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Insertionsinaktivierung mit pBR322

Insertionsinaktivierung mit pBR322


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Ich habe Fragen zum Thema "Selektion mittels Insertionsinaktivierung".

In einem typischen DNA-Rekombinationsexperiment unter Verwendung des Plasmids pBR322, bei dem ein neues Gen anstelle von . eingefügt wird tet Gen wird gesagt, dass Einheiten mit dem rekombinanten Plasmid durch Züchten aller Bakterien in zwei verschiedenen Medien selektiert werden können: eines mit Tetracyclin und eines mit Ampicillin.

Ich weiß, dass pBR322 zwei Gene enthält, die es sowohl gegen Tetracyclin als auch gegen Ampicillin resistent machen, und auch, dass das neu geschaffene Plasmid nur gegen Ampicillin resistent ist, da es tet Gen ist nicht mehr funktionsfähig.

In der Platte mit Tetracyclin wachsen also nur Einheiten mit dem ursprünglichen Plasmid. In der Platte mit Ampicillin wachsen jedoch Einheiten mit dem ursprünglichen Plasmid und dem modifizierten Plasmid.

Wie kann dies eine Auswahl sein, wenn zwei verschiedene Arten von Entitäten in einer Platte wachsen?

Verstehe ich in diesem Fall die Bedeutung von "Auswahl" falsch?

Meine obige Erklärung scheint sehr unausgereift, daher wäre es großartig, wenn mir jemand ein tieferes Verständnis liefern könnte.


Die Ampicillin-Platte selektiert nach Bakterien, die mit dem Plasmid transformiert wurden, entweder dem ursprünglichen oder rekombinanten, während die Tetracyclin-Platte nur nach Bakterien selektiert, die mit dem ursprünglichen Plasmid transformiert wurden. Da Sie nur an dem rekombinanten Plasmid interessiert sind, müssen Sie eine Art Replika-Plattierung durchführen und die beiden Platten vergleichen, um abzuleiten, welche Kolonien das rekombinante Plasmid enthalten (die Kolonien, die auf Ampicillin, aber nicht auf Tetracyclin wachsen).


  • Transposons enthalten Signale, um die Expression eines unterbrochenen Gens zu verkürzen und es so zu inaktivieren.
  • Transposons sind weit verbreitete Werkzeuge in der Biologie, die häufig für die Insertionsmutagenese, groß angelegte Genunterbrechungsstudien und das Gen-Tagging verwendet werden.
  • Transposon-vermittelte Genunterbrechungsexperimente und Promotorfallen beruhen auf einer promiskuitiven, ungerichteten und pseudozufälligen Insertion des Transposons.
  • transponierbar: Kann (in jedem Sinne) transponiert werden.
  • Plasmid: Ein von den Chromosomen getrennter Kreis aus doppelsträngiger DNA, der in Bakterien und Protozoen vorkommt.

Ein transponierbares Element (TE) ist eine DNA-Sequenz, die ihre relative Position (Selbsttransponierung) innerhalb des Genoms einer einzelnen Zelle ändern kann. Der Transpositionsmechanismus kann entweder &ldquocopy and paste&rdquo oder &ldquocut and paste sein. &rdquo Transposition kann phänotypisch signifikante Mutationen erzeugen und die Genomgröße der Zelle verändern. Barbara McClintocks Entdeckung dieser Springgene zu Beginn ihrer Karriere brachte ihr 1983 den Nobelpreis ein.

Transposons in Bakterien tragen normalerweise ein zusätzliches Gen für eine andere Funktion als die Transposition für Antibiotikaresistenz. In Bakterien können Transposons von chromosomaler DNA zu Plasmid-DNA und zurück springen, was den Transfer und die dauerhafte Hinzufügung von Genen ermöglicht, die beispielsweise für Antibiotikaresistenzen kodieren (auf diese Weise können multiantibiotikaresistente Bakterienstämme erzeugt werden). Wenn den transponierbaren Elementen zusätzliche Gene fehlen, werden sie als Insertionssequenzen bezeichnet. Transposons sind semi-parasitäre DNA-Sequenzen, die sich replizieren und durch das Genom des Wirts ausbreiten können. Sie können als genetisches Werkzeug zur Analyse der Gen- und Proteinfunktion genutzt werden. Die Verwendung von Transposons ist bei Drosophila (bei der P-Elemente am häufigsten verwendet werden) und bei Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) und Bakterien wie Escherichia coli (E. coli) gut entwickelt.

Synthetische DNA-Transposon-Systeme werden konstruiert, um genau definierte DNA-Sequenzen in die Chromosomen von Wirbeltieren einzuführen, um neue Merkmale einzuführen und neue Gene und deren Funktionen zu entdecken (z. B. durch Etablierung eines Funktionsverlust-Phänotyps oder Geninaktivierung). Transposition ist ein präziser Vorgang, bei dem ein definiertes DNA-Segment aus einem DNA-Molekül herausgeschnitten und an eine andere Stelle im gleichen oder einem anderen DNA-Molekül oder Genom verschoben wird.

Abbildung: Transposon-System: Die Transposon-Systemanwendungen von Dornröschen.


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2. PUC Biologie Biotechnologie: Prinzipien und Prozesse One Mark Fragen und Antworten

Frage 1.
Haben eukaryotische Zellen Restriktionsendonukleasen? Rechtfertige deine Antwort.
Antworten:
Die eukaryontischen Zellen besitzen keine Restriktionsendonukleasen. Die eukaryotischen Zellen haben einige andere Abwehrmittel, d. h. das Immunsystem) gegen eine Virusinfektion.

Frage 2.
Welche Wirtszellen werden in der Gentechnik am häufigsten verwendet?
Antworten:
E coli.

Frage 3.
Welches sind die üblichen Vektoren, die zum Klonen von Genen in Pflanzen verwendet werden?
Antworten:
In Agrobacterium tumefaciens vorhandenes Tiplasmid.

Frage 4.
Wer hat die PCR-Technik entdeckt?
Antworten:
Kary Mullis.

Frage 5.
Was ist ein Bioreaktor?
Antworten:
Es handelt sich um einen technischen Aufbau zur Durchführung biologischer Reaktionen unter aseptischen Bedingungen.

Frage 6.
Nennen Sie die Technik, mit der DNA-Fragmente getrennt werden können?
Antworten:
Gelelektrophorese.

Frage 7.
Nennen Sie die Quelle der Taq-Polymerase?
Antworten:
Thermus aquaticus.

Frage 8.
Was sind rekombinante Proteine?
Antworten:
Proteine, die aus einer rekombinanten DNA oder einem transgenen Organismus hergestellt werden, sind rekombinante Proteine.

Frage 9.
Nennen Sie den am häufigsten verwendeten Vektor für die Transformation in Pflanzenzellen?
Antworten:
Agrobacterium tumefacien.

Frage 10.
Wer hat das Restriktionsenzym zum ersten Mal isoliert?
Antworten:
Warner Arber und Hamilton Smith.

Frage 11.
Ein Patent definieren?
Antworten:
Patent ist der staatliche Schutz des Erfinders von biologischem Material und sichert ihm für eine bestimmte Zeit das ausschließliche Recht, eine Erfindung herzustellen, zu verwerten, zu nutzen und zu verkaufen.

Frage 12.
Definieren Sie den Begriff Plasmid.
Antworten:
Autonom replizierende zirkuläre extrachromosomale DNA (oder) Eine zirkuläre doppelsträngige, extrachromosomale DNA, die im Zytoplasma von Bakterien vorhanden ist.

Frage 13.
Biotechnologie definieren.
Antworten:
Die Integration von Naturwissenschaften und Organismen, Zellen, Teilen davon und molekularen Analoga in Produkte und Dienstleistungen wird als Biotechnologie bezeichnet.

Frage 14.
Nennen Sie die Verbindung, die zur Visualisierung von DNA unter UV-Strahlung verwendet wird.
Antworten:
Ethidiumbromid.

2. PUC Biologie Biotechnologie: Prinzipien und Prozesse Zwei-Mark-Fragen und Antworten

Frage 1.
Beschreiben Sie kurz Folgendes:
(a) Ursprung der Replikation
(b) Bioreaktoren
(c) Nachgelagerte Verarbeitung.
Antworten:
(a) Replikationsursprung: Dies ist die Sequenz im DNA-Molekül, von der aus die Replikation beginnt und jedes DNA-Stück, wenn es mit dieser Sequenz verbunden ist, dazu gebracht werden kann, sich innerhalb der Wirtszelle zu replizieren.

(b) Bioreaktoren: Dies sind Kulturgefäße, in denen ein großes Kulturvolumen (100-1000 Liter) verarbeitet werden kann, um eine große Menge eines Produkts im kommerziellen Maßstab zu erhalten.

(c) Downstream Processing: Nach der Bildung durchläuft ein Produkt einige Prozesse, bevor ein fertiges Produkt zur Vermarktung bereit ist. Diese Prozesse umfassen Trennung und Reinigung, die zusammen als Downstream Processing bezeichnet werden.

Frage 2.
Kurz erklären:
(a) PCR
(b) Restriktionsenzyme und DNA
(c) Chitinase
Antworten:
(a) PCR: PCR steht für Polymerase-Kettenreaktion. Bei dieser Reaktion werden mehrere Kopien des interessierenden Gens (oder DNA) in vitro synthetisiert, wobei Primersätze und das Enzym Taq DNA-Polymerase verwendet werden.

(b) Restriktionsenzyme und DNA: Dies sind die Enzyme, die das Wachstum von Bakteriophagen einschränken. Diese Enzyme sind in vielen Bakterien vorhanden, wo sie als Teil ihres Abwehrmechanismus, dem sogenannten Restriktionsmodifikationssystem, fungieren. Es gibt zwei Arten von Restriktionsenzymen:
(a) Restriktionsendonuklease schneidet DNA in Stücke.
(b) Das Modifikationsenzym fügt der DNA eine Methylgruppe hinzu.

(c) Chitinase: Es ist ein Enzym, das die in der Wand von Pilzen vorhandene Chitinsubstanz abbaut.

Frage 3.
Besprechen Sie mit Ihrem Lehrer und finden Sie heraus, wie Sie zwischen den folgenden Punkten unterscheiden können:
(a) Plasmid-DNA und chromosomale DNA
(b) RNA und DNA
(c) Exonuklease und Endonuklease.
Antworten:
(a) Plasmid-DNA und chromosomale DNA: Plasmid-DNA ist eine kleine doppelsträngige zirkuläre DNA, die in einigen Bakterien vorhanden ist. Sie tragen Gene für Arzneimittelresistenz, N2-Fixierung und Fruchtbarkeit. Die chromosomale DNA ist viel größer und trägt Gene für andere Merkmale der Zelle.

(b) RNA und DNA: RNA ist ein einzelsträngiges Polymer von Ribonukleotiden, die Ribose-Zucker und Adenin, Guanin-Cytosin und Uracil-Stickstoffbasen enthalten, während DNA ein doppelsträngiges Polymer von Desoxyribo-Nukleotiden ist, das Desoxyribose-Zucker und Adenin, Guanin, Cytosin enthält und Thymin-Stickstoffbasen.

(c) Exonuklease und Endonuklease: Exonukleasen entfernen Nukleotide von den Enden der DNA, während Endonukleasen Schnitte an spezifischen Positionen innerhalb der DNA vornehmen.

Frage 4.
Erwähnen Sie die Werkzeuge, die in der rekombinanten DNA-Technologie verwendet werden.
Antworten:
Gewünschtes Gen, Vektor-DNA, Enzyme, Wirtszelle und Bioreaktor.

Frage 5.
Was sind palindromische Sequenzen? Gib ein Beispiel.
Antworten:
Wenn in einem doppelsträngigen DNA-Molekül die beiden Stränge in einer Region sowohl in Vorwärts- als auch in Rückwärtsrichtung identisch sind, werden sie als palindromische Sequenzen bezeichnet.

Frage 6.
Wie werden Restriktionsendonukleasen benannt?
Antworten:
Die Benennung der Restriktionsendonuklease basiert auf folgenden Regeln:

  • Der erste Buchstabe des REN bezieht sich auf den Gattungsnamen der Bakterien, von denen er abgeleitet ist, und wird in Großbuchstaben geschrieben.
  • Der zweite und der dritte Buchstabe beziehen sich auf den Artnamen des Bakteriums, von dem es abstammt und wird als Kleinbuchstabe geschrieben.
  • Wenn ein vierter Buchstabe vorhanden ist, steht er für den Namen des Bakterienstamms oder der Unterart.
  • Die römische Zahl gibt die verschiedenen RENs an, die von demselben Organismus stammen.
    Bsp.: Hind III.

Frage 7.
Was sind Molekularscheren? Erklären Sie ihre Rolle.
Antworten:
Die nuklearen Enzyme, die DNA an bestimmten Stellen brechen, werden als Restriktionsendonukleasen [REN] bezeichnet. Die RENs sind im Volksmund als biomolekulare Scheren bekannt. REN kann beide Stränge einer DNA an der gleichen Position oder an unterschiedlichen Positionen schneiden,
B.: Eco RI, Hind III, Sal I, Bam I.

Frage 8.
Zeichnen Sie ein ordentlich beschriftetes Diagramm von Plasmid pBR322
Antworten:

Frage 9.
Schreiben Sie die Anwendungen der PCR-Technik.
Antworten:

  • Zur Amplifikation von DNA- und RNA-Strängen.
  • Um die Orientierung und Lage von Restriktionsfragmenten relativ zueinander zu untersuchen.
  • Nachweis von Mutationen/Vorhandensein mutierter Gene in den Chromosomen.
  • Um DNA-Fingerabdrücke zu identifizieren.

Frage 10.
Was sind Nukleasen? Unterscheiden Sie zwischen Exonukleasen und Endonukleasen.
Antworten:
Restriktionsenzyme sind die Nukleasen. Es gibt zwei Arten, nämlich Exonukleasen und
Endonukleasen.

Exonukleasen entfernen Nukleotide von den Enden der DNA und Endonukleasen können an bestimmten Stellen innerhalb der DNA selbst schneiden

Frage 11.
Zeichnen Sie ein ordentlich beschriftetes Diagramm des Rührtank-Bioreaktors.
Antworten:

Frage 12.
Was sind „selektierbare Marker“? Welchen Nutzen haben sie in der Gentechnik?
Antworten:
Ein selektierbarer Marker ist ein Gen, das bei der Selektion jener Wirtszellen, die den Vektor enthalten, und bei der Eliminierung der Nicht-Transformanten, z.B. Antibiotikaresistenz codierende Gene sind nützliche selektierbare Marker, da sie nur ein selektives Wachstum von Transformanten ermöglichen.

Frage 13.
Was ist „Insertionsinaktivierung“?
Antworten:
Wird eine rekombinante DNA in die kodierende Sequenz des Enzyms B – Galactosidase eingefügt, führt dies zur Inaktivierung des Enzyms, die als „Insertionsinaktivierung“ bezeichnet wird. Das Vorhandensein von chromogenem Substrat führt zu blau gefärbten Kolonien, wenn das Plasmid in den Bakterien kein Insert aufweist. Das Vorhandensein von Insert führt zur Inaktivierung der Insertion und die Kolonien produzieren keine Farbe.

Frage 14.
Zeichnen Sie ein ordentlich beschriftetes Diagramm des besprühten Rührtank-Bioreaktors.
Antworten:

Frage 15.
Was sind Bioreaktoren? Nennen Sie den am häufigsten verwendeten Bioreaktor in der Gentechnik.
Antworten:
Es handelt sich um einen technischen Aufbau zur Durchführung biologischer Reaktionen unter aseptischen Bedingungen.

2. PUC Biologie Biotechnologie: Prinzipien und Prozesse Drei Mark Fragen und Antworten

Frage 1.
Was sind die beiden grundlegenden Techniken der modernen Biotechnologie?
Antworten:
Die zwei grundlegenden Techniken der modernen Biotechnologie sind:
(a) Gentechnik, bei der die Natur des genetischen Materials verändert oder in einen anderen Wirtsorganismus eingebracht wird, um seinen Phänotyp zu ändern.

(b) Techniken, um das Wachstum und die Vermehrung nur der gewünschten Mikroben oder Zellen in großer Zahl unter sterilen Bedingungen für die Herstellung zu erleichtern.

Frage 2.
Was sind gentechnisch veränderte Organismen? Nennen Sie zwei Faktoren, von denen ihr Verhalten abhängt?
Antworten:
Als gentechnisch veränderte Organismen oder transgene Organismen werden solche Organismen bezeichnet, deren Gene durch Manipulation verändert wurden. Die beiden Faktoren, von denen ihr Verhalten abhängt, sind:

  • richtige Insertion des interessierenden Gens.
  • die richtige Ernte von genetisch veränderten Organismen, um das gewünschte Produkt herzustellen.

Frage 3.
Was meinen Sie mit „Biopiraterie“ Geben Sie ein Beispiel?
Antworten:
Biopiraterie bezieht sich auf die Nutzung von Bioressourcen durch multinationale Unternehmen und andere Organisationen ohne entsprechende Genehmigungen der betroffenen Länder und Personen, z. Basmati-Reis, der in Indien angebaut wird, zeichnet sich durch seinen einzigartigen Geschmack und sein Aroma aus, aber ein amerikanisches Unternehmen hat durch ein US-Patent Patentrechte an Basmati erhalten.

2. PUC Biologie Biotechnologie: Prinzipien und Prozesse Fünf Mark Fragen und Antworten

Frage 1.
Erklären Sie den Prozess der rekombinanten DNA-Technologie.
Antworten:
Verfahren der Gentechnik:
(a) Isolierung von genetischem Material (DNA): Bei der rekombinanten DNA-Technologie ist es wichtig, DNA in reiner Form frei von anderen Makromolekülen zu isolieren. Da das DNA-Molekül mit der Membran in der Zelle eingeschlossen ist, müssen wir die Zelle aufbrechen, um DNA zusammen mit anderen Makromolekülen wie RNA, Proteinen, Polysacchariden und Lipiden freizusetzen. Dies geschieht in Bakterienzellen, Pflanzen- und Tierzellen mit bestimmten Enzymen.

Die anderen Makromoleküle können durch geeignete Behandlung mit spezifischen Enzymen entfernt werden. Schließlich werden die gereinigten DNA-Moleküle nach Zugabe von gekühltem Ethanol ausgefällt, was als Ansammlung feiner Fäden in der Suspension zu sehen ist.

(b) Schneiden von DNA an bestimmten Stellen: Das isolierte gereinigte DNA-Molekül wird mit Hilfe eines geeigneten Enzyms namens Restriktionsendonuklease in Segmente mit klebrigen Enden geschnitten (gespalten).

(c) Gelelektrophorese: Die geschnittenen DNA-Fragmente werden durch Gelelektrophorese unter Verwendung von Agarosegel getrennt. DNA ist ein negativ geladenes Molekül, daher bewegt es sich in Richtung der positiven Elektrode (Anode).

(d) Amplifikation des interessierenden Gens mittels PCR: Die Amplifikation eines Gens ist „ein Prozess, bei dem viele Kopien eines Gens hergestellt werden“. Dies wird durch eine Technik namens Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erreicht.

Verfahren der PCR:
1. Die DNA aus dem gewünschten zu amplifizierenden Segment, ein Überschuss der beiden Primermoleküle, der vier Desoxyribosetriphosphate und DNA-Polymerase werden in einem Reaktionsgemisch in einem Eppendorf-Röhrchen mit ausreichenden Mengen Mg ++ zusammengemischt. Das Eppendorf-Röhrchen wird in die PCR-Einheit gestellt und die folgenden Vorgänge werden nacheinander ausgeführt.

2. Denaturierung: Das Reaktionsgemisch wird zunächst einer Temperatur zwischen 90 – 98 °C (üblicherweise 94 °C) ausgesetzt. Es führt zur Trennung von zwei DNA-Strängen aufgrund des Aufbrechens von Wasserstoffbrücken. Dies wird Denaturierung genannt. Jeder DNA-Strang fungiert als Template-Strang für die DNA-Synthese. Die Dauer dieses Schrittes im ersten PCR-Zyklus beträgt normalerweise 2 Minuten bei 94 °C.

3. Glühen (anneal=verbinden): Die Mischung wird nun auf eine niedrige Temperatur (40-60°C) abgekühlt. Während dieses Schrittes hybridisieren (hybridisieren) zwei Oligonukleotidprimer, die zu einer DNA-Region komplementär sind, einen an jedes 3 Ende des DNA-Strangs. Die Dauer des Annealing-Schritts beträgt in der Regel eine Minute während des ersten sowie der nachfolgenden PCR-Zyklen.

4. Primerverlängerung: Während dieses Schrittes verlängert das Enzym taq DNA Polymerase die Primer unter Verwendung von Nukleotiden und DNA-Matrizen. Die beiden Primer erstrecken sich aufeinander zu, um zwei neue DNA-Stränge (an 5) zu enden. Die Dauer der Primerverlängerung beträgt normalerweise 2 Minuten bei 72 °C. Das amplifizierte Fragment kann nun bei Bedarf zum Ligieren mit Vector zur weiteren Klonierung verwendet werden. Die taq-DNA-Polymerase bleibt während der Hochtemperatur-induzierten Denaturierung von doppelsträngiger DNA aktiv.

(e) Insertion rekombinanter DNA in den Wirt:
1. Elektroporation: Die Bakterienzelle wird in eine Lösung mit kaltem CaCl . gelegt2 Lösung, gefolgt von einer intermittierenden Lagerung bei 42 °C. Dies führt zur Bildung von Poren in der Zellmembran. Nun wandert das rekombinante Plasmid in die Wirtszelle und die Bakterienzelle wird transformiert.

2. Mikroinjektion: Es ist die direkte Injektion eines gewünschten Gens in den Zellkern einer tierischen Zelle durch eine Mikrospritze.

3. Biolistik: Hier wird eine geeignete Pflanzenzelle mit Hochgeschwindigkeits-Mikropartikeln (2-2 mm) aus Gold oder Wolfram, die mit DNA beschichtet sind, beschossen, um die DNA in die Zelle einzubringen.

(f) Erhalten des fremden Genprodukts:

  • Das Transgen exprimiert sich selbst in Form von Protein(en) unter geeigneten Bedingungen.
  • Das/die Produkt(e) kann/können durch Anwendung eines geeigneten Verfahrens aus dem Medium extrahiert werden.
  • Die transgenen Zellen können im Labor kultiviert werden, um das transgene Produkt in kleinem Maßstab zu erhalten.
  • Die transgenen Zellen können auch in einem kontinuierlichen Kultursystem kultiviert/vermehrt werden, bei dem das gebrauchte Medium von einer Seite abgelassen und von der anderen Seite frisches Medium zur Produktion größerer Biomasse und des gewünschten Produkts zugegeben wird.
  • Bioreaktoren werden verwendet, um große Kulturvolumina zu verarbeiten, um das interessierende Produkt in ausreichenden Mengen im kommerziellen Maßstab zu erhalten.

(g) Downstream Processing: Die in einem Bioreaktor gebildeten Produkte müssen einer Reihe von Prozessen unterzogen werden, bevor sie als Fertigprodukt vermarktet werden können.
Die verschiedenen Verfahren zur Gewinnung von Wertprodukten werden zusammenfassend als Downstream Processing bezeichnet. Die Prozesse umfassen die Trennung und Reinigung des Produkts, die Zugabe geeigneter Konservierungsstoffe und eine strenge Qualitätskontrolle usw. Solche Formulierungen müssen wie bei Arzneimitteln strengen klinischen Prüfungen unterzogen werden. Diese Qualitätskontrolltests und klinischen Studien variieren von Produkt zu Produkt.

Frage 2.
Erklären Sie mit Hilfe des Diagramms das Plasmid pBR322.
Antworten:

pBR-322 ist ein natürliches Plasmid und F + -Plasmid. Es ist etwa 4,3 kb groß. Es ist ein Plasmid mit einer ori-Stelle (Replikationsursprung), zwei Antibiotika-Resistenzstellen, selektierbaren Markern für Amphicillin-Resistenz (Ampr) und Tetracyclin-Resistenz (Tetr). Es hat dreizehn einzigartige Stätten in verschiedenen Regionen, von denen sieben wichtig sind. Eine einzigartige Stelle ist eine Erkennungsstelle für spezifische Restriktionsenzyme (REN), die ECORI genannt wird.

Vektoren zum Klonen von Genen in Pflanzen und Tieren sind Ti-Plasmid, das aus Agrobacterium tumefaciens in Pflanzen isoliert wurde, und Retroviren werden nun nicht pathogen gemacht und werden verwendet, um das Gen in Tierzellen zu transportieren.

Hinweis: Insertionsinaktivierung: Wenn ein Gen oder eine rekombinante DNA in die kodierende Sequenz eines Vektors eingefügt wird, wird die kodierende Sequenz, die für ein Enzym oder ein bestimmtes Zeichen verantwortlich ist, inaktiviert. Dies wird als Insertionsinaktivierung bezeichnet.

Frage 3.
a) Was ist Gelelektrophorese? Erklären Sie, wie DNA-Fragmente mit dieser Technik getrennt und nachgewiesen werden.
b) Was sind Plasmide? Nennen Sie zwei beliebige Merkmale eines idealen Plasmids.
Antworten:
(a) Das Schneiden von DNA durch Restriktionsendonukleasen führt zu den DNA-Fragmenten. Diese Fragmente können durch eine als Gelelektrophorese bekannte Technik getrennt werden. Da DNA-Fragmente negativ geladene Moleküle sind, können sie getrennt werden, indem sie gezwungen werden, sich unter einem elektrischen Feld durch ein Medium/eine Matrix zur Anode zu bewegen.

Heutzutage ist die am häufigsten verwendete Matrix Agarose, ein natürliches Polymer, das aus Meeresalgen gewonnen wird. Durch den Siebeffekt des Agarosegels werden die DNA-Fragmente nach ihrer Größe getrennt (aufgelöst). Je kleiner also die Fragmentgröße ist, desto weiter bewegt es sich.

Die getrennten DNA-Fragmente können nur sichtbar gemacht werden, nachdem die DNA mit einer als Ethidiumbromid bekannten Verbindung gefärbt und anschließend UV-Strahlung ausgesetzt wurde (im sichtbaren Licht und ohne Färbung sind reine DNA-Fragmente nicht zu sehen). Sie können leuchtend orangefarbene DNA-Banden in einem mit Ethidiumbromid gefärbten Gel sehen, das UV-Licht ausgesetzt wurde.

Die getrennten DNA-Banden werden aus dem Agarosegel ausgeschnitten und aus dem Gelstück extrahiert. Dieser Schritt wird als Elution bezeichnet. Die auf diese Weise gereinigten DNA-Fragmente werden zur Konstruktion rekombinanter DNA verwendet, indem sie mit Klonierungsvektoren verbunden werden.

(b) Die kleinen kreisförmigen und extrachromosomalen doppelsträngigen DNA-Moleküle, die im Zytoplasma von Bakterien vorhanden sind, werden als Plasmide bezeichnet. Sie zeigen Selbstreplikation. Sie enthalten 2 to. 8 Tausend Stickstoffbasenpaare. Sie enthalten auch einige Gene, wie antibiotikaresistente Gene und Gene zur Expression einiger Merkmale. Sie können mit Restriktionsenzymen an spezifischen Stellen geschnitten werden und gewünschte Gene können in diese Plasmide eingefügt werden.


Biotechnologie : Prinzipien und Verfahren | Studiennotizen | Klasse-12 Biologie

Biotechnologie – Bereich der Biologie, der sich mit der Verwendung lebender Organismen oder biologischer Systeme befasst, um Produkte oder Prozesse herzustellen, die für den Menschen nützlich sind.

✔ Biotechnologie nach Europäische Föderation für Biotechnologie (EFB) – Die Integration von Naturwissenschaften und Organismen, Zellen, Teilen davon und molekularen Analoga für Produkte und Dienstleistungen.

Prinzipien der Biotechnologie

Gentechnik:

o Techniken zu genetisches Material verändern.

o Es ermöglicht die Einführung dieses modifizierten genetischen Materials in die Wirtsorganismen.

o Kann den Phänotyp des Organismus verändern.

Bioverfahrenstechnik:

o Aufrechterhaltung eines sterilen Zustands, um das Wachstum nur der gewünschten Mikroben zu ermöglichen.

▪ Steril: Frei von mikrobieller Kontamination.

o Verhindert das Wachstum unerwünschter Mikroben.

Einige grundlegende Konzepte

Ö Was passiert, wenn ein DNA-Molekül irgendwie in eine Wirtszelle eingeführt wird?

▪ Die DNA kann sich in der Wirtszelle nicht replizieren.

▪ Höchstwahrscheinlich wird es degradiert.

Ö Wie kann man die fremde DNA dazu bringen, sich in der Wirtszelle zu vermehren oder Kopien von sich selbst anzufertigen?

▪ Die fremde DNA muss Teil des Genoms des Wirtsorganismus werden, indem sie sich in dieses integriert.

● Genom: Das gesamte genetische Material eines Organismus.

▪ Die fremde DNA wird nun zusammen mit dem Wirtschromosom vermehrt, da das Wirtschromosom die Ursprung der Replikation.

● Der Replikationsursprung ist wichtig, um den Prozess der DNA-Replikation einzuleiten.

▪ Dieser Vorgang wird als Klonen oder Anfertigen mehrerer identischer Kopien einer beliebigen Template-DNA.

Konstruktion und Klonierung des ersten künstlichen rDNA-Moleküls:

o Wissenschaftler: Stanley Cohen und Herbert Boyer (1972)

o Natives Plasmid von Salmonella typhimurium wurde mit Antibiotika-Resistenz-Gen in Verbindung gebracht.

Plasmid : Doppelsträngige, autonom replizierende, extra chromosomale zirkuläre DNA, die der Bakterienzelle, falls vorhanden, zusätzliche Eigenschaften verleiht.

Antibiotikaresistentes Gen : Gen, das es den Bakterien ermöglicht, in einem antibiotikahaltigen Medium zu überleben.

▪ Identifizierung und Schneiden eines DNA-Stücks aus einem Plasmid, das Resistenz gegen Antibiotika verleiht.

● Die DNA wurde an einer bestimmten Position geschnitten.

● Enzym beteiligt: Restriktionsenzyme – Molekulare Schere.

▪ Das geschnittene DNA-Stück wurde mit dem nativen Plasmid von verknüpft S. typhimurium.

● Enzym beteiligt: DNA-Ligase

▪ Diese modifizierte zirkuläre DNA ist ein rekombinante DNA (rDNA) und fungiert als Vektor.

● Vektor – Träger der fremden DNA/des interessierenden Gens.

● rDNA – Ein DNA-Molekül, das modifiziert wurde und ein fremdes DNA-Segment aufweisen kann.

▪ Nach Einführung dieser rDNA in Escherichia coli Bakterien konnte sich die rDNA im neuen Wirt replizieren (E coli) und multiplizieren sich mit dem DNA-Polymerase-Enzym des neuen Wirts.

▪ Da das ursprüngliche antibiotikaresistente Gen innerhalb der E coli Dieser Vorgang wird als Klonen des Antibiotikaresistenzgens in E coli.

Drei grundlegende Schritte zur genetischen Veränderung eines Organismus

I. Identifizierung von DNA mit wünschenswerten Genen

II. Einführung der identifizierten DNA in den Wirt

III. Erhaltung der eingeführten DNA im Wirt und Übertragung der DNA auf ihre Nachkommen.

WERKZEUGE DER REKOMBINANTEN DNA-TECHNOLOGIE

Restriktionsenzyme

o 1963: Zwei Enzyme wurden entdeckt, die das Wachstum von Bakteriophagen in E. coli einschränken könnten.

▪ Ein Enzym fügte der DNA eine Methylgruppe hinzu.

▪ Das andere Enzym könnte die DNA zerschneiden- Restriktionsendonuklease.

o Die erste identifizierte Restriktionsendonuklease ist Hinterhand II.

o Restriktionsenzyme fallen unter Nukleasen (größere Enzymklasse).

o Entfernt Nukleotide von der Peripherie/den Enden der DNA.

o Es schneidet die DNA an bestimmten Stellen außerhalb der Peripherie innerhalb der DNA.

o Die Restriktionsendonuklease schneidet die DNA an einer bestimmten Position, indem sie eine bestimmte DNA-Sequenz erkennt, die als bezeichnet wird Erkennungssequenz.

