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Labor 4: Säureschnelle, Sporen- und Kapselflecken – Biologie

Labor 4: Säureschnelle, Sporen- und Kapselflecken – Biologie


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SÄURE-SCHNELL

Säurefeste Färbung ist eine Differentialfärbung, die verwendet wird, um säurefeste Organismen wie Mitglieder der Gattung Mycobacterium zu identifizieren. Säurefeste Organismen zeichnen sich durch wachsartige, nahezu undurchlässige Zellwände aus; sie enthalten Mykolsäure und große Mengen an Fettsäuren, Wachsen und komplexen Lipiden. Dieser Zellwandtyp ist gegen die meisten Verbindungen resistent, daher erfordern säurefeste Organismen eine spezielle Färbetechnik.

Der primäre Farbstoff, der bei der säurefesten Färbung verwendet wird, Karbolfuchsin, ist fettlöslich und enthält Phenol, das dem Farbstoff hilft, die Zellwand zu durchdringen. Dies wird durch die Zufuhr von Wärme in Form von Wärme (Dampf) zusätzlich unterstützt. Dampf hilft, die Wachsschicht aufzulockern und fördert das Eindringen der Primärfärbung in die Zelle. Der Ausstrich wird dann mit einem sehr starken Entfärber gespült, der den Farbstoff von allen nicht säurefesten Zellen entfernt, aber nicht die Zellwand säurefester Organismen durchdringt. Die entfärbten, nicht säurefesten Zellen nehmen dann die Gegenfärbung, in unserem Fall Methylenblau, auf.

1. Arbeiten Sie paarweise und bereiten Sie DREI Objektträger wie unten beschrieben vor (2 als Backup und einer zum Färben).

2. Beschriften Sie jeden Objektträger und zeichnen Sie mit einem Wachsstift einen Kreis in der Mitte des Objektträgers.

3. Bereiten Sie auf jedem Objektträger eine Emulsion mit 4 Ösen Staphylococcus epidermidis aus Ihrer Kulturbrühe auf dem Objektträger vor (dies sind Ihre säurefesten negativen Bakterien).

4. Fügen Sie dann eine Schleife voll Mycobacterium chelonae (dies sind Ihre säurefesten positiven Bakterien) hinzu und mischen Sie die beiden Bakterien.

5. Lassen Sie die Objektträger auf den Objektträgerwärmern an der Luft trocknen (bereiten Sie Ihre Objektträger während des Trocknens für die Sporenfärbung vor).

6. Sobald die Flüssigkeit vollständig verdampft ist, fixieren Sie die Bakterien durch Hitze, indem Sie sie dreimal durch Ihre Flamme führen.

7. Stellen Sie sicher, dass das Objektträgergestell oben auf Ihrem Becher vollständig waagerecht ist. Bringen Sie dann Ihr Wasser zum Kochen, während die Objektträger trocknen.

Sie benötigen nur etwa 200 Milliliter Wasser. Wenn Sie mehr hinzufügen, warten Sie die ganze Laborzeit, bis Ihr Wasser kocht.

8. Sobald das Wasser kocht, legen Sie Ihren Objektträger auf das Objektträgergestell über dem kochenden Wasser.

9. Bedecken Sie den Bereich Ihres Abstrichs auf dem Objektträger mit einem quadratischen Stück PRECUT Papiertuch. Stellen Sie sicher, dass kein Papier von der Folie herunterhängt.

10. Tragen Sie die CARBOL FUCHSIN Beize vorsichtig auf das Papiertuch auf.

Wenn das Wasser, das Sie kochen, Flecken aufweist, stoppen Sie bitte und entsorgen Sie das verschmutzte Wasser in der Flüssigabfallentsorgung. Die Dämpfe von Karbolfuchsin können giftig sein.

11. Dämpfen Sie 7 Minuten lang mit dem Fleck auf dem Objektträger, während Sie kontinuierlich mehr Fleck auftragen, damit das Papierquadrat nie austrocknet.

12. Entfernen Sie das Papier vorsichtig mit einer Pinzette und entsorgen Sie es in dem kleinen Papierbecher, der auf Ihrer Werkbank bereitgestellt wird. Spülen Sie dann den Objektträger mit Wasser ab.

13. Legen Sie den Objektträger auf Ihr Färbebecken und spülen Sie ihn vorsichtig mit Wasser ab.

14. Entfärben Sie mit 6 Tropfen saurem Alkohol (kein Ethanol aus Ihrem Gramm-Färbeset) und spülen Sie es dann mit Wasser ab.

15. Gegenfärbung mit Methylenblau für 2 Minuten.

16. Mit Wasser abspülen und mit saugfähigem Papier trocken tupfen (nicht den Objektträgerwärmer verwenden).

17. Untersuchen Sie unter dem 100X-Objektiv mit Ölimmersion und notieren Sie Ihre Ergebnisse.

Die Farben dieses Bildes können aufgrund des Druckens/Kopierens leicht abweichen.

SPORE FLECK

Die Endosporenfärbung ist eine Differentialfärbung, die verwendet wird, um bakterielle Endosporen sichtbar zu machen. Eine Endospore ist eine ruhende Form eines Bakteriums, die einige Bakterienarten unter Stressbedingungen wie schlechter Ernährung, hohen Temperaturen oder trockener Umgebung produzieren. Die äußere Schicht besteht aus Keratin, das Fleckenbildung widersteht. Die malachitgrüne Färbung wird mit Wasserdampf in die Spore gedrückt. Sporen können zentral, terminal und subterminal sein. Diese Färbung wird häufig verwendet, um Sporen nachzuweisen, die von den Gattungen Bacillus und Clostridium produziert werden.

18. Bereiten Sie zwei Objektträger mit Emulsionen vor, einen von Platte A und einen von Platte B.

19. Erhitzen Sie die Objektträger und legen Sie sie auf das Objektträgergestell über dem kochenden Wasser.

20. Bedecken Sie den Bereich Ihres Abstrichs auf jedem Objektträger mit einem quadratischen Stück PRECUT Papiertuch.

21. Tragen Sie den Fleck MALACHITE GREEN vorsichtig auf das Papiertuch auf.

22. 10 Minuten dämpfen und das Papier während dieser Zeit mit dem Fleck getränkt halten.

23. Entfernen Sie das Papier vorsichtig mit einer Pinzette, entsorgen Sie es in den kleinen Papierabfallbecher, der auf Ihrer Werkbank bereitgestellt wird, und spülen Sie dann den Objektträger mit Wasser ab.

24. Legen Sie die Objektträger auf Ihr Färbebecken und spülen Sie sie vorsichtig mit Wasser ab.

25. 1 Minute mit SAFRANIN gegenfärben und dann mit Wasser abspülen. Mit saugfähigem Papier trocken tupfen.

26. Untersuchen Sie unter dem 100X-Objektiv mit Ölimmersion und notieren Sie Ihre Ergebnisse.

Die Farben dieses Bildes können aufgrund des Druckens/Kopierens leicht abweichen.

KAPSELFLECK

Die meisten Kapseln bestehen aus Polysacchariden oder Polypeptiden, die eine dicke, nachweisbare und diskrete Schicht außerhalb der Zellwand darstellen. Einige Kapseln haben gut definierte Grenzen, während andere unscharfe, nachlaufende Kanten haben. Kapseln schützen Bakterien vor der phagozytischen Wirkung von Immunzellen und ermöglichen das Eindringen von Krankheitserregern in den Körper. Verliert ein Erreger seine Fähigkeit, Kapseln zu bilden, ist er oft nicht mehr pathogen.

27. Beschriften und präparieren Sie einen Objektträger mit einer Emulsion von Klebsiella pneumoniae.

28. Lassen Sie es an der Luft trocknen (VERWENDEN SIE DEN DIAWÄRMER NICHT, NICHT HEIZEN FIX).

29. Mit 1% Kristallviolett 2 Minuten lang anfärben (KRISTALLVIOLET VON GRAM STAIN VERWENDEN).

30. SEHR SANFT mit 6 Tropfen Kupfersulfat spülen.

31. Lassen Sie es auf der Theke an der Luft trocknen (verwenden Sie keinen Objektträgerwärmer).

32. Untersuchen Sie unter dem 100X-Objektiv mit Ölimmersion und notieren Sie Ihre Ergebnisse.


Kapselfärbung – Prinzip, Reagenzien, Verfahren und Ergebnis

Der Hauptzweck der Kapselfärbung besteht darin, Kapselmaterial von der Bakterienzelle zu unterscheiden. EIN Kapsel ist eine gallertartige äußere Schicht, die von Bakterienzellen abgesondert wird und die Zellwand umgibt und an ihr haftet. Die meisten Kapseln bestehen aus Polysacchariden, aber einige bestehen aus Polypeptiden. Die Kapsel unterscheidet sich von der Schleimschicht die die meisten Bakterienzellen produzieren, da es sich um eine dicke, nachweisbare, diskrete Schicht außerhalb der Zellwand handelt. Die Kapselfärbung verwendet eine saure Färbung und eine basische Färbung, um die Kapselproduktion nachzuweisen.


Kapselfleck

Kapselfärbung ist eine Art von Differenzfärbung, die die Verwendung von zwei Farbstoffen, der Primärfärbung und der Gegenfärbung, beinhaltet. Hier ist es erwähnenswert, dass Kapseln größtenteils nichtionisch sind.

Dadurch bleiben saure und basische Flecken oft nicht haften. Aus diesem Grund wird es notwendig, den Hintergrund mit einer sauren Färbung zu färben, während die Zelle mit einer basischen Färbung gefärbt wird.

Zwei der am häufigsten verwendeten Methoden bei der Kapselfärbung sind:


Flecken

Die meisten Bakterien sind nicht nur sehr klein, sondern auch sehr klar und ohne vorherige Färbung unter dem Mikroskop schwer zu erkennen. Sie müssen Ihre Bakterien fest auf einem Objektträger befestigen, bevor Sie sie färben können. Bei der Vorbereitung eines Objektträgers zum Färben sind zwei wichtige Dinge zu beachten:

  1. Die Bakterien müssen gleichmäßig und leicht verteilt sein. Wenn sich zu viele Bakterien auf dem Objektträger befinden, bilden sie einen großen Klumpen und Sie können die Morphologie der einzelnen Zellen nicht sehen. Große Zellklumpen färben sich auch nicht richtig und könnten durch unsachgemäße Färbung zu falschen Ergebnissen führen.
  2. Die Bakterien müssen fest mit dem Objektträger verbunden sein, damit sie während des Färbevorgangs nicht abgewaschen werden. Alle Verfahren, bei denen die Bakterien auf dem Objektträger befestigt werden, führen zu einigen morphologischen Veränderungen. Die Zellen schrumpfen typischerweise in ihrer Größe und zeigen einige Veränderungen der Form und der extrazellulären Matrizen.

Sie bereiten Objektträger für die Färbung von Brühe und Agar-Oberflächen vor. Während die Ziele für gleichmäßig und leicht dispergierte Zellen, die fest an der Objektträgeroberfläche haften, gleich sind, unterscheiden sich die Techniken geringfügig. Färben ist ebenso viel Kunst wie Wissenschaft. Sie werden zweifellos mehrere Versuche brauchen, bis Sie erfolgreich sind.

Materialien

  • Glasobjektträger reinigen
  • Impfösen oder -nadeln
  • Steriles Wasser
  • Markierstift
  • Verschiedene Brühen und Plattenkulturen

Sicherheitsaspekte

Achten Sie auf Aerosole, wenn Sie Bakterien von Ihrer Schlinge auf den Objektträger übertragen. Die Schlaufe ist sehr flexibel und es ist einfach, eine Schlaufe voller Organismen abzustreifen. Gehen Sie nicht davon aus, dass Ihr Organismus tot ist. Die Abtötung des Organismus durch Hitze oder Methanolfixierung ist nicht garantiert. Entsorgen Sie Ihre fertigen Objektträger im Desinfektionsmitteleimer an Ihrer Werkbank.

Allgemeine Überlegungen

Sie streben nach einer leichten Zellsuspension, die eine schwach trübe Ablagerung auf Ihrem Objektträger hinterlässt. Sie haben viel Platz auf Ihrer Folie, verwenden Sie es! Es hilft, zunächst einen Kreis am unteren Rand der Folie zu zeichnen, damit Sie wissen, wo Sie nach Ihrem Abstrich suchen müssen. Es ist sehr leicht zu verwechseln, auf welcher Seite des Objektträgers sich Ihr Abstrich befindet. Achten Sie darauf, die hintere Kante der Folie zu beschriften. Tun Sie dies konsequent am selben Ende der Folie, um die Ausrichtung Ihrer Folie zu erleichtern.

Seien Sie geduldig und nehmen Sie sich die Zeit, Ihren Objektträger an der Luft trocknen zu lassen, bevor Sie ihn auf den Objektträger kleben. Wenn Ihr Objektträger nass ist und Sie ihn hitzefixieren, kochen die Bakterien und die Zellmorphologie geht verloren. Wenn Ihr Objektträger nass ist und ihn in Methanol fixiert, wird er höchstwahrscheinlich vom Objektträger abgewaschen. Zu dicke Ausstriche werden höchstwahrscheinlich unabhängig von der Fixierungsmethode vom Objektträger abgewaschen.

Abstrich aus Brühe

Brühenkulturen sind in der Regel einfacher zu verarbeiten, da die Zellen bereits in der Brühe verdünnt sind. Achten Sie darauf, das Kulturröhrchen sorgfältig zu mischen, um die Bakterien in der Brühe zu suspendieren.

  1. Beschriften Sie Ihre Folie. Übertragen Sie aseptisch eine Schleife voller Organismen auf die Mitte Ihres Objektträgers.
  2. Verwenden Sie den flachen Teil der Schlaufe, um den Brühentropfen um den Objektträger zu schmieren. Verwenden Sie eine spiralförmige, kreisende Bewegung, um den Tropfen zu verteilen. Da die Brühe proteinreich ist, bleibt der Ausstrich normalerweise ausgebreitet und perlt nicht auf der Oberfläche des Objektträgers ab.
  3. Legen Sie den Objektträger zum Trocknen beiseite. Dies dauert mindestens einige Minuten. Überstürzen Sie diesen Schritt nicht.

Abstrich vom Teller

Sie können mit Ihrer Schlaufe viele Organismen abschöpfen. Möglicherweise möchten Sie eine Impfnadel verwenden, um Ihren Organismus auf den Objektträger zu übertragen. Verwenden Sie unbedingt steriles Wasser, um Ihre Proben zu verdünnen. Regelmäßiges Leitungswasser oder das entionisierte Wasser in Ihren Spülflaschen sind oft mit Bakterien verunreinigt.

  1. Beschriften Sie Ihre Folie. Übertragen Sie aseptisch eine Schleife mit sterilem Wasser in die Mitte des Objektträgers.
    • Dies dient sowohl dazu, Ihre Bakterien zu verdünnen als auch Ihnen etwas zum Verteilen zu geben.
  2. Wählen Sie eine gut isolierte Kolonie.
  3. Stechen Sie es mit Ihrer sterilen Nadel ein oder schöpfen Sie den Rand der Kolonie mit Ihrer sterilen Schlaufe leicht ab.
  4. Platzieren Sie Ihre Nadel/Schlinge in der Mitte des Tropfens und verteilen Sie die Bakterien mit einer spiralförmigen kreisförmigen Bewegung auf dem Objektträger.
  5. Legen Sie den Objektträger zum Trocknen beiseite. Dies dauert mindestens einige Minuten. Überstürzen Sie diesen Schritt nicht.

Fixierung

Das Fixierverfahren ist unabhängig von Abstrichquelle, Platte oder Brühe gleich. Es gibt zwei Methoden, um Ihre Bakterien auf dem Objektträger zu befestigen, die Hitzefixierung oder die Methanolfixierung. Die Heißfixierung wird nur bei BSL1-Organismen verwendet. Die Organismen, mit denen wir arbeiten werden, sind BSL2, daher müssen Sie die Methanol-Fixierungstechnik verwenden. Das Fixieren des Objektträgers durch Hitze kann Aerosole erzeugen, und bei BSL2-Organismen müssen wir dies so weit wie möglich verhindern. Die Methanolfixierung verursacht weniger Veränderungen in der Zellmorphologie und erzeugt keine Aerosole.

Bitte seien Sie beim Arbeiten mit dem Methanol vorsichtig, wenn Sie vergessen, dass Sie es mit Methanol fixiert haben und Ihr Objektträger nicht ganz trocken ist, fängt das restliche Methanol Feuer.

Methanolfixierung (BSL2)

  1. Stellen Sie sicher, dass Ihre Folie vollständig trocken ist. Stellen Sie es auf das Färbegestell über der Spüle.
  2. Fluten Sie den Objektträger vorsichtig mit 95 % Methanol. Lassen Sie es zwei Minuten einwirken.
  3. Kippen Sie den Objektträger und gießen Sie das Methanol ab.
    • Berühren Sie die Kante des Objektträgers mit einem Papiertuch, um das überschüssige Methanol abzusaugen.
  4. Legen Sie den Objektträger beiseite, um ihn vor dem Färben an der Luft zu trocknen.

Einfacher Fleck

Einfache Flecken sind genau das – fügen Sie einen Fleck zu einem fixierten Abstrich-Objektträger hinzu, lassen Sie ihn einwirken, spülen Sie ihn ab, lassen Sie ihn trocknen und betrachten Sie ihn. Es ist ein schnelles Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Morphologie von Bakterien in klinischen Proben wie Stuhl und Ausfluss.

Methylenblau wird verwendet, um die Morphologie von spindelförmigen und Spirochäten bei oralen Infektionen zu bestimmen. Es ist auch das Färbemittel der Wahl zur Identifizierung der metachromatischen Granula in Corynebacterium diphtheriae. Das Granulat färbt sich deutlich tiefer blau als die umgebenden blauen Bakterien. Andere Arten von Corynebakterium haben keine metachromatischen Körnchen. Alle basischen Farbstoffe wie Methylenblau, Kristallviolett, Malachitgrün oder Safranin funktionieren gut.

Basische (kationische oder positiv geladene) Farbstoffe binden an negativ geladene Komponenten in der Zellmembran und im Zytoplasma.

Materialien

  • Methylenblau
  • Safranin
  • Kristallviolett
  • Malachitgrün
  • Färbegestelle
  • Mikro-Werkzeugkästen
  • Vorbereitete Abstrich-Objektträger

Allgemeine Überlegungen

Färben ist teils Kunst und teils Wissenschaft. Für Färbe- und Spülzeiten gibt es keine festen Regeln. Die aufgeführten Zeiten sind Vorschläge, die normalerweise gut funktionieren. Sie müssen damit experimentieren, was für die Bakterien, die Sie haben, und die Techniken, die Sie verwenden, funktioniert.

Es ist wichtig, dass Sie genau das, was Sie tun und die Ergebnisse, die Sie beobachten, in Ihrem Laborbuch festhalten. Sie werden diese Färbungen später im Semester wiederholen und möchten Ihre Zeit nicht damit verschwenden, Ihr erfolgreiches Färbeverfahren neu zu erfinden. Es wäre nützlich, wenn jedes Labortisch-Mitglied einen anderen Fleck auswählt, damit Sie sehen können, wie sie alle aussehen.

Einfaches Färbeverfahren

  1. Legen Sie Ihre sorgfältig vorbereiteten fixierten Abstrich-Objektträger auf den Fleckenrost über der Spüle.
    • Machen Sie eine Folie nach der anderen.
    • Bedecke den Abstrich mit einer der verfügbaren Grundfarben.
    • Sie brauchen nur genug Farbe, um den Ausstrich zu bedecken. Der Fleck sollte nicht vom Objektträger tropfen.
  2. Lassen Sie den Fleck 1-5 Minuten einwirken.
  3. Greifen Sie mit der Wäscheklammer das lange Ende des Objektträgers, kippen Sie den Objektträger über das Waschbecken und spülen Sie den Fleck mit einem Wasserstrahl aus der Waschflasche ab.
    • Sprühen Sie unbedingt über den Abstrich und lassen Sie ihn nach unten tropfen.
    • Wenn Sie direkt auf den Ausstrich sprühen, besteht die Gefahr, dass der Ausstrich vom Objektträger abgewaschen wird.
    • Spülen, bis das Wasser klar oder nur leicht gefärbt ist.
  4. Berühren Sie die Kante des Objektträgers mit einem Papiertuch, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Sie können es jetzt an der Luft trocknen lassen. Alternativ können Sie es mit Löschpapier trocknen, indem Sie es in das Löschpapierbuch legen und leicht andrücken. Diese Methode ist zwar schneller, du kannst aber auch einen schlecht haftenden Abstrich abtupfen.
  5. Betrachten Sie Ihren Objektträger unter Ölimmersion und notieren Sie Ihre Beobachtungen in Ihrem Laborbuch.
  6. Entsorgen Sie Ihre gebrauchten gefärbten Objektträger in den Desinfektionseimer im Waschbecken.

Negativer Fleck

Negative Flecken sind noch einfacher als einfache Flecken, weil Sie keinen Abstrich machen müssen. Ein Zelltropfen wird auf einem Objektträger verteilt und ohne Fixierung betrachtet. Der Fleck ist eine Suspension von Kohlenstoff, die in Tusche oder Nigrosin enthalten ist. Die Kohlenstoffpartikel sind negativ geladen, ebenso die Zellmembran. Der Hintergrund sieht schwarz oder sepiafarben aus und die Zellen bleiben klar, da sie den Farbstoff abstoßen.

Einige positiv geladene Einschlusskörper, wie beispielsweise Schwefel, können sich verfärben. Diese Färbung gibt genaue Informationen über die Zellmorphologie und das Vorhandensein von Kapseln, da die Zellen nicht fixiert sind. Die Zellgröße erscheint etwas größer, da sich auch keine extrazellulären Beschichtungen oder Sekrete auf der Außenseite der Zellmembran nicht färben. Negative Färbungen sind nützlich für die schnelle Bestimmung des Vorhandenseins von Cryptococcus neformans, dem Erreger der Kryptokokzise, ​​in der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit. Diese Technik wird auch verwendet, wenn Sie auf Endosporen und Kapseln färben.

Materialien

Allgemeine Überlegungen

Genau wie beim Anfertigen eines Abstrichs benötigen Sie nur eine geringe Menge an Organismus. Wenn Sie zu viele Organismen haben, können Sie die Morphologie einzelner Zellen nicht sehen. Es ist auch wichtig, nicht zu viel Nigrosin zu verwenden. Wenn es zu dick ist, hat der Hintergrund ein rissiges Aussehen, ähnlich wie Schlammpfützen, die in der Sonne trocknen. Sie möchten einen leichten Film bekommen. Ihr Lehrer wird Ihnen diese Technik demonstrieren.

Negatives Färbeverfahren

  1. Beschriften Sie Ihre Folie. Wenn Sie mit einer Brühe arbeiten, platzieren Sie eine Schleife voller Organismen zu etwa drei Vierteln auf der linken Seite des Objektträgers. Wenn Sie mit einer Plattenkultur arbeiten, geben Sie einen Tropfen steriles Wasser auf den Objektträger und verdünnen Sie Ihren Organismus im Tropfen, ohne den Tropfen zu verteilen.
  2. Geben Sie ein oder zwei Tropfen Nigrosin auf einen anderen Objektträger. Verwenden Sie Ihre sterilisierte Schlinge, um eine Schlinge voller Nigrosin aufzunehmen. Mischen Sie es vorsichtig mit dem Zelltropfen, ohne den Tropfen zu stark zu verteilen.

  1. Halten Sie das rechte Ende des Objektträgers mit der linken Hand in Ihrer rechten Hand – nehmen Sie einen weiteren Objektträger in einem Winkel von 45° oder weniger zum ersten Objektträger, direkt hinter Ihrem Nigrosin-/Zelltropfen.
  2. Schieben Sie die abgewinkelte Rutsche entlang der Oberfläche der ersten Rutsche zurück, bis sie nur berührt den Tropfen von Nigrosin und Zellen. Warten Sie auf die Kapillarwirkung, um die Flüssigkeit entlang der Vorderkante des abgewinkelten Objektträgers zu ziehen.
  3. Schieben Sie den abgewinkelten Objektträger über die Oberfläche des flachen Objektträgers. Das meiste Nigrosin sollte noch an der ursprünglichen Stelle belassen werden. Entsorgen Sie den Objektträger im Desinfektionsmitteleimer.
  4. Legen Sie den gefärbten Objektträger zum Trocknen beiseite, bevor Sie ihn in Öl betrachten. Achten Sie darauf, Ihren Objektträger in dem Bereich mit dem schwächsten grauen Hintergrund zu untersuchen.
  5. Notieren Sie Ihre Beobachtungen in Ihrem Laborbuch.
  6. Entsorgen Sie Ihren gebrauchten gefärbten Objektträger im Desinfektionsmitteleimer.

Spezielle Notiz

Nigrosin löst sich sehr leicht vom Objektträger und auf Ihr Ölimmersionsobjektiv. Achten Sie darauf, Ihre Öllinse gründlich zu reinigen, wenn Sie fertig sind. Dann wieder sauber machen. Sobald es auf dem Objektiv getrocknet ist, ist es sehr schwer zu entfernen und beeinträchtigt Ihre Fähigkeit (und die anderen Mikroschüler, die dieses Zielfernrohr verwenden), klar aus dem Objektiv zu sehen.

Gramm-Färbung

Die Gram-Färbung ist die am häufigsten verwendete Differenzialfärbung in der Mikrobiologie. Differentielle Flecken verwenden mehr als einen Farbstoff. Die einzigartigen zellulären Bestandteile der Bakterien bestimmen, wie sie auf die verschiedenen Farbstoffe reagieren. Das Gram-Färbungsverfahren ist seit seiner Entwicklung im Jahr 1884 im Wesentlichen unverändert geblieben. Fast alle Bakterien können in zwei Gruppen eingeteilt werden, Gram-negativ oder Gram-positiv. Einige Bakterien sind gramvariabel. Trichomonas, Strongyloides, einige Pilze und einige Protozoenzysten haben auch eine Gram-Reaktion. Sehr kleine Bakterien oder Bakterien ohne Zellwand, wie z Treponema, Mykoplasmen, Chlamydien, oder Rickettsien keine Grammreaktion haben. Die Charakterisierung neuer Bakterien muss ihre Gram-Reaktion einschließen.

Typischerweise besteht eine Differentialfärbung aus vier Komponenten, der Primärfärbung, einem Beizmittel, das die Färbung festigt, einem Entfärbungsmittel, um die Primärfärbung zu entfernen, und einer Gegenfärbung. Bei der Gram-Färbung ist die primäre Färbung Kristallviolett. Dadurch erhält die Zelle eine intensive violette Farbe. Das Beizmittel Jod bildet mit dem Kristallviolett innerhalb der Zellwand einen Komplex. Die Zelle wird dann entweder mit Grams Entfärber oder 95 % Ethanol gewaschen. Gram-positive Zellen behalten den Farbstoffkomplex und bleiben violett. Der Farbstoff wird in gramnegativen Zellen ausgespült. Die Gegenfärbung, Safranin, wird verwendet, um die Zellen zu färben, die die primäre Färbung verloren haben, andernfalls würden sie farblos bleiben und Sie könnten sie nicht sehen.

Der große Jod-Kristallviolett-Komplex wird aufgrund der molekularen Struktur der vielen Peptidoglycanschichten in der Zellwand in den Zellwänden grampositiver Zellen zurückgehalten. Es gibt viele vernetzte Teichonsäuren und der Jod-Farbstoff-Komplex kann physikalisch nicht austreten. Außerdem befindet sich weniger Lipid in der Membran und das Entfärbungsmittel kann auch nicht dorthin gelangen. Gram-negative Zellen haben eine äußere Membran und nur eine Peptidoglycan-Schicht mit mehr Lipid. Der Kristallviolettfarbstoff lässt sich leicht auswaschen.

Allgemeine Überlegungen

Die Genauigkeit der Gram-Färbung hängt von der Integrität der Bakterienzellwand ab. Es gibt eine Vielzahl von Dingen, die die Integrität der Zellwand beeinflussen können alte Zellen (dh Kulturen, die älter als 24 Stunden sind), die Probe stammt von jemandem, der mit Antibiotika behandelt wurde, die auf diese Zellwand wie Penicillin abzielen, die Zellen wurden grob gehandhabt oder Sie über Hitze fixierte sie. Unter diesen Bedingungen erscheinen grampositive Zellen als gramnegativ. Wenn Sie zu lange entfärben, sehen grampositive Zellen wie gramnegative Zellen aus. Umgekehrt, wenn Sie nicht genug entfärben, sehen Gram-Negative wie Gram-Positive aus. Nur so können Sie Ihren Ergebnissen vertrauen, wenn Sie immer ein bekanntes Gram-Positiv und ein bekanntes Gram-Negativ auf demselben Objektträger laufen lassen. Wenn sie sich wie vorhergesagt färben, können Sie ziemlich sicher sein, dass das Ergebnis Ihrer unbekannten Probe zuverlässig ist.

Die Gram-Färbung erfordert Übung, um richtig zu werden. Erwarten Sie nicht, dass Sie beim ersten Versuch einen guten Gram-Fleck bekommen. Es ist eine gute Idee, Ihre Folie mit einer Wäscheklammer zu halten, Ihre Handschuhe werden ziemlich psychedelisch, genau wie alles, was Sie anfassen!

Gram-Färbungsverfahren

  1. Beschriften Sie Ihre Folie. Bereiten Sie Ihre Abstriche auf einem Objektträger mit einem Gram-Negativ auf der linken Seite, Ihrem Unbekannten in der Mitte und einem Gram-Positiv auf der rechten Seite vor.
    • Vergessen Sie nicht, Ihren Objektträger mit Methanol zu reparieren!
  2. Legen Sie Ihren Objektträger auf das Färbegestell und bedecken Sie die Ausstriche 1 Minute lang mit Kristallviolett.
    • Verwenden Sie gerade genug Färbemittel, um den Ausstrich vollständig zu bedecken, aber nicht so viel, dass er vom Objektträger läuft oder tropft.
  3. Kippen Sie den Objektträger und gießen Sie das Kristallviolett ab und spülen Sie es kurz mit Wasser aus Ihrer Waschflasche aus.
    • Denken Sie daran, nicht direkt auf die Abstriche zu sprühen, da Sie sie sonst abwaschen.
  4. Fluten Sie den Objektträger 1 Minute lang mit Jodbeizmittