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Protokoll zur Messung der Ausdauer von arthritischen Mäusen

Protokoll zur Messung der Ausdauer von arthritischen Mäusen



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Ich werde einige Mäuse an Arthritis erkranken lassen. Das Medikament, das ich als Kontrolle teste, ist dafür bekannt, extreme Müdigkeit zu verursachen. Ich glaube, ich habe es verbessert. Ich würde gerne ihre Ausdauer in Gegenwart von etwas wie Morphium menschlich messen. Wie würde ich das ethisch machen?


Ich glaube, der Standard ist ein Laufbandtest mit abgestufter Geschwindigkeit. Eine Beispielkneipe:

Genetische Variabilität der erzwungenen und freiwilligen Ausdauerleistung bei sieben Inzucht-Mausstämmen

Wenn es ein besonderes ethisches Anliegen gibt, sollten Sie es immer von Ihrem institutionellen Gutachtergremium prüfen lassen. Wenn Sie Ihre Abteilung für Tierressourcen (oder wie auch immer es in Ihrer Einrichtung heißt) anrufen, erhalten Sie fast immer Listen mit bevorzugten LOPs.

Eine andere Möglichkeit wäre, Schlafzeiten zu erzielen, wenn Sie sie unter Verhaltensüberwachung haben. Das Problem dabei ist die große Menge an Arbeitsstunden, die benötigt wird, selbst beim Ansehen von Bändern mit hoher Geschwindigkeit. Stattdessen empfehle ich Ihnen, dieses Papier zu lesen:

Auswertung von zwei automatisierten Metriken zur Analyse von Partnerpräferenztests

Um eine genaue Bewertung zu erhalten, legte ich dann eine stark gefärbte Bettunterlage in eine Ecke, damit der Computer sie aufnehmen konnte. Legen Sie die Einstreu mindestens eine Woche vorher ein, damit sich die Mäuse daran gewöhnen und tatsächlich darauf schlafen.


Wenn die Mäuse nicht in der Lage sind, auf einem Laufband zu laufen, was darauf hindeutet, dass sie sehr krank sind, können Sie einfach ihre Homecage-Aktivität messen. Es gibt ein normales Grundniveau der Aktivität in einem Käfig. Sie könnten Kontrollen mit Placebos mit Experimenten vergleichen. Wenn das von Ihnen getestete Medikament die Homecage-Aktivität erhöht, scheint es wirksam zu sein. Xieet al. beschreiben ein ziemlich umfassendes System.

Hier ist ein Beispiel. Grundsätzlich handelt es sich um eine sehr empfindliche 4-Säulen-Skala, die darauf ausgelegt ist, im xy-Raum zu bestimmen, wenn sich die Maus im Käfig befindet.


Verfahren zur Keimzelltransplantation in Maushoden

Zielsetzung: Zur Veranschaulichung des Schritt-für-Schritt-Protokolls zum Testen der Keimzelltransplantation in das Samenepithel von Maushoden.

Entwurf: Videopräsentation eines Tiermodells für die Forschung in der Reproduktions- und Regenerativen Medizin.

Einstellung: Forschungslabor.

Tiere): Männliche Nacktmäuse (NU-Foxn1(nu)).

Intervention(en): Mäuse wurden chemisch mit Alkylantverbindungen (Busulfan) sterilisiert, gefolgt von einer Mikrochirurgie der Gonaden, um Spenderkeimzellen zu injizieren.

Hauptzielparameter): Spenderzellen sollten mit Reportergenen wie grün fluoreszierendem Protein (GFP), Laktoseoperon (LacZ) markiert werden oder alternativ eine effektive Strategie mit spezifischen Antikörpern entwickeln, um sie in den Empfängerhoden zu verfolgen. Der Spermiennachweis im Ejakulat kann auch als Auslese verwendet werden. Allerdings ist in diesem Fall der Nachweis des Spendergenotyps im Sperma zwingend erforderlich, um deren Herkunft aufzuklären.

Ergebnisse): In der vorliegenden Studie beschreiben wir das komplette Protokoll für die Keimzelltransplantation durch efferente Ductus-Injektion, einschließlich der Vorbereitung von Empfängermäusen, der Operation für die Keimzelltransplantation und der Analyse der Empfängerhoden. Die Stärke dieser Technik liegt vor allem darin, dass sie den Goldstandard für eine Funktionsprüfung des Keimzellpotentials darstellt, da nur spermatogoniale Stammzellen in der Lage sind, das Samenlumen richtig zu besiedeln. Als Spenderkeimzellen eignen sich für diese Technik sowohl frische als auch gefrorene/aufgetaute Hodenzellen. Auch die Anreicherung lebender spermatogonialer Stammzellen vor der Transplantation scheint die Effizienz der Kolonisation zu verbessern. Für eine ordnungsgemäße Besiedlung von Keimzellen sollte die Nische verfügbar sein und daher werden normalerweise Mausstämme verwendet, denen eine endogene Spermatogenese fehlt, wie z. B. W/W(v)-Mutantenmäuse. Bei nicht passenden Spenderzellen sollte das Samenepithel von immunsupprimierten Empfängermäusen vor der Transplantation keimzelldepletiert werden. Eine Einschränkung dieser Technik besteht darin, dass das Verfahren bis zu 3 Monate dauern kann. Im Gegensatz zur vollständigen Wiederherstellung der Spermatogenese bei Maus-zu-Maus-Transplantationen führt die Xenotransplantation von Keimzellen von phylogenetisch entfernten Spezies wie dem Menschen in Mausempfänger zur Besiedlung von Spenderzellen und zur Spermatogonienexpansion, scheitert jedoch in ihrer spermatogenen Progression aufgrund evolutiver Inkompatibilitäten mit der Empfängernische. Die Xenotransplantation von Gewebestücken des Spenderhodengewebes unter die Haut von Mauswirten ist ein alternativer Ansatz, der derzeit untersucht wird, um zu versuchen, diese Einschränkung zu lösen.

Schlussfolgerung(en): Die Transplantation von spermatogonialen Stammzellen in das Samenlumen von Maushoden ist ein funktioneller Test, der diese zelluläre Subpopulation durch ihre Fähigkeit zur Kolonisierung definiert. Diese Technik kann als Modell verwendet werden, um die Erkenntnisse von spermatogonialen Stammzellen aufzuklären, transgene Tiere durch genetische Manipulation von Spenderzellen vor der Transplantation zu erzeugen, aber sie hat auch potenzielle Anwendungen bei der Fertilitätserhaltung bei Rindern und Menschen, wie es bei Großtieren möglich ist, wie jüngste Berichte bei Rhesusaffen gezeigt haben, die die Spermatogenese nach allogener Transplantation erholten, und sogar aus menschlichen Leichenhoden. Daher könnten Spermatogonien-Stammzellen, die von präpuberalen Jungen isoliert wurden, die mit einer Alkylantien-Chemotherapie behandelt wurden, in ihre Hoden zurückgeführt werden, um die Spermatogenese in Zukunft zu regenerieren.

Schlüsselwörter: Spermatogoniale Stammzellen Besiedelung des Samenepithels Keimzelltransplantation Regeneration der Spermatogenese.

Copyright © 2014 Amerikanische Gesellschaft für Reproduktionsmedizin. Herausgegeben von Elsevier Inc. Alle Rechte vorbehalten.