▪ Jede Restriktionsendonuklease erkennt eine spezifische palindromische Nukleotidsequenzen in der DNA.

Palindrom in der DNA ist eine Sequenz von Basenpaaren, die liest sich gleich auf den beiden Strängen, wenn Die Leseorientierung wird beibehalten.

● Zum Beispiel liest sich die folgende Sequenz auf den beiden Strängen in 5' → 3' Richtung gleich. Dies gilt auch, wenn in 3' → 5' Richtung gelesen wird.

o Nach Identifizierung der Erkennungssequenz bindet das RE an die DNA und schneidet jeden der beiden Stränge der DNA-Doppelhelix an bestimmten Stellen in deren Zucker-Phosphat-Rückgrat.

Stumpfes Ende und klebriges Ende

o Viele RE machen einen einfachen doppelsträngigen Schnitt in der Mitte der Erkennungssequenz, was zu a stumpfes Ende.

▪ Beispiele für RE, die stumpfes Ende produzieren: PvuII und AluI.

o In anderen RE werden die beiden DNA-Stränge nicht an genau derselben Position geschnitten. Stattdessen ist der Schnitt gestaffelt, normalerweise um zwei oder vier Nukleotide, so dass die resultierenden DNA-Fragmente kurze eindrähtige Überhänge an jedem Ende.

▪ Diese heißen Klebrige Enden, da eine Basenpaarung zwischen ihnen das DNA-Molekül wieder zusammenkleben kann.

▪ Diese Klebrigkeit der Enden erleichtert die Wirkung des Enzyms DNA-Ligase.




Nomenklatur von Restriktionsenzymen

o Nomenklaturregeln für RE:

▪ Der erste Buchstabe des Namens stammt vom Gattungsnamen.

▪ Die zweiten beiden Buchstaben stammen von der Spezies der prokaryontischen Zelle, aus der sie isoliert wurden

▪ Nach den drei Buchstaben wird manchmal der Stamm dargestellt.

▪ Nach dem Stamm geben die römischen Zahlen nach den Namen die Reihenfolge an, in der die Enzyme aus diesem Bakterienstamm isoliert wurden.

o Beispiele: (muss sich nur an die EcoRI-Nomenklatur erinnern)

Gattungsname des Quellorganismus

Artname des Quellorganismus

Reihenfolge der Isolierung aus dem Bakterienstamm

Schritte bei der Bildung rekombinanter DNA durch die Wirkung des Restriktionsendonuklease-Enzyms – EcoRI

Rekombinante DNA (rDNA)

o RE werden in der Gentechnik verwendet, um ‘rekombinante’ DNA-Moleküle zu bilden, die aus DNA aus verschiedenen Quellen/Genomen bestehen.

o Beim Schneiden mit dem gleichen Restriktionsenzym haben die resultierenden DNA-Fragmente die gleiche Art von ‘sticky-ends’ und können mit DNA-Ligasen (End-to-End) miteinander verbunden werden.

o Wenn man den Vektor und die Quell-DNA nicht mit demselben Restriktionsenzym schneidet, kann das rekombinante Vektormolekül nicht erzeugt werden.

Agarose-Gelelektrophorese

o Wird zur Trennung und Isolierung von DNA-Fragmenten verwendet, die nach einem Restriktionsverdau gebildet werden.

o Gelelektrophorese trennt DNA-Moleküle nach ihrer Größe.

o DNA-Moleküle sind negativ geladen.

▪ aufgrund des Vorhandenseins einer Phosphateinheit.

o DNA-Moleküle können getrennt werden, indem sie unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes durch ein Medium/eine Matrix gezwungen werden, sich zur Anode zu bewegen.

o Verwendete Matrix: Agarose

▪ Agarose wird gewonnen aus Seegras.

o Die DNA-Fragmente werden nach ihrer Größe durch Siebwirkung des Agarosegels getrennt (aufgelöst).

▪ Kleinere DNA-Fragmente: Bewegt sich am weitesten.

▪ Größere DNA-Fragmente: Bewegt sich am wenigsten und befindet sich normalerweise näher an den Lademulden des Agarosegels.

Visualisierung von getrennten DNA-Fragmenten

o DNA ist unter normalem Licht nicht sichtbar, wenn nicht mit einer Verbindung gefärbt wird, die die DNA sichtbar macht.

Ö Ethidiumbromid (EtBr) wird zur Färbung der DNA im Agarosegel verwendet.

o Die unterschiedlichen DNA-Banden im Gel sind deutlich sichtbar unter ultraviolettes Licht nach Färbung mit EtBr.

▪ Dieses Verfahren ist sehr gefährlich, da Ethidiumbromid ein starkes Mutagen ist.

o Die DNA-Banden erscheinen als leuchtend orange farbige Bänder.




o Der Vorgang des Ausschneidens der erforderlichen getrennten DNA-Banden aus dem Agarosegel und die Extraktion der DNA aus dem Gelstück nach der Gelelektrophorese wird als Elution bezeichnet.

o Diese gereinigten DNA-Fragmente werden dann zur Konstruktion rekombinanter DNA verwendet, indem sie mit Klonierungsvektoren verbunden werden.

o Plasmide und Bakteriophagen haben die Fähigkeit, sich in Bakterienzellen unabhängig von der Kontrolle der chromosomalen DNA zu replizieren.

Zahl in Vektor kopieren

o Die Kopienzahl bezieht sich auf die Anzahl der Moleküle eines einzelnen Plasmids/Phagen, die normalerweise in einer einzelnen Bakterienzelle vorkommen.

o Einige Plasmide haben möglicherweise nur eine oder zwei Kopien pro Zelle, während andere 15-100 Kopien pro Zelle haben können.

o Bakteriophagen haben aufgrund ihrer hohen Anzahl pro Zelle sehr hohe Kopienzahlen ihres Genoms innerhalb der Bakterienzellen.

o Wenn die Fremd-DNA (Fremd-DNA) mit dieser Plasmid-DNA oder diesem Bakteriophagen verknüpft werden kann, wird die Anzahl der Fremd-DNA gleich der Kopienzahl des Plasmids oder Bakteriophagen.

o Mit anderen Worten: Je höher die Kopienzahl, desto mehr Genexpression und somit wird mehr Produkt erhalten.

Merkmale eines Klonierungsvektors

o Bestimmte Merkmale sind für das Plasmid wesentlich, damit die Klonierung stattfinden kann. Diese sind wie folgt:

1. Ursprung der Replikation (ori)

o Sequenz wo Replikation beginnt.

o Wenn eine DNA-Sequenz mit dem ‘ori’, es wird repliziert.

Ö ‘Ori’ reguliert auch die Kopienzahl dieser verknüpften DNA.

2. Wählbarer Marker

o Es hilft bei der Identifizierung der Transformanten von den Nicht-Transformanten, die eliminiert werden können.

o Es hilft beim selektiven Wachstum der Transformanten.

▪ Transformation – Der Prozess, durch den eine fremde DNA (Plasmid/Vektor/rDNA) in eine bakterielle Wirtszelle eingeführt wird.

▪ Transformanten – Bakterienzellen, die den Transformationsprozess erfolgreich durchlaufen haben und die fremde DNA enthalten.










▪ Antibiotikaresistentes Gen

● Ampicillin-resistentes Gen (Verstärker R)

● Tetracyclin-resistentes Gen (tet R)

● Chloramphenicol-resistentes Gen

Verwendung von wählbaren Markern (Nur zu Ihrem Verständnis!!)

o Es hilft, eine Zelle, die ein Plasmid aufgenommen hat (Transformante) von den vielen Tausend Zellen zu unterscheiden, die das Plasmid nicht aufgenommen haben (Nicht-Transformanten).

o E. coli-Zellen sind normalerweise empfindlich gegenüber den Antibiotika Ampicillin und Tetracyclin.

o Allerdings sind Zellen, die das Plasmid pBR322 (einer der ersten Klonierungsvektoren, die entwickelt wurden) enthalten, gegen diese Antibiotika resistent.

o Dies liegt daran, dass pBR322 Gene trägt, die die Wirtszelle (E coli) resistent gegen Ampicillin und Tetracyclin, wenn exprimiert.

o Nach Transformation mit pBR322 sind nur diejenigen E. coli-Zellen, die ein Plasmid aufgenommen haben, amp R tet R und in der Lage, Kolonien auf einem Ampicillin oder Tetracyclin enthaltenden Agarmedium zu bilden.

o Nicht-Transformanten, die pBR322 nicht enthalten, können die antibiotikaresistenten Gene nicht exprimieren und bilden daher keine Kolonien auf dem Agarmedium, das Ampicillin oder Tetracyclin enthält.

o Transformanten und Nicht-Transformanten sind daher leicht zu unterscheiden.

