Information

Trimmen von tRNA-Vorläufern


Aus Molecular Biology of the Cell (4. Auflage) von Bruce Alberts et al. (Kap. 6, S. 338) :

Sowohl bakterielle als auch eukaryotische tRNAs werden typischerweise als größere Vorläufer-tRNAs synthetisiert, und diese werden dann getrimmt, um die reife tRNA zu produzieren. Darüber hinaus enthalten einige tRNA-Vorläufer (sowohl aus Bakterien als auch aus Eukaryoten) Introns, die herausgespleißt werden müssen.

Was ist der Unterschied zwischen den beiden Anweisungen (und zwischen Trimmen und Spleißen)?


Trimmen = Entfernen von RNA-Sequenzen von einem Ende.

Spleißen = Introns entfernen und Exons wieder zusammenfügen.


Isotopenmarkierung von Biomolekülen - Markierungsmethoden

Olivier Duss, . Frédéric H.-T. Allain, in Methoden der Enzymologie, 2015

5.3 Sequenzspezifische RNase H-Spaltung

Der RNA-Vorläufer wird dann einer sequenzspezifischen RNase H-Spaltung unterzogen, die mit einem 2'- Ö-Methyl-RNA/DNA-Chimäre hybridisierte an die Spaltungsstelle ( 3 und 8 ). Für eine erfolgreiche Spaltung muss die Chimäre so gestaltet sein, dass vier DNA-Nukleotide direkt 5' an die Spaltstelle auf der RNA hybridisieren und mehrere zusätzliche 2'-Ö-Methyl-RNA-Nukleotide hybridisieren weiter stromaufwärts an die zu spaltende RNA (Abb. 5 B). Obwohl für die Spaltung nicht erforderlich, 2′-Ö-Methyl-RNA-Nukleotide können auch entworfen werden, um mit der RNA stromabwärts der Spaltungsstelle zu hybridisieren ( 3 ). Wir fanden, dass Chimären, die 14–16 Nukleotide lang sind und sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts der Spaltungsstellen hybridisieren, typischerweise die vollständigsten und spezifischsten Spaltungsergebnisse liefern (bis zu 95% spezifische Spaltung) (Duss et al., 2010, 2012).

Abbildung 8 . Beispiel für eine Vorläufer-RNA und die entsprechende 2′-Ö-Methyl-RNA/DNA-Chimäre für die ortsspezifische Spaltung, die durch RNase H vermittelt wird ′ Vorbauschlaufe in schwarz. Vier zusätzliche Nukleotide verlängern die VS-Stammschleife und sind entbehrlich. Die 2'-Ö-Methyl-RNA-Nukleotide sind mit einem „m“ gekennzeichnet.

Die besten Bedingungen für die Spaltung werden durch Reaktionen im kleinen Maßstab erhalten (typischerweise 500 pmol RNA in 15 µl Reaktionsvolumen). Die wichtigsten Optimierungsparameter sind die RNase H-Enzymkonzentration (NEB, oder selbst hergestellt (Ponchon, Beauvais, Nonin-Lecomte, & Dardel, 2009)) und das Verhältnis zwischen RNA und 2′-Ö-Methyl-RNA/DNA-Chimäre (Duss et al., 2010). Obwohl die meisten RNase H-Spaltungsreaktionen mit nur 5% stöchiometrischer Menge an 2′-Ö-Methyl-RNA/DNA-Chimäre im Vergleich zu zu spaltender RNA sind einige Reaktionen weniger empfindlich gegenüber unspezifischer Spaltung, wenn stöchiometrische Mengen an Chimäre verwendet werden. Im Allgemeinen werden die Reaktionen 1 h bei 37 °C inkubiert. Einige Reaktionen können auch bei niedrigeren Temperaturen (z. B. 4 °C) durchgeführt werden, um eine unspezifische Spaltung zu minimieren.

Die besten Bedingungen werden auf eine großmaßstäbliche Reaktion (typischerweise 20–200 nmol) hochskaliert. Beachten Sie, dass bei einer proportionalen Erhöhung der RNase H-Enzymkonzentration wie bei den anderen Reaktionskomponenten dies zu einer unspezifischen Spaltung führen kann. Daher sollte die RNase H-Konzentration in der groß angelegten Reaktion um das 10-fache reduziert werden. Der Abschluss der Reaktion sollte durch Denaturierung von Polyacrylamidgelen überprüft werden. Bei unvollständiger Spaltung kann mehr RNase H zugegeben werden und die Reaktion um eine weitere Stunde fortgesetzt werden. Eine typische Reaktion zur Spaltung von 200 nmol RNA wird in einem 6-ml-Volumen mit 33 μ . durchgeführtm RNA, 1,65 μm Chimäre, 80 nm selbst hergestellte RNase H in 50 mm Tris-HCl (pH 7,5), 100 mm NaCl und 10 mlm MgCl2.

Die Reaktionen werden direkt auf eine Anionenaustauscher-HPLC geladen, gefolgt von n-Butanol-Extraktion und Lyophilisation wie oben erwähnt.


Verarbeitung von Prä-tRNA in E.coli und Hefe | Genetik

In diesem Artikel werden wir die Verarbeitung von prä-tRNA in E.coli und Hefe diskutieren.

In Prokaryonten gibt es viele Operons (z. B. 7 Gene in E. coli), die durch Spacer-Sequenzen getrennt sind. Reife tRNA-Moleküle werden durch die Verarbeitung längerer prä-tRNA-Transkripte erzeugt. Durch einen spezifischen Schritt erzeugen die RNasen D, E, F und P diese reifen tRNA-Moleküle durch exo- und endonukleolytische Spaltung (Abb. 10.11 A).

Wenn sich die primären Transkripte gefaltet und Stamm und Schleife gebildet haben, schneidet eine Endonuklease (RNase oder F) eine abblätternde Sequenz am 3′ Ende an der Basis des Stamms ab und erzeugt einen Vorläufer mit neun zusätzlichen Nukleotiden. Dann entfernt RNase D nacheinander sieben dieser 3′-Nukleotide.

RNase P spaltet, um das reife 5′ Ende der tRNA zu produzieren, gefolgt von RNase D Trimmen der verbleibenden 2 Nukleotide vom 3′ Ende. Schließlich durchläuft die tRNA eine Basenmodifikationskette, d. h. eine Modifikation in 20% der Basen, um ungewöhnliche Basen wie Ribothymidin (rT), Pseudouridin (Ψ), Dihydrouridin (DHU) und Inosin (I) zu bilden.