Einführung

Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine Autoimmunerkrankung, die chronische Entzündungen in den Gelenken sowie in anderen Organen wie der Lunge verursacht. Lungenkomplikationen sind häufig (19� %) und gelten als die zweithäufigste Todesursache bei RA-Patienten (1𠄳). Klinische Daten von RA-Patienten, die zeigen, dass Autoantikörper (Auto-Abs) gegen citrullinierte Proteine ​​in den bronchoalveolären Lavageflüssigkeiten in der präklinischen Phase (5� Jahre) vor Entzündung und Zerstörung der Gelenke nachgewiesen werden, haben zu einer langen -bestehende Hypothese, dass die Autoimmunität der Schleimhaut einer anderen systemischen Entwicklung einer Autoimmunerkrankung bei RA vorausgehen könnte (4). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Lunge eine initiierende Stelle für RA-bedingte Autoimmunität sein könnte (4). Dementsprechend bietet die Definition der RA-bedingten Lungenpathogenese, ein wenig verstandenes Thema, und die Identifizierung der Wirkstoffe, die sie mildern könnten, große therapeutische Möglichkeiten sowohl für RA-bedingte Lungen- als auch Gelenkerkrankungen.

K/BxN-Mäuse sind ein Autoimmun-Arthritis-Modell, bei dem transgene KRN-T-Zellen Glukose-6-Phosphat-Isomerase (GPI), das Selbstantigen (Ag), das von MHC-Klasse-II-I-A-g7-Molekülen präsentiert wird, erkennen. Wie bei menschlichen RA-Patienten sind Auto-Ak entscheidend für die Krankheitspathogenese bei K/BxN-Mäusen (5). Wichtig ist, dass K/BxN-Mäuse zuvor gezeigt haben, dass sie induzierbare bronchus-assoziierte lymphoide Gewebe (iBALT)-ähnliche Strukturen in ihren Lungen entwickeln (6), ektope lymphoide Gewebe, von denen bekannt ist, dass sie mit Lungengewebeschäden bei RA-Patienten korrelieren (7). Follikuläre T-Helferzellen (Tfh) sind eine entscheidende Untergruppe der CD4 + T-Zellen, die den B-Zellen helfen, hochaffine und hochtitrige ABS zu produzieren (8�), und eine übermäßige Tfh-Zellantwort kann zu vielen Autoimmunerkrankungen einschließlich RA ( 11). T-Helfer-17 (Th17)-Zellen, ein T-Effektor-Zelltyp, der an vielen Autoimmunerkrankungen beteiligt ist, fördern die Auto-Ab-Produktion und Entzündung (12). Unsere früheren Daten haben gezeigt, dass durch segmentierte filamentöse Bakterien (SFB) induzierte Tfh- und Th17-Zellen der Darmmikrobiota signifikant zur Auto-Ak-Produktion bei K/BxN-Mäusen beitragen, und ein Mangel an einem der T-Effektorzelltypen die Auto-Ak-Produktion und Autoimmunreaktionen stark verbessert Arthritisentwicklung (13, 14).

Retinsäure, ein Metabolit von Vitamin A, hat ein breites Spektrum biologischer Aktivität, einschließlich der Regulierung von Immunreaktionen (15). AM80 ist eine synthetische Retinsäure, die sich im Vergleich zu all-trans-Retinsäure, einem der aktivsten physiologischen Vertreter der Retinoid-Metaboliten, durch eine höhere Stabilität und weniger potenzielle Nebenwirkungen auszeichnet (16, 17). Es wurde berichtet, dass Retinsäure und AM80 viele Autoimmunreaktionen verbessern, einschließlich experimenteller Autoimmunmyositis, experimenteller Autoimmunenzephalitis und kollageninduzierter Arthritis (18�). Was die Wirkungen von Retinsäure in der Lunge angeht, hat sich gezeigt, dass die Behandlung mit Retinsäure das Lungenemphysem aufhebt (22, 23), aber über ihre Wirkung bei autoimmunbedingten Lungenerkrankungen ist wenig bekannt. In vitro Kultur von Retinsäure erhöht die Expression des sich im Darm einfindenden Rezeptors Integrin 㬔㬧 auf T-Zellen (24�). Die 㬔㬧-Integrinrezeptoren werden von dendritischen Zellen (DCs) aus Peyer’s-Pflastern (PPs) und mesenterialen Lymphknoten (LNs) auf Lymphozyten geprägt (26, 27). Eine kürzlich durchgeführte Studie ergab, dass Lungen-DCs auch das sich im Darm einfindende Integrin 㬔β . hochregulieren können in vitro und in vivo (28). Ein Großteil der entzündungshemmenden Wirkung von Retinsäure hängt von der Hemmung von Th17 und der Förderung von Foxp3 + regulatorischen T-Zell-(Treg)-Antworten ab (15, 29). Trotz einer starken Implikation der Beteiligung von Retinsäure an der Schleimhaut ist viel weniger über ihre Rolle bei Th17- und Treg-Reaktionen der Schleimhaut bekannt in vivo wie in der Lunge und Dünndarm-Lamina propria (SI-LP). Darüber hinaus bleibt die Rolle der Retinsäure bei der Tfh-Antwort weitgehend unbekannt.

Hier untersuchen wir, ob das synthetische Retinoid AM80 autoimmunbedingte Lungenerkrankungen unterdrückt. Um seinen potenziellen therapeutischen Mechanismus aufzuklären, haben wir die Wirkung von AM80 auf die pathologischen T-Effektorzellen, Tfh- und Th17-Zellen sowie auf Tregs in mukosalen und nicht-mukosalen Immunkompartimenten verglichen. Wir bestimmen einen neuen Winkel des therapeutischen Mechanismus von Retinsäure, indem wir fragen, ob AM80 Autoimmunreaktionen unterdrückt, indem pathologische T-Effektorzellen wie Tfh-Zellen und Th17-Zellen in den Darm und damit weg von den systemischen (Nicht-Darm-) Entzündungsgeweben umgeleitet werden . Es ist erwähnenswert, dass wir, obwohl wir diese Studie mit einem Fokus auf die Wirkung von Retinsäure auf RA-bedingte Lungenerkrankungen begonnen haben, auch die Wirkung von AM80 auf Gelenkerkrankungen in unsere Analyse einbezogen haben. Diese Analysen zeigen, dass unsere Ergebnisse in der Lunge ohne weiteres auf Gelenkerkrankungen übertragbar sind, da wir eine starke Korrelation zwischen den immunregulatorischen Wirkungen von AM80 bei RA-bedingten Gelenk- und Lungenerkrankungen zeigen.


Messung von Apoptose und anderen Formen des Zelltods

Da sich der programmierte Zelltod (PCD) oder Apoptose als wichtiger Regulator der Entwicklung und Homöostase in vielzelligen Organismen herausgebildet hat, wurden Methoden entwickelt, um Apoptose zu quantifizieren und von Nekrose zu unterscheiden. Diese Einheit präsentiert eine Reihe von Assays für diese Zwecke, von denen viele technisch sehr einfach sind und sich ideal für die Untersuchung hämatopoetischer Zellen eignen. Das erste Basisprotokoll ermöglicht die qualitative und quantitative Beurteilung der Apoptose in Lymphozyten-Zellkulturen mittels Licht- oder Fluoreszenzmikroskopie. Es folgen drei Protokolle, die entwickelt wurden, um nukleare DNA-Fragmentierung nachzuweisen, und unterstützende Protokolle beschreiben Verfahren zur radioaktiven Markierung der DNA und des Zytoplasmas der zu testenden Zellen. Anschließend werden Techniken beschrieben, die apoptotische Zellen unter Verwendung von Durchflusszytometrie quantifizieren, und unterstützende Protokolle stellen Verfahren zum Priming von T-Zellklonen bzw. frisch isolierten Lymphknotenzellen für T-Zellrezeptor (TCR)-induzierte Apoptose bereit. Ein quantitativer Nachweis der DNA-Fragmentierung in apoptotischen Zellen wird ebenfalls beschrieben. TdT-vermittelte dUTP-Biotin-Nick-End-Markierungs-(TUNEL)-Verfahren werden für den Nachweis apoptotischer Zellen bereitgestellt, zusammen mit Verfahren zur durchflusszytometrischen Quantifizierung apoptotischer Zellen unter Verwendung von TUNEL und TUNEL-Färbung von Gewebeschnitten zur Identifizierung apoptotischer Zellen. Da über die molekularen Wege des programmierten Todes noch vieles unvollständig verstanden ist, ist es wahrscheinlich am besten, mehr als eines der grundlegenden Protokolle durchzuführen, um eine Beobachtung des apoptotischen Zelltods zu bestätigen.


