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Warum kann NMR nicht an großen RNA-Molekülen verwendet werden?

Warum kann NMR nicht an großen RNA-Molekülen verwendet werden?


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Beim Lesen meines Molecular Bio-Lehrbuchs stieß ich auf einen Satz, der besagte, dass NMR nicht an großen RNA-Molekülen verwendet werden kann, um deren Struktur zu bestimmen. Warum ist das? Liegt es daran, dass RNA einzelsträngig ist?


RNA hat normalerweise ziemlich komplexe Strukturen. Das Problem bei der NMR ist jedoch, dass große RNAs, wie mRNAs, keine 1-Struktur haben, sondern eine Population möglicher Sekundärstrukturen haben und selbst wenn kleine Teile der RNA immer die gleiche lokale Struktur haben, das Gesamtmolekül wird verschiedene Formen annehmen. Das NMR sieht eine Population von Strukturen und kann kein gutes Signal erhalten. DNA und RNA scheinen verlockende Ziele für die NMR zu sein, da der Phosphor im Rückgrat NMR-aktiv ist, was möglicherweise die Bestimmung der Rückgratstruktur ermöglicht, aber dies funktioniert nur bei kurzen RNA-Stücken, die eine einzige Konformation annehmen.

Leider habe ich keine Quellen, nur ein paar Semester NMR-Kurse und ein Jahr In-vitro-Transkription von mRNA.


Kernresonanzspektroskopie

Die Bedeutung der Kernspinresonanz für Strukturstudien

Obwohl Chromatographie, Massenspektrometrie und Quantifizierung der Strahlungsabsorption umfassende Kenntnisse über molekulare Eigenschaften liefern, ist eine komplexere Technologie erforderlich, um eine Struktur vollständig zu lösen. Kernspinresonanz (NMR)-Spektroskopie und Röntgenkristallographie sind die am häufigsten verwendeten Methoden zur Aufklärung der Strukturen von Metaboliten. NMR-Assays klären die Bindungsanordnung von Atomen in einem Molekül auf, die Kristallographie liefert jedoch zusätzliche Informationen. Beispielsweise werden die räumliche Konfiguration um ein chirales Zentrum, die Bindungslängen und die Winkel zwischen benachbarten Bindungen durch Kristallographie bereitgestellt.

Die Kristallographie weist jedoch eine Reihe von Einschränkungen auf. Der bedeutendste ist der Bedarf an Einkristallen. Obwohl die bekannten physikalischen Eigenschaften eines Moleküls, wie die Löslichkeit, verwendet werden, um ein Kristallisationsschema zu entwerfen, sind einige Verbindungen sehr schwer zu kristallisieren ( Glazer, 2016 Massa, 2004 Stout & Jensen, 1989 ). Wenn viele Versuche unternommen werden müssen, um Kristalle zu bilden, können Dutzende oder Hunderte von Milligramm der Verbindung erforderlich sein. Ausreichende NMR-spektroskopische Daten für Metaboliten lassen sich oft schon aus einer Lösung mit wenigen Milligramm erhalten.

Notiz: Die Literaturhinweise, die in den folgenden Abschnitten zitiert werden, enthalten Diagramme, die die hier diskutierten Konzepte verdeutlichen.


Inhalt

Bei Nukleinsäuren werden fast immer zweidimensionale NMR-Methoden verwendet. Dazu gehören die Korrelationsspektroskopie (COSY) und die totale Kohärenztransferspektroskopie (TOCSY) zum Nachweis von Kernkopplungen durch Bindungen und die nukleare Overhauser-Effekt-Spektroskopie (NOESY) zum Nachweis von Kopplungen zwischen im Raum nahe beieinander liegenden Kernen. Die üblicherweise mit Nukleinsäuren durchgeführten NMR-Typen sind 1 H-NMR, 13 C-NMR, 15 N-NMR und 31 P-NMR. 19 F-NMR ist auch nützlich, wenn nichtnatürliche Nukleotide wie 2'-Fluor-2'-desoxyadenosin in den Nukleinsäurestrang eingebaut werden, da natürliche Nukleinsäuren keine Fluoratome enthalten. [2] [4]

1 H und 31 P weisen eine natürliche Häufigkeit von nahezu 100 % auf, während 13 C und 15 N eine geringe natürliche Häufigkeit aufweisen. Für diese beiden letztgenannten Kerne besteht die Fähigkeit, gewünschte Atome innerhalb der Moleküle entweder einheitlich oder ortsspezifisch isotopisch anzureichern. Mit 13 C und/oder 15 N einheitlich angereicherte Nukleotide können durch biochemische Verfahren erhalten werden, indem eine Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von dNTPs oder NTPs durchgeführt wird, die von Bakterien stammen, die in einer isotopenangereicherten Umgebung gezüchtet wurden. Die ortsspezifische Isotopenanreicherung muss durch chemische Synthese des markierten Nukleosid-Phosphoramidit-Monomers und des Vollstrangs erfolgen, jedoch sind diese schwierig und teuer zu synthetisieren. [fünfzehn]

Da Nukleinsäuren eine relativ große Anzahl von lösungsmittelaustauschbaren Protonen aufweisen, wird Nukleinsäure-NMR im Allgemeinen nicht in D . durchgeführt2O-Lösungsmittel, wie es bei anderen NMR-Typen üblich ist. Denn das Deuterium im Lösungsmittel würde die austauschbaren Protonen ersetzen und ihr Signal auslöschen. h2O wird als Lösungsmittel verwendet, und andere Methoden werden verwendet, um das starke Lösungsmittelsignal zu eliminieren, wie z mit den Nukleinsäureprotonen oder nur interessierende Resonanzen anzuregen ("selektive Anregung"), was den zusätzlichen, möglicherweise unerwünschten Effekt hat, die Spitzenamplituden zu verzerren. [2]