Viele Eukaryoten, Prä-tRNA-Moleküle, werden mit einem 16-Nukleotid-5′-Leader, einem 14-Nukleotid-Intron und zusätzlichen 5′- und 3′-Nukleotiden synthetisiert. Diese werden jedoch bei der Verarbeitung entfernt. Das Primärtranskript wird in eine Sekundärstruktur mit Stämmen und Schleifen umgewandelt.

Diese ermöglichen es den Endonukleasen, den 5′-Leader und zwei 3′-Nukleotide zu erkennen und zu schneiden. Im Gegensatz zur prokaryotischen tRNA wird das 3’terminal 5′ CCA-3′ durch das Enzym tRNA Nukleotidyltransferase hinzugefügt. An jedem Ende werden Introns durch endokatalytische Spaltung entfernt, gefolgt von Ligation der halben tRNA-Moleküle. (Abb. 10.11B).


Resultate und Diskussionen

Fülle von RNA-Spezies

Die RNA-Seq-Methodik wurde verwendet, um einen globalen Überblick über die Produktion und Verarbeitung kleiner RNA-Moleküle in N. equitans. Abhängig von der gewählten Methode der RNA-Isolierung, Bibliothekserstellung und der verwendeten RNA-Sequenzierungsplattform werden verschiedene RNA-Spezies selektiv angereichert [16]. Um ein möglichst vollständiges Bild der kleinen RNA-Diversität in der N. equitans Zelle wurden kleine RNAs angereichert, aber nicht an ribosomalen RNAs verarmt. Alle RNA-Proben wurden mit T4-Polynukleotidkinase und Tabaksäurepyrophosphatase vor der Adapterligation behandelt. Diese Schritte wurden verwendet, um sicherzustellen, dass RNAs mit 5'-Triphosphat- oder 5'-OH-Termini und 2',3'-cyclischen Phosphat-Termini eingefangen wurden. Illumina HiSeq2000-Sequenzierung wurde verwendet, die über 12 Millionen Reads ergab, die auf die N. equitans Genom (Zusatzdatei 1). Die Analyse der Häufigkeit verschiedener RNA-Spezies bestätigte, dass alle erwarteten verschiedenen Typen von RNA-Spezies in den RNA-Seq-Daten nachgewiesen wurden, einschließlich rRNAs, tRNAs, tRNA-Halbmoleküle, kleine RNAs (sRNAs) und crRNAs. Trotzdem wurde nur eine überraschend kleine Menge an reifen tRNAs nachgewiesen und Sequenzierungs-Reads (normalerweise weniger als 1.000 Reads) auf Fragmente von tRNA-Genen kartiert. Diese Beobachtung soll beispielhaft für die Herausforderungen stehen, die hochstrukturierte und stark modifizierte RNA-Sequenzen für Reverse-Transkriptase-Enzyme darstellen. Die meisten erhaltenen Sequenzierungs-Reads (ungefähr 8,5 Millionen Reads) wurden den Genen zugeordnet, die für die 5S-, 16S- und 23S-rRNAs kodieren, gefolgt von mehreren sehr häufig vorkommenden C/D-Box-sRNAs und crRNAs (Abbildung 1). Die Analyse dieser beiden kleinen RNA-Spezies wird unten detailliert beschrieben. Obwohl der RNA-Isolierungsansatz nicht für die Reinigung von mRNAs eingerichtet wurde, ermöglichten die Tiefen der erhaltenen Sequenzierungsergebnisse die Kartierung von reichlich fragmentierten mRNA-Reads. Die meisten mRNA-Fragment-Reads (ca. 119.000 Reads) wurden den beiden Genen NEQ300 (S-Layer-Protein) und NEQ026 (Protein mit unbekannter Funktion) zugeordnet. Beide Genprodukte wurden auch durch Ganzzell-Proteomik als unter den sechs am häufigsten vorkommenden identifiziert N. equitans Proteine ​​[12]. Das einzige identifizierbare Homolog von NEQ026 findet sich in Thermofilum-Anhänger (arCOG06945) und mit einer mutmaßlichen Aminosäurepermease verbunden. Diese Beobachtung bietet einen Ausgangspunkt für die Analyse des sehr häufig vorkommenden Proteins NEQ026, das möglicherweise an der Aufnahme von Aminosäuren aus beteiligt ist I. hospitalis.

RNA-Häufigkeit in N. equitans. Illumina HiSeq2000-Sequenzierungs-Reads, die dem N. equitans Referenzgenom (GenBank: NC_005213, 490885 bp) unterstreichen die Fülle an crRNAs und C/D-Box-sRNAs.