ERGEBNISSE

Klinische Untersuchungsbefunde

Insgesamt entwickelten 6 der 12 Versuchsmäuse, denen Kollagen injiziert wurde, eine schwere Arthritis mit deutlichen klinischen Manifestationen wie Rötung, Schwellung und Lahmheit der Beingelenke sowie einem erhöhten Lymphozyten:Granulozyten-Verhältnis 30 Tage nach Induktion der Arthritis (weitere Daten sind auf Anfrage beim korrespondierenden Autor erhältlich). Klinische Manifestationen von RA wurden bei einer gesunden Kontrollmaus mit einem normalen Lymphozyten:Granulozyten-Verhältnis von 3:1 nicht beobachtet.

Ergebnisse der In-vivo-Bildgebung

MSOT 2 Stunden 30 Minuten nach Injektion des L-Selectin/P-Selectin-zielenden Kontrastmittels dPGS-NIR in die Gliedmaßen der Maus lieferte einen optimalen Kontrast zwischen den gesunden Beinen und den arthritischen Beinen im Vergleich zu verschiedenen Zeitpunkten bis zu 240 Minuten (Ergebnisse nicht gezeigt). Die verarbeiteten MSOT-Bilder zeigten einen deutlichen Unterschied zwischen der rechten (gesunden) und linken (arthritischen) Seite von Tieren, die eine Kollageninjektion erhalten hatten und Entzündungssymptome entwickelt hatten. In Abhängigkeit vom Fortschreiten der Arthritis und ihren klinischen Charakteristika konnte bei allen Mäusen, bei denen eine Synovitis im MRT nachgewiesen wurde, ein signifikanter Anstieg des MSOT-Signals von >35% in den arthritischen Gelenken beobachtet werden, während nur eine gesunde Maus eine abweichende Akkumulation aufwies der Sonde in nur einem Glied (P = 0,023 für den Durchschnitt des gemessenen Signals in entzündeten Gelenken gegenüber dem Durchschnitt des gemessenen Signals in normalen Gelenken).

Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für ein Tier in einem fortgeschrittenen Stadium von Arthritis, wie es bei der klinischen Untersuchung festgestellt wurde, mit offensichtlicher Schwellung, Rötung und Steifigkeit der Extremität. In MSOT-Bildern mit einer einzelnen Beleuchtungswellenlänge von 860 nm erschien das linke Gelenk größer als das rechte Gelenk (Abbildungen 1A und D). Nach der multispektralen Entmischung schien das identifizierte Signal, d. h. die Akkumulation von dPGS-NIR, mehr Pixel zu besetzen und auch im linken Gelenk intensiver zu sein (Fig. 1B und E).

Multispektrale optoakustische Tomographie (MSOT) Bildgebung der Knöchel (Ein) und Knie (K) einer repräsentativen Maus in einem fortgeschrittenen Stadium der Arthritis unter Verwendung von Nahinfrarot(NIR)-Bildgebung mit polyanionischem dendritischem Polyglycerinsulfat (dPGS)-Kontrastmittel. A–F, MSOT-Bilder des linken und rechten Knöchels (EIN) und Knie (D) wurden bei einer Beleuchtungswellenlänge von 860 nm für den anatomischen Kontrast aufgenommen. MSOT-Signale für dPGS-NIR-Akkumulation und sauerstoffangereichertes Hämoglobin in den Knöcheln (B und C) und in den Knien (E und F) werden als Fluoreszenz-Overlays auf den anatomischen Bildern angezeigt. Ein Teil der Blase ist ebenfalls sichtbar. Balken = 5 mm. g und H, Sagittal T1-gewichtete Magnetresonanzbilder wurden vom linken Kniegelenk derselben Maus vor (G) und danach (H) Gadolinium-Injektion. BV = Blutgefäß.

Da eine rein visuelle Beobachtung nicht ausreicht, um eine Arthritis zu diagnostizieren, den entzündeten Bereich zu inszenieren und die Behandlung möglicherweise genau zu überwachen, haben wir in unserem Tiermodell eine quantitative Methode zum Vergleich des linken (arthritischen) und rechten (gesunden) Gelenks entwickelt. Bei dem in Abbildung 1 gezeigten repräsentativen Tier bedeutet dies eine Signalerhöhung von ∼ 72 % zwischen dem linken und rechten Gelenk, wobei das Signal der gesunden Seite einen dPGS-NIR-Signalwert von 83 willkürlichen Einheiten (AU) aufweist, verglichen mit >140 AU im arthritischen Knie. An den Knöcheln desselben Tieres erreichte das Verhältnis zwischen der gesunden Seite und der arthritischen Seite 600 % mit einem dPGS-NIR-Signalwert von 42 AU im rechten Gelenk gegenüber 300 AU im linken Gelenk.

Die MSOT-Bildgebung des sauerstoffreichen Hämoglobingehalts, ein guter Indikator für die Blutzirkulation innerhalb eines Tieres, zeigte, dass die Sonde zum Zeitpunkt der Bildgebung extravasiert und fast vollständig aus dem Blutfluss in den Knöcheln und Knien verschwunden war (Abbildungen 1B, C, E und F). Darüber hinaus zeigte die MSOT-Bildgebung, dass das Blutvolumen, das in der Nähe des entzündeten Gelenks zirkulierte, viel höher war als in den gesunden Beinen, wie es bei akuten Entzündungen zu erwarten ist. Im transversalen Bild des Knies (Abbildung 1F) zeigten die Vena saphena und die Arterie im arthritischen Bein eine Lumenoberfläche von ∼ 2,6 mm 2 im Vergleich zu 0,65 mm 2 im gesunden Bein.

Insgesamt zeigten die arthritischen Tiere mit mäßiger Entzündung eine mittlere ± SD-Differenz in der Sondenakkumulation von ∼48 ± 11%, wobei die Werte im linken Knie typischerweise zwischen 110 AU und 132 AU lagen, aber die Werte im rechten Knie lagen nahe bei denen in gesunde Tiere (84 AE). In extremeren Fällen erreichte der Unterschied in der Sondenakkumulation fast 80%.

Wenn zweidimensionale Bilder verwendet wurden, um ein dreidimensionales Volumen aufzubauen, wurde es einfacher, das Ausmaß und die Intensität der Entzündung in und um die Gelenke zu visualisieren. Mit dieser Technik konnte der basale Spiegel von dPGS-NIR im gesunden rechten Bein einer Maus gesehen werden. Im Gegensatz dazu konnte in dem Bein, das eine Kollageninduktion erhielt, die Zunahme sowohl des Ausmaßes als auch der Intensität des Kontrastmittelsignals rund um die Gelenke sowie oberhalb des Knöchels beobachtet werden (Video verfügbar unter http://www.cbi. ei.turn.de/index.php?id=109).

Parallel dazu wurde an denselben Mäusen eine MRT durchgeführt, um eine sagittale Ansicht des Kniegelenks vor und direkt nach Injektion des Gadolinium-Kontrastmittels zu erhalten. Bei Mäusen, die RA entwickelten, wie durch eine Kombination von klinischen Manifestationen und MRT-Ergebnissen bestimmt, konnten wir typischerweise eine Synovitis im Knie des linken Beins nahe der Injektionsstelle der Induktionsverbindung feststellen, während das gesunde rechte Knie (ohne Kollageninduktion) keine Befunde im Zusammenhang mit RA fehlten. Darüber hinaus waren bei einigen der arthritischen Mäuse leichte bis schwere Weichteilschwellungen in der Umgebung des Gelenks sowie Ödeme in der Nähe des Gelenks durch MRT erkennbar, begleitet von Rötungen, Schwellungen oder Lahmheiten des Gelenks.

Die Schwere der klinischen Symptome war mit dem Grad der im MRT sichtbaren pathologischen Veränderungen verbunden, was ein Staging der entzündeten Stelle ermöglichte. Das in Abbildung 1 dargestellte spezifische Tier zeigte eine sehr ausgedehnte Synovitis, hervorgehoben nach Gadolinium-Injektion im MRT (Abbildungen 1G und H), mit offensichtlichen klinischen Symptomen. Schwellungen wurden auch entlang der Wade und des Schienbeins beobachtet, und das Lymphozyten:Granulozyten-Verhältnis betrug 1,8, was bestätigte, dass ein Zustand akuter Entzündung vorlag.

Im Gegensatz dazu wurde in einem gesunden Gelenk (ohne Kollageninjektion oder die Extremität auf der rechten Seite eines injizierten Tieres) nur ein schwaches, aber unterscheidbares Signal im Knie- und Sprunggelenk durch MSOT detektiert, das als dPGS identifiziert werden konnte. NIR durch spektrale Entmischung (Abbildung 2). Die von den Gelenken auf jeder Seite erhaltene Signalstärke war visuell vergleichbar, was darauf hindeutet, dass nur eine basale Entzündung von L-Selektinen und P-Selektinen vorlag, was darauf hindeutet, dass keine Entzündung vorhanden war und ein gewisses Signal auch von der Blase gesehen werden konnte Bestätigung des in vorläufigen Fluoreszenzexperimenten beobachteten Ausscheidungsweges der Verbindung (Ergebnisse auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich). Bei gesunden Tieren betrug der Absolutwert der Differenz zwischen der dPGS-NIR-Signalintensität der beiden Seiten bei jedem Tier <30%, mit einer mittleren ± SD-Signalstärke von ∼84 ± 17 AU, ähnlich der auf der rechten Seite erhaltenen der injizierten Tiere.

MSOT-Bildgebung der Knöchel (Ein) und Knie (K) einer repräsentativen gesunden Maus unter Verwendung von NIR-Bildgebung mit dPGS-Kontrastmittel. A–F, MSOT-Bilder des linken und rechten Knöchels (EIN) und Knie (D) wurden bei einer Beleuchtungswellenlänge von 860 nm für den anatomischen Kontrast aufgenommen. MSOT-Signale für dPGS-NIR-Akkumulation und sauerstoffangereichertes Hämoglobin in den Knöcheln (B und C) und in den Knien (E und F) werden als Fluoreszenz-Overlays auf den anatomischen Bildern angezeigt. Teil der Blase (Bl) ist ebenfalls sichtbar. Balken = 5 mm. g und H, Sagittal T1-gewichtete Magnetresonanzbilder wurden vom linken Kniegelenk derselben Maus vor (G) und danach (H) Gadolinium-Injektion. BV = Blutgefäß.

Darüber hinaus waren die Blutmenge und das Volumen der Blutgefäße in den Gelenken von beiden Seiten gesunder Mäuse gleich, was bestätigt, dass keine Entzündung vorlag. Das Lumen der sichtbaren saphenösen Blutgefäße in der Nähe des Knies war auf beiden Seiten mit 0,65 mm 2 auf der linken Seite und 0,59 mm 2 auf der rechten Seite vergleichbar, und diese Werte waren ähnlich wie bei gesunden Knien Mäuse (Abbildung 2). Auf MR-Bildern von gesunden Tieren waren weder Synovitis noch Schwellung sichtbar (Abbildungen 2G und H).

Um die Effizienz der eingesetzten Methoden in dieser Tierkohorte zu beurteilen, führten wir einen systematischen Vergleich der Entzündungsstadien zwischen den klassischen Staging-Methoden und den MSOT-Befunden durch. Die Stadien wurden als Abwesenheit von Entzündung, geringe Entzündung oder starke Entzündung definiert (wie in Abbildung 3 dargestellt). MSOT-Befunde gesunder Gelenke (d. h. solche, die mit dem dPGS-NIR-Kontrastmittel als nicht arthritisch identifiziert wurden) korrespondierten mit dem Fehlen klinischer Symptome und dem Fehlen einer Synovitis auf MR-Bildern derselben Gelenke. Tiere, bei denen eine geringe Entzündung festgestellt wurde, zeigten auf MR-Bildern begrenzte klinische Symptome und eine leichte bis mittelschwere Synovitis. Tiere, deren MSOT-Bilder eine starke Entzündung anzeigten, wiesen auf MR-Bildern ausgedehnte klinische Symptome und eine mittelschwere bis schwere Synovitis auf. Es wurde bestätigt, dass beide Seiten gesunder Tiere ein ähnliches Niveau der dPGS-NIR-Akkumulation aufwiesen, während bei Tieren mit geringer bis mäßiger Entzündung der Unterschied in der dPGS-NIR-Akkumulation zwischen den Seiten fast 50 % betrug und bei Tieren mit . bis zu > 70 % betrug hohe Entzündung. Obwohl die berechnete Standardabweichung dieses Unterschieds signifikant war (von 7% für eine geringe Entzündung bis zu 15% für gesunde Tiere), blieb sie niedrig genug, um die Tiere in unserem Panel unterscheiden und kategorisieren zu können.

Unterschied im MSOT dPGS-NIR-Signal zwischen der gesunden und der entzündeten Seite bei einer Reihe von Tieren im Vergleich zu Bewertungen der Entzündung durch klinische Untersuchung und Magnetresonanztomographie. Die Gruppe von Mäusen, bei denen bei MSOT gesunde (nicht arthritische) Gelenke festgestellt wurden, zeigte keine sichtbaren Anzeichen einer Entzündung und eine normale Blutzellzahl. Die Gruppe der Mäuse mit geringer Entzündung hatte eine weniger schwere Synovitis und eine veränderte Blutzellzahl. Die Gruppe von Mäusen mit hoher Entzündung zeigte eine größere Schwere der Synovitis und ein niedriges Lymphozyten:Granulozyten-Verhältnis. Balken zeigen den Mittelwert ± SD-Prozentsatz, der die absoluten Werte der Differenz der dPGS-NIR-Akkumulation zwischen den Gliedmaßen darstellt. Siehe Abbildung 1 für Definitionen.

Ergebnisse der histopathologischen Analyse

Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen der Gliedmaßen von gesunden Mäusen und der rechten Gliedmaßen von arthritischen Mäusen zeigten keine pathologischen Veränderungen, während die linken Gliedmaßen von arthritischen Mäusen entzündliche Infiltrate in der Kapsel aufwiesen. Wie in den Abbildungen 4A–D dargestellt, zeigten gesunde Gelenke normale morphologische Strukturen, wie durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbung gezeigt, und eine sehr geringe und diffuse Anreicherung des Kontrastmittels im Kniegelenk. Im Gegensatz dazu zeigten die entzündeten Gelenke, wie durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbung bestätigt, eine starke Anreicherung des Kontrastmittels im arthritischen Bereich, was die Anreicherung der Sonde bestätigt, die makroskopisch in vivo auf MSOT beobachtet wurde. Diese Befunde weisen auf eine erhöhte Expression von L-Selektinen und P-Selektinen in dem Gebiet hin. Darüber hinaus zeigten die entzündeten Gelenke die klassischen morphologischen und physiologischen Merkmale der Arthritis. Insbesondere das Volumen der Synovialflüssigkeit erschien viel höher, mit einer Verzerrung der Kapselform. Es war eine Erosion des Knorpels bis zum Knochen zu sehen, zusammen mit ausgedehnten Infiltraten, die in die Kapsel eindringen. Entzündungszellen, insbesondere Leukozyten, waren vorhanden und diffundierten im gesamten Gelenk.

