA targets. Caution: do not discard beads.

    3.9.5. Add 200 &mul of freshly prepared 80% ethanol to the tube while in the magnetic rack. Incubate at room temperature for 30 seconds, and then carefully remove and discard the supernatant.

    3.9.6. Repeat Step 3.9.5 once for a total of 2 washing steps.

    3.9.7. Air dry the beads for up to 5 minutes while the tube is on the magnetic rack with the lid open.

    Caution: Do not over-dry the beads. This may result in lower recovery of DNA target. Elute the samples when the beads are still dark brown and glossy looking, but when all visible liquid has evaporated. When the beads turn lighter brown and start to crack they are too dry.

    3.9.8. Remove the tube from the magnetic rack. Elute the DNA target from the beads by adding 23 &mul 0.1X TE (provided) to the beads. Mix well on a vortex mixer or by pipetting up and down ten times. Quickly spin the tube in a microcentrifuge and incubate for 2 minutes at room temperature. Place the tube in the magnetic rack until the solution is clear.

    3.9.9. Transfer 20 &mul of the supernatant to a clean PCR tube and store at &ndash20°C.

    3.10. Library Quantification

    3.10.1. Use a Bioanalyzer or TapeStation to determine the size distribution and concentration of the libraries.

    3.10.2. Check that the electropherogram shows a narrow distribution with a peak size approximately 300 bp.

    80 bp (primers) or 128 bp (adaptor-dimer) is visible in the bioanalyzer traces, bring up the sample volume (from Step 3.9.9) to 50 &mul with 0.1X TE buffer and repeat the SPRIselect Bead or NEBNext Sample Purification Bead Cleanup Step (Section 3.9).

    Figure 3.9.1 Example of RNA library size distribution on a Bioanalyzer.


    Colony PCR or PCR with Growing culture in Broth - Trying to detect the cloned fragment in living cells (Jan/18/2007 )

    Hey Guys
    Another Question for you.
    What is the best technique to do PCR on living cells, cells from colony or can I directly take cell from overnight cultures which I use for plasmid extraction. I tried it once while taking 1 microliter from the broth culture in a total volume of 25 microliter. It worked and I got the amplification but I am not sure, will it work in every case.
    Any Suggestions are highly appreciated.
    And if any body has a nice protocol for this, I will request to post it here too.
    Danke im Voraus.

    if the cells are oldish (growing for >16hrs) I would avoid using them for PCR. This is true for both colonies and cultures.. cells growing more then 16hrs greatly increase their production of liposaccarides (slime!) which intefers with the PCR reaction.

    Otherwise (provide sufficient dilution) and the cells are 'fresh-young' there is no difference between the two methods. Personally I prefer doing my PCR on colonies.. i use colony PCR for screening purposes and doing the screen on colonies saves me a day.

    Use a 96 well plate to hold my colony dilutions.

    Fill 96 well plate with 50ul sterile distilled water
    Pick 1 isolated colony with pipette tip and place said colony into a well.
    Repeat as many times as desired.

    PCR mix per reaction (but this is usually made a single master mix)
    4.22 ul sterile distilled water
    1ul 2mM dNTP
    1ul 10X taq buffer
    0.5ul primer forward
    0.5ul primer reverse
    0.08ul Taq
    0.2ul 50mM MgCl2

    Add PCR mix into 96 Well PCR plate. Then add

    1 = 95 Celsius (4min)
    2 = 94 Celsius (30 sec) melting
    3 = Tm (30 sec) anealing
    4 = 72 Celsius (1min) extention

    Of course the above conditions can be changed. the time for each step is a little too long, but I don't bother to optimise it for each individual screen.

    EDIT: The primer concentration is 10mM, made by diluting a master stock (100mM) with sterile distilled water.

    if the cells are oldish (growing for >16hrs) I would avoid using them for PCR. This is true for both colonies and cultures.. cells growing more then 16hrs greatly increase their production of liposaccarides (slime!) which intefers with the PCR reaction.

    Otherwise (provide sufficient dilution) and the cells are 'fresh-young' there is no difference between the two methods. Personally I prefer doing my PCR on colonies.. i use colony PCR for screening purposes and doing the screen on colonies saves me a day.

    Use a 96 well plate to hold my colony dilutions.

    Fill 96 well plate with 50ul sterile distilled water
    Pick 1 isolated colony with pipette tip and place said colony into a well.
    Repeat as many times as desired.

    PCR mix per reaction (but this is usually made a single master mix)
    4.22 ul sterile distilled water
    1ul 2mM dNTP
    1ul 10X taq buffer
    0.5ul primer forward
    0.5ul primer reverse
    0.08ul Taq
    0.2ul 50mM MgCl2

    Add PCR mix into 96 Well PCR plate. Then add

    1 = 95 Celsius (4min)
    2 = 94 Celsius (30 sec) melting
    3 = Tm (30 sec) anealing
    4 = 72 Celsius (1min) extention

    Of course the above conditions can be changed. the time for each step is a little too long, but I don't bother to optimise it for each individual screen.

    if the cells are oldish (growing for >16hrs) I would avoid using them for PCR. This is true for both colonies and cultures.. cells growing more then 16hrs greatly increase their production of liposaccarides (slime!) which intefers with the PCR reaction.

    Otherwise (provide sufficient dilution) and the cells are 'fresh-young' there is no difference between the two methods. Personally I prefer doing my PCR on colonies.. i use colony PCR for screening purposes and doing the screen on colonies saves me a day.

    Hi, I've been getting negative results all this time for my colony pcr screen! White colonies with negative results really depressing
    My colonies have been on the plate for 2 days (unfortunately) cause they were really too small to be picked.
    Would it also matter if I had resuspended the colonies in LB (5ul) instead of sterile water? Had realised you used 50ul!!
    Maybe i should try out your dilution method as well.

    yes, I certainly agree. Do dilute your colony solution. If the colony solution is too concentrated, the PCR reaction will either fail or become very smeary.

    If only a small amount of LB entered the PCR mix, 2ul or so, there should not be any effect. But personally I use sterile distilled water. Should I decide to keep the colonies in the 96 well plate for an extended time (>2 days), I later add LB to the wells.

    Hi perneseblue,
    I just added another 50ul of distilled water as u suggested.
    But unfortunately, still nothing turned up
    Have tried on 36 samples !

    Did u do any serial dilutions, or change the volumes of Colony dilutons for your PCR screen?
    Anyway, I'll be repeating the TA cloning step once more since my plate is about 4days old now

    Is there any other factors other than colony dilutions? I've browsed through the forum and it seems that there are also other members facing similar problems: picking up white colonies but not finding the inserts

    I'd like to foresee any upcoming problems and be mentally prepared

    Hi perneseblue,
    I just added another 50ul of distilled water as u suggested.
    But unfortunately, still nothing turned up
    Have tried on 36 samples !

    Did u do any serial dilutions, or change the volumes of Colony dilutons for your PCR screen?
    Anyway, I'll be repeating the TA cloning step once more since my plate is about 4days old now

    Is there any other factors other than colony dilutions? I've browsed through the forum and it seems that there are also other members facing similar problems: picking up white colonies but not finding the inserts

    I'd like to foresee any upcoming problems and be mentally prepared

    1. Add 100 uL water to desired number of wells in a PCR plate or tubes.
    2. Toothpick colony into each well or add 10 uL of overnight culture
    3. Heat in thermal cycler to 95C for 5 or 10 minutes. Heat blocks are not recommended, as the protocol does not work as well if the temperature is 93C rather than 95C.
    4. Spin down the plate or tubes so that any cell debris is pelleted at the bottom of the tube/well. This removes the inhibitory components from the supernatant.
    5. Carefully transfer 25 uL of supernatant to the PCR reaction, being careful not to disturb the bottom of the tube/well, even if you can't see any pellet.
    6. PCR with forward and reverse to check for single/double inserts. Use vector only for a control.

    hi makosad05 and tfitzwater,

    Thanks for your replies!
    I use the same primers as my inserts, 40cycles
    my PCR reaction is 10ul

    Hi perneseblue,
    I just added another 50ul of distilled water as u suggested.
    But unfortunately, still nothing turned up
    Have tried on 36 samples !

    Did u do any serial dilutions, or change the volumes of Colony dilutons for your PCR screen?
    Anyway, I'll be repeating the TA cloning step once more since my plate is about 4days old now

    Is there any other factors other than colony dilutions? I've browsed through the forum and it seems that there are also other members facing similar problems: picking up white colonies but not finding the inserts

    I'd like to foresee any upcoming problems and be mentally prepared

    The PCR product size. I find that under colony PCR conditions, Taq polymerase is reliably only for amplification of 900bp products and below. Anything larger, and the reaction's success becomes uncertain. If your product is on the large side, I would try reducing the extention temperature (to around 70 Celsius - 68 Celsius) compensating by increased extention time. (50% longer)

    tm- what is the tm of your primers? Like any PCR reaction, all rules concerning primers design apply. There shouldn't be too large a difference between primers melting temperature.

    The rule of the tumb for annealing tempearture is (tm - 5 Celsius). You can reduce the annealing temperature, a little further.

    I would also consider testing more colonies, up to 72.

    Lastly, there is there is the possibility that there the colony PCR isn't working because there aren't any colonies which are positive.


    Principles of Molecular Techniques

    Faramarz Naeim , . Wayne W. Grody , in Atlas of Hematopathology , 2013

    Related Amplification Techniques

    A large number of innovations to the basic PCR technique have been developed over the years to address particular applications or to circumvent certain pitfalls. Included are such techniques as nested PCR, whole-genome amplification, inverse PCR, hot-start PCR, allele-specific PCR, cold PCR, and many others. For the most part they are beyond the scope of this chapter, but will be mentioned in the context of particular disease applications where relevant elsewhere in the book. In addition, a number of non-PCR amplification techniques have been developed over the years, such as Q-β replicase, ligation chain reaction, etc., but for the most part they have fallen by the wayside in favor of PCR, at least for applications relevant to hematopathology (some are used in molecular microbiology and genetics testing).


    Schau das Video: How To: PCR Master Mixes (Januar 2022).