Reifung von tRNA-Molekülen

N. equitans war der erste identifizierte Organismus, der sechs tRNA-Isoakzeptoren über a . erzeugte trans-Spleißreaktion unter Verwendung von tRNA-Halbmolekülen. Frühere Studien charakterisierten die reifen gespleißten tRNA-Moleküle in der Zelle, jedoch konnte nur ein einziges tRNA-Halbtranskript identifiziert werden [5, 17]. Die Tiefe der verfügbaren RNA-Seq-Daten ermöglichte die Identifizierung aller 11 tRNA-Hälften in der N. equitans Zelle. Die tRNA-Halbmoleküle enthalten die Sequenz, die sich in den reifen tRNA-Körper falten wird, und einen GC-reichen Abschnitt, der komplementär zu einer Sequenz ist, die nur in der passenden tRNA-Hälfte gefunden wird. Diese Sequenzen sollen die Identifizierung der passenden Hälften erleichtern, um die sich der tRNA-Körper faltet [5]. Anschließend erzeugt die konzertierte Aktion einer heterotetrameren Spleiß-Endonuklease und einer RNA-Ligase trans-gespleißte reife tRNAs. Die Termini aller tRNA-Hälften wurden identifiziert (Abbildung 2). Die 5'-Termini der tRNA-Vorläufer sind definierter als ihre 3'-Termini und enthalten den Purinrest, der für die richtige Initiation der Transkription erforderlich ist. In den meisten Fällen reichen die tRNA-Vorläufertranskripte nicht über den GC-reichen Abschnitt hinaus. Diese Region ist nur um zwei Nukleotide (GC) für die 3' tRNA Met Hälfte, um ein Nukleotid (A) für die 3' tRNA His Hälfte und um ein Nukleotid (A) für die 3' tRNA Lys Hälfte verlängert. In einigen Fällen verschmelzen die erhaltenen tRNA-Vorläufersequenzen mit der mRNA des benachbarten Gens. Ein Beispiel ist die 5'-tRNA-His-Hälfte, die sich direkt stromaufwärts des Gens befindet, das für die Valyl-tRNA-Synthetase kodiert und ihre 5'-untranslatierte Region definiert. Es ist verlockend zu spekulieren, dass diese strukturierte tRNA-Hälfte eine Rolle bei der mRNA-Stabilität oder Regulierung der Valyl-tRNA-Synthetase-Synthese spielen könnte. Die 5' tRNA Glu (UUC) Hälfte und 3' tRNAich Met-Halbsequenzen erstrecken sich in benachbarte Gene unterschiedlicher Orientierung, was Schwierigkeiten für die richtigen Terminationssignale verursachen könnte. Diese Sequenzen weisen darauf hin, dass ein definiertes 3'-Ende möglicherweise nicht immer eine Notwendigkeit für den Zusammenbau von tRNA-Hälften zu funktionellen tRNA-Molekülen darstellt. Schließlich beide 5'-tRNA-Hälften für die tRNAich Met und die tRNA His enthalten bereits die zusätzliche -1 Base, die zu einem verlängerten Akzeptorstamm in der reifen tRNA führt.

Identifizierung von tRNA-Halbvorläufern für das tRNA-Spleißen in trans. Das Beobachtete N. equitans Genomabdeckung der Illumina HiSeq2000-Sequenz liest die Termini von tRNA-Halbvorläufern punktgenau. Die Annotation der tRNA-Vorläufer, die Sequenzen enthalten, die sich zur endgültigen tRNA (umrandet) zusammenfügen, und GC-reiche umgekehrte komplementäre Abschnitte, die die übereinstimmende Hälfte identifizieren (unterstrichen), sind aus [17] entnommen.

Abwesenheit von RNase P

In intergenen Regionen wurde nach potentiellen strukturellen RNA-Molekülen mit geringer Häufigkeit gesucht, aber das ansonsten universelle RNase-P-RNA-Molekül konnte nicht nachgewiesen werden, was mit früheren Studien übereinstimmt [9]. Genomische Umlagerungen kompensieren den Verlust von RNase P und stellen sicher, dass alle tRNAs mit einem Purinrest direkt an der Transkriptionsinitiationsstelle beginnen. Die RNA-Seq-Daten ermöglichten es uns, die 5'-tRNA-Termini zu analysieren und das Fehlen von Leadersequenzen zu verifizieren. Ein interessantes Beispiel ist die tRNA Tyr , die zu ihrer Erkennung durch die Tyrosyl-tRNA-Synthetase eine C1-Base benötigt. Ohne RNase P könnten solche tRNAs jedoch nicht mit einem Pyrimidinrest beginnen und es wurde berichtet, dass eine ungewöhnliche G-1-Verlängerung die Notwendigkeit sowohl einer C1-Base als auch eines Purinrests am Transkriptionsstart löst [9]. Da dieser einzigartige Akzeptorstamm ein direkter Beweis für die Abwesenheit von RNase P ist, wurden die RNA-Seq-Reads auf (i) das tRNA-Gen mit einem Intron und (ii) die reife intronlose tRNA kartiert. Während für die reife tRNA aufgrund von Problemen der reversen Transkription einer vollständig modifizierten tRNA signifikant weniger Reads nachgewiesen wurden, enthielt die überwiegende Mehrheit aller Sequenzen, die auf den tRNA-Tyr-Locus kartiert wurden, die G-1-Erweiterung.

Verarbeitung von CRISPR-RNAs

N. equitans enthält zwei CRISPR-Cluster, deren crRNAs in der Zelle sehr häufig vorkommen. Zu beachten ist, dass beide CRISPR-Cluster in den gängigen CRISPR-Datenbanken in umgekehrter Orientierung annotiert sind [18, 19]. Diese crRNAs bestehen aus einzelnen Spacer-Sequenzen, von denen in anderen Organismen gezeigt wurde, dass sie viralen oder konjugativen Plasmidfragmenten entsprechen, die während eines früheren Angriffs dieses mobilen genetischen Elements in das CRISPR eingebaut wurden und durch Basenkomplementarität Resistenz gegen wiederholte Angriffe bieten [15]. Viren, die angreifen N. equitans sind nicht bekannt. Dennoch erlaubt das reduzierte Genom immer noch das Vorhandensein von 41 verschiedenen Spacer-Sequenzen, die auf zwei CRISPR-Cluster verteilt sind. Die CRISPR-Cluster werden innerhalb identischer 28 bp-Wiederholungssequenzen transkribiert und gespalten. Prozessierte crRNAs wurden für alle Spacer nachgewiesen und enthielten einen 5'-terminalen 8-Nukleotid-Tag, der die 3'-terminalen Wiederholungsnukleotide ATTGAAAG enthält, die normalerweise durch Cas6-Spaltung erzeugt werden (Fig. 3). Die 3'-Enden werden allmählich verkürzt und deuten auf einen 3'-terminalen exonukleolytischen Abbau hin. Die Häufigkeit von crRNAs variiert drastisch, wobei die höchste Häufigkeit für Spacer 2 von CRISPR-Cluster 1 und Spacer 1 von CRISPR-Cluster 2 zu verzeichnen ist zur Promoter-Region innerhalb der Leader-Region des CRISPR-Clusters stellen die jüngsten Angriffe dar [20]. Die drastisch reduzierte Häufigkeit einiger Spacer kann ein Effekt einer reduzierten Stabilität der crRNA oder einer ineffizienten Prä-crRNA-Prozessierung sein. Darüber hinaus neuere Arbeiten in Sulfolobus solfataricus identifizierten eine Korrelation zwischen der Häufigkeit und der Neigung zur RNA-Faltung [21]. Die selten vorkommende crRNA 4 des CRISPR-Clusters 1 enthält einen Spacer, der erheblich länger ist als alle anderen Spacer im Cluster, was die crRNA-Reifungsmaschinerie vor Herausforderungen stellen könnte. Angrenzend an beide CRISPR-Cluster wurde eine Leader-Region identifiziert, deren Sequenz für 130 Nukleotide stromaufwärts der ersten Wiederholung identisch ist. Somit besitzen beide CRISPR-Cluster identische Promotoren und die Transkription beginnt in beiden Fällen bei einem Adenosinrest 33 Nukleotide stromaufwärts der ersten Wiederholung. Die Box A-Region archaealer Promotoren befindet sich normalerweise in einem festen Abstand von der Transkriptionsstartstelle [22] und eine Konsensus-5'-TTTAAA-3'-Sequenz wurde tatsächlich -27 Nukleotide stromaufwärts des Transkriptionsstarts identifiziert. Identische Promotor- und Leader-Regionen erklären die vergleichbaren Raten der crRNA-Produktion aus beiden CRISPR-Clustern und deuten auf ein kürzliches Duplikationsereignis hin. Das CRISPR/Cas-System von N. equitans gehört zu den kürzlich definierten Typ-I-Systemen mit Cas3 (NEQ022) als Protein, das den Abbau der viralen DNA katalysiert [23, 24]. Alle universellen Proteine ​​Cas1 (NEQ017), Cas2 (NEQ016) und Cas4 (NEQ021), von denen angenommen wird, dass sie an der Integration von Spacern beteiligt sind, sind vorhanden. Schließlich werden NEQ018, Cas7 (NEQ019) und Cas5 (NEQ020) vorgeschlagen, um den Cascade-Komplex zu bilden, der die crRNAs an das DNA-Ziel liefert. Ein Cas6-Enzym kann nicht leicht identifiziert werden, was auf seine Sequenzabweichung von bekannten Cas6-Enzymen hinweisen könnte.