Die austauschbaren und nicht-austauschbaren Protonen werden ihren spezifischen Peaks üblicherweise als zwei unabhängige Gruppen zugeordnet. Für austauschbare Protonen, bei denen es sich hauptsächlich um die Protonen handelt, die an der Basenpaarung beteiligt sind, kann NOESY verwendet werden, um Korrelationen zwischen benachbarten Basen durch den Raum zu finden, wodurch ein ganzes Duplexmolekül durch sequentielles Gehen zugeordnet werden kann. Für nicht austauschbare Protonen, von denen sich viele auf dem Zuckeranteil der Nukleinsäure befinden, werden COSY und TOCSY verwendet, um Systeme gekoppelter Kerne zu identifizieren, während NOESY wiederum verwendet wird, um den Zucker mit der Base und jede Base mit ihrer benachbarten Base zu korrelieren. Bei nicht austauschbaren Duplex-DNA-Protonen korrelieren die H6/H8-Protonen auf der Base mit ihren Gegenstücken auf benachbarten Basen und mit dem H1'-Proton auf dem Zucker, was ein sequentielles Gehen ermöglicht. Für RNA machen die Unterschiede in der chemischen Struktur und Helixgeometrie diese Zuordnung technisch schwieriger, aber immer noch möglich. Die Methodik des sequentiellen Gehens ist weder für nicht-doppelhelikale Nukleinsäurestrukturen noch für die Z-DNA-Form möglich, was die Zuordnung von Resonanzen erschwert. [2] [3]

Aus dem Spektrum entnommene Parameter, hauptsächlich NOESY-Kreuzpeaks und Kopplungskonstanten, können verwendet werden, um lokale Strukturmerkmale wie glycosidische Bindungswinkel, Diederwinkel (unter Verwendung der Karplus-Gleichung) und Sugar-Pucker-Konformationen zu bestimmen. Das Vorhandensein oder Fehlen von Imino-Proton-Resonanzen oder die Kopplung zwischen 15 N-Atomen über eine Wasserstoffbrücke weist auf das Vorhandensein oder Fehlen einer Basenpaarung hin. Für großräumige Strukturen müssen diese lokalen Parameter durch andere strukturelle Annahmen oder Modelle ergänzt werden, da sich Fehler beim Durchqueren der Doppelhelix addieren und die Doppelhelix im Gegensatz zu Proteinen kein kompaktes Inneres hat und sich nicht zurückfaltet selbst. Orientierungsinformationen über große Entfernungen können jedoch durch verbleibende dipolare Kopplungsexperimente in einem Medium erhalten werden, das den Nukleinsäuremolekülen eine schwache Ausrichtung auferlegt. [1] [2]

Vor kurzem wurde die Festkörper-NMR-Methodik zur Strukturbestimmung von Nukleinsäuren eingeführt. [6] Das Protokoll impliziert zwei Ansätze: selektive Markierung von RNA vom Nukleotidtyp und Verwendung von heteronuklearen Korrelationsexperimenten.

NMR ist auch nützlich für die Untersuchung von nicht standardmäßigen Geometrien wie gebogenen Helices, Nicht-Watson-Crick-Basenpaarungen und koaxialer Stapelung. Es war besonders nützlich bei der Untersuchung der Struktur natürlicher RNA-Oligonukleotide, die dazu neigen, komplexe Konformationen wie Stammschleifen und Pseudoknoten anzunehmen. Wechselwirkungen zwischen RNA und Metallionen können mit einer Reihe von Methoden untersucht werden, einschließlich der Beobachtung von Änderungen der chemischen Verschiebung bei der Ionenbindung, der Beobachtung der Linienverbreiterung für paramagnetische Ionenspezies und der Beobachtung intermolekularer NOE-Kontakte für metallorganische Mimetika der Metallionen. NMR ist auch nützlich, um die Bindung von Nukleinsäuremolekülen an andere Moleküle, wie Proteine ​​oder Arzneimittel, zu untersuchen. Dies kann durch Chemical-Shift-Mapping erfolgen, bei dem festgestellt wird, welche Resonanzen bei der Bindung des anderen Moleküls verschoben werden, oder durch Kreuzsättigungsexperimente, bei denen eines der bindenden Moleküle selektiv gesättigt wird und, falls es gebunden ist, die Sättigung auf das andere übertragen wird Molekül im Komplex. [1] [2]

Dynamische Eigenschaften wie Duplex-Einzelstrang-Gleichgewichte und Bindungsraten anderer Moleküle an Duplexe können auch durch ihren Einfluss auf die Spin-Gitter-Relaxationszeit bestimmt werden T1, aber diese Methoden sind unempfindlich gegenüber Zwischengeschwindigkeiten von 10 4 –10 8 s −1 , die mit anderen Methoden wie der Festkörper-NMR untersucht werden müssen. Die Dynamik mechanischer Eigenschaften einer Nukleinsäure-Doppelhelix wie Biegen und Verdrehen kann auch mit NMR untersucht werden. Gepulste Feldgradienten-NMR-Experimente können verwendet werden, um Diffusionskonstanten zu messen. [1] [2] [7]

Nukleinsäure-NMR-Untersuchungen wurden bereits 1971 durchgeführt, [8] und konzentrierten sich auf die Verwendung der Niedrigfeld-Imino-Protonen-Resonanzen zur Untersuchung von Basenpaarungswechselwirkungen. Diese frühen Studien konzentrierten sich auf tRNA, da diese Nukleinsäuren zu dieser Zeit die einzigen verfügbaren Proben waren, deren Molekulargewicht niedrig genug war, dass die NMR-Spektrallinienbreiten praktisch waren. Die Studie konzentrierte sich auf die Niederfeldprotonen, da sie die einzigen Protonen waren, die mit den damals besten verfügbaren Spektrometern in wässriger Lösung zuverlässig beobachtet werden konnten. Es wurde schnell erkannt, dass Spektren der Niederfeld-Iminoprotonen Hinweise auf die Tertiärstruktur der tRNA in Lösung lieferten. Das erste NMR-Spektrum einer doppelhelikalen DNA wurde 1977 veröffentlicht [9] unter Verwendung einer synthetischen, 30 Basenpaare umfassenden Doppelhelix. Um die starke Linienverbreiterung in nativer DNA zu überwinden, wurde rein degradierte natürliche DNA hergestellt und untersucht, um die Persistenzlänge doppelhelikaler DNA zu erfahren. [10] Gleichzeitig wurden Kernpartikel von Nukleosomen untersucht, um weitere Erkenntnisse über die Flexibilität der Doppelhelix zu gewinnen. [11] Die ersten NMR-Spektren für eine einheitliche niedermolekulare Nativsequenz-DNA, die mit Restriktionsenzymen hergestellt wurde, wurden 1981 veröffentlicht. [12] Diese Arbeit war auch der erste Bericht über Nukleinsäure-NMR-Spektren, die bei Hochfeld erhalten wurden. 1982 wurde über zweidimensionale NMR-Studien berichtet [13], und dann, mit dem Aufkommen der Oligonukleotidsynthese und ausgefeilterer Instrumentierung, wurden ab 1983 viele detaillierte Strukturstudien veröffentlicht. [14]