3. Klonen von Websites




o Es bezieht sich auf das DNA-Segment im Plasmid, in das die fremde (fremde) DNA eingefügt werden kann.

o Der Vektor/das Plasmid sollte idealerweise eine oder sehr wenige Erkennungsstellen für das häufig verwendete RE aufweisen.




o Für die Klonierung wird ein RE gewählt, das in der Regel Teil des Selektionsmarkers ist.

▪ Zum Beispiel kann eine fremde DNA an der BamH I Stelle des Tetracyclin-Resistenzgens im Vektor pBR322.

Insertionsinaktivierung

o Wenn wir Bakterienzellen auf einem selektiven Medium (Agarmedium, das Ampicillin oder Tetracyclin enthält) züchten, können wir zwischen Transformanten und Nicht-Transformanten unterscheiden.

o Wir haben jedoch noch keine Ahnung, ob die Transformanten die rekombinante Plasmid-DNA oder die ursprüngliche Plasmid-DNA enthalten.

o Diese Technik wird verwendet, um die Rekombinanten von den Nicht-Rekombinanten zu identifizieren.

▪ Rekombinanten – Plasmid-DNA mit der inserierten fremden/fremden/Ziel-DNA.

o Die Insertion eines fremden DNA-Fragments in das Plasmid zerstört die Integrität eines der Gene (selektierbares Markergen) auf dem Molekül vorhanden.




o Rekombinanten können daher identifiziert werden, weil das durch das inaktivierte Gen kodierte Merkmal von den Wirtszellen nicht mehr präsentiert wird.

Insertionsinaktivierung eines Antibiotikaresistenzgens

o Wenn eine fremde DNA am BamH I Stelle des Tetracyclin-Resistenzgens im Vektor pBR322 ligiert wird, verlieren die rekombinanten Plasmide die Tetracyclin-Resistenz aufgrund der Insertion von Fremd-DNA.

o Es kann immer noch aus nicht-rekombinanten ausgewählt werden, indem die Transformanten auf Tetracyclin-haltigem Medium ausplattiert werden.

o Die auf Ampicillin-enthaltendem Medium wachsenden Transformanten werden dann auf ein Tetracyclin-enthaltendes Medium übertragen.

o Die Rekombinanten wachsen in Ampicillin-haltigem Medium, jedoch nicht auf Tetracyclin-haltigem.

o Nicht-Rekombinanten wachsen jedoch auf dem Medium, das beide Antibiotika enthält.




Insertionsinaktivierung ohne Antibiotikaresistenzgen (β-Galactosidase-Gen)

o Hier werden die Rekombinanten und die Nicht-Rekombinanten anhand ihrer Fähigkeit zur Farberzeugung in Gegenwart von a . unterschieden chromogenes Substrat.

o Bei dieser Methode wird die Fremd-/Ziel-DNA in die kodierende Sequenz eines Enzyms eingefügt, β-Galactosidase.

o Dies inaktivierte die β-Galactosidase-Genexpression.




o Wenn chromogenes Substrat (X-gal) hinzugefügt wird, ergeben Bakterienkolonien mit funktioneller β-Galactosidase eine blaue Farbe, während Bakterienkolonien ohne die funktionelle β-Galactosidase keine Farbe ergeben.










Nomenklatur von pBR322 (Zusätzliche Informationen)

o “p” zeigt an, dass es sich tatsächlich um ein Plasmid handelt.

o “BR” identifiziert das Labor, in dem der Vektor ursprünglich konstruiert wurde (BR steht für Bolivar und Rodriguez, die beiden Forscher, die pBR322 entwickelten).

o �” unterscheidet dieses Plasmid von anderen, die im selben Labor entwickelt wurden (es gibt auch Plasmide namens pBR325, pBR327, pBR328 usw.).

Vektor zum Klonen von Genen in Pflanzen und Tieren

Agrobacterium tumifaziens : Es liefert ‘T – DNA’ in die verschiedenen zweikeimblättrigen Pflanzen und wandelt die normalen Zellen in Tumorzellen um und leitet diese Tumorzellen an, die vom Krankheitserreger benötigten Chemikalien zu produzieren.

▪ Das ‘Ti’ Plasmid von A tumifaciens wurde in einen Klonierungsvektor modifiziert.

● Es ist nicht mehr pathogen für Pflanzen.

● Es kann das fremde Gen in eine große Anzahl von Pflanzen transportieren.

Retroviren : Es kann die normalen tierischen Zellen in Krebszellen umwandeln.

▪ Es wurde jetzt wie folgt geändert:

● Es ist nicht mehr pathogen für Tierzellen.

● Es kann das fremde Gen in tierische Zellen transportieren.

Einführung fremder DNA in die Wirtszelle

Bakterielle Transformation

o Prozess der Aufnahme von DNA durch Bakterien.

Kompetente Zellen

o Da DNA von Natur aus hydrophil ist, kann sie die Zellmembranen nicht passieren.

o Nicht alle Bakterienzellen können die gewünschte DNA aufnehmen.

o Nur kompetente Bakterienzellen kann die DNA aufnehmen.

▪ Diese Zellen werden hergestellt, indem man sie mit einer bestimmten Konzentration von a . behandelt zweiwertiges Kation, wie zum Beispiel Kalzium.[ 50 mM Calciumchlorid (CaCl2)]

▪ Es erhöht die Effizienz, mit der DNA durch Poren in seiner Zellwand in das Bakterium eindringt.

Transformationsprozess (Hitzeschockbehandlung)

o Kompetente Zellen werden zusammen mit der rDNA (Fremd-/Ziel-DNA) in einem eiskalt Zustand.

o A Hitzeschock wird den Zellen gegeben, indem sie kurz auf gelegt werden 42 0 C.

o Anschließend werden die Zellen wieder auf das Eis gelegt.

o Dadurch können die kompetenten Zellen die fremde DNA aufnehmen.

Mikroinjektion

o Hier wird die rDNA direkt in den Zellkern der Wirtszelle injiziert.

o Es verwendet eine sehr feine Pipette, um DNA-Moleküle zu injizieren.

o Diese Methode wird im Allgemeinen für die tierischen Zellen verwendet.

Biolistik / Genkanone

o Die Wirtszellen werden mit Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilen beschossen, normalerweise Partikel aus Gold oder Wolfram mit DNA beschichtet.

o Diese Methode ist besser für die Pflanzenzellen geeignet.




PROZESSE DER REKOMBINANTEN DNA-TECHNOLOGIE

o Die rekombinante DNA-Technologie umfasst mehrere Schritte in spezifischer Abfolge wie Isolierung von DNA, Fragmentierung von DNA durch Restriktionsendonukleasen, Isolierung eines gewünschten DNA-Fragments, Ligation des DNA-Fragments in einen Vektor, Übertragung der rekombinanten DNA in den Wirt, Kultivierung des Wirts Zellen in einem Medium im großen Maßstab und Extraktion des gewünschten Produkts.

Isolierung von DNA

o DNA wird isoliert, indem zuerst alle Membranen, die sie umschließen, mit spezifischen Enzymen abgebaut werden

▪ Für Bakterienzelle – Lysozym

▪ Für Pflanzenzellen – Cellulase

▪ Für Pilzzellen – Chitinase

o RNA wird durch Behandlung mit RNA-verdauenden Enzymen entfernt – Ribonuklease.

o Proteine ​​werden durch die Behandlung mit proteinverdauenden Enzymen entfernt – Protease.

o Andere Biomoleküle werden durch geeignete Behandlungen entfernt.

o Schließlich wird die DNA durch Zugabe von gekühltem Ethanol ausgefällt.

▪ Dies wird als Ansammlung von feinen Fäden in der Aufhängung angesehen.

▪ Diese DNA kann durch Aufspulen entfernt werden.

Schneiden von DNA an bestimmten Stellen

o DNA kann an einer bestimmten Stelle geschnitten werden, indem die gereinigte DNA mit einem bestimmten Restriktionsenzym verdaut wird.

o Agarosegelelektrophorese kann verwendet werden, um den Fortschritt des Restriktionsverdaus zu überprüfen.

o Nachdem die Quell-DNA und die Vektor-DNA mit einem spezifischen RE geschnitten wurden, wird das interessierende Gen ausgeschnitten und mit der geschnittenen Vektor-DNA (Plasmid) ligiert.

▪ Die Ligation des interessierenden Gens und der Vektor-DNA wird durch ein Enzym namens – . vermittelt DNA-Ligase.

Amplifikation des interessierenden Gens mittels PCR

o Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) führt zur selektiven Amplifikation einer ausgewählten Region eines DNA-Moleküls.

Voraussetzungen für die PCR

o Thermostabiles Enzym: Taq Polymerase

▪ Quelle: Bakterium - Thermus aquaticus

▪ Eigentum:Das Enzym bleibt während der hohen Temperatur aktiv.

o Sätze von Grundierungen:

▪ Primer sind kleine chemisch synthetisierte Oligonukleotide, die zu den DNA-Regionen komplementär sind.

▪ Sie begrenzen die zu amplifizierende DNA-Region.

An der PCR beteiligter Schritt

o Die PCR wird in einem einzigen Teströhrchen durchgeführt, indem einfach DNA mit einem Satz Reagenzien gemischt und das Röhrchen in einen Thermocycler gegeben wird.

1. Denaturierung

o Die Mischung wird auf 94°C erhitzt, bei dieser Temperatur werden die Wasserstoffbrückenbindungen, die die beiden Stränge des doppelsträngigen DNA-Moleküls zusammenhalten, aufgebrochen, wodurch das Molekül denaturiert.

o Es bildet einzelsträngige DNA (ssDNA).

2. Glühen

o Die Mischung wird auf 50󈞨°C abgekühlt.

o Die Primer annealen (verbinden) mit den ssDNA-Molekülen an bestimmten Positionen.

3. Verlängerung

o Die Temperatur wird auf 74°C erhöht.

o Die Taq DNA-Polymerase funktioniert bei dieser Temperatur am besten.

o Es bindet an ein Ende jedes Primers und synthetisiert neue DNA-Stränge, die komplementär zu den DNA-Matrizenmolekülen sind.

o Dies führt zu vier DNA-Ständen anstelle der zwei, mit denen es am Anfang ging.

Insertion rekombinanter DNA in die Wirtszelle/den Wirtsorganismus




o Empfängerzellen nehmen die in ihrer Umgebung vorhandene DNA auf, nachdem sie sie ‘kompetent’ gemacht haben.

o Wenn also ein rekombinantes DNA-tragendes Gen für die Resistenz gegen ein Antibiotikum (z. B. Ampicillin) in E coli. Zellen werden die Wirtszellen in Ampicillin-resistente Zellen umgewandelt.

o Wenn wir die transformierten Zellen auf Ampicillin enthaltenden Agarplatten verteilen, wachsen nur Transformanten, untransformierte Empfängerzellen sterben ab.

o Da man aufgrund des Ampicillin-Resistenzgens in der Lage ist, eine transformierte Zelle in Gegenwart von Ampicillin zu selektieren. Das Ampicillin-Resistenzgen wird in diesem Fall als selektierbarer Marker bezeichnet.

Beschaffung des fremden Genprodukts

o Bei den meisten rekombinanten Technologien besteht das ultimative Ziel darin, ein wünschenswertes Protein zu produzieren.

o Das Fremdgen wird exprimiert und produziert unter geeigneten Bedingungen das maximale Protein.

Ö Rekombinantes Protein : Wenn ein Protein kodierendes Gen in a . exprimiert wird heterolog Gastgeber.

Kultivierung der Wirtszelle

o Die Wirtszellen mit der rDNA werden unter geeigneten Bedingungen (richtige Nährstoffe, Temperatur, pH usw.) gezüchtet.

o Kultur im kleinen Maßstab: Zellen werden im Labor in Kulturen gezüchtet. Das Protein wird dann extrahiert und unter Verwendung verschiedener Trenntechniken gereinigt.

o Kultur im großen Maßstab: Zellen werden in kontinuierliches Kultursystem wobei das gebrauchte Medium von einer Seite abgelassen wird, während frisches Medium von der anderen zugegeben wird, um die Zellen in ihrer physiologisch aktivsten log/exponentiellen Phase zu halten.

o Dies sind große Gefäße mit großem Volumen (100-1000 Liter), in denen Rohstoffe mit mikrobiellen, pflanzlichen, tierischen oder menschlichen Zellen biologisch in spezifische Produkte, einzelne Enzyme usw. umgewandelt werden.

o Durch optimale Wachstumsbedingungen (Temperatur, pH-Wert, Substrat, Salze, Vitamine, Sauerstoff) werden die optimalen Bedingungen für die Erzielung des gewünschten Produkts geschaffen.

Komponenten eines Bioreaktors:




▪ ein Sauerstoffzufuhrsystem

▪ ein Temperaturkontrollsystem

▪ Probenahmeöffnungen, damit regelmäßig kleine Mengen der Kultur entnommen werden können

Rührtank-Bioreaktor

o Ein Rührkesselreaktor ist normalerweise zylindrisch oder hat einen gewölbten Boden, um das Mischen des Reaktorinhalts zu erleichtern.

o Der Rührer ermöglicht eine gleichmäßige Durchmischung und Sauerstoffverfügbarkeit im gesamten Bioreaktor.

Besprühter Rührtank-Bioreaktor

o Es handelt sich um einen Bioreaktor vom Typ Rührtankreaktor, in dem die Luft gesprudelt wird.

Weiterverarbeitung

o Es umfasst alle Stadien nach der Expression des Genprodukts im Kultursystem durch die Wirtszellen (Biosynthesestadium).

o Die Prozesse umfassen Trennung und Reinigung, die zusammenfassend als nachgelagerte Verarbeitung bezeichnet werden.

o Geeignet Konservierungsstoffe bei Bedarf hinzugefügt werden.

o Wenn es sich bei dem Produkt um ein Medikament handelt, unterliegt es klinische Versuche.

o Die nachgelagerten Verarbeitungs- und Qualitätskontrollprüfungen variieren von Produkt zu Produkt.

PDF-Notizen für Biotechnologie herunterladen: Prinzipien und Prozesse - Klasse-XII.


Die Insertionsinaktivierung des Streptococcus mutans dexA (Dextranase)-Gens führt zu einer veränderten Adhärenz und einem veränderten Dextran-Katabolismus

Streptococcus mutans ist in der Lage, extrazelluläre Glucane aus Saccharose zu synthetisieren, die zur Adhärenz dieser Bakterien beitragen. Extrazelluläre Dextranase kann die Glucane teilweise abbauen und kann daher die Virulenz von S. mutans beeinflussen. Um Mutanten zu isolieren, die keine Dextranase produzieren können, wurde eine DNA-Bibliothek konstruiert, indem zufällige Sau3AI-verdaute Fragmente chromosomaler DNA aus S. mutans in die BamHI-Stelle des Streptokokken-Integrationsvektors pVA891 eingefügt wurden, der in Escherichia coli replizieren kann, aber nicht keinen Streptokokken-Replikationsursprung besitzen. Die resultierenden Plasmide wurden in S. mutans LT11 eingeführt, was eine Insertionsinaktivierung durch homologe Rekombination ermöglicht. Es wurden zwei Transformanten identifiziert, die keine Dextranase-Aktivität aufwiesen. Die Integration einer einzelnen Kopie des Plasmids in das Chromosom dieser Transformanten wurde durch Southern-Hybridisierungsanalyse bestätigt. Chromosomale DNA-Fragmente, die das Plasmid flankierten, wurden unter Verwendung einer Marker-Rescue-Technik gewonnen und sequenziert. Ein Vergleich mit bekannten Sequenzen unter Verwendung des BLASTX-Programms zeigte 56% Homologie auf Aminosäureebene zwischen dem sequenzierten Genfragment und Dextranase aus Streptococcus sobrinus, was stark darauf hindeutet, dass das S. mutans-Dextranase-Gen (dexA) inaktiviert worden war. Die Koloniemorphologie der Dextranase-Mutanten, wenn sie auf saccharosehaltigem Todd-Hewitt-Agar gezüchtet wurden, war im Vergleich zum Elternstamm mit einer offensichtlichen Ansammlung von extrazellulärem Polymer verändert. Die Mutanten hafteten auch stärker an einer glatten Oberfläche als LT11, aber es gab keinen offensichtlichen Unterschied in der Saccharose-abhängigen Zell-Zell-Aggregation.