Identifizierung der CRISPR-RNA-Prozessierung. (ein) Die crRNA-Sequenzierungs-Reads wurden den beiden zugeordnet N. equitans CRISPR-Cluster zur Bestimmung der Häufigkeit einzelner crRNAs. Die Prozessierung erfolgt innerhalb der Wiederholungselemente, wodurch crRNAs mit einem 5'-terminalen ATTGAAAG-8-Nukleotid-Tag (unterstrichen) und allmähliches Trimmen des 3'-terminalen Tags erzeugt werden. Pfeile zeigen Hotspots zum Trimmen an. (B) Sequenzierungs-Reads stromaufwärts der ersten Wiederholung innerhalb der identischen Leadersequenz beider CRISPR-Arrays zeigen die Transkriptionsstartstelle (+1) und ein potentielles Promotor-TATA-Box-Element (Box A) an.

Identifizierung von C/D-Box- und H/ACA-Box-sRNAs

N. equitans unterhält ein großes Arsenal an RNA-Modifikationsenzymen, und während der Genom-Annotation wurden 14 kleine nukleoläre (sno)-ähnliche RNAs beschrieben, die als Leit-RNAs für die Methylierung von rRNAs dienen [3]. Die Daten zeigten, dass diese snoRNAs (C/D-Box-sRNAs in Archaeen) in der Zelle sehr häufig vorkommen (Abbildung 1). Darüber hinaus konnten die Sequenzen für 26 C/D-Box-sRNAs identifiziert werden (Abbildung 4). Alle 14 vom snoscan-Algorithmus vorhergesagten C/D-Box-sRNAs [25] wurden verifiziert und fünf als „fragwürdig“ eingestufte Vorhersagen überlappten teilweise mit den identifizierten Transkripten. Sieben zusätzliche C/D-Box-sRNAs wurden identifiziert, für die Computervorhersagen fehlschlugen. Das Alignment aller identifizierten C/D-Box-sRNAs unterstreicht ihre kompakte und konservierte Anordnung sowie die charakteristischen Box-C/D- und Box-C'/D'-Sequenzmotive (Abbildung 5). Die 5'- und 3'-Enden dieser RNAs sind nicht basengepaart. Mutmaßliche 2'O-Ribose-Methylierungsziele wurden durch den Algorithmus PLEXY [26] vorhergesagt (zusätzliche Datei 2). In der Zelle sind die Proteine ​​Fibrillarin (NEQ125) und NOP56 (NEQ342) vorhanden, die mit diesen C/D-Box-sRNAs assoziieren und die Methylierung steuern. Die Gruppe der archaealen Methyltransferasen umfasst ein Enzym, das nur in Thermokokken vorkommt und N. equitans und verwendet S-Adenosylmethionin als Cofaktor, um die Bildung von 5-Methyluridin in tRNAs und rRNAs zu katalysieren [27]. Eine neu identifizierte C/D-Box-sRNA (sRNA2) überlappt mit dem Gen für diese Methyltransferase (NEQ053), was auf ihre funktionelle Assoziation hinweisen könnte. Drei weitere C/D-Box-sRNA-Gene überlappen mit Genen für mutmaßliche rRNA-Methyltransferasen (sRNA5, sRNA11, sRNA17) und ein Gen (sRNA25) überlappt mit einer mutmaßlichen rRNA-Pseudouridin-Synthase.

Identifizierung und Ausrichtung von C/D-Box-sRNAs. Es wurden 26 C/D-Box-sRNAs identifiziert, die jeweils von über 3.000 kartierten Sequenzierungs-Reads (Zusatzdatei 2) abgedeckt wurden. Alle sRNAs enthalten konservierte Box-C/D- und Box-C'/D'-Elemente. Die permutierte sRNA24 ist in Abbildung 7 detailliert dargestellt.

Strukturvorhersage für eine dicistronische tRNA-C/D-Box-sRNA und eine H/ACA-Box-sRNA. (ein) Die am häufigsten vorkommende C/D-Box-sRNA, sRNA8, befindet sich unmittelbar stromabwärts von tRNA Val (TAC). Die tRNA-Sekundärstruktur wurde mit tRNA-Scan-SE erhalten [41] und eine mögliche C/D-Box-sRNA8-Sekundärstruktur wurde mit mfold berechnet [40]. Die Box-C/D- und Box-C'/D'-Elemente und die vorgeschlagene RNase Z-Schnittstelle sind angegeben. (B) Mögliche Sekundärstruktur (mfold [40]) für die einzelne identifizierte H/ACA-Box-sRNA. Zwei ACA-Motive und zwei identische k-Turn-Bulges mit potentiellen GA-GA-Paaren sind angegeben.

Die sRNAs der C/D-Box26 enthalten eine umgekehrte Reihenfolge der konservierten Boxen, wobei die Box D stromaufwärts von Box C liegt. Pyrococcus furiosus [28].

In der intergenen Region zwischen den Genen NEQ389 (Tyrosyl-tRNA-Synthetase) und NEQ392 (hypothetisches Protein) wurde eine einzelne 159 Nukleotide lange H/ACA-Box-sRNA identifiziert. Eine H/ACA-Box-sRNA steuert die Pseudouridylierung von rRNA-Targets. Die identifizierte kompakte H/ACA-Box-sRNA enthält zwei verlängerte Haarnadeln, die jeweils eine Ausbuchtung mit Knick-Turn-(k-Turn)-Ausbuchtungen enthalten (Abbildung 5). Ähnliche Ausbuchtungen wurden in Pseudouridin-Guide-RNAs in gefunden Pyrobakulum [29]. Eine richtige H-Domäne (ANANNA) wird nicht beobachtet, da die beiden Haarnadeln nur durch die Sequenz ACA in der Scharnierregion getrennt sind (Abbildung 5). Potenzielle Pseudouridylierungsziele innerhalb der 16S rRNA und 23S rRNA wurden durch den RNAsnoop-Algorithmus [30] bestimmt (Zusatzdatei 2). Es wurde identifiziert, dass eine stabile RNA im 66-Nukleotid-Intron der Elongator-tRNA Met kodiert. Diese tRNA ist eine von vier Intron-enthaltenden tRNAs, aber die anderen drei Introns sind erheblich kürzer. Die RNA enthält Elemente, die ihre potenzielle Rolle als C/D-Box-sRNA nahelegen, die möglicherweise die RNA-Methylierung leitet (Abbildung 6). Die Introns von tRNAs sind in der Regel eher instabile Produkte, und bisher war nur in wenigen Archaeen bekannt, dass nur tRNA-Trp-Spezies eine funktionelle C/D-Box-sRNA enthalten [31, 32]. Die N. equitans Das tRNA Met-Intron enthält außerdem eine postulierte stabile Haarnadel mit sechs aufeinanderfolgenden GC-Basenpaarungen. Da gespaltene tRNA-Gene durch die Spaltung von Intron-haltigen tRNAs entstanden sein könnten, könnte eine solche Struktur auf den Ursprung der GC-reichen komplementären Sequenzen an den Grenzen von hinweisen trans- gespleißte tRNA-Hälften.

Strukturvorhersage für die tRNA Getroffen intron. Die vorhergesagte Sekundärstruktur des stabilen und reichlich vorhandenen tRNA-Met-Introns weist auf die Bildung einer Box-C/D-sRNA hin. Die Konsensus-Box D und ein Box-C-Motiv mit einer T-zu-G-Mutation an Position 30 sind angegeben.

Mobile C/D-Box-sRNAs

Die Ausrichtung der DNA-Strecken stromaufwärts und stromabwärts der identifizierten kleinen RNA-Termini ermöglicht die Analyse potenzieller Promotor- und Terminatorelemente. Zuvor wurden die konservierten Elemente von Nanoarchael-tRNA- und tRNA-Halbgen-Promotoren identifiziert [9]. Die Promotoren enthalten ein klar identifizierbares Box-A-Motiv (5'-TTTAAA-3') 26 Nukleotide stromaufwärts des Transkriptionsstarts und der Terminator enthält einen Abschnitt von Polypyrimidinen (T-Stretch) stromabwärts des tRNA-Gens. Beide Elemente werden als häufig von der archaealen RNA-Transkriptionsmaschinerie verwendet [22, 33] und können auch für die H/ACA-Box-sRNA gefunden werden. Die Transkription und Verarbeitung von C/D-Box-sRNAs ist vielfältiger. Einige C/D-Box-sRNAs (sRNA12, 13, 15, 16, 21) enthalten ihren eigenen Promotor und eigene Terminationssignale und die Transkription beginnt mit einem Purinrest. Die meisten C/D-Box-sRNAs enthalten jedoch keine leicht identifizierbaren Promotoren oder beginnen mit einem Pyrimidinrest, was darauf hinweist, dass sie während der Reifung prozessiert werden. Interessanterweise wurden potenzielle dicistronische tRNA-sRNA-Vorläufer identifiziert. Das Gen für die am häufigsten vorkommende C/D-Box-sRNA, sRNA8, liegt unmittelbar stromabwärts des Gens für tRNA Val. Daher erzeugt die 3'-Prozessierung des sRNA8-tRNA-Val-Vorläufers durch RNase Z (NEQ064) automatisch den 5'-Terminus der C/D-Box-sRNA (Abbildung 5). Dies ist nach meinem besten Wissen das erste Mal, dass diese Verarbeitungsaktivität bei Prokaryonten beobachtet wurde, da tRNA-snoRNAs bisher als einzigartig für Pflanzen angesehen wurden [34]. Darüber hinaus befinden sich zwei tRNAGly-Isoakzeptoren (tRNAGly(CCC), tRNAGly(TCC)) neben der C/D-Box sRNAs3 und sRNA14.

Die meisten C/D-Box-sRNAs überlappen mit mRNA-Sequenzen (zusätzliche Datei 2). Ein bemerkenswertes Merkmal ist das Auftreten von C/D-Box-sRNA-Genen an den Grenzen von Split-Genen. Sie befinden sich neben NEQ156 (RNA-Polymerase-Untereinheit B, carboxyterminaler Teil), NEQ096/NEQ097 (hypothetisches Protein, carboxyterminaler Teil), NEQ124 (Archaeosin-tRNA-Guanin-Transglycosylase, aminoterminaler Teil) und NEQ434 (reverse Gyrase, aminoterminaler Teil) (Abbildung 7a). NEQ157, das Gen, das sich an der Position befindet, an der der aminoterminale Teil der RNA-Polymerase-Untereinheit B für ein kontinuierliches Gen erwartet würde, wird von zwei C/D-Box-sRNA-Genen flankiert. Darüber hinaus wird der aminoterminale Teil der reversen Gyrase auch von zwei C/D-Box-sRNAs flankiert. In Eukaryoten werden snoRNAs als mobile genetische Elemente erkannt [35] die oft mit Introns assoziieren. In Archaeen und möglicherweise in N. equitans, C/D-Box-sRNA kann innerhalb von tRNA-Introns lokalisiert werden [36]. Zukünftige Forschung muss die Grundlage für die Mobilität der C/D-Box-sRNA in Archaea bestimmen. Die Beobachtung, dass eine der beiden C/D-Box-sRNAs, die das Reverse-Gyrase-Halbgen flankieren, permutiert ist (Abbildung 7a), deutet auf eine zirkularisierte Zwischenstruktur hin. Ein inverser RT-PCR-Ansatz wurde verwendet, um nach ringförmigen C/D-Box-sRNAs zu suchen. Sowohl die C/D-Box-sRNA23 als auch die permutierte C/D-Box-sRNA24 wurden als zirkuläre Moleküle in der Zelle nachgewiesen (Abbildung 7b). Nur die zirkuläre Anordnung der permutierten C/D-Box sRNA24 erlaubt die korrekte, konservierte Anordnung der C- und D-Box-Elemente und könnte somit die Funktionalität garantieren. Dieses Phänomen muss bei automatisierten Genom-Annotationsverfahren von C/D-Box-sRNAs berücksichtigt werden. Genomumlagerungen, die permutierte C/D-Box-sRNAs erzeugen, sind möglicherweise nur für kürzliche Fragmentierungsereignisse nachweisbar, da inaktive C/D-Box-sRNA-Gene schnell Mutationen anhäufen. Zusammengenommen deuten diese Beobachtungen stark auf eine Beteiligung von C/D-Box-sRNA-Sequenzen an der Aufspaltung von sowohl tRNA- als auch Protein-kodierenden Genen im fragmentierten Genom von N. equitans.

C/D-Box-sRNAs flankieren ein gespaltenes Reverse-Gyrase-Gen. (ein) Das Gen für den aminoterminalen Teil der gespaltenen reversen Gyrase (NEQ434, schwarz) wird von zwei Box-C/D-sRNAs flankiert. Box-C- und Box-D-Elemente (umrandet) sind angegeben, um die Permutation der sRNA24 hervorzuheben. (B) Die Sequenzierung inverser RT-PCR-Amplifikate mit den angezeigten (unterstrichenen) nach außen gerichteten Primern ergab zirkuläre C/D-sRNAs23 und 24. Die nachgewiesenen Zirkularisierungsstellen weisen darauf hin, dass zirkuläre C/D-sRNAs etwas größer sind als die durchschnittliche Länge der linearen Moleküle, die durch . amplifiziert wurden RNA-Seq-Methodik.


Strukturelle Grundlage für RNA-Trimming durch RNase T in stabiler RNA-3′-End-Reifung

Die RNA-Reifung beruht auf verschiedenen Exonukleasen, um Nukleotide nacheinander vom 5'- oder 3'-Ende von Nukleinsäuren zu entfernen. Über die molekularen Grundlagen der Substrat- und Spaltungspräferenz von Exonukleasen ist jedoch wenig bekannt. Unsere biochemischen und strukturellen Analysen von RNase T-DNA-Komplexen zeigen, dass das RNase T-Dimer eine ideale Architektur hat, um einen Duplex mit einem kurzen 3′-Überhang zu binden, um ein Verdauungsprodukt eines Duplex mit einem 2-Nukleotid (nt) oder 1- nt 3′-Überhang, abhängig von der Zusammensetzung des letzten Basenpaares im Duplex. Ein „C-Filter“ in RNase T filtert die Nukleinsäuren mit 3'-terminalen Cytosinen auf Hydrolyse aus, indem er eine störende Konformationsänderung am aktiven Zentrum induziert. Unsere Ergebnisse zeigen die allgemeinen Prinzipien und den Arbeitsmechanismus für den letzten Trimming-Schritt von RNase T bei der Reifung stabiler RNA und ebnen den Weg für das Verständnis anderer Exonukleasen der DEDD-Familie.


DISKUSSION

Die Ergebnisse dieser Studie liefern wichtige Informationen über E coli RNase BN/RNase Z Katalyse und Funktion. Wir haben gezeigt, dass (ein) RNase BN kann die 3′ Termini von CCA-losen und CCA-haltigen Prä-tRNAs verarbeiten (B) im Gegensatz zu den Vorschlägen von Takaku und Nashimoto (20) entfernt RNase BN normalerweise nicht die CCA-Sequenz von Vorläufer- oder reifen tRNAs (C) RNase BN kann entweder als Exoribonuklease oder Endoribonuklease auf tRNA-Vorläufer wirken und (D) ist die Wirkungsweise von RNase BN vom vorhandenen Metallion abhängig. Diese Kombination katalytischer Eigenschaften unterscheidet RNase BN von anderen RNase Z-Enzymen und wirft erneut die Frage auf, welche Funktion sie haben könnte E coli. Trotz seiner Fähigkeit, auf tRNA-Vorläufer einzuwirken, gibt es keine Hinweise darauf in vivo außer wenn alle anderen 3′-prozessierenden Enzyme fehlen oder während einer Bakteriophagen-T4-Infektion, wenn sie für die T4-tRNA-Reifung erforderlich ist (22). Tatsächlich zeigen Zellen, denen RNase BN fehlt, keinen erkennbaren Phänotyp (16).