CCR5 RNA-Pseudoknoten: Rückstands- und ortsspezifische Markierung korrelieren interne Bewegungen mit microRNA-Bindung

Die Konformationsdynamik von RNA-Molekülen spielt eine entscheidende Rolle bei der Steuerung ihrer biologischen Funktionen. Messungen des dynamischen Verhaltens von RNA geben wichtige Hinweise auf Stellen, die mit ihren Bindungspartnern oder zellulären Stimulatoren interagieren. Für große RNA-Moleküle (>70 nt nt=Nukleotide) sind solche Messungen mit Lösungs-NMR jedoch aufgrund starker spektraler Überlappung, homonuklearer 13 C-Skalarkopplungen und Linienverbreiterung schwierig. Hier wird eine strategische Kombination aus Festphasensynthese, ortsspezifischen isotopenmarkierten Phosphoramiditen und enzymatischer Ligation vorgestellt. Dieser Ansatz ermöglichte die positionsspezifische Insertion von Isotopensonden in eine 96 nt CCR5 RNA-Fragment. Genaue Messungen der funktionellen Dynamik mit den Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) Relaxationsdispersion (RD) Experimenten ermöglichten die Extraktion der Austauschraten und Populationen dieser RNA. Eine NMR-Störungsanalyse der chemischen Verschiebung des RNA/microRNA-1224-Komplexes zeigte, dass A90-C1′ des Pseudoknotens ähnliche Veränderungen der chemischen Verschiebung zeigt, die im angeregten Zustand beobachtet wurden. Diese Arbeit demonstriert die allgemeine Anwendbarkeit einer NMR-Markierungsstrategie zur Untersuchung der Strukturdynamik funktioneller RNA.

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Fortschritte, die das Studium großer RNA-Struktur und -Dynamik durch Kernspinresonanzspektroskopie erleichtern

Sarah C. Keane, Biophysik-Programm und Department of Chemistry, University of Michigan, Ann Arbor, MI 48109-1055.

Biophysik-Programm, University of Michigan, Ann Arbor, Michigan

Biophysik-Programm, University of Michigan, Ann Arbor, Michigan

Department of Chemistry, University of Michigan, Ann Arbor, Michigan

Sarah C. Keane, Biophysik-Programm und Department of Chemistry, University of Michigan, Ann Arbor, MI 48109-1055.

Abstrakt

Die Charakterisierung funktioneller, aber nicht proteinkodierender (nc) RNAs hat die Rolle der RNA in der Zelle von einem passiven Akteur im zentralen Dogma der Molekularbiologie zu einem aktiven Regulator der Genexpression erweitert. Die Fehlregulation der ncRNA-Funktion wurde mit einer Vielzahl von Krankheiten und Störungen in Verbindung gebracht, die von Krebs bis hin zu Neurodegeneration reichen. Ein detailliertes molekulares Verständnis der Funktion von ncRNAs war jedoch teilweise aufgrund der Schwierigkeiten, die mit der Gewinnung hochauflösender Strukturen großer RNAs verbunden sind, begrenzt. Die Tertiärstrukturbestimmung der RNA als Ganzes wird durch verschiedene technische Herausforderungen behindert, die alle mit zunehmender Größe der RNA verschlimmert werden. RNAs neigen nämlich dazu, hochflexible und dynamische Moleküle zu sein, die schwer zu kristallisieren sind. Die biomolekulare Kernspinresonanz(NMR)-Spektroskopie bietet eine brauchbare Alternative zur Bestimmung der Struktur großer RNA-Moleküle, die nicht leicht kristallisieren, aber selbst durch einige technische Beschränkungen behindert wird. Kürzlich hat eine Reihe von Fortschritten es dem biomolekularen NMR-Feld ermöglicht, einige dieser Beschränkungen zumindest teilweise zu überwinden. Zu diesen Fortschritten gehören Verbesserungen der Probenvorbereitungsstrategien sowie methodische Verbesserungen. Zusammen ebnen diese Innovationen den Weg für die Untersuchung immer größerer RNA-Moleküle, die eine wichtige biologische Funktion haben.

  • RNA-Struktur und -Dynamik > RNA-Struktur, -Dynamik und -Chemie
  • Regulatorische RNAs/RNAi/Riboswitches > Regulatorische RNAs
  • RNA-Struktur und -Dynamik > Einfluss der RNA-Struktur in biologischen Systemen

Abstrakt

Überblick über wichtige Probenvorbereitung und methodische Fortschritte, die die Untersuchung großer RNA-Struktur und -Dynamik durch Kernspinresonanzspektroskopie erleichtern. Diese Innovationen ebnen den Weg für das Studium bisher widerspenstiger Systeme.


NMR-Methoden zur Untersuchung von RNA-Proteinkomplexen – Teil II

Als ich in Göttingen war, wurden wir von Pharmaunternehmen angesprochen, die eine Reihe von Wirkstoffen haben und wissen wollten, wie diese Wirkstoffe an einen bestimmten Rezeptor binden.

Die Hälfte der Wirkstoffe würde mit dem Rezeptor kristallisieren, sodass sie leicht herausfinden könnten, wie diese binden, die Hälfte jedoch nicht. Sie fragten, ob wir eine Methode hätten, die ihnen dabei helfen könnte. Diese Rezeptoren waren in der Regel große Rezeptoren, sodass eine De-novo-Strukturbestimmung des Komplexes mit klassischen NMR-Methoden nicht möglich war.

Wir mussten uns daher alternative Wege ausdenken, und diese Wirkstoffe sind normalerweise Moleküle, die recht schwach an den Rezeptor binden, mit Dissoziationskonstanten im mikromolaren Bereich. Sie tauschen während eines NMR-Experiments schnell zwischen dem rezeptorgebundenen und dem freien Zustand aus.

In diesem Fall können Sie eine Reihe von Experimenten verwenden, die in den 80er Jahren entwickelt wurden, übertragene NOE (nuklearer Overhauser-Effekt), die tatsächlich nur den Liganden betrachten, der sich an seinen Zustand erinnert, wenn er an gebunden ist der Rezeptor.