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Abstrakt

Methionin (Met) S-methyltransferase (MMT) catalyzes the synthesis of S-methyl-Met (SMM) from Met andS-adenosyl-Met (Ado-Met). SMM can be reconverted to Met by donating a methyl group to homocysteine (homo-Cys), and concurrent operation of this reaction and that mediated by MMT sets up the SMM cycle. SMM has been hypothesized to be essential as a methyl donor or as a transport form of sulfur, and the SMM cycle has been hypothesized to guard against depletion of the free Met pool by excess Ado-Met synthesis or to regulate Ado-Met level and hence the Ado-Met toS-adenosylhomo-Cys ratio (the methylation ratio). To test these hypotheses, we isolated insertional mmtmutants of Arabidopsis and maize (Zea mays). Both mutants lacked the capacity to produce SMM and thus had no SMM cycle. They nevertheless grew and reproduced normally, and the seeds of the Arabidopsis mutant had normal sulfur contents. These findings rule out an indispensable role for SMM as a methyl donor or in sulfur transport. The Arabidopsis mutant had significantly higher Ado-Met and lowerS-adenosylhomo-Cys levels than the wild type and consequently had a higher methylation ratio (13.8 versus 9.5). Free Met and thiol pools were unaltered in this mutant, although there were moderate decreases (of 30%–60%) in free serine, threonine, proline, and other amino acids. These data indicate that the SMM cycle contributes to regulation of Ado-Met levels rather than preventing depletion of free Met.

The SMM cycle and its relationship to the activated methyl cycle. The reactions catalyzed by MMT and HMT are bolded. CH3-THF, 5-Methyltetrahydrofolate THF, tetrahydrofolate.

The SMM cycle and its relationship to the activated methyl cycle. The reactions catalyzed by MMT and HMT are bolded. CH3-THF, 5-Methyltetrahydrofolate THF, tetrahydrofolate.

The functions of SMM and its seemingly wasteful cycle are for the most part unknown. The only established role of SMM is in transporting reduced sulfur in the phloem, for which there is qualitative evidence in a range of plants including Arabidopsis ( Bourgis et al., 1999). The importance of SMM relative to other translocated forms of sulfur has been quantified only in wheat (Triticum aestivum), where it accounts for one-half the sulfur moving to developing grains ( Bourgis et al., 1999). However, the contribution of SMM to sulfur transport may be less in other species ( Bourgis et al., 1999) and may depend on developmental stage and sulfur nutrition ( Fitzgerald et al., 2001). A hypothetical role for SMM is as methyl donor for a plant-specific reaction ( Giovanelli et al., 1980). This role has not been tested but is attractive because it would obviously explain why plants alone have SMM.

Roles in transport or methylation might explain why plants produce SMM, but not why there is futile cycling of SMM throughout the plant. Two hypotheses have been advanced to justify this cycling. The first is that the SMM cycle prevents overshoots in Ado-Met synthesis from depleting the free Met pool required for protein synthesis ( Mudd and Datko, 1990) by providing a way to convert Met moieties locked up in Ado-Met back to free Met. The second hypothesis is that the SMM cycle is a means whereby plants control Ado-Met level in the absence of the feedback loops between Ado-Met and the enzymes involved in its synthesis that occur in other eukaryotes ( Ranocha et al., 2001 Roje et al., 2002). Controlling the levels of Ado-Met and AdoHcy is considered crucial to the many methyl transfer reactions that take place in cells: AdoHcy is a potent competitive inhibitor of methyltransferases ( Cantoni et al., 1979) so that the Ado-Met:AdoHcy ratio (the methylation ratio) determines the activity of these enzymes ( Cantoni, 1977). Computer modeling of the SMM cycle in Arabidopsis leaves, based on data for wild-type plants, favored the hypothesis that the SMM cycle contributes to the control of Ado-Met level. Thus, when the SMM cycle was eliminated in silico, the Ado-Met level increased by up to 160%, but steady-state free Met levels did not change. Moreover, the free Met pool recovered from a simulated overshoot in Ado-Met synthesis almost as fast in the absence of the SMM cycle as in its presence ( Ranocha et al., 2001).

In the present study, we investigated the function of SMM and its cycle by isolating and characterizing insertional knockout mutants of MMT in Arabidopsis and maize (Zea mays), which both have singleMMT genes ( Bourgis et al., 1999). We found that SMM is dispensable but that eliminating it caused an increase in Ado-Met level and in the methylation ratio.


Analysis and nucleotide sequence of an origin of DNA replication in Acinetobacter calcoaceticus and its use for Escherichia coli shuttle plasmids

A shuttle plasmid for Acinetobacter calcoaceticus and Escherichia coli has been constructed from a cryptic A. calcoaceticus lwoffi plasmid and pBR322. It is transformed to A. calcoaceticus BD413 by natural competency, yielding about 10(6) transformants per microgram of plasmid DNA. The ApR and TcR genes of pBR322 are functional in A. calcoaceticus. A gene bank was constructed from chromosomal A. calcoaceticus DNA and the shuttle plasmid. Direct transformation to A. calcoaceticus yielded about 95% recombinants, indicating a sixfold enrichment of recombinant plasmids compared to E. coli. One clone complementing a trpE mutation carried a 20-kb insertion and transformed with a 30-fold higher efficiency when compared to the vector. A deletion analysis of the shuttle plasmid indicates that 2.2 kb is necessary for autonomous replication and stable maintenance in A. calcoaceticus. No rearrangements of the DNA or loss of plasmids are found in that organism, even in the absence of selective pressure, when this sequence is present. A further insertional inactivation analysis creating lacZ transcriptional fusions suggests that the origin of replication (ori) is contained within about 1350 bp. Analysis of beta-galactosidase production in A. calcoaceticus indicates that only a weak promoter activity is directed out of one end of this ori. Its sequence contains A + T-rich regions, an 18-bp element with nearly perfect palindromic symmetry and eleven repeats of the consensus sequence, AAAAAATAT, eight of which are clustered within 360 bp. However, no open reading frames or significant homologies to other ori were found.


DNA cloning in Bacillus subtilis. III. Efficiency of random-segment cloning and insertional inactivation vectors ☆

Random segments of Bacillus amyloliquefaciens and yeast Saccharomyces cerevisiae DNA were used to determine two parameters pertinent to cloning in Bacillus subtilis, the yield of hybrids and the mean size of cloned segments. 10 3 to 10 4 hybrids/μg of DNA segments were obtained. Hybrids represented 11–18% of transformants. Mean m. wt. of cloned DNA segments was about 1 × 10 6 , substantially lower than 3 × 10 6 found for donor DNAs after digestion with restriction endonucleases.

We have cloned a B. amyloliquefaciens DNA segment which complemented a deficiency in B. subtilis hisH und E. coli hisC genes, which encode imidazolylacetolphosphate aminotransferase. The cloning efficiency for this gene was 10 transformed hosts/μg of donor DNA.

Mehrere B. subtilis insertional-inactivation cloning vectors were examined. One, pHV41, allows inactivation of the kanamycin-resistance (Km R ) gene by insertion into its unique BglII site. In two other vectors, pHV11 and pHV23, insertion in their unique Kpn site inactivates the tetracycline-resistance (Tc R ) gene. pHV23 replicates both in E coli und B. subtilis, and carries unique sites for seven restriction endonucleases (BamHI, ÖkoRI, HpaICH, KpnICH, PstICH, SalICH, XbaI). This makes it one of the most versatile B. subtilis cloning vectors yet described.