Die Fähigkeit der RNase BN, sowohl CCA-freie als auch CCA-haltige tRNAs zu verarbeiten, kombiniert in diesem Enzym die katalytischen Eigenschaften der meisten RNase-Z-Enzyme, die nach dem Diskriminatornukleotid spalten (11, 14), mit denen der RNase Z aus Thermotoga Maritima, die direkt nach der CCA-Sequenz spaltet (6). Dies wirft die Frage auf, warum sich unsere Ergebnisse von denen von Takaku und Nashimoto unterscheiden (20). Diese Arbeiter schlugen vor, dass E coli RNase Z spaltete sowohl reife tRNAs als auch tRNA-Vorläufer, um die 3′-terminale CCA-Sequenz zu entfernen. Abgesehen von der Tatsache, dass eine solche Reaktion verschwenderisch zu sein scheint und eine kontinuierliche Neuaddition der CCA-Sequenz erfordert, haben wir zuvor mit Modell-RNA-Substraten gezeigt, dass die RNase-BN-Wirkung durch die CCA-Sequenz gehemmt wird, mit Ausnahme eines geringfügigen Trimmens des terminalen AMP-Restes (21). Es ist auch bekannt, dass der Endumsatz von tRNA in vivo ist auf die Wirkung von RNase T zurückzuführen, nicht auf RNase BN (27). Eine Möglichkeit, die den Unterschied in den Ergebnissen erklären könnte, besteht darin, dass Takaku und Nashimoto alle ihre Studien bei 50 °C mit einem viel höheren Verhältnis von Enzym zu Substrat durchgeführt haben (20). Vielleicht würde bei dieser erhöhten Temperatur die tRNA-Struktur zumindest teilweise zerstört, wodurch die Spezifität von RNase BN für ihre Substrate verändert würde. Als wir jedoch die RNase-BN-Aktivität auf tRNA Phe und tRNA Cys unter den in Lit. 20, konnten wir immer noch keine Entfernung der CCA-Sequenz beobachten. 3 Daher sind weitere Arbeiten erforderlich, um die Datenunterschiede zwischen den beiden Labors auszugleichen.

In früheren Arbeiten mit Modell-RNA-Substraten haben wir gezeigt, dass RNase BN sowohl Exoribonuklease- als auch Endoribonuklease-Aktivität aufweist (21). Die hier vorgestellten Studien erweitern diese Beobachtungen auch auf tRNA-Vorläufer. Bei CCA-freien Substraten war die Spaltung fast ausschließlich endonukleolytisch, was zu einer Spaltung nach dem Diskriminatornukleotid führte, bei CCA-haltigen tRNA-Vorläufern war jedoch jeder Wirkungsmodus möglich und hing hauptsächlich vom vorhandenen Metallion ab. In Gegenwart von Co 2+ zeigte RNase BN eine erhöhte Aktivität und fungierte weitgehend als Exoribonuklease, um zusätzliche 3′-Reste von tRNA-Vorläufern zu entfernen. In Gegenwart von Mg 2+ war seine primäre Wirkungsweise eine Endoribonuklease, die nach der CCA-Sequenz spaltet. Die Rolle des Metallions bei der Aktivität und Spezifität von RNase BN ist für zukünftige Struktur- und Funktionsstudien von großem Interesse.

Wie bereits erwähnt, variierte die Wirkung von RNase BN auch dramatisch mit dem Prä-tRNA-Substrat. So wurden CCA-freie tRNAs nach dem Diskriminatorrest endonukleolytisch gespalten, wohingegen bei CCA-haltigen Molekülen Reste nach der CCA-Sequenz entweder exonukleolytisch oder endonukleolytisch entfernt werden konnten. Wie das Enzym die beiden Substrattypen unterscheidet und welche strukturellen Merkmale der tRNA diese Spezifität bestimmen, muss noch erforscht werden. Es sollte auch beachtet werden, dass mehrere getestete prä-tRNAs schlechte Substrate für RNase BN waren. Dazu gehörte tRNA Cys , die mit Co 2+ aktiv war, aber in Gegenwart von Mg 2+ im Wesentlichen inaktiv war ( Fig. 5' D). Pre-tRNA LeuZ und pre-tRNA AlaU wurden auch in Gegenwart von Co 2+ von RNase BN nur schwach beeinflußt. 3 Die Unfähigkeit von RNase BN, auf allen prä-tRNAs effizient zu funktionieren, erklärt wahrscheinlich, warum Zellen in Abwesenheit aller anderen 3′-tRNA-verarbeitenden Enzyme, die in vorhanden sind, sehr langsam wachsen E coli (12).

Die hier vorgestellten Ergebnisse tragen erheblich zu unserem Wissen über die Spezifität von RNase BN bei und helfen, den gegenwärtigen Kenntnisstand über seine Spezifität zu erklären in vivo Wirkung auf tRNA-Vorläufer. Allerdings gibt es über diese interessante RNase hinsichtlich ihres Mechanismus und ihrer primären offensichtlich noch viel zu lernen in vivo Funktion.


Beckmann, J.S., Johnson, P.F. &. Abelson, J. Wissenschaft 196, 205 (1977).

Birkenmeier, E. H., Brown, D. D. &. Jordan, E. Zelle 15, 1077 (1978).

Schmidt, O., Mao, J., Silverman, S., Hovemann, B. &. Söll, D. Proz. nat. Akad. Wissenschaft VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA. 75, 4819 (1978).

Yen, P.H. et al. Zelle 11, 763 (1977).

Hovemann, B., Sharp, S., Yamada, H. &. Söll, D. Zelle 19, 889 (1980).

Tener, G.M. et al. in Transfer-RNA: Biologische Aspekte (Hrsg. Söll, D., Abelson, J. & Schimmel, P.) 295 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980).

Müller, F. & Clarkson, S.G. Zelle 19, 345 (1980).

Cortese, R., Melton, D., Tranquilla, T. & Smith, J.D. Nukleinsäuren Res. 5, 4593 (1978).

Garber, R.L. & Gage, L.P. Zelle 18, 817 (1979).

Hagenbüchle, O., Larson, D., Hall, G. & Sprague, K. Zelle 18, 1217 (1979).

Bernhardt, D. und Darnell, J.E. J. molec. Biol. 42, 43 (1969).

Feldmann, H. Nukleinsäuren Res. 4, 2831 (1977).

De Robertis, E. M. & Olson, M. V. Natur 278, 137 (1979).

Ogden, R.C. et al. Zelle 17, 399 (1979).

Telford, J.L. et al. Proz. nat. Akad. Wissenschaft 76, 2590 (1979).

Beckmann, J.S. et al. in Nonsense-Mutationen und tRNA-Suppressoren (Hrsg. Celis, J. E. & Smith, J. D.) 207 (Academic, New York, 1979).

Keith, G. &. Dirheimer, G. Biochem. biophys. Res. Komm. 92, 116 (1980).

Gangloff, J., Keith, G., Ebel, J.P. &. Dirheimer, G. Biochim. biophys. Acta 259, 210 (1972).

Silverman, S., Schmidt, O., Söll, D. & Hovemann, B. J. biol. Chem.-Nr. 254, 10290 (1979).

Mao, J., Schmidt, O. & Söll, D. Zelle 20, 589 (1980).

Brownlee, G. G. in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (eds Work, T. S. & Work, E.) 67 (Elsevier, New York, 1972).

Melton, D. A., De Robertis, E. M. & Cortese, R. Natur 284, 143 (1980).


The four rRNAs in eukaryotes are first transcribed as two long precursor molecules. One contains just the pre-rRNA that will be processed into the 5S rRNA the other spans the 28S, 5.8S, and 18S rRNAs. Enzymes then cleave the precursors into subunits corresponding to each rRNA. In bacteria, there are only three rRNAs and all are transcribed in one long precursor molecule that is cleaved into the individual rRNAs. Some of the bases of pre-rRNAs are methylated for added stability. Mature rRNAs make up 50-60% of each ribosome. Some of a ribosome&rsquos RNA molecules are purely structural, whereas others have catalytic or binding activities.

The eukaryotic ribosome is composed of two subunits: a large subunit (60S) and a small subunit (40S). The 60S subunit is composed of the 28S rRNA, 5.8S rRNA, 5S rRNA, and 50 proteins. The 40S subunit is composed of the 18S rRNA and 33 proteins. The bacterial ribosome is composed of two similar subunits, with slightly different components. The bacterial large subunit is called the 50S subunit and is composed of the 23S rRNA, 5S rRNA, and 31 proteins, while the bacterial small subunit is called the 30S subunit and is composed of the 16S rRNA and 21 proteins.

The two subunits join to constitute a functioning ribosome that is capable of creating proteins.


Arc1p: an adapter between the tRNA transport and mRNA translation machinery?

Yet another tRNA-binding protein, known as Arc1p, was identified through its genetic interactions with Los1p. Arc1p is found in a complex with two aminoacyl-tRNA synthetases in S. cerevisiae, MetRS and GluRS, where it is required for the efficient aminoacylation of tRNA by these enzymes (Simos et al. 1996a, 1998). Although cells lacking Arc1p grow slowly, cells lacking both Arc1p and Los1p are inviable. Experiments in which Arc1p was localized within cells using indirect immunofluorescence have revealed that while Arc1p is cytoplasmic, the protein appears to be concentrated at the nuclear periphery (Simos et al. 1996a). This finding, together with the observed synthetic lethality with Los1p, have been incorporated into a model in which tRNA is delivered by Los1p to Arc1p which transfers it to the synthetases (Simos et al. 1996a, 1998).

How might this model be reconciled with the observation that, inXenopus oocytes, aminoacylation occurs inside the nucleus and facilitates efficient tRNA export? One possibility is that, in both yeast and higher eukaryotes, aminoacylation takes place at the nuclear pore. This scenario would be consistent with the observed concentration of Arc1p at the nuclear periphery in S. cerevisiae (Simos et al. 1996a). Alternatively, aminoacylation in the nucleoplasm may be confined to higher species. In organisms from Drosophila to humans, nine aminoacyl-tRNA synthetases associate with three other polypeptides to form a multienzyme complex (Filonenko and Deutscher 1994 Kerjan et al. 1994). One of the three nonsynthetase polypeptides, p43, was recently cloned and found to share a domain with Arc1p, suggesting that it may be the mammalian homolog (Quevillon et al. 1997). Interestingly, p43, unlike the rest of the mammalian multisynthetase complex, is largely nuclear (Popenko et al. 1994). Thus, p43/Arc1p may exist in higher eukaryotes both as a free nuclear protein as well as a component of the multisynthetase complex. It is thus possible that, at least in higher eukaryotes, the nuclear fraction of p43/Arc1p facilitates aminoacylation by nuclear tRNA synthetases.

Interestingly, although S. cerevisiae cells lackingARC1 grow slowly, these cells become inviable in the presence of mutations in either LOS1, which encodes the tRNA export receptor, or NSP1, which encodes a nuclear pore protein (Simos et al. 1996a 1998). One intriguing possibility is that, in both yeast and mammalian cells, binding by nuclear p43/Arc1p allows certain tRNAs to exit the nucleus through a protein export pathway that recognizes and transports p43/Arc1p to the cytoplasm. The existence of these sorts of redundant mechanisms for tRNA nuclear transport would explain the puzzling result that Los1p is encoded by a dispensable gene. Although Arc1p is predominantly cytoplasmic inS. cerevisiae (Simos et al. 1996a), it is possible that the protein shuttles between the nucleus and the cytoplasm to facilitate export.


Perspectives: does tRNA channeling begin at birth?

Experiments performed in permeabilized mammalian cells have led to the proposal that during repeated cycles of protein synthesis, aminoacyl tRNA molecules are directly transferred, or ‘channeled,’ from the synthetases to the elongation factor EF-1 to the ribosome, and then are transferred back to the aminoacyl synthetases without dissociating into the surrounding medium (Stapulionis and Deutscher 1995). The discovery that certain tRNA binding proteins, such as Los1p and p43/Arc1p, exhibit numerous biochemical and genetic interactions with other components of the tRNA modification, transport, aminoacylation, and protein synthesis pathways suggest that tRNAs are also channeled from one component to the next during the various steps in their complicated biogenesis. For example, Los1p physically interacts with Gcd11p, the γ subunit of initiation factor eIF-2, in a two-hybrid assay (Hellmuth et al. 1998). One interpretation of this result might be that Los1p, upon entering the cytoplasm, directly hands tRNA to eIF-2 to facilitate efficient initiation of translation. Similarly, binding of certain tRNAs by p43/Arc1p, whether it occurred in the nucleus or cytoplasm, could serve to deliver these tRNAs directly to aminoacyl synthetases (Quevillon et al. 1997 Simos et al. 1998).

If the channeling model of protein synthesis can be extended to include tRNA export from the nucleus, what about the earliest steps in tRNA biogenesis? To begin to answer this question, more information is clearly needed about these very early steps. For example, where in the nucleus are the different tRNA genes transcribed? Is binding by the La protein required for nucleolar targeting or retention of the nascent pre-tRNAs? If end maturation occurs in the nucleolus, how are the end-matured but intron-containing tRNAs transported to the nuclear periphery for splicing? It is our expectation that further biochemical, genetic, and cell biological analyses of the tRNA biogenesis pathway will continue to yield important insights, not only into the basic mechanisms of tRNA maturation and processing, but also into subcellular organization and RNA transport.


Schau das Video: Transcription DNA to mRNA (Januar 2022).