Wenn der Austausch zwischen dem rezeptorgebundenen und dem rezeptorfreien Zustand schnell genug ist, behält der Ligand eine Erinnerung an den rezeptorgebundenen Zustand, während er sich in seinem freien Zustand befindet. Indem Sie den Liganden in seinem freien Zustand betrachten, können Sie das System nach seinem Gedächtnis im gebundenen Zustand befragen.

Diese übertragenen NOEs können Ihnen nun die Konformation des gebundenen Liganden liefern, also im Grunde sagen, welche Form der gebundene Ligand annimmt, wenn er an den Rezeptor bindet. Dies kann jedoch nicht sagen, wie der Ligand den Rezeptor bindet, also in welcher Ausrichtung er sich in der Bindungstasche des Rezeptors befindet, also welcher Teil des Liganden mit welchem ​​Teil des Rezeptors interagiert. Dafür haben wir uns eine alternative Methode überlegt.

Dies führte zu InPharma, das zwei Liganden verwendet, die abwechselnd an den Rezeptor binden, entweder bindet ein Ligand oder der andere Ligand bindet, so dass sie ihre Position in der Bindungstasche des Rezeptors kontinuierlich austauschen.

Wenn nun der erste Ligand an den Rezeptor bindet, hinterlässt er dort einige Informationen und hinterlässt einen Abdruck von sich selbst, bevor er den Rezeptor verlässt. Der zweite Ligand kommt dann herein und lernt den ersten Liganden kennen, indem er die Information ausliest, die der erste Ligand dort hinterlassen hat.

Es ist ein bisschen so, als ob Sie an eine Person denken, die einen Raum betritt und eine Notiz für Sie auf dem Schreibtisch hinterlässt. Dann betritt man den Raum, macht sich diese Notiz und weiß somit, dass die erste Person da war. Nun, was Sie wissen ist, dass diese Person in der Nähe des Schreibtisches war, weil sie dort eine Notiz hinterlegt hatte. Indem man die beiden Liganden auf diese Weise zum Sprechen bringt, weiß man, welcher Ligand sich in der Nähe von welchem ​​Teil des Rezeptors befunden hat, indem man ihn in den Teilen der Liganden ausliest, die in der Lage waren, miteinander zu kommunizieren.

Wenn Person A und Person B eine Notiz machen, die auf dem Schreibtisch hinterlassen wurde, wissen Sie, dass Person A und Person B am Schreibtisch waren. Wenn sich Person C und Person D über einen am Fenster hinterlassenen Zettel verständigt haben, wissen Sie, dass Person C und Person D am Fenster vorbeigegangen sind. Dies ist die gleiche Art von Informationen, die wir mit InPharma sammeln.

Wir lassen die beiden Liganden durch die Bindungstasche des Rezeptors miteinander sprechen. Dann wissen wir, welche Teile der beiden Liganden den gleichen Teil der Bindungsstelle des Rezeptors gesehen haben.

Wir tun dies mit Kombinationen vieler Ligandenpaare. Wir verwenden ein von uns geschriebenes Bioinformatikprogramm, um diese Informationen aus den NMR-Daten zu extrahieren. Durch Kombination dieses Programms mit Docking-Modellen können wir ableiten, wie diese verschiedenen Liganden an die Rezeptoren gebunden haben, also welche Teile des Rezeptors sie gesehen haben und wie sie mit dem Rezeptor kommuniziert haben.

Dies geschieht, ohne dass man sich jemals die Rezeptorresonanzen ansehen muss. Der Rezeptor kann unmarkiert sein, er kann einfach aus menschlichem Material, aus Zellen, extrahiert werden. Wir benötigen nur sehr geringe Mengen des Rezeptors. Das einzige, was wir uns ansehen müssen, sind die Liganden.

Es ist oft nicht so einfach, eine Kristallstruktur eines an einen Rezeptor gebundenen Liganden zu erhalten, selbst wenn der Rezeptor leicht kristallisiert. Der Ligand gelangt möglicherweise nicht in den Kristall oder in einer anderen Konformation oder in einer anderen Orientierung als in Lösung. Es ist möglicherweise nicht löslich genug oder es könnte den Kristall beim Einweichen zerstören. Es gibt verschiedene Probleme, die auftreten können, wenn versucht wird, einen Rezeptor zusammen mit einem Liganden zu kristallisieren.

Aus diesem Grund kamen Leute des Pharmaunternehmens auf uns zu und baten uns um Hilfe, da sie Fälle hatten, in denen es nicht möglich war, eine Kristallstruktur der Liganden mit dem Rezeptor zu erhalten. Durch die Entwicklung dieser Methodik haben wir einen Weg gefunden, die Bindungsmodi dieser Liganden an Rezeptoren zu ermitteln.

Ich denke, wir haben im Laufe der Jahre die Führungskräfte mehrerer Pharmaunternehmen davon überzeugt, dass die Methode gut genug und hilfreich ist. Wir sind dabei, einige unserer Kollegen in der Dateninterpretation zu schulen. Die Daten müssen bioinformatisch interpretiert und ein Programm verwendet werden. Wir haben tatsächlich mehrere Versionen dieses Programms entwickelt.

Dieses Projekt startete in Zusammenarbeit mit Christian Griesinger am MPI, daher hat das MPI eine Version dieses Programms. Wir haben andere Versionen des Programms. Die Methodik wird langsam von der Pharmaindustrie aufgegriffen und wir haben bereits die ersten Poster gesehen, die über InPharma-Daten berichteten, die ohne unsere Hilfe oder Beratung erworben wurden, daher sind wir sehr zufrieden damit.

Wäre dies etwas, das die Röntgenkristallographie für alles ersetzen würde, oder nur für Fälle, in denen sie nicht in Kristalle gelangen können?

Zunächst benötigt InPharma ein Strukturmodell des Proteins im Apo-Zustand. Für diese oder jede andere Modellierungsmethode benötigen wir noch Kristallographie oder Röntgenstrukturen homologer Proteine.

Zweitens ist Röntgen definitiv die schnellste Methode zur Lösung solcher Fragen, wenn der Rezeptor mit Ihrem Liganden kristallisiert. Ich sage nicht, dass wir die Röntgenkristallographie vollständig ersetzen oder ersetzen wollen, wir sind komplementär, wenn die Röntgenkristallographie nicht funktioniert.

Die beiden Methoden können auch parallel verwendet werden, um sich gegenseitig zu überprüfen. Es ist immer sehr gut, Informationen aus verschiedenen Methoden zu haben. Wir haben auch Fälle gesehen, in denen Kristallstrukturen nicht das reproduzierten, was wir in Lösung sahen. Dies kann passieren, insbesondere wenn man bedenkt, dass wenn ein so kleiner Ligand an eine große Proteintasche binden muss, der Ligand eine bevorzugte Orientierung annehmen könnte, die nur von der dreidimensionalen Struktur des Kristalls bestimmt wird, aber nicht wirklich von der meisten günstiges Zusammenspiel mit der Bindungstasche.

Sie sagten, das Röntgen sei die schnellere Methode. Was wäre der Zeitunterschied?

Es ist schwer zu sagen, weil es davon abhängt, wie gut Sie in InPharma und in der Kristallographie sind und wie schwierig es ist, einen Kristall des Komplexes zu bekommen. Sobald der Kristall da ist und Sie ein erfahrener Kristallograph sind, ist die Kristallographie viel schneller als InPharma, aber zuerst müssen Sie einen Kristall besorgen.

Sie sehen jetzt einige Poster für Pharmaunternehmen, die Ihre Methodik eigenständig übernehmen und anwenden können. Glaubst du, das könnte üblich werden?
Wir hoffen es. Wir pushen und promoten das Produkt. Wenn die Methodik eine komplizierte Dateninterpretation erfordert, müssen die Leute manchmal eine gewisse Energiebarriere überwinden. Wir arbeiten daran, den Menschen zu ermöglichen, diese Energiebarriere zu überwinden. Wir hoffen, dass die Methode dann sehr oft oder sicher regelmäßig von der Pharmaindustrie eingesetzt wird.

Wie wurde dies in der Pharmaindustrie verwendet? Wissen Sie, welche Art von Medikamenten sie untersuchen und welche Art von Verbindungen sie untersuchen?

Manchmal zeigt das Pharmaunternehmen seine Verbindungen nicht. Sie können Ihnen Spektren und die Methode zeigen, aber nicht die Verbindungen. Die Methodik wurde von uns verwendet, um alle Arten von Liganden zu untersuchen, von kleinen Liganden, wirklich kleinen, organischen Molekülen, bis hin zu Naturstoffen. Ich habe es in den Pharmaunternehmen gesehen, insbesondere bei kleinen Peptiden.

Wie wichtig werden Ihrer Meinung nach interdisziplinäre Ansätze für die Zukunft der Strukturchemie sein?

Mit den Fortschritten in der Biologie haben Wissenschaftler immer mehr molekulare Maschinen entdeckt, die Schlüsselfunktionen in Zellen haben, und deren Zusammensetzung charakterisiert. Jetzt wollen wir natürlich verstehen, wie sich diese Maschinen verhalten wie sie funktionieren wie sie ihre Konformation während der Katalyse ändern wie sie reguliert werden wie wir ihre Funktion stören können, zum Beispiel in einer Krankheitssituation wie wir ihre Funktion steigern können wie wir kann einige der Fehler korrigieren, die möglicherweise auf genetische Defekte usw. zurückzuführen sind.

Aus diesem Grund müssen wir verstehen, wie diese molekularen Maschinen funktionieren und wie sich ihre Struktur im Laufe der Zeit ändert, während sie ihre Funktion erfüllen. Natürlich kann man mit Röntgenkristallographie Schnappschüsse von verschiedenen Strukturen machen, und dies war die klassische Methode, um die Funktionsweise von Enzymen zu untersuchen, aber dazu muss man diese Maschinen in den verschiedenen Zuständen einfangen können. Durch Methoden in Lösung können Sie diese molekularen Maschinen tatsächlich in Echtzeit beobachten, wenn die Reaktion auf der NMR-Zeitskala langsam genug ist oder wenn Sie sie verlangsamen können, indem Sie mit der Temperatur oder anderen Bedingungen spielen. Dies ist wirklich einzigartig für NMR in Lösung.

Wenn Sie molekulare Maschinen mit hohem Molekulargewicht, also mehreren Hundert Kilodalton, betrachten möchten, können Sie deren Struktur natürlich nicht nur durch NMR lösen. Wir sind nun in der Lage, Proteine ​​mit sehr hohen Molekulargewichten in Lösung mit Hilfe von Methylgruppen als Spione zu betrachten, die uns sagen, wie sich die Konformation dieser molekularen Maschinen im Laufe der Zeit ändert oder was zum Beispiel in einem aktiven Zentrum eines Enzyms passiert. Wir sind nicht in der Lage, eine vollständige Struktur zu lösen.

Um die Struktur großer Komplexe zu bestimmen, benötigen wir zunächst die hochauflösende Struktur von Teilen dieser Komplexe. Wir können diese Teile dann mit den NMR-Beschränkungen zusammensetzen, die wir sammeln können, indem wir die Methylgruppen von Proteinen beobachten. Die NMR ist sehr gut beim Heranzoomen und beim Betrachten der molekularen Details bestimmter Teile des Enzyms, jedoch müssen wir die NMR durch andere Techniken in Lösung wie Kleinwinkel-Neutronenstreuung ergänzen, die in der Lage sind, über die Konformationsänderungen von . zu berichten die molekulare Maschine auf globaler Ebene. Wenn wir die beiden Arten von Informationen kombinieren, haben wir wirklich eine sehr leistungsfähige Methode, um das, sagen wir, Konformationsleben des Enzyms während seiner Funktion, während seiner Aktivität aufzulösen und darzustellen.

Die beiden Heiligen Gral der NMR sind Empfindlichkeit und Auflösung. Persönlich neige ich immer eher dazu, Auflösungen auf meine Wunschliste zu setzen. Da wir mit großen molekularen Maschinen und RNA arbeiten, ist die Auflösung wirklich ein Problem. Große Magnete tun beides, sie erfüllen beide Zwecke, wenn ich also etwas auf meine Wunschliste setzen müsste, würde ich auf jeden Fall große Felder darauf setzen.

Die dynamische Kernpolarisation (DNP) ist eine sehr interessante Entwicklung in Bezug auf die Empfindlichkeit, insbesondere für die Festkörper-NMR. Aus meiner Sicht ist es noch nicht ausgereift genug, um von jedem Labor der Welt problemlos verwendet zu werden. Wir haben einige DNP in Zusammenarbeit mit anderen Labors durchgeführt und haben sehr vielversprechende Ergebnisse, insbesondere bei der RNA. Wir trauen uns nicht, die DNP-Maschine selbst zu betreiben und alle Experimente und Anpassungen zu entwickeln, die notwendig wären, um die Technik wirklich für RNA zu optimieren.

Ich würde mir jedoch definitiv wünschen, dass es eine breit anwendbare Technik wird, die auch Nicht-Experten anwenden könnten. Bei DNP gibt es natürlich auch die Kostenfrage. Die laufenden Kosten sind sehr hoch, die sich wohl nicht jede Universität leisten könnte. Für mich sind große Felder wirklich das Wichtigste.

Können Sonden dabei überhaupt eine Rolle spielen? Können Sie Sonden verwenden, um die Auflösung zu verbessern?

Mit Sonden können Sie eine bessere Empfindlichkeit erzielen. Wenn Sie nur an Sensibilität interessiert sind, ist dies ein Weg. Wenn Sie auch daran interessiert sind, mit großen molekularen Maschinen zu arbeiten, die ein komplexes Spektrum haben, oder Sie mit RNA mit vielen überlappenden Resonanzen arbeiten, ist die Auflösung wirklich ein Thema und die Qualität der Spektren ändert sich durch die Änderung des Magnetfelds enorm. Daran führt kein Weg vorbei.

Können auch kleine Schritte eine große Verbesserung bewirken?

Ja, selbst kleine Inkremente im Feld machen manchmal den Unterschied zwischen der Fähigkeit, Informationen aus einem sehr überlappenden Bereich aufzulösen und zu erhalten, oder nicht in der Lage. Wenn Sie beispielsweise ein RNA-Spektrum bei 700 oder 900 MHz laufen lassen, würden Sie bei einigen Resonanzen einen großen Unterschied sehen, insbesondere in der Riboseregion. Es muss kein außergewöhnlicher Schritt sein, progressive Änderungen oder Verbesserungen sind für uns wichtig.

Spielt Massenspektrometrie eine Rolle?

Die Massenspektrometrie nimmt ihre Rolle in der Strukturbiologie wieder auf. Es gibt mehrere Anwendungen der Massenspektroskopie, die wir ebenfalls gerne verwenden würden. Das versuchen wir meist in Zusammenarbeit, weil man nicht für alles das Know-how im Haus haben kann und Kollegen braucht.

Eine Weiterentwicklung der Massenspektroskopie ist die Detektion von Crosslinks, die es ermöglicht, Informationen über Protein-Protein- oder Protein-RNA-Abstände in großen Komplexen zu erhalten.

Die Leute verwenden diese Art von Beschränkungen, um die Struktur zu berechnen. Es ist ein bisschen so, als würde man ein Experiment zur Steigerung der paramagnetischen Relaxation durchführen, bei dem man Abstände zwischen zwei spezifischen Positionen zweier Proteine ​​​​erhält. NMR mit paramagnetischer Relaxationsverstärkung ist viel leistungsfähiger, weil Sie die Abstände zwischen Ihrem paramagnetischen Tag und allen Methylgruppen, beispielsweise Ihrer Partnerproteine, erhalten, sodass Sie viel mehr Abstände erhalten. Die Abstände sind viel genauer und damit zuverlässiger.

Ich würde die Informationen, die Sie durch paramagnetische Relaxationsverstärkung erhalten, nicht durch Massenspektroskopie ersetzen, aber ich würde sie als ergänzende Methode verwenden, damit Sie zum Beispiel Abstände zwischen Lysin-Seitenketten betrachten können, die Sie nicht können Schauen Sie sich die Methylgruppen-Korrelationen an, die wir in der NMR für große Moleküle verwenden.

Ein weiterer interessanter Aspekt der Massenspektrometrie ist die sogenannte native Massenspektrometrie, bei der man beispielsweise komplexe Stöchiometrie und komplexe Gleichgewichte in Bulk betrachten kann. Dies ist auch etwas, was wir in Zusammenarbeit beginnen. Es ist schön zu haben, aber es ist nicht entscheidend für das, was wir tun.

Die wirklich entscheidende Komponente für das, was wir tun, ist die Neutronenkleinwinkelstreuung, die leider nur an Neutronenreaktoren durchgeführt werden kann und es nur wenige davon auf der Welt gibt. Europa ist dafür recht gut aufgestellt. Zumindest haben wir Zugang zu dem in München und dem in Frankreich, aber anscheinend ist es in den USA ziemlich schwierig, Kleinwinkel-Neutronenstreuung für biologische Proben durchzuführen. Ich höre, dass diese Technik dort nicht sehr zugänglich ist.

Ist dies komplementär zu NMR?

Es ist komplementär. Die Informationen, die Sie mit Kleinwinkelstreuung erhalten, haben eine sehr geringe Auflösung. Bei der Neutronenstreuung können Sie eine Technik namens Kontrastanpassung verwenden, die Ihnen in Kombination mit der Deuterierung bestimmter Komponenten Ihres Komplexes viel mehr Informationen liefert als die Röntgenkleinwinkelstreuung. Es ist meiner Meinung nach leistungsfähiger, aber die Informationen bleiben über die globale Form des Komplexes oder von Unterkomponenten Ihres Komplexes. Es wird niemals die hochauflösende atomare Information liefern, die NMR liefert.

Es ist auch nicht, wo die Forschung im Moment hingeht. Die Forschung geht in Richtung Interdisziplinarität und betrachtet die Dinge aus verschiedenen Blickwinkeln und unterschiedlichen Aspekten, sodass wir uns definitiv von der Einstellung „eine Maschine macht alles“ oder „eine Expertise macht alles“ wegbewegen. Sie müssen über alles Bescheid wissen.

Sehen Sie darin den allgemeinen Trend – die Notwendigkeit eines interdisziplinären Ansatzes?

Ja auf jeden Fall. Gerade wenn Sie in High-Impact-Journals publizieren wollen, brauchen Sie diesen interdisziplinären Aspekt.

Heutzutage sind wir besonders daran interessiert, die Möglichkeiten zu erforschen, die Festkörper-NMR im Hinblick auf den RNA-Teil unserer Komplexe bietet. In solution, we can look at large proteins or protein complexes because proteins have methyl groups and methyl groups can still be seen at very high molecular weights, but RNA is different. RNA doesn’t have any methyl groups and there are actually no chemical groups that are easily seen from the RNA part of molecular machines of several hundreds of kilodalton in solution.

When we studied the structure of the RNP methylation enzyme, we could watch the proteins in action, because we had the methyl groups of the proteins. However, we had one part of the complex, namely the RNA part, which remained obscure to us and silent.

I actually always like to compare NMR spectra with the molecule talking to us. You let the reaction start in the NMR tube and the molecule talks to you by shifting the peaks and telling you: “I’m here… I’m doing this, I’m doing that.”

The RNA wouldn’t talk to us. The reason for that is because there is no real chemical moiety in the RNA molecule that is still observable in molecular machines of high molecular weight. All resonances have just become too broad to be observed. The way we somehow got information on the NMR conformation is through small-angle neutron scattering with contrast matching, and through biochemical assays, but we would really love to be able to see the RNA talking to us and reporting on its state and on what it’s doing at specific steps during the reaction.

We believe that solid-state NMR might be the only technique that is able to give us this information. That’s why we embarked on developing a methodology to watch the RNA in solid-state NMR. When we started this project, there had been only very few things done on RNA in solid-state NMR. We had to develop the methodology to assign the NMR resonances, collect structural restraints and solve the structure of the RNA by solid-state NMR, which we did successfully.

Now, we are progressing to the next step, namely, looking at the RNA in the context of molecular machines. We have obtained really beautiful spectra of the RNA component of our large RNP methylation complex with excellent line widths and we are really excited about the possibility of now watching the RNA in the complex using solid-state NMR.

About Prof. Dr. Teresa Carlomagno
Prof. Dr Teresa Carlomagno studied chemistry in Naples, Italy. She did her PhD partly in Naples and partly in Germany, in the group led by Christian Griesinger in Frankfurt, where she also stayed on for a post-doc. Then, she moved to The Scripps Research Institute in the US to work together with James Williamson.

With Christian, Prof. Dr. Carlomagno learned all the NMR and the methodology development side of NMR. With James Williamson, she wanted to learn the wet-lab part and she was particularly interested in RNA structure at the time. RNA structure was just coming up. People mostly liked to focus on proteins, but she wanted to learn how to produce RNA and how to look at RNA interactions with proteins, so she moved to the Williamson lab where she spent two years as a post-doc.

Then, she took up a group leader position at the Max Planck Institute in Goettingen. From there, she moved to the EMBL, where she also had a group leader position for about seven years. Since summer 2015, Prof. Dr Carlomagno has been in Hannover, where she holds a professorship. She’s also associated with the Helmholtz Centre for Infection Research in Braunschweig.


Recent advances in RNA sequencing technologies have greatly expanded our knowledge of the RNA landscape in cells, often with spatiotemporal resolution. These techniques identified many new (often non-coding) RNA molecules. Large-scale studies have also discovered novel RNA binding proteins (RBPs), which exhibit single or multiple RNA binding domains (RBDs) for recognition of specific sequence or structured motifs in RNA. Starting from these large-scale approaches it is crucial to unravel the molecular principles of protein-RNA recognition in ribonucleoprotein complexes (RNPs) to understand the underlying mechanisms of gene regulation. Structural biology and biophysical studies at highest possible resolution are key to elucidate molecular mechanisms of RNA recognition by RBPs and how conformational dynamics, weak interactions and cooperative binding contribute to the formation of specific, context-dependent RNPs. While large compact RNPs can be well studied by X-ray crystallography and cryo-EM, analysis of dynamics and weak interaction necessitates the use of solution methods to capture these properties.

Here, we illustrate methods to study the structure and conformational dynamics of protein-RNA complexes in solution starting from the identification of interaction partners in a given RNP. Biophysical and biochemical techniques support the characterization of a protein-RNA complex and identify regions relevant in structural analysis. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful tool to gain information on folding, stability and dynamics of RNAs and characterize RNPs in solution. It provides crucial information that is complementary to the static pictures derived from other techniques. NMR can be readily combined with other solution techniques, such as small angle X-ray and/or neutron scattering (SAXS/SANS), electron paramagnetic resonance (EPR), and Förster resonance energy transfer (FRET), which provide information about overall shapes, internal domain arrangements and dynamics. Principles of protein-RNA recognition and current approaches are reviewed and illustrated with recent studies.


Explained: Why RNA vaccines for Covid-19 raced to the front of the pack

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Developing and testing a new vaccine typically takes at least 12 to 18 months. However, just over 10 months after the genetic sequence of the SARS-CoV-2 virus was published, two pharmaceutical companies applied for FDA emergency use authorization of vaccines that appear to be highly effective against the virus.

Both vaccines are made from messenger RNA, the molecule that cells naturally use to carry DNA’s instructions to cells’ protein-building machinery. A vaccine based on mRNA has never been approved by the FDA before. However, many years of research have gone into RNA vaccines, which is one reason why scientists were able to start testing such vaccines against Covid-19 so quickly. Once the viral sequences were revealed in January, it took just days for pharmaceutical companies Moderna and Pfizer, along with its German partner BioNTech, to generate mRNA vaccine candidates.

“What’s particularly unique to mRNA is the ability to rapidly generate vaccines against new diseases. That I think is one of the most exciting stories behind this technology,” says Daniel Anderson, a professor of chemical engineering at MIT and a member of MIT’s Koch Institute for Integrative Cancer Research and Institute for Medical Engineering and Science.

Most traditional vaccines consist of either killed or weakened forms of a virus or bacterium. These provoke an immune response that allows the body to fight off the actual pathogen later on.

Instead of delivering a virus or a viral protein, RNA vaccines deliver genetic information that allows the body’s own cells to produce a viral protein. Synthetic mRNA that encodes a viral protein can borrow this machinery to produce many copies of the protein. These proteins stimulate the immune system to mount a response, without posing any risk of infection.

A key advantage of mRNA is that it is very easy to synthesize once researchers know the sequence of the viral protein they want to target. Most vaccines for SARS-CoV-2 provoke an immune response that targets the coronavirus spike protein, which is found on the surface of the virus and gives the virus its characteristic spiky shape. Messenger RNA vaccines encode segments of the spike protein, and those mRNA sequences are much easier to generate in the lab than the spike protein itself.

“With traditional vaccines, you have to do a lot of development. You need a big factory to make the protein, or the virus, and it takes a long time to grow them,” says Robert Langer, the David H. Koch Institute Professor at MIT, a member of the Koch Institute, and one of the founders of Moderna. “The beauty of mRNA is that you don’t need that. If you inject nanoencapsulated mRNA into a person, it goes into the cells, and then the body is your factory. The body takes care of everything else from there.”

Langer has spent decades developing novel ways to deliver medicines, including therapeutic nucleic acids such as RNA and DNA. In the 1970s, he published the first study showing that it was possible to encapsulate nucleic acids, as well as other large molecules, in tiny particles and deliver them into the body. (Work by MIT Institute Professor Phillip Sharp and others on RNA splicing, which also laid groundwork for today’s mRNA vaccines, began in the ’70s as well.)

“It was very controversial at the time,” Langer recalls. “Everybody told us it was impossible, and my first nine grants were rejected. I spent about two years working on it, and I found over 200 ways to get it to not work. But then eventually I did find a way to get it to work.”

That paper, which appeared in Natur in 1976, showed that tiny particles made of synthetic polymers could safely carry and slowly release large molecules such as proteins and nucleic acids. Later, Langer and others showed that when polyethylene glycol (PEG) was added to the surface of nanoparticles, they could last in the body for much longer, instead of being destroyed almost immediately.

In subsequent years, Langer, Anderson, and others have developed fatty molecules called lipid nanoparticles that are also very effective at delivering nucleic acids. These carriers protect RNA from being broken down in the body and help to ferry it through cell membranes. Both the Moderna and Pfizer RNA vaccines are carried by lipid nanoparticles with PEG.

“Messenger RNA is a large hydrophilic molecule. It doesn’t naturally enter cells by itself, and so these vaccines are wrapped up in nanoparticles that facilitate their delivery inside of cells. This allows the RNA to be delivered inside of cells, and then translated into proteins,” Anderson says.

In 2018, the FDA approved the first lipid nanoparticle carrier for RNA, which was developed by Alnylam Pharmaceuticals to deliver a type of RNA called siRNA. Unlike mRNA, siRNA silences its target genes, which can benefit patients by turning off mutated genes that cause disease.

One drawback to mRNA vaccines is that they can break down at high temperatures, which is why the current vaccines are stored at such cold temperatures. Pfizer’s SARS-CoV-2 vaccine has to be stored at -70 degrees Celsius (-94 degrees Fahrenheit), and the Moderna vaccine at -20 C (-4 F). One way to make RNA vaccines more stable, Anderson points out, is to add stabilizers and remove water from the vaccine through a process called lyophilization, which has been shown to allow some mRNA vaccines to be stored in a refrigerator instead of a freezer.

The striking effectiveness of both of these Covid-19 vaccines in phase 3 clinical trials (roughly 95 percent) offers hope that not only will those vaccines help to end the current pandemic, but also that in the future, RNA vaccines may help in the fight against other diseases such as HIV and cancer, Anderson says.

“People in the field, including myself, saw a lot of promise in the technology, but you don’t really know until you get human data. So to see that level of protection, not just with the Pfizer vaccine but also with Moderna, really validates the potential of the technology — not only for Covid, but also for all these other diseases that people are working on,” he says. “I think it’s an important moment for the field.”


Topological constraints: using RNA secondary structure to model 3D conformation, folding pathways, and dynamic adaptation

Accompanying recent advances in determining RNA secondary structure is the growing appreciation for the importance of relatively simple topological constraints, encoded at the secondary structure level, in defining the overall architecture, folding pathways, and dynamic adaptability of RNA. A new view is emerging in which tertiary interactions do not define RNA 3D structure, but rather, help select specific conformers from an already narrow, topologically pre-defined conformational distribution. Studies are providing fundamental insights into the nature of these topological constraints, how they are encoded by the RNA secondary structure, and how they interplay with other interactions, breathing new meaning to RNA secondary structure. New approaches have been developed that take advantage of topological constraints in determining RNA backbone conformation based on secondary structure, and a limited set of other, easily accessible constraints. Topological constraints are also providing a much-needed framework for rationalizing and describing RNA dynamics and structural adaptation. Finally, studies suggest that topological constraints may play important roles in steering RNA folding pathways. Here, we review recent advances in our understanding of topological constraints encoded by the RNA secondary structure.

Höhepunkte

► Secondary structures can define RNA global architecture and dynamic adaptability. ► Tertiary interactions select for specific conformers from structural ensembles. ► New structure prediction approaches are utilizing topological derived constraints. ► Topological constraints rationalize and describe RNA dynamics and adaptation. ► Topological constraints may direct RNA down specific folding pathways.


APPLICATIONS OF NMR TO STUDIES OF TISSUE METABOLISM

Many bacterial clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)–CRISPR-associated (Cas) systems employ the dual RNA–guided DNA endonuclease Cas9 to defend against invading phages and conjugative plasmids by introducing site-specific . Read More

Supplemental Materials

Supplemental Videos 1 and 2 Read More

Figure 1: CRISPR–Cas9-mediated DNA interference in bacterial adaptive immunity. (a) A typical CRISPR locus in a type II CRISPR–Cas system comprises an array of repetitive sequences (repeats, brown dia.

Figure 2: The mechanism of CRISPR–Cas9–mediated genome engineering. The synthetic sgRNA or crRNA–tracrRNA structure directs a Cas9 endonuclease to almost arbitrary DNA sequence in the genome through a.

Figure 3: Overall structure of Streptococcus pyogenes Cas9 (SpyCas9) in the apo state. (a) Ribbon representation of the crystal structure of SpyCas9 (PDB ID 4CMP). Individual Cas9 domains are colored .

Figure 4: Guide RNA loading enables Cas9 to form a DNA recognition–competent conformation for target search. (a) Ribbon diagram showing the apo structure of SpyCas9 aligned in the same orientation as .

Figure 5: Structures of CRISPR–Cas9 bound to DNA substrates, showing the same view as in Figure 4c after superposition. (a) Crystal structure of SpyCas9 (surface representation) in complex with sgRNA .

Figure 6: Schematic representations of the proposed mechanisms of CRISPR–Cas9-mediated target DNA recognition and cleavage. Upon sgRNA loading, Cas9 undergoes a large conformational rearrangement to r.

Figure 7: Structures of Cas9 orthologs reveal both the conserved and divergent structural features among orthologous CRISPR–Cas9 systems. Individual Cas9 domains are colored according to the scheme in.


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