Mikroskopische Analyse der Mauskniegelenke. Die Kniegelenke einer gesunden Maus (EIN und C) und eine Maus mit Kollagen-induzierter Arthritis (B und D) wurden zur histopathologischen Analyse mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt (EIN und B) und ausgewertet durch Fluoreszenzbildgebung mit DAPI (blauer Kanal) und polyanionischem dendritischem Polyglycerinsulfat mit einem fluoreszierenden Indocarbocyanin-Konjugat als Kontrastmittel (roter Kanal) (C und D). Balken = 100 µm.


ZWEI STRATEGIEN ZUR MESSUNG VON GLEICHGEWICHTSKONSTANTEN

Zwei allgemeine Optionen stehen zur Verfügung, um Affinitäten zu messen. 1) In einer Gleichgewichtsexperiment, bestimmt man das Ausmaß der Reaktion in Abhängigkeit von der Konzentration eines der Reaktionspartner. Die Analyse dieser Daten ergibt die Gleichgewichtskonstante. 2) In a kinetisches Experiment, bestimmt man die Geschwindigkeiten der Hin- und Rückreaktion als Funktion der Konzentration eines der Reaktanten. Die Analyse dieser Daten ergibt die Geschwindigkeitskonstanten für die Hin- und Rückreaktionen. Das Verhältnis dieser Geschwindigkeitskonstanten ergibt die Gleichgewichtskonstante.

Der kinetische Ansatz ist aufschlussreicher, da er nicht nur den thermodynamischen Parameter, die Gleichgewichtskonstante, sondern auch die Geschwindigkeitskonstanten liefert, die die Dynamik des Systems charakterisieren. Beachten Sie, dass die Straße ein Weg von Geschwindigkeitskonstanten zu Gleichgewichtskonstanten ist. Nur die Affinität aus einem Gleichgewichtsexperiment zu kennen, zeigt nichts über die Geschwindigkeiten der Hin- oder Rückreaktionen. Obwohl im Allgemeinen stärker als Gleichgewichtsexperimente, erfordern kinetische Experimente oft mehr Reagenzien und ausgefeiltere Assays.


Ein neues Mausmodell der Gebrechlichkeit: die Cu/Zn-Superoxid-Dismutase-Knockout-Maus

Frailty ist ein geriatrisches Syndrom, das für die in den USA lebenden älteren Menschen ein wichtiges öffentliches Gesundheitsproblem darstellt. Obwohl mehrere Methoden entwickelt wurden, um Gebrechlichkeit beim Menschen zu messen, haben wir nur sehr wenig Verständnis für ihre Ätiologie. Da die molekularen Grundlagen der Gebrechlichkeit kaum verstanden sind, wären Mausmodelle von großem Wert, um zu bestimmen, welche Wege zur Entstehung von Gebrechlichkeit beitragen. Noch wichtiger ist, dass Mausmodelle beim Testen potenzieller Therapien zur Behandlung und möglicherweise Vorbeugung von Gebrechlichkeit von entscheidender Bedeutung wären. In diesem Artikel präsentieren wir Daten, die zeigen, dass Sod1KO-Mäuse, denen das antioxidative Enzym Cu/Zn-Superoxid-Dismutase fehlt, ein ausgezeichnetes Gebrechlichkeitsmodell sind, und wir vergleichen die Sod1KO-Mäuse mit dem einzigen anderen Mäusemodell für Gebrechlichkeit, Mäusen mit der Deletion des IL-10-Gens. Sod1KO-Mäuse weisen vier Merkmale auf, die verwendet wurden, um menschliche Gebrechlichkeit zu definieren: Gewichtsverlust, Schwäche, geringe körperliche Aktivität und Erschöpfung. Darüber hinaus zeigen Sod1KO-Mäuse eine erhöhte Entzündung und Sarkopenie, die stark mit menschlicher Gebrechlichkeit verbunden sind. Die Sod1KO-Mäuse zeigen auch Veränderungen in Signalwegen, von denen angenommen wurde, dass sie eine Rolle bei der Ätiologie der Gebrechlichkeit spielen: oxidativer Stress, mitochondriale Dysfunktion und Zellalterung. Anhand von Sod1KO-Mäusen zeigen wir, dass eine diätetische Einschränkung Merkmale von Gebrechlichkeit bei Mäusen verzögern/verhindern kann.

Schlüsselwörter: Cu/Zn-Superoxid-Dismutase Gebrechlichkeit Entzündung Oxidativer Stress Sarkopenie Seneszenz.

Figuren

Muskelmasse wird reduziert in…

Bei Sod1KO-Mäusen ist die Muskelmasse reduziert. ein Muskelmasse der Hinterbeine von WT…

Die Muskelkraft wird reduziert bei…

Die Muskelkraft ist bei Sod1KO-Mäusen reduziert. ein Griffstärke eines 9 Monate alten Männchens…

Freiwilliger Radlauf, Rotarod Performance,…

Der freiwillige Radlauf, die Rotarod-Leistung und die Laufbandausdauer sind bei Sod1KO-Mäusen reduziert.…

Entzündungsmaßnahmen werden erhöht…

Entzündungsmaße sind bei Sod1KO-Mäusen erhöht. ein NFκB-Bindungsaktivität von…

Oxidativer Stress, mitochondriale Dysfunktion und…

Oxidativer Stress, mitochondriale Dysfunktion und Zellalterung sind bei Sod1KO-Mäusen erhöht. ein…


IVIS-Methoden und -Protokolle

  1. Besprechen Sie Ihr Experiment mit dem Core Director, um die optimale Kombination von Tieren und Bildgebungsprodukten zu bestimmen.
  2. Platte a Schwarz Well-Platte (Informationen zum Plattenkauf) mit Verdünnungen Ihres Bildgebungsprodukts in vitro, um sicherzustellen, dass Ihr Signal nachweisbar ist, bevor Sie In-vivo-Experimente versuchen.
  3. Empfohlene Tiere: Mäuse werden bevorzugt, da wir derzeit Ausrüstung für diese Tiere führen, wenn Ratten verwendet werden. Forscher müssen ihre eigenen Nasenkegel mitbringen, wenn sie das XGI-8-Anästhesiesystem verwenden möchten.
  4. In unserem IVIS Core haben wir noch keine größeren Säugetiere wie Kaninchen, Katzen oder Chinchillas verwendet, sondern flaches Gewebe dieser Tiere (bis zu

2) Akquisition: Optimierungs- und Bildgebungsprotokoll

Biolumineszenz

Notiz: Wenn Sie ein Experiment mit biolumineszenten und fluoreszierenden Reportern durchführen, stellen Sie die Fluoreszenz immer VOR der Biolumineszenz ab, da die Lumineszenz im gleichen Bereich wie einige Fluorophore (insbesondere Rottöne) emittieren und das Fluoreszenzsignal stören kann.

  1. Bestimme dein Optimum in vivo Bildgebungszeit, indem inkrementelle Bilder aufgenommen werden. Typisch für Glühwürmchen-Luciferase erreicht die Lumineszenz erst nach 10 Minuten eine nachweisbare Ausstrahlung.
  2. Verwenden Sie das Bedienfeld, um die Bildgebungsparameter entweder manuell einzustellen oder verwenden Sie den Bildgebungsassistenten der Software (unter Sequenzeinrichtung), um die Bildgebungsparameter automatisch einzustellen. Beachten Sie, dass lumineszierende Bilder oft längere Belichtungszeiten und eine niedrigere Blendenzahl (eine größere Blende lässt mehr Licht das CCD erreichen) erfordern als fluoreszierende Bilder. Idealerweise sollten Bilder nicht länger als 5 Minuten Belichtungszeit dauern. Die automatische Belichtung wird empfohlen, um optimale Belichtungsbedingungen zu finden, die von der CCD-Kamera automatisch eingestellt werden. Bild von Caliper
  3. Verwenden Sie Sequence Setup, um mehrere Bilder aufzunehmen, während Sie einen Parameter pro Bild ändern.
    Wählen Sie den Zeitpunkt, an dem der gemessene Signalwert im Gesamtphotonenfluss „plateaus“ (fast gleich bleibt) wie in der folgenden Abbildung.

Fluoreszenz

  1. Bestimmen Sie die maximale Signalstärke entweder manuell oder automatisch mit dem Imaging-Assistenten. Beachten Sie, dass Fluoreszenzbilder oft eine kürzere Belichtungszeit, eine größere Blende und spezifische Emissions- und Anregungsfilter erfordern. Denken Sie auch daran, dass tierisches Gewebe Autofluoreszenz erzeugen kann, sodass eine Hintergrundsubtraktion erforderlich sein kann
  2. Nehmen Sie eine Bildfolge auf (falls der Assistent Sie nicht bereits dazu aufgefordert hat)
  3. Wählen Sie das beste Filtersatzbild (indem Sie die Signal-Rausch-Verhältnisse aller Bilder in Folge vergleichen) für die Analyse oder fahren Sie mit den Hintergrundsubtraktionsfunktionen fort:

– Adaptive FL-Subtraktion
– Bild-Mathematik-Tool
– Spectral Unmixing

Tipps für erweiterte Bildgebung

3D-Rekonstruktion

  1. Verwenden der 3D-Rekonstruktionsfunktion der Living Image 3.2-Software, cell Nummer quantifiziert werden kann. Dazu muss mit der Kamera eine In-vitro-Messung einer stabil integrierten Zelllinie von Interesse durchgeführt werden. Aufgrund von Algorithmen in der Software, die Gewebeobstruktionen korrigieren, kann diese In-vitro-Messung dann mit der Signalmessung aus einer 3D-Rekonstruktion korreliert werden.
  2. Die Software Living Image 3.2 hat die Fähigkeit, den „Massenschwerpunkt“ des Signals relativ zur Tiertopographie, die für eine 3D-Rekonstruktion erzeugt wird, zu lokalisieren. Typischerweise ist es am Ende eines Experiments wichtig, das Tier zu sacken und zu sezieren, um die Signalposition zu bestätigen. Die Software bietet Millimetermessungen in den Seitenteilen, mit denen die Signaltiefe von verschiedenen Oberflächen des Tieres bestimmt werden kann.
  3. Organs can be imaged separately after dissection for comparison with in vivo images and for confirmation of source location.
  4. Remember that animals may be euthanized in the IVIS Core Facility (W914), but dissections must take place elsewhere.

To schedule equipment time or services please use the Cores Equipment Scheduler (CES). For new users click here.

Kontakt

Francesca Seta, PhD
Core Director
Evans Biomedical Research Center, X-Building
650 Albany St. 7th Floor, Room X-720
Boston, MA 02118
(617) 358-7814| [email protected]

Standort

IVIS Imaging Core
Boston University Medical Campus
Center for Advanced Biomedical Research, W-Building
700 Albany St., 9th Floor
Boston, MA 02118


Methoden

Mice and collagen-induced arthritis (CIA) model

PR-flox mice were obtained from Baylor College of Medicine (Houston, TX, USA). A targeting vector designed to replace part of exon 2 of the PR gene with a selectable marker was employed to create a strain of mice carrying a conditional null PR allele [40]. Prx1-Cre mice were purchased from the Jackson Laboratory. Eight-week-old female and male mice were immunized with 100 μg chicken collagen in completed Freund’s adjuvant (CFA) (Chondrex Inc. Redmond WA USA). On day 21, the mice were boosted with 100 μg chicken collagen in in-completed Freund’s adjuvant (IFA) subcutaneously. On day 24, all mice received 50 μg LPS E. coli O111: B4 (Sigma St. Louis, MI USA) via intraperitoneal injection (i.p.) in normal saline. The mice were euthanized on day 50. The onset of the CIA usually occurs on day 26, after initial immunization, and the disease model generally lasts 40 days [41,42,43,44,45].

PCR-based strategies were used for genotyping mouse genomic DNA. All animal work was done in compliance with the guiding principles of UC Davis’s “Care and Use of Animals.” Mice were housed in the animal facility under strictly controlled environmental conditions (12-h light/dark cycle, room temperature 22 °C), and fed ad libitum (food and water). The Institutional Animal Care and Use Committee of the University of California Davis approved the animal protocol.

T cell stimulation for FACS

Total mononuclear cells were collected from peripheral blood using the Ficoll-Paque density gradient method. The cells were then incubated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) in combination with ionomycin for 3 days before running fluorescence-activated cell sorting (FACS). We used the following key markers for activated T cells CD3/PerCP-Cy5.5 (Total T), CD25/PE-CF594, and CD45RO/PE-Cy7 (R &D Systems, Minneapolis, MN, USA).

Measurements of inflammation, bone erosion, and cartilage damage

Whole knee and ankle joints were fixed, decalcified, embedded in paraffin, and stained with hematoxylin or Safranin-O. Inflammation was scored semi-quantitatively from 0 to 5: 0 = normal 1 = minimal infiltration of inflammatory cells and/or mild edema 3 = moderate infiltration 4 = marked infiltration and 5 = severe infiltration. For bone erosion, joint sections were stained for tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and counterstained with hematoxylin (Sigma St Louis, IL, USA). A score of 0–5 was assigned for bone erosion: 0 = normal 1 = minimal (small areas of bone resorption, not readily apparent on low magnification) 2 = mild (more areas of resorption in trabecular and cortical bone) 3 = moderate (obvious bone resorption of trabecular and cortical bone, without defects in cortex or loss of trabeculae) 4 = marked (full-thickness defects in cortical bone and marked trabecular bone loss) and 5 = severe (defects in the entire cortex, marked trabecular bone loss) [46,47,48]. Total TRAP+ cells within the subchondral area were counted and presented as TRAP+ cell/bone surface. Cartilage damage was calculated by the loss of Safranin-O staining that was scored on a semi-quantitative scale from 0 to 4: 0 = intact 1 = minor (< 10%) 2 = moderate (10–50%) 3 = high (50–80%) and 4 = severe (80–100%) [49, 50]. Two blinded observers performed all the scorings. Data are presented as the average of the scores of both observers.

Bone mass measurements by microCT

The right knee joints including both the distal femurs (DFM) and the proximal tibiae were scanned and analyzed using VivaCT 40 (Scanco Medical, Bassersdorf, Switzerland) with a voxel resolution of 10 μm in all three spatial dimensions and a mono-energetic (70 Kev) X-ray source. We evaluated the entire knee covering a total of 645 mm in length centered around the knee joint to obtain total knee bone volume/tissue volume (BV/TV) ratio [34, 51, 52] using 3D image-registration schemes Gaussian filters of sigma = 0.8, support = 1, and threshold = 180 for total knee and DFM. Gaussian filters of sigma = 1, support = 2, and threshold = 280 were applied to register the paw.

Knee histopathology

The left knee joints were fixed in 10% phosphate-buffered saline formalin for 2 days, decalcified in 10% EDTA for 3 weeks, and embedded in paraffin. Sections were stained with Safranin-O—Fast green for measurement of articular cartilage thickness, subchondral bone plate thickness, subchondral trabecular bone number and diameter, and cartilage content using Bioquant Imaging software (Bioquant Imaging System, Nashville, VA USA) [51, 52].

Statistical analysis

The results are expressed as mean ± standard deviation for bone structure measures, bone turnover, and bone strength variables. Two-way ANOVA was used to account for genotype and sex. If significant differences were observed, then a Sidak’s multiple comparisons test was used to assess pairwise comparisons. Ein Wert von P < 0.05 was considered statistically significant. Data were analyzed using the GraphPad Prism 8 software package (La Jolla, CA, USA).


Contents

The typical ADCC involves activation of NK cells by antibodies in a multi-tiered progression of immune control. [5] A NK cell expresses Fcγ receptors. These receptors recognize and bind to the reciprocal portion of an antibody, such as IgG, which binds to the surface of a pathogen-infected target cell. The most common of these Fc receptors on the surface of an NK cell is CD16 or FcγRIII. Once the Fc receptor binds to the Fc region of the antibody, the NK cell releases cytotoxic factors that cause the death of the target cell.

During replication of a virus, some of the viral proteins are expressed on the cell surface membrane of the infected cell. Antibodies can then bind to these viral proteins. Next, the NK cells which have reciprocal Fcγ receptors will bind to that antibody, inducing the NK cell to release proteins such as perforin and proteases known as granzymes, which causes the lysis of the infected cell to hinder the spread of the virus.

Large parasites like helminths are too big to be engulfed and killed by phagocytosis. They also have an external structure or integument that is resistant to attack by substances released by neutrophils and macrophages. After IgE coat these parasites, the Fc receptor (FcɛRI) of an eosinophil will recognize IgE. Subsequently, interaction between FcεRI and the Fc portion of helminth-bound IgE signals the eosinophil to degranulate.

Several laboratory methods exist for determining the efficacy of antibodies or effector cells in eliciting ADCC. Usually, a target cell line expressing a certain surface-exposed antigen is incubated with antibody specific for that antigen. After washing, effector cells expressing Fc receptor CD16 are co-incubated with the antibody-labelled target cells. Effector cells are typically PBMCs (peripheral blood mononuclear cell), of which a small percentage are NK cells (Natural Killer cell) less often they are purified NK cells themselves. Over the course of a few hours a complex forms between the antibody, target cell, and effector cell which leads to lysis of the cell membrane of the target. If the target cell was pre-loaded with a label of some sort, that label is released in proportion to the amount of cell lysis. Cytotoxicity can be quantified by measuring the amount of label in solution compared to the amount of label that remains within healthy, intact cells.

The classical method of detecting this is the Chromium-51 [ 51 Cr] release assay the Sulfur-35 [ 35 S] release assay is a little used radioisotope-based alternative. Target cell lysis is determined by measuring the amount of radiolabel released into the cell culture medium by means of a gamma counter or scintillation counter. A variety of non-radioactive methods are now in widespread use. Fluorescence-based methods include such things as direct labelling with a fluorescent dye like calcein or labelling with europium that becomes fluorescent when released Eu 3+ binds to a chelator. Fluorescence can be measured by means of multi-well fluorometers or by flow cytometry methods. There are also enzymatic-based assays in which the contents of the lysed cells includes cellular enzymes like GAPDH that remain active supplying a substrate for that enzyme can catalyze a reaction whose product can be detected by luminescence or by absorbance.

NK cells are involved in killing tumor cells and other cells that may lack MHC I on their surface, indicating a non-self cell. NK cells have been shown to behave similarly to memory cells due to their ability to react to destroy non-host cells only after interacting with a host cell. As NK cells are not themselves specific to certain pathways of immune control, they are utilized a majority of the time in ADCC as a less discriminate cell destroyer than antibody-specific apoptosis mechanisms. The ability of activated ex vivo NK cells has been a topic of interest for the treatment of tumors. After early clinical trials involving activation through cytokines produced poor results and severe toxicological side effects, more recent studies have produced success in regulating metastatic tumors using interleukin proteins to activate the NK cell. [6]

The effects against solid tumors of trastuzumab and rituximab monoclonal antibodies have been shown in experiments with mice to involve ADCC as an important mechanism of therapeutic action. [7] In the clinic, the FcgRIII 158V/F polymorphism interfere with the ability to generate ADCC responses in vitro during trastuzumab treatment.

Multiple myeloma can be treated with daratumumab (Darzalex) monoclonal antibody. [8] Studies with in vitro materials and patient materials indicate that ADCC is an important mechanism, along with CDC (Complement-dependent cytotoxicity). [9]

ADCC as used in immune control is typically more useful for viral infections than bacterial infections due to IgG antibodies binding to virus-related antigens over prokaryotic cells. [10] Instead of ADCC removing outside toxins, immunoglobulins neutralize products of infecting bacteria and encase infected host cells that have had bacterial toxins directly inserted through the cell membrane.

ADCC is also important in the use of vaccines, as creation of antibodies and the destruction of antigens introduced to the host body are crucial to building immunity through small exposure to viral and bacterial proteins. Examples of this include vaccines targeting repeats in toxins (RTX) that are structurally crucial to a wide variety of erythrocyte-lysing bacteria, described as hemolysins. [11] These bacteria target the CD18 portion of leukocytes, which has historically been shown to impact ADCC in adhesion-deficient cells. [12]


Quantitative polymerase chain reaction

Firestein, G.S. 2003. Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Natur 423(6937): 356–361.

McInnes, I.B., and G. Schett. 2011. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine 365(23): 2205–2219.

Smolen, J.S., and G. Steiner. 2003. Therapeutic strategies for rheumatoid arthritis. Nature Reviews. Drug Discovery 2(6): 473–488.

Isaacs, J.D., and G. Ferraccioli. 2011. The need for personalised medicine for rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases 70(1): 4–7.

van der Pouw Kraan, T.C., F.A. van Gaalen, P.V. Kasperkovitz, N.L. Verbeet, T.J. Smeets, M.C. Kraan, et al. 2003. Rheumatoid arthritis is a heterogeneous disease: evidence for differences in the activation of the STAT-1 pathway between rheumatoid tissues. Arthritis and Rheumatism 48(8): 2132–2145.

Schena, M., D. Shalon, R. Heller, A. Chai, P.O. Brown, and R.W. Davis. 1996. Parallel human genome analysis: microarray-based expression monitoring of 1000 genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93(20): 10614–10619.

Nolan, T., R.E. Hands, and S.A. Bustin. 2006. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nature Protocols 1(3): 1559–1582.

Heid, C.A., J. Stevens, K.J. Livak, and P.M. Williams. 1996. Real time quantitative PCR. Genome Research 6(10): 986–994.

Bustin, S.A., and T. Nolan. 2004. Pitfalls of quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. Journal of Biomolecular Techniques: JBT 15(3): 155–166.

Udvardi, M.K., T. Czechowski, and W.R. Scheible. 2008. Eleven golden rules of quantitative RT-PCR. The Plant Cell 20(7): 1736–1737.

Peters, I.R., C.R. Helps, E.J. Hall, and M.J. Day. 2004. Real-time RT-PCR: considerations for efficient and sensitive assay design. Zeitschrift für immunologische Methoden 286(1–2): 203–217.

Fleige, S., and M.W. Pfaffl. 2006. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molekulare Aspekte der Medizin 27(2–3): 126–139.

Nolan, T., R.E. Hands, W. Ogunkolade, and S.A. Bustin. 2006. SPUD: a quantitative PCR assay for the detection of inhibitors in nucleic acid preparations. Analytische Biochemie 351(2): 308–310.

Rieu, I., and S.J. Befugnisse. 2009. Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics. The Plant Cell 21(4): 1031–1033.

Tricarico, C., P. Pinzani, S. Bianchi, M. Paglierani, V. Distante, M. Pazzagli, et al. 2002. Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction: normalization to rRNA or single housekeeping genes is inappropriate for human tissue biopsies. Analytische Biochemie 309(2): 293–300.

Vandesompele, J., K. De Preter, F. Pattyn, B. Poppe, N. Van Roy, A. De Paepe, et al. 2002. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology 3(7), RESEARCH0034.

Pfaffl, M.W., A. Tichopad, C. Prgomet, and T.P. Neuvians. 2004. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper–Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnology Letters 26(6): 509–515.

Andersen, C.L., J.L. Jensen, and T.F. Orntoft. 2004. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Krebsforschung 64(15): 5245–5250.

Libus, J., and H. Storchova. 2006. Quantification of cDNA generated by reverse transcription of total RNA provides a simple alternative tool for quantitative RT-PCR normalization. BioTechniken 41(2): 156. 158, 160 passim.

Verweij, C.L. 2009. Transcript profiling towards personalised medicine in rheumatoid arthritis. The Netherlands Journal of Medicine 67(11): 364–371.

Pombo-Suarez, M., M. Calaza, J.J. Gomez-Reino, and A. Gonzalez. 2008. Reference genes for normalization of gene expression studies in human osteoarthritic articular cartilage. BMC Molecular Biology 9: 17.

Hanafy, S., and F. Jamali. 2011. Adjuvant arthritis influences expression of housekeeping genes. Inflammation Research: Official Journal of the European Histamine Research Society … [et al.] 60(6): 521–523.

Jiang, C., L. Meng, W. Zhu, M. Shahzad, X. Yang, and S. Lu. 2009. Housekeeping gene stability in pristane-induced arthritis and antigen-induced pulmonary inflammation of rats. Inflammation Research: Official Journal of the European Histamine Research Society 58(9): 601–609.

Kouskoff, V., A.S. Korganow, V. Duchatelle, C. Degott, C. Benoist, and D. Mathis. 1996. Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Zelle 87(5): 811–822.

Ditzel, H.J. 2004. The K/BxN mouse: a model of human inflammatory arthritis. Trends in der Molekularen Medizin 10(1): 40–45.

Lee, D.M., D.S. Friend, M.F. Gurish, C. Benoist, D. Mathis, and M.B. Brenner. 2002. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Wissenschaft 297(5587): 1689–1692.

Monach, P.A., P.A. Nigrovic, M. Chen, H. Hock, D.M. Lee, C. Benoist, et al. 2010. Neutrophils in a mouse model of autoantibody-mediated arthritis: Critical producers of Fc receptor gamma, the receptor for C5a, and lymphocyte function-associated antigen 1. Arthritis and Rheumatism 62(3): 753–764.

Matzelle, M.M., M.A. Gallant, K.W. Condon, N.C. Walsh, C.A. Manning, G.S. Stein, et al. 2012. Resolution of inflammation induces osteoblast function and regulates the Wnt signaling pathway. Arthritis and Rheumatism 64(5): 1540–1550.

Montero-Melendez, T., H.B. Patel, M. Seed, S. Nielsen, T.E. Jonassen, and M. Perretti. 2011. The melanocortin agonist AP214 exerts anti-inflammatory and proresolving properties. The American Journal of Pathology 179(1): 259–269.

Patel, H.B., K.N. Kornerup, A.L. Sampaio, F. D’Acquisto, M.P. Seed, A.P. Girol, et al. 2012. The impact of endogenous annexin A1 on glucocorticoid control of inflammatory arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases 71(11): 1872–1880.

Savli, H., A. Karadenizli, F. Kolayli, S. Gundes, U. Ozbek, and H. Vahaboglu. 2003. Expression stability of six housekeeping genes: a proposal for resistance gene quantification studies of Pseudomonas aeruginosa by real-time quantitative RT-PCR. Zeitschrift für Medizinische Mikrobiologie 52(Pt 5): 403–408.

Chen, M., E. Boilard, P.A. Nigrovic, P. Clark, D. Xu, G.A. Fitzgerald, et al. 2008. Predominance of cyclooxygenase 1 over cyclooxygenase 2 in the generation of proinflammatory prostaglandins in autoantibody-driven K/BxN serum-transfer arthritis. Arthritis and Rheumatism 58(5): 1354–1365.

Patel, H.B., M. Bombardieri, A.L. Sampaio, F. D’Acquisto, M. Gray, P. Grieco, et al. 2010. Anti-inflammatory and antiosteoclastogenesis properties of endogenous melanocortin receptor type 3 in experimental arthritis. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 24(12): 4835–4843.

Al-Kashi, A., T. Montero-Melendez, N. Moradi-Bidhendi, J.P. Gilligan, N. Mehta, and M. Perretti. 2013. The calcitonin and glucocorticoids combination: mechanistic insights into their class-effect synergy in experimental arthritis. PloS One 8(2): e54299.

Dabek, J., J. Wilczok, A. Kulach, and Z. Gasior. 2010. Altered transcriptional activity of gene encoding GAPDH in peripheral blood mononuclear cells from patients with cardiac syndrome X—an important part in pathology of microvascular angina? Archives of Medical Science AMS 6(5): 709–712.

Della Beffa, C., F. Klawonn, J.P. Menetski, H.R. Schumacher Jr., and F. Pessler. 2011. Evaluation of glyceraldehyde-3-phosphate, prolylpeptidyl isomerase A, and a set of stably expressed genes as reference mRNAs in urate crystal inflammation. BMC Research Notes 4: 443.

Waxman, S., and E. Wurmbach. 2007. De-regulation of common housekeeping genes in hepatocellular carcinoma. BMC Genomics 8: 243.

Glare, E.M., M. Divjak, M.J. Bailey, and E.H. Walters. 2002. beta-Actin and GAPDH housekeeping gene expression in asthmatic airways is variable and not suitable for normalising mRNA levels. Thorax 57(9): 765–770.

Wan, G., K. Yang, Q. Lim, L. Zhou, B.P. He, H.K. Wong, et al. 2010. Identification and validation of reference genes for expression studies in a rat model of neuropathic pain. Biochemical and Biophysical Research Communications 400(4): 575–580.

Foldager, C.B., S. Munir, M. Ulrik-Vinther, K. Soballe, C. Bunger, and M. Lind. 2009. Validation of suitable housekeeping genes for hypoxia-cultured human chondrocytes. BMC Molecular Biology 10: 94.

Perez, S., L.J. Royo, A. Astudillo, D. Escudero, F. Alvarez, A. Rodriguez, et al. 2007. Identifying the most suitable endogenous control for determining gene expression in hearts from organ donors. BMC Molecular Biology 8: 114.

Mori, R., Q. Wang, K.D. Danenberg, J.K. Pinski, and P.V. Danenberg. 2008. Both beta-actin and GAPDH are useful reference genes for normalization of quantitative RT-PCR in human FFPE tissue samples of prostate cancer. The Prostate 68(14): 1555–1560.

Arenas-Hernandez, M., and R. Vega-Sanchez. 2013. Housekeeping gene expression stability in reproductive tissues after mitogen stimulation. BMC Research Notes 6: 285.


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