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Warum gibt es einen Cp/Ct-Wert (Kreuzungspunkt) für eine negative Probe in der COVID-19 RT-PCR?

Warum gibt es einen Cp/Ct-Wert (Kreuzungspunkt) für eine negative Probe in der COVID-19 RT-PCR?



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Ich komme aus dem IT/Engineering-Hintergrund und habe einige Verwirrung in RT-PCR. Soweit ich weiß, extrahieren wir RNA aus Testproben und transkribieren sie in komplementäre DNA (cDNA), und innerhalb der PCR wird die DNA-Doppelhelix getrennt. Dann Primer eine kurze Nukleinsäuresequenz, die einen Ausgangspunkt für die DNA-Synthese mit der Zielsequenz bietet und die Ziel-DNA vervielfacht.

Da ein höherer cp-Wert ein negatives Ergebnis anzeigt, aber warum haben negative Ergebnisse einen cp-Wert? Warum überschreitet es die Schwelle, wenn es eine Zielsequenz (virale DNA) hat? Fluoreszenz ist das Maß für die Ziel-DNA, oder??

Bei der Extraktion wird RNA extrahiert, wird nur COVID-Virus-RNA abgezogen? Was passiert mit anderer viraler und menschlicher RNA?

Ich habe ein Ergebnis gesehen, bei dem wir einen niedrigen cp-Wert hatten und das Testergebnis negativ war. Der Grund dafür war, dass die Kurve keine Sigmoid-Funktion hat. Ich brauche mehr Erklärung dazu.


  1. Die PCR ist hochspezifisch (dh sie amplifiziert nur die DNA, an die die Primer binden), sodass die Ergebnisse im Allgemeinen gut sind. Aber: Aufgrund der exponentiellen Natur der Amplifikation können schon sehr kleine Fehlpaarungen zur Amplifikation einer sehr kleinen DNA-Menge und in der Folge zu einem Fluoreszenzsignal führen. Es gibt grundsätzlich zwei Möglichkeiten, diese Amplifikation zu erhalten (außer der gewünschten): Kontaminationen und Primer-Selbstamplifikation. Der erste sollte klar sein, der zweite passiert, wenn Primer an sich selbst (oder den komplementären) binden können. Dies zeigt sich in der Regel erst spät in der PCR, weshalb Sie ihm einen Ct-Wert zuordnen und danach kein aussagekräftiges Amplifikationsergebnis mehr erwarten.

  2. Je nach Methode extrahieren Sie die gesamte RNA aus Ihrer Probe und übersetzen diese in cDNA. Für die Amplifikation in der PCR benötigt man jedoch Primer, die zu dieser cDNA passen. Und da diese Primer nachweislich hochspezifisch sind (dh sie binden absolut keine andere Sequenz, auch nicht von nahe verwandten Virusspezies), können wir sicher sein, dass jedes Signal, das den unter 1. genannten Kriterien entspricht, von viraler RNA und zeigt eine Infektion. Siehe die Referenz für einen der häufig verwendeten PCR-Tests.

  3. Ohne die Kurve zu sehen, kann ich nichts genaues dazu sagen. Im Allgemeinen folgt eine Echtzeit-PCR-Kurve einer Sigmaform. Dies gibt einige Informationen über den Verlauf der Reaktion im Laufe der Zeit. Wenn es anders aussieht, kann entweder etwas mit der Reaktion oder der Probe passiert sein. Es kann einen PCR-Inhibitor enthalten, die Probe kann kontaminiert sein oder etwas anderes. Ich würde einem solchen Ergebnis nicht trauen und es mit einer neuen Probe wiederholen.

Referenz

Erkennung des neuartigen Coronavirus 2019 (2019-nCoV) durch Echtzeit-RT-PCR


Während die Antwort von @ Chris richtig ist, gibt es eine Komplikation:

Das Prinzip der quantitativen PCR (qPCR) besteht darin, dass Sie eine Reaktion haben, die, wenn Ihre Reaktion 100 % effizient ist, die Anzahl der pro Zyklus produzierten DNA-Stränge verdoppelt. Theoretisch können Sie mit einem Strang beginnen und 2, dann 4, dann 8 in einem 2 erhaltenn Stilgleichung, wobeinist die Zyklusnummer.

In Wirklichkeit passiert dies jedoch selten, die meisten Reaktionen sind nicht 100% effizient; im Allgemeinen wird ein Bereich von 90 % als akzeptabel angesehen. Wenn Sie also rechnen, funktioniert es nicht ganz, dass sich jeder Zyklus verdoppelt.

Die qPCR-Tests, die mit COVID-19-Proben durchgeführt werden, dauern im Allgemeinen 45 Zyklen cDNA) in jeder Reaktion, daher handelt es sich bei dem Signal wahrscheinlich um eine unspezifische Amplifikation oder um Störsignale von anderen Produkten in der Reaktion, wie z -aber beseitigt dieses Problem).

Unspezifische Amplifikation kann durch Betrachten der Reaktion und Vergleichen der Schmelzkurven der Produkte der PCR nachgewiesen werden. Bestimmte Produkte haben Schmelzkurven, die bestimmte Kriterien erfüllen (alle mit einem Peak am selben Punkt), während unspezifische Produkte unterschiedliche Schmelzpunkte/Kurven aufweisen.


Echtzeit-PCR: C t . verstehen

Real-time PCR, auch quantitative PCR oder qPCR genannt, kann eine einfache und elegante Methode zur Bestimmung der Menge einer Zielsequenz oder eines Gens bieten, die in einer Probe vorhanden ist. Seine Einfachheit kann manchmal zu Problemen führen, wenn einige der kritischen Faktoren übersehen werden, die dafür sorgen, dass es funktioniert. Diese Übersicht wird diese Faktoren hervorheben, die bei der Einrichtung und Bewertung einer Echtzeit-PCR-Reaktion berücksichtigt werden müssen.

Faktoren, die C . beeinflussen könnenT

CT (Schwellenzyklus) ist der Schnittpunkt zwischen einer Verstärkungskurve und einer Schwellenlinie (Abbildung 1B). Es ist ein relatives Maß für die Konzentration des Ziels in der PCR-Reaktion. Viele Faktoren beeinflussen den absoluten Wert von CT neben der Konzentration des Ziels. Wir werden die häufigsten templatunabhängigen Faktoren diskutieren, die C . beeinflussen könnenT und beschreiben, wie die Leistung einer Echtzeit-PCR-Reaktion bewertet wird.

Abbildung 1 oben zeigt mehrere Parameter des Echtzeit-Reaktionsverstärkungsdiagramms. Die exponentielle Phase in 1B entspricht der linearen Phase in 1C . Der Schwellenwert muss in der linearen Phase des Verstärkungsdiagramms in Abbildung 1C eingestellt werden. Das CT Wert steigt mit abnehmender Vorlagenmenge. Artefakte aus dem Reaktionsgemisch oder Instrument, die die Fluoreszenzmessungen im Zusammenhang mit dem C . verändernT Berechnung führt zu vorlagenunabhängigen Änderungen des CT Wert. Daher ist das CT Werte von PCR-Reaktionen, die unter anderen Bedingungen oder mit verschiedenen Reagenzien durchgeführt wurden, können nicht direkt verglichen werden.


Abstrakt

Die Histoplasmose gilt als eine der wichtigsten endemischen und systemischen Mykosen weltweit. Bisher wurden nur wenige molekulare Techniken zu ihrer Diagnose entwickelt. Ziel dieser Studie war es, drei Real-Time-PCR (qPCR)-Protokolle für verschiedene proteinkodierende Gene (100-kDa-, H- und M-Antigene) im Tiermodell zu entwickeln und zu evaluieren. Frisches und formalinfixiertes und in Paraffin eingebettetes (FFPE) Lungengewebe von BALB/c-Mäusen, die i.n. mit 2.5x10 6 Histoplasma capsulatum Hefe oder PBS wurden 1, 2, 3, 4, 8, 12 und 16 Wochen nach der Infektion erhalten. Eine Sammlung von DNA aus Kulturen, die verschiedene Kladen von . darstellen h. Kapsel (30 Stämme) und andere medizinisch relevante Krankheitserreger (36 Stämme verwandter Pilze und Mycobacterium tuberculosis) wurden verwendet, um Sensitivität und Spezifität zu analysieren. Analytische Sensitivität und Spezifität betrugen 100 %, wenn DNAs aus den verschiedenen Stämmen getestet wurden. Die höchste Pilzbelastung trat in der ersten Woche nach der Infektion auf, und nach der dritten Woche wurde eine vollständige Pilzbeseitigung beobachtet h. Kapsel Hefezellen wurde in der histopathologischen Analyse nachgewiesen. In der ersten Woche nach der Infektion werden alle frischen und FFPE-Lungengewebe von h. Kapsel-infizierte Tiere waren für die getesteten qPCR-Protokolle positiv, mit Ausnahme des M-Antigen-Protokolls, das bei der Analyse frischer Lungengewebeproben zu unterschiedlichen Ergebnissen führte. In der zweiten Woche zeigten alle qPCR-Protokolle unterschiedliche Ergebnisse sowohl für frisches als auch für FFPE-Gewebe. Proben von den infizierten Mäusen zu den verbleibenden Zeiten nach der Infektion und nicht infizierten Mäusen (Kontrollen) waren für alle Protokolle negativ. Es wurde eine gute Übereinstimmung zwischen den CFUs, der histopathologischen Analyse und den qPCR-Ergebnissen für die 100-kDa- und H-Antigen-Protokolle beobachtet. Wir haben erfolgreich drei qPCR-Assays zum Nachweis von . standardisiert und validiert h. Kapsel DNA in frischem und FFPE-Gewebe und schlussfolgern, dass die 100-kDa- und H-Antigen-Molekularassays vielversprechende Tests zur Diagnose dieser Mykose sind.

Zitat: López LF, Muñoz CO, Cáceres DH, Tobón M, Loparev V, Clay O, et al. (2017)Standardisierung und Validierung von Echtzeit-PCR-Assays zur Diagnose von Histoplasmose unter Verwendung von drei molekularen Zielen in einem Tiermodell. PLoS ONE 12(12): e0190311. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0190311

Editor: Ulrich Melcher, Oklahoma State University, VEREINIGTE STAATEN

Empfangen: 19. September 2017 Akzeptiert: 12. Dezember 2017 Veröffentlicht: 29. Dezember 2017

Dies ist ein Open-Access-Artikel, der frei von allen Urheberrechten ist und von jedermann für rechtmäßige Zwecke frei reproduziert, verteilt, übertragen, modifiziert, darauf aufgebaut oder anderweitig verwendet werden darf. Die Arbeit wird unter der Creative Commons CC0 Public Domain Widmung zur Verfügung gestellt.

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind im Papier enthalten.

Finanzierung: Diese Studie wurde unterstützt von Colciencias (Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación), Bogotá, Kolumbien, Projektcode 221356933625 an BLG Fondo de Investigaciones de la Universidad del Rosario (FIUR), Bogotá, Kolumbien, Code DVG154 an BLG Comité para el Desarrollo de la Investigación (CODI) der Universidad de Antioquia durch das Sustainability Strategy Program 2016-2017 und die Mycotic Diseases Branch, CDC, Atlanta, USA, und die IMMY Company, Norman, Oklahoma, USA für ein Reisestipendium für den Studenten, der unsere Projekt. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.


2 Antworten 2

NIST verfügt über zwei Dokumente, die Kategorisierungen und Unterkategorien der Informationssicherheit abdecken.

Das CyberSecurity Framework (NIST CSF - siehe https://www.nist.gov/cyberframework) ist das einfachere der beiden, bietet aber sicherlich das, wonach Sie suchen, auf hohem Niveau. Die Hauptkategorien sind Identifizieren, Schützen, Erkennen, Reagieren, Wiederherstellen, und jede davon hat eine Unterkategorisierung. Der CSF umfasst etwas mehr als 100 Elemente, was ihn sehr zugänglich macht.

Das andere Dokument ist Security and Privacy Controls for Federal Information Systems and Organizations (siehe http://nvlpubs.nist.gov/nistpubs/SpecialPublications/NIST.SP.800-53r4.pdf). Sicherheitskontrollen sind in Anhang F aufgeführt.

Wenn Sie Befunde haben, die nicht in die obigen Kategorisierungen passen, können Sie Ihren eigenen Bereich Sonstiges erstellen. Wenn Sie sich jedoch an NIST halten, präsentieren Sie Ihre Ergebnisse zumindest unter Verwendung eines anerkannten Branchenrahmens, der für verschiedene Kunden verwendet werden kann, und stellen sicher, dass Sie eine standardisierte Sprache sprechen.


2 Antworten 2

Sie können versuchen, das 30m SRTM für Ihre Region herunterzuladen und die Konturen selbst abzuleiten. Es ist kostenlos über EarthExplorer erhältlich. Konturen können mit dem Werkzeug Raster > Extraktion > Kontur in QGIS erzeugt werden.

Ähnlich wie Rob Skellys Vorschlag würde ich als zweites 30m SRTM-Daten verwenden.

Ich weiß, dass Whitebox dafür ein großartiges Tool hat, das die SRTM-Dateien herunterlädt und das DEM in einem Schuss basierend auf Ihrer Region verarbeitet.


1 Antwort 1

Der Tweak ist ein Dienst, den die Verschlüsselungsmethode für Sie bereitstellt. Sie können damit die Kontexttrennung für verschiedene Verschlüsselungen mit demselben Schlüssel bereitstellen.

Hier ist das Problem, bei dem es zu helfen versucht: Angenommen, Sie verwenden denselben Schlüssel, um beispielsweise eine Reihe von Elementen zu verschlüsseln. Angenommen, Sie verschlüsseln alle Elemente in einer Spalte einer Datenbank mit diesem Schlüssel.

Dies führt zu einem Problem: Wenn der Datensatz, der Alice entspricht, eine 5 in diesem Feld hat und der Datensatz, der Bob entspricht, hat auch eine 5 in diesem Feld, dann hätten beide Datensätze den gleichen verschlüsselten Wert. Jemand, der sich die verschlüsselten Datensätze ansieht, kann nicht erkennen, was dieser gemeinsame Wert ist, aber er weiß, dass sie gleich sind. Und wenn Bob seinen Wert kennt, dann kennt er auch den Wert von Alice.

Eine offensichtliche Möglichkeit, damit umzugehen, besteht darin, für jeden Datensatz einen anderen Schlüssel zu verwenden. Das würde funktionieren, aber das ist eine Menge Schlüssel zu handhaben und zu speichern.

Der Tweak bietet eine alternative Möglichkeit, damit umzugehen, er ändert die Zuordnung zwischen Klartext und Chiffretext, aber (im Gegensatz zum Schlüssel) gehen wir nicht davon aus, dass der Angreifer nicht weiß, was es ist. In unserem Datenbankbeispiel könnten wir den Namen des Benutzers ("Alice" und "Bob") optimieren, dann kann niemand etwas daraus ableiten, selbst wenn Alices und Bobs verschlüsselter Datensatz den gleichen verschlüsselten Wert hat (weil die Zuordnungen vom Chiffretext zum Klartext unabhängig ist, können sie auf denselben Wert abgebildet werden, und möglicherweise nicht).

Was bedeutet das für Sie? Nun, das hängt davon ab, wofür Sie FE1 verwenden. Wenn Sie buchstäblich einen Wert mit dem Schlüssel verschlüsseln, brauchen Sie ihn wirklich nicht - Sie können ihn auf einen festen Wert setzen (z. B. die leere Zeichenfolge). Wenn Sie jedoch mehrere Werte mit demselben Schlüssel verschlüsseln, können Sie dies möglicherweise nutzen.

Eine letzte Anmerkung: Warum ist diese Optimierung für die formaterhaltende Verschlüsselung besonders wichtig? Nun, bei Standardverschlüsselungsmodi fügen wir während der Verschlüsselung einen Zufallsfaktor (IVs) hinzu (so dass wir, selbst wenn Sie denselben Wert zweimal verschlüsseln, unterschiedliche IVs auswählen), und der verschlüsselte Text würde anders aussehen. Diese Randomisierung macht jedoch notwendigerweise den Geheimtext größer als den Klartext. Bei der Formaterhaltenden Verschlüsselung haben wir diese Option nicht, daher brauchen wir einen anderen Weg, um dies zu beheben.


Warum gibt es einen Cp/Ct-Wert (Kreuzungspunkt) für eine negative Probe in der COVID-19 RT-PCR? - Biologie

Habilitation beim Fakultätszentrum Lebens- und Lebensmittelwissenschaften,
Technische Universität München - Weihenstephan im Januar 2003
Autor: Dr. Michael W. Pfaffl
Institut für Physiologie, Zentrum für Lebens- und Lebensmittelwissenschaften, Weihenstephaner Berg 3, 85354 Freising, Deutschland

  • Abstrakt
  • Einführung
  • Viehtranskriptom
    • RNA-Extraktion
    • Reverse Transkription
    • Absolute Quantifizierung
    • Vor- und Nachteile externer Standards
    • Anwendung der absoluten Quantifizierung
    • Relative Quantifizierung
    • Anwendung der relativen Quantifizierung
    • Datenauswertung
    • Automatisierung des Quantifizierungsverfahrens
    • Statistischer Vergleich

    C) Extern standardisierte RT-PCR mit Online-Detektion mittels spezifischer Hybridisierungssonden (18-20): Dieses Detektionsformat basiert auf verschiedenen Fluoreszenzdetektionsformaten, z.B. Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET).


    Viehtranskriptom

    Abbildung 1: Charakterisierung des aus zahlreichen Rindergewebeproben isolierten Transkriptoms (29, 30).

    Isolierte RNA kann Gewebeenzyminhibitoren enthalten, die zu verringerten RT- und PCR-Reaktionseffizienzen führen und unzuverlässige und falsche Quantifizierungsergebnisse erzeugen (25, 26). Die meisten RNA-Präparate sind in sehr geringen Mengen mit DNA und Proteinen verunreinigt. Selbst kommerziell erhaltene RNA von hoher Qualität enthält nachweisbare Mengen an DNA (26). Auch wenn dies für einige Anwendungen kein Problem darstellt, kann die enorme Amplifikationsleistung der kinetischen PCR selbst kleinste Mengen an DNA-Kontamination zur Beeinträchtigung der gewünschten “spezifischen Amplifikation” führen. Um das Fehlen von DNA-Resten zu bestätigen, sollte immer entweder eine “minus-RT” oder eine „Wasserkontrolle“ in das Versuchsdesign aufgenommen werden. Es kann erforderlich sein, die RNA-Probe mit kommerziell erhältlicher RNAse-freier DNAse zu behandeln, um restliche DNA zu entfernen.


    Reverse Transkription

    Zufallshexamer-Primer > Poly-dt-Primer > Gen-spezifischer Primer


    Vergleich der Echtzeit-RT-PCR mit der Endpunkterkennungsmethode

    Figur 2: Die vier charakteristischen Phasen der PCR, bewertet durch Echtzeit-PCR-Fluoreszenzakquisition (59, 60).


    Chemisch entwickelte und Echtzeit-RT-PCR-Plattformen


    Quantifizierungsstrategien in der kinetischen RT-PCR

    Absolute Quantifizierung

    80%) und Transfer-RNA (tRNA, 10-15%), wie in Abbildung 1 dargestellt. 4, 85, 86). Um Hintergrundeffekte zu kompensieren und eine natürliche RNA-Verteilung wie in nativer Gesamt-RNA nachzuahmen, kann aus Bakterien- oder Insektenzelllinien isolierte Gesamt-RNA verwendet werden. Alternativ können kommerziell erhältliche RNA-Quellen als RNA-Hintergrund verwendet werden, z.B. poly-A-RNA oder tRNA, repräsentieren jedoch keine native RNA-Verteilung über alle RNA-Unterfraktionen (3, 4, 42). Frühere Ergebnisse legen nahe, dass im Allgemeinen ein Minimum an RNA-Hintergrund erforderlich ist und dass dies die Effizienz der RT-Synthese erhöht. Niedrige Konzentrationen von recRNA, die in Kalibrierkurven verwendet werden, sollten immer mit moderaten Konzentrationen an unspezifischer Hintergrund- oder Träger-RNA gepuffert werden, da sonst die geringen Mengen durch RNAse leicht abgebaut werden können. Sehr hohe Hintergrundkonzentrationen hatten einen signifikanteren Suppressionseffekt auf die RT-Syntheserate und die spätere Echtzeit-PCR-Effizienz (4).


    Vor- und Nachteile externer Standards

    Abbildung 5: Mittlere Intra-Assay- (n = 7x3) und Inter-Assay-Variation (n = 7x7) des Östrogenrezeptor (ER)-Alpha-Echtzeit-RT-PCR-Assays unter Verwendung einer extern standardisierten recDNA-Kalibrierungskurve (73-75, 83).


    Anwendung der absoluten Quantifizierung

    Abbildung 7: Mittlere PrPc-mRNA-Kopienzahlen in verschiedenen Rindergeweben auf mg-Gewebebasis (76). Fehlerlinien zeigen SD an.


    Relative Quantifizierung

    Gleichung 1

    Gleichung 2

    Gleichung 3

    Gleichung 4

    Gleichung 5

    Gleichung 6


    Anwendung der relativen Quantifizierung

    Von den 1001 Genen, die auf dem Microarray vorhanden waren, wurden 457 Gene in der Leber und 566 Gene im Jejunum mit Signalintensitäten in mindestens einem der beiden Kanäle für Cy3 oder Cy5 exprimiert, die größer als das Zweifache der negativen Kontrollen waren. Gene wurden in Klassen (0,1-fache Expressionsbreite), zwischen 1-fachem und 2-fachem Expressionsverhältnis und über 2-facher Expression in größeren Bereichen zusammengefasst. Eine dreiparametrische Gaußsche Regression wurde für jedes Gewebe (Fig. 10) auf der Grundlage einer logarithmischen Umrechnung (10 log) der medianen Expressionsverhältnisse jeder Klasse berechnet. Dies führte zu einem hohen Regressionskoeffizienten (rliver = 0,854, p < 0,0001 rjejunum = 0,853, p < 0,0001) und zu einer Normalverteilung beider Häufigkeitsdatensätze. Für das x-fache Expressionsverhältnis (x) wurde ein 95 % vertrauliches Intervall berechnet, zweiseitig vom Mittelwert (µ) gemäß der Gaußschen Verteilung ( µ - 1,96 x Standardabweichung < µ < µ + 1,96 x Standardabweichung ) und die zweiseitige 2,5% Signifikanzniveaugrenzen wurden definiert (p < 0,05). Für Leber und Jejunum wurden die folgenden 95 %-Konfidenzintervalle berechnet: -1,82-fach < x < +1,74-fach bzw. -1,71-fach < x < +1,61-fach. Gemäß den abgeleiteten Cut-Offs wurden insgesamt 85 Kandidatengene ausgewählt (Abbildung 10).


    So werden Sie unspezifische Echtzeit-PCR-Artefakte los

    1. Segment mit Denaturierung bei 95°C
    2. Segment mit Primer-Annealing bei 55-65°C
    3. Segment mit Dehnung bei 72°.C
    4. Segment mit Fluoreszenzaufnahme bei erhöhten Temperaturen (51, 64, 103).

    Die Vorteile einer Hochtemperatur-Fluoreszenzaufnahme während der Amplifikation sind eine zuverlässigere Quantifizierung mit geringerer Variation in einem breiteren Quantifizierungsbereich (60, 72, 83). Die Fluoreszenzaufnahme im 4. Segment wird hauptsächlich im Bereich von 80-87 °C durchgeführt, eliminiert die unspezifischen Fluoreszenzsignale, die von Primerdimeren oder unspezifischen Nebenprodukten stammen, und gewährleistet eine genaue Quantifizierung des gewünschten Produkts. Die Hochtemperatur-Quantifizierung hält die Hintergrundfluoreszenz und die „keine Template-Kontrolle“-Fluoreszenz unter 2-3% der maximalen Fluoreszenz im Plateau (58, 60, 72). Insbesondere bei der SYBR ® Green I-Bestimmung kann eine sensitive Transkriptquantifizierung mit hoher Linearität (Korrelationskoeffizient r = 0,99) über acht Größenordnungen (102 bis 109 RNA-Startmoleküle) erreicht werden (Abbildung 12 B). Im Gegensatz dazu führt eine konventionelle Bestimmung bei 72°C zu einem verkürzten Quantifizierungsbereich (r = 0,99) über nur vier Größenordnungen (105 bis 109 RNA-Startmoleküle, Abbildung 12 A).


    Effizienz der Echtzeit-PCR-Amplifikation

    Abbildung 13: Bestimmung der Real-Time-PCR-Effizienzen aus den Steigungen der Kalibrierungskurve (Methode A), gemäß der Gleichung: E ​​= 10 [𔂿/slope] (5, 53, 65) des “Referenzgen”Glutathiontransferase (Gst) und zwei “Zielgene”: Tryptophan-Operon (TyrA) und Aspartat-Transcarbamylase (PyrB) (99). CP-Zyklen gegen cDNA (reverse transkribierte Gesamt-RNA) Konzentrationseingabe (log-Skala) wurden aufgetragen, um die Steigung zu berechnen (mittlere ± SD n = 3).


    Normalisierung von Ausdrucksergebnissen

    Hier stellt sich eine zentrale Frage: “Was ist das geeignete Referenzgen für eine experimentelle Behandlung und untersuchtes Gewebe?” (3, 42, 133).

    jvdesomp/genorm/). Das GeNorm VBA-Applet für Microsoft Excel bestimmt die stabilsten Housekeeping-Gene aus einem Satz von 10 getesteten Genen in einem bestimmten cDNA-Probenpanel und berechnet einen Genexpressions-Normalisierungsfaktor für jede Gewebeprobe basierend auf dem geometrischen Mittel einer benutzerdefinierten Anzahl von Housekeeping Gene. Die in GeNorm verwendete Normalisierungsstrategie ist eine Voraussetzung für ein genaues kinetisches RT-PCR-Expressionsprofil, das die Möglichkeit eröffnet, die biologische Relevanz kleiner Expressionsunterschiede zu untersuchen (40).


    Echtzeit-PCR-Datenverarbeitung


    Automatisierung des Quantifizierungsverfahrens

    Dennoch hängt die erfolgreiche Anwendung von Echtzeit-RT-PCR und REST von einem klaren Verständnis der praktischen Probleme ab. Daher bleibt ein kohärentes experimentelles Design, Anwendung und Validierung des individuellen Echtzeit-RT-PCR-Assays für eine genaue und vollständig quantitative Messung von mRNA-Transkripten unerlässlich (http://www.wzw.tum.de/gene-quantification/rest.html ).


    Statistischer Vergleich

    Nur zwei kostenlos verfügbare Softwarepakete unterstützen die statistische Analyse von Expressionsergebnissen: Q-Gene (102) und REST (100). Das Q-Gene Statistics Add-In ist eine Sammlung mehrerer VBA-Programme für die schnelle und menügeführte Durchführung häufig verwendeter parametrischer und nichtparametrischer statistischer Tests. Um die Signifikanzniveaudifferenz zwischen zwei beliebigen Gruppenausdruckswerten zu bewerten, ist es möglich, einen gepaarten oder einen ungepaarten Student’-Test, einen Mann-Whitney-U-Test oder einen Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test durchzuführen (137). Darüber hinaus kann die Korrelationsanalyse nach Pearson zwischen zwei übereinstimmenden Gruppen von Ausdruckswerten angewendet werden. Darüber hinaus berechnen alle Statistikprogramme die Mittelwerte der beiden analysierten Gruppen und deren prozentuale Differenz.

    Ich danke D. Tetzlaff und A. Sachsenhauser für die fachliche Unterstützung und allen anderen Labormitarbeitern für das gute Arbeitsklima.

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    2 Answers 2

    Question 1) Is this a good idea in general?

    Solving this problem as a supervised learning regression problem is a fantastic idea and is the type of solution that will greatly benefit your company since it will translate to other similar and dissimilar problems much more easily than deterministic methods.

    However using a neural network to solve this supervised learning regression problem is probably a very bad idea. Neural networks can add great value to certain problems, are among the very best algorithms for complex problems where computing power is not an issue, and have fascinating implications for the future of machine learning and artificial intelligence. But. they can be very tricky to train, require a lot of computing power, require a lot of data, and perform poorly in many cases.

    I suggest you scope the problem using linear regression and then try a support vector regressor (SVM, SVR) or naive Bayes regressor. The analogue methods in SVR work very well with limited data and provide surprisingly accurate results.

    Question 2) If yes, what type of NN would be most suited for such a problem?

    If you must use a neural network then try playing with the problem. Start with a feed forward neural network. Note that it will likely underperform an SVR. Then think about moving toward a convolution neural network. Again, this is probably a very bad way to go. Try linear regression followed by other methods first.

    Moving forward

    The documentation for either Scikit-Learn in python, H20 in Java, or Weka provide very shallow learning curves to jump on the merry-go-round and take a spin or two. Please make sure that you thoroughly understand cross validation and scoring metrics as this is essential to continued, adequate progress.


    Products

    Hot Start PCR is a technique that inhibits Hot Start Taq polymerase activity or the incorporation of modified dNTPs during reaction set up until a heat activation step occurs. Hot Start PCR allows for reaction set up at room temperature without non-specific amplification and primer dimer formation. Discover our wide selection of Hot Start PCR enzymes including KOD, FastStart™, JumpStart™, and KAPA Biosystems reagents. Additionally, our Extract-N-AMP™ PCR kits integrate DNA extraction and amplification using a hot start PCR ReadyMix™ reagent and are suitable for blood, tissue, and plant samples. For additional information on Hot Start PCR reagents and product information, please navigate the product selection table to meet your Hot Start PCR needs.


    Abstrakt

    Parthenogenetic activation of the mammalian oocyte constitutes an essential step to a number of oocyte- or embryo-related technologies. Mammalian parthenotes are useful tools for studying the roles of paternal and maternal genomes in early mammalian development and are considered potential candidates for an ethical source of embryonic stem cells.

    We investigated the in vitro developmental competence of pre-implantation ovine embryos derived from in vitro fertilization (IVF) and parthenogenetic activation (PA) together with the expression of a panel of fourteen genes at different times of development. IVF and PA embryos showed similar developmental competence. No differences in gene expression were observed between PA and IVF two cell-stage embryos, while PA morulae showed a significantly higher expression of IGF2. At the blastocyst stage, parthenotes exhibited up-regulation of TP-1, CDC2, und IGF2 transcripts and significantly lower levels of AQP3, ATP1A1, H2A.Z, hsp90beta, und OCT4, while NANOG, BAX, CCNB1, CDH1, GAPDH, und IGF2R displayed similar expression patterns in the two groups.

    Our study indicates that oocyte parthenogenetic activation does not impair in vitro pre-implantation development to the blastocyst stage, but affects the gene expression status of the embryo after the activation of its own genome.