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Protokoll für alkalische Phosphatase und Ligase zum Klonen


Im Bild ist das zirkuläre Molekül ein eingeschränkter Vektor und das lineare rote Molekül ist ein DNA-Insert. Ich habe dieses Protokoll in meinen Unterrichtsnotizen gefunden, aber ich verstehe nicht, wie es möglich ist, dass Ligase eine Reaktion zwischen 5'-OH und 5'-P katalysiert. Diese Reaktion sollte als Produkt eine 5'-5'-Brücke zwischen den 2 Nukleotiden des Inserts und dem Vektor bilden. Normalerweise repariert Ligase Nicks zwischen 5'-P und 3'-OH und schafft so 5'-3'-Bindungen zwischen Nukleotiden, die in Nukleinsäuren normal sind 5'-5' Bindung?


DNA-Ligase katalysiert die Bildung einer Bindung zwischen 3'-OH und 5'-PO4 seines Nukleinsäuresubstrats. (Siehe Lehnman, 1974) Die Ligationsbindung wird gebildet, wenn die richtigen Enden nahe beieinander liegen, wodurch die Ligase wirken kann. Lassen Sie uns Ihr Diagramm neu zeichnen und die 5'- und 3'-Bezeichnungen hinzufügen. Ich denke, das kann helfen, einige Punkte zu klären.

Was die alkalische Phosphatase-Behandlung mit Ligation angeht, denke ich, dass Dale und Greenaway es so viel besser gesagt haben, als ich es kann. Zitat (Dale und Greenaway, 1985):

[Die Strategie] besteht darin, die gespaltene Vektor-DNA mit alkalischer Phosphatase zu behandeln, die die 5'-Phosphatgruppe aus der DNA entfernt. Da die Anwesenheit eines terminalen 5'-Phosphats für die Wirkung der DNA-Ligase notwendig ist, kann ein dephosphorylierter DNA-Strang nicht an einer Ligationsreaktion teilnehmen. Da dies für beide Enden des linearisierten Vektors gilt, können die Enden nicht wieder zusammengefügt werden, dh die Regenerierung des Elternvektors ist unmöglich. Dies führt zu einer sehr geringen Transformationsfrequenz durch den Vektor (da lineare DNA sehr schlecht transformiert). Der Vektor 3'-Hydroxyl endet jedoch sind verfügbar zum Verbinden (durch DNA-Ligase) mit den 5'-Phosphat-Termini von beliebigen zu klonierenden DNA-Fragmenten. Dies führt zu einem zirkulären rekombinanten Molekül mit einem einzelsträngigen Nick an jedem Ende des Vektorteils. Diese Moleküle transformieren normalerweise genauso effizient wie das vollständig ligierte Produkt, und die Nicks werden nach der Transformation in vivo repariert. Somit erhöht die Phosphatase-Behandlung der Vektormoleküle den Anteil an Hybrid-DNA-Molekülen in der Population transformierter Zellen und verhindert auch die Bildung von oligomeren Formen des Vektors.

Verweise

Dale, J. W. und Greenaway, P. J. (1985) „Die Verwendung von alkalischer Phosphatase zur Verhinderung der Vektorregeneration“ Methoden Mol. Biol. 2:231-236. Link zum Papier

Lehnman, I. R. (1974) „DNA-Ligase: Struktur, Mechanismus und Funktion“ Wissenschaft 186:790-797. Link zum Papier


Klonen

Restriktionsenzyme (Restriktionsendonukleasen) sind Proteine, die DNA an (oder in der Nähe) bestimmter Erkennungsstellen schneiden (siehe Herstellerkataloge oder Restriktionsenzymdatenbank). Es gibt zwei Arten von Restriktionsenzymen, die sich darin unterscheiden, wie sie die Ziel-DNA schneiden:

Stumpfe Endenschneider. Diese Enzyme schneiden beide Stränge der Ziel-DNA an derselben Stelle und erzeugen stumpfe Enden.

Klebrige Endenschneider. Diese Enzyme schneiden beide Stränge der Ziel-DNA an verschiedenen Stellen und erzeugen 3'- oder 5'-Überhänge von 1 bis 4 Nukleotiden (sog. Sticky Ends).

Um ein DNA-Insert in einen Klonierungs- oder Expressionsvektor klonieren zu können, müssen beide mit zwei Restriktionsenzymen behandelt werden, die kompatible Enden erzeugen. Mindestens eines der verwendeten Enzyme sollte ein klebriger Endschneider sein, um sicherzustellen, dass der Einsatz in der richtigen Ausrichtung eingearbeitet wird.

Es spart Ihnen viel Zeit, wenn Sie beide Aufschlüsse gleichzeitig durchführen können (Doppelaufschluss). Nicht alle Restriktionsenzyme funktionieren in allen kommerziell erhältlichen Puffern gleich gut, daher lohnt es sich zu überprüfen (z.B. im Referenzanhang des New England Biolabs-Katalogs), welche Enzyme kompatibel sind und in welchem ​​Puffer. Um einen effizienten Verdau zu gewährleisten, sollten die beiden Erkennungsstellen mehr als 10 Basenpaare voneinander entfernt sein. Wenn eines der Enzyme ein schlechter Cutter ist oder wenn die Stellen 10 Basenpaare oder weniger getrennt sind, sollten die Verdauungen nacheinander durchgeführt werden. Der erste Verdau sollte mit dem Enzym durchgeführt werden, das am schlechtesten schneidet, und das zweite Enzym sollte hinzugefügt werden, nachdem der Verdau überprüft wurde, indem eine Probe des Reaktionsgemisches auf einem Agarosegel laufen gelassen wurde.

Für unsere Klonarbeit haben wir zwei Sticky End Cutter ausgewählt, die unterschiedliche 5'-Überhänge erzeugen:

  • 3'-Ende: Nco I. Seine Erkennungsstelle enthält die ATG Codon starten.
  • 5'-Ende: BamH I. Es ist billig und in den meisten Puffern aktiv.

Es wird empfohlen, das spezielle zu verwenden BamH I Puffer (New England Biolabs) für diese Doppelverdauung.


Mehr Informationen

Anwendungen

  • Entfernung der Phosphatgruppe, um die Selbstligation und den Vektorhintergrund zu reduzieren
  • Dephosphorylierung von DNA 5'-Termini vor Kinase-Markierungsreaktionen

Quelle

Lagerung

Bakterielle alkalische Phosphatase (E coli) ist extrem stabil und wird nicht vollständig hitzeinaktiviert, daher müssen die Reaktionsprodukte zur Inaktivierung des Enzyms zweimal durch Phenol-Chloroform-Extraktion und anschließende Ethanolfällung gereinigt werden.

Puffer

Geliefert mit 10X Reaktionspuffer [500 mM Tris-HCl (pH 9,0), 10 mM MgCl2]

Einheitendefinition

Eine Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die benötigt wird, um 1 µmol/min von . zu erzeugen P-Nitrophenol aus P-Nitrophenylphosphat bei 25°C und pH 8,0.

Konzentration

Produktzitate

Reid, T.W. &. Wilson, I.B.E. coli Alkaline Phosphatase. Enzym. 4, 373 &ndash 415 (1971).

Takanami, M. Analyse der 5'-terminalen Nukleotidsequenzen von Ribonukleinsäuren: I. Die 5'-Termini von Escherichia coli Ribosomale RNA. J.Mol. Biol. 23, 135 und 48 (1967).

Zusätzliche Produktinformationen

Informationen zu Lagerbedingungen, Produktkomponenten und technischen Spezifikationen finden Sie im Analysezertifikat des Produkts. Bitte beachten Sie die Kitkomponentenliste, um die Kitkomponenten zu bestimmen. Analysenzertifikate und Kitkomponentenlisten befinden sich auf der Registerkarte Dokumente.

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USA/Kanada: +1.800.662.2566 & Bulle Asien-Pazifik: +1.650.919.7300 & Bulle Europa: +33.(0)1.3904.6880 & Bulle Japan: +81.(0)77.565.6999
NUR FÜR FORSCHUNGSZWECKE. NICHT ZUR VERWENDUNG IN DIAGNOSTISCHEN VERFAHREN. & Kopie 2021 Takara Bio Inc. Alle Rechte vorbehalten. Alle Marken sind Eigentum von Takara Bio Inc. oder seinen verbundenen Unternehmen in den USA und/oder anderen Ländern oder ihren jeweiligen Eigentümern. Bestimmte Marken sind möglicherweise nicht in allen Gerichtsbarkeiten eingetragen. Weitere Informationen zu Produkten, geistigem Eigentum und eingeschränkter Nutzung finden Sie unter takarabio.com.

Takara Bio Europe ist ein Mitglied der Takara Bio Group, einem führenden Life-Science-Unternehmen, das sich der Verbesserung des menschlichen Zustands durch Biotechnologie verschrieben hat. Durch unsere Marken Takara, Clontech und Cellartis ist es unsere Mission, hochwertige innovative Tools und Dienstleistungen zu entwickeln, um die Entdeckung zu beschleunigen.


Mehr Informationen

Anwendungen

  • Reduzierung der linearen Vektorselbstligation und des Vektorhintergrunds während der Klonierung
  • Dephosphorylierung von DNA vor Kinase-Markierungsreaktionen
  • Schablonenvorbereitung vor dem 5'-End-Labeling
  • Proteindephosphorylierung

Quelle

Lagerung

Anmerkungen

Die alkalische Phosphatase aus Kälberdarm (CIAP) kann nicht vollständig durch Hitze inaktiviert werden, und daher wird empfohlen, das DNA-Produkt durch Gel- oder Spin-Säulen-Reinigung oder Phenol-Chloroform-Extraktion zu reinigen.

Puffer

Geliefert mit 10X Reaktionspuffer [500 mM Tris-HCl (pH 9,0), 10 mM MgCl2].

Einheitendefinition

Eine Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die 1 µmol/min von . erzeugt P-Nitrophenol aus P-Nitrophenylphosphat bei 37°C und pH 9,8.

Konzentration

Produktzitate

Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. Molekulares Klonen: ein Laborhandbuch. (Laboratorium Cold Spring Harbor, 1989).

Zusätzliche Produktinformationen

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Phosphatase-Behandlung von klebrigen Endprodukten? - (15.09.2006)

Versuch, ein 800 bp-Fragment in einen 2400 bp-Vektor zu inserieren. Beide wurden mit Bam HI und Hind III doppelt verdaut. Die beiden sollten mit dem Rapid Ligation Kit (T4-Ligase) von Roche ligiert werden. Ich hatte frühe Probleme, also habe ich es auf mich genommen, sowohl den verdauten Vektor als auch den verdauten 800 bp-Fragment mit Kälberdarm- und Garnelenphosphatsen zu dephosphorylieren.

Mir wurde gesagt, dass dies zwar für Ligationen mit stumpfen Enden in Ordnung sei, aber für Ligationen mit klebrigen Enden zumindest der Vektor oder das Insert Phosphate aufweisen muss, damit die Ligation fortschreiten kann. Bevor ich anfange, mehr Zeit mit Ligaturen und Transformationen zu verschwenden, kann mir jemand sagen, ob dies wahr ist oder eine alte Frauenmärchen ist?!!

Ich weiß, dass Sie den Vektor dephosphorilieren können, aber ich glaube nicht, dass Sie auch das Insert dephosphorilieren können: Wie kann man ohne freies Phosphat ligieren?

ja das stimmt
für einen Vektor ist die Dephosphorierung wichtig, um eine Vektorschließung zu vermeiden, aber
für die Einlage ist es nicht, da es nur ein Fragment ist

und dementsprechend ist der Vektor das, mit dem wir für die Ligation arbeiten müssen,
Daher sollte der Vektor unabhängig davon, ob er stumpfe Enden oder klebrige Enden hat, an beiden Enden ein freies 5-P haben.

warten wir mal auf andere antworten..

wir dephosphorylieren nur den Vektor, aber das ist nur für das Klonen von stumpfen Enden. Bei klebrigen Enden führen wir dieses Verfahren selten durch.

Wenn Sie sowohl den Vektor als auch das Insert dephosphorylieren, funktioniert die Ligation nicht.

Die Ligation mit klebrigen Enden funktionierte, wenn weder der Vektor noch das Insert dephosphoryliert wurden. Die Ligation funktionierte jedoch nicht mit einem mit Phosphatase behandelten Vektor und einem unbehandelten Insert. Ich bin mir nicht sicher warum, aber ich habe es einmal zum Laufen gebracht, also bin ich glücklich "33"

Kennt jemand eine gute Alternative für Novozyme 234 zur Protoplastenbildung?

Ich bin mir nicht sicher über die Protoplasten-Sache, wollte aber meine .02 hinzufügen.

für die Phosphatase kann das Enzym je nach verwendetem Typ und Reaktionsbedingungen die Enden Ihres DNA-Fragments zerkauen, nachdem es das Phosphat entfernt hat. Daher funktioniert es manchmal nicht, weil Sie vielleicht eines oder beide Enden zerstört haben, so dass die Seiten nicht mehr existieren und sie nicht in der Lage sind, wieder an ein komplementäres klebriges Ende zu religieren. Manchmal muss man mit den Bedingungen der Phosphatase-Reaktion spielen, um die beste Dephosphorylierung zu erreichen, ohne die DNA zu zerstören

Ich bin mir bei der Protoplasten-Sache nicht sicher, wollte aber meine .02 hinzufügen.

für die Phosphatase kann das Enzym je nach verwendetem Typ und Reaktionsbedingungen die Enden Ihres DNA-Fragments zerkauen, nachdem es das Phosphat entfernt hat. Daher funktioniert es manchmal nicht, weil Sie vielleicht eines oder beide Enden zerstört haben, so dass die Seiten nicht mehr existieren und sie nicht in der Lage sind, wieder an ein komplementäres klebriges Ende zu religieren. Manchmal muss man mit den Bedingungen der Phosphatase-Reaktion spielen, um die beste Dephosphorylierung zu erreichen, ohne die DNA zu zerstören

Sie haben nicht erwähnt, dass im Handbuch "33" eine Kombination aus Shrimps und alkalischen Kälberdarmphosphaten von Roche verwendet wurde. Würde erklären, warum ich eine erfolgreiche Ligation erhielt, wenn weder Vektor noch Insert dephosphoryliert wurden, und eine erfolglose Ligation, wenn der Vektor mit Phosphatase behandelt wurde.

Ich stimme Aimikin zu – Deposphorylierung ist ein Gleichgewicht zwischen der Minimierung Ihrer Chancen auf eine Vektor-Selbstligation und der Zerstörung Ihres Vektors.

Das fragliche Experiment benötigte überhaupt keine Dephosphorylierung, da (unter der Annahme, dass beide Enzyme den Vektor schneiden) eine Selbstligation des Vektors nicht möglich war. Wenn Sie jedoch einen Vektor aufgrund eines einzelnen Enzymverdaus oder eines stumpfen Verdaus deposphorylieren müssen, verwenden Sie sehr wenig Dephosphorylase, inkubieren Sie die Dephosphorylierungsreaktion für eine begrenzte Zeit (5 bis 15 Minuten bei 37 °C) und gelieren Sie Reinigen Sie den Vektor vor der Verwendung.


Design (Auswahl der Enzyme)

Viele DNA-Analysetools, einschließlich des Sequence Analyzer von Addgene, ermöglichen es Ihnen, zu identifizieren, welche Restriktionsschnittstellen in einer bestimmten Sequenz vorhanden sind. Bei der Auswahl von Restriktionsenzymen möchten Sie Enzyme auswählen, die:

  • Flankieren Sie Ihre Einlage, aber schneiden Sie nicht innerhalb Ihrer Einlage
  • sich an der gewünschten Stelle in Ihrem Empfängerplasmid befinden (normalerweise in der Multiple Cloning Site (MCS)), aber nicht an anderer Stelle auf dem Plasmid schneiden
  • Dies führt dazu, dass Ihr Insert die richtige Ausrichtung im Empfängerplasmid hat. (Sie möchten nicht die Antisense-Version Ihres Gens exprimieren!)
  • Sind im Rahmen mit Tags oder Fusionsproteinen im Empfängerplasmid (wenn Sie ein Fusionsprotein erstellen)

Idealerweise finden Sie für Ihre Subklonierung zwei verschiedene Restriktionsenzyme. Es ist auch möglich, ein einzelnes Enzym zu verwenden, dies erfordert jedoch eine Phosphatase-Behandlung Ihres Empfängerplasmids sowie später einen speziell entwickelten Testverdau, um zu überprüfen, ob das Insert in der richtigen Orientierung kloniert wurde.

Wenn Sie keine Enzyme finden, die diese Kriterien erfüllen, haben Sie keine Angst. Sie haben andere Möglichkeiten, wie zum Beispiel:

  • Hinzufügen gewünschter Restriktionsstellen, um Ihr Insert zu flankieren : Sie können das PCR-basierte Klonen verwenden und den Enden Ihrer Oligos Restriktionsstellen hinzufügen. Dadurch können Sie eine Version Ihres Inserts produzieren, die von Restriktionsschnittstellen flankiert wird, die mit dem MCS des Empfängerplasmids kompatibel sind. Sie müssen jedoch weiterhin Restriktionsenzyme vermeiden, die in Ihr Insert schneiden.
  • Hinzufügen der gewünschten Restriktionsschnittstellen zu Ihrem Empfängerplasmid : Sie können die MCS Ihres Empfängerplasmids mit Annealed-Oligo-Klonierung modifizieren.

Wenn Sie das Glück haben, mehrere Optionen für Enzyme zu haben, die Ihr Insert flankieren und zu einer korrekten Orientierung im Empfängerplasmid führen, ist es nützlich zu sehen, ob ein Enzymsatz im gleichen Restriktionsenzympuffer funktioniert (siehe New England Biolabs für mehr Informationen über Restriktionsenzympuffer). Wenn Sie Enzyme auswählen, die im gleichen Puffer funktionieren können, sparen Sie bei zukünftigen Schritten Zeit.


Sollten Sie alkalische Phosphatase (CIP) aus Kälberdarm beim Klonen von Plasmiden verwenden?

Ein obskures Manuskript von 1980 von Ellen Mossner und Kollegen [1] beschrieb zuerst seine Isolierung, aber die erste veröffentlichte Beschreibung der Verwendung von alkalischer Phosphatase (CIP) aus Kälberdarm beim Klonen von Genen wurde eine Weile später veröffentlicht — in Sambrook et al Handbuch, Molekulares Klonen (2. Auflage) [2]. Und so wurde die knifflige Wissenschaft geboren, CIP zur Dephosphorylierung eines Vektors zu verwenden.

CIP funktioniert, indem es die Phosphatgruppe vom 5′-Ende der linearisierten DNA entfernt, was bedeutet, dass Sie es verwenden können, um Ihr Vektormolekül zu dephosphorylieren, um zu verhindern, dass es sich selbst ligiert und Ihnen nach der Ligation und Transformation die Kopfschmerzen eines hohen leeren Vektorhintergrunds verursachen . Aber es kann eine echte Qual sein, damit zu arbeiten, denn:

1. Es ist schwierig, durch Hitzedenaturierung zu eliminieren. Das Protokoll sagt, das Enzym bei 65 ° C für 30 Minuten zu denaturieren, aber dies entfernt es nicht vollständig. Daher ist ein zusätzlicher Reinigungsschritt (Spin-Säule oder Phenolextraktion) erforderlich.

2. Es klebt wie eine Napfschnecke an den DNA-Enden, was die Entfernung noch schwieriger macht und die Ligatur beeinträchtigen kann.

3. Wenn sich die restliche CIP-Aktivität bis zur Ligation durchsetzt, wird das Insert dephosphoryliert, um eine Ligation zu verhindern.

4. Anekdotisch kann eine Überdosierung der Behandlung mit alkalischer Phosphatase die DNA schädigen. Ich habe jedoch nie einen Beweis dafür oder gute Ideen dafür finden können, wie es passieren könnte, außer in einer kürzlich durchgeführten Diskussion im Biotechniques-Forum, in der vermutet wurde, dass der Schaden durch unspezifische Nukleasen verursacht werden könnte .

Neuere Alternativen zu CIP

Die gute Nachricht ist, dass es einige neue Enzyme gibt, die diese Aufgabe erfüllen, jedoch ohne so viele Nachteile. Das sind Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) und NEB’s Antarctic Phosphatase (AP). Beide sind hitzelabiler als CIP, was bedeutet, dass sie durch Hitzedenaturierung leichter entfernt werden können.

Während jedoch auch SAP nach 30 Minuten bei 65 °C nicht vollständig eliminiert wird, ist AP, das nach nur 5 Minuten bei 65 °C vollständig zerstört wird, eine weit überlegene Wahl. Tatsächlich sagt NEB, dass es nach der Hitzedenaturierung des AP-behandelten Vektors sicher ist, ohne weiteren Reinigungsschritt direkt zur Legation zu gehen. Ich füge vor der Ligatur immer einen Reinigungsschritt hinzu, aber ich bin in vielen Dingen paranoid, also ignoriere mich einfach.

Sollten Sie also CIP beim Klonen verwenden? Ich würde nein sagen — warum solltest du? Warum wird CIP tatsächlich immer noch als Klonierungsreagenz verkauft? AP ist eine weit überlegene Wahl. Obwohl AP doppelt so viel kostet wie CIP, denke ich, dass Sie bei fehlgeschlagenen Klonexperimenten mit CIP wahrscheinlich mehr Geld verlieren, also ist die billigere Option eine falsche Ökonomie.

Was denken Sie? Verwenden Sie CIP?

(Oh, und wenn Sie wissen, ob die Legende von CIP-schädigenden DNA-Enden wahr ist, und vor allem, wenn Sie wissen, wie dies geschieht, würde ich es gerne wissen.)


Ligation unmöglich: Hilfe bei meinem Klonprotokoll?

Hallo zusammen, ich bin so frustriert über ein einfaches Klonen, dass ich dachte, ich würde mich an euch wenden, um einen Rat zu erhalten.

Ich versuche, ein 700-bp-Fragment in einen Expressionsvektor zu ligieren (NdeI/BamHI), aber nach 2 Monaten und 6 Versuchen habe ich noch kein erfolgreiches rekombinantes Plasmid erhalten. hier ist mein protokoll:

NdeI/BamHI-geschnittenes 700 bp-Fragment von pBlueScript und Gelreinigung – Insert wurde sequenziert und beide Restriktionsschnittstellen sind vorhanden. Ich habe diesen Verdau entweder als Doppelverdau oder als zwei Einzelverdaus versucht, um die Plasmid-Linearisierung dazwischen zu überprüfen. Nach der Reinigung sieht die Einlage auf einem Gel gut aus.

geschnittenen Vektor (wie oben, versuchten sowohl Doppelverdau als auch sequentielle Einzelverdauung), alkalische Phosphatase zu behandeln und Enzyme durch Hitze 20 Minuten lang bei 80°C abzutöten. Beide Restriktionsenzyme linearisieren den Vektor, wenn sie separat geschnitten werden, aber ich kann nicht überprüfen, ob der Vektor von beiden geschnitten wird.

über Nacht bei 16°C ligieren (Einfügen: Vektor 5:1), Hitzeschock in DH5a-Zellen umwandeln und auf Apramycin R selektieren. Ligase und kompetente Zellen haben bei allen meinen anderen Experimenten gut funktioniert, daher ist es unwahrscheinlich, dass das Problem hier liegt.

jedes Mal bekomme ich ein paar Hintergrundkolonien ohne Insert (Plasmid isoliert kleiner als leerer Vektor). Das Gen, mit dem ich arbeite, ist ein bakterieller Transkriptionsfaktor. Da es jedoch unter die Kontrolle eines Thiostrepton-induzierbaren Promotors gestellt wird, halte ich es für unwahrscheinlich, dass das Genprodukt transkribiert wird und für z. coli.

Mir wurde von etwas namens "Plasmid-Instabilität" erzählt, bei dem eine Transformation einfach nicht möglich ist, aber ich möchte andere potenzielle Fehler in der Methode vorher ausschließen. wenn dir noch etwas einfällt was ich versuchen kann lass es mich wissen. Danke!


Schau das Video: DNA Ligase u0026 Its Mechanism. Gap Sealing. Molecular Biology. Part-5. CSIR-NET Life Sciences (Januar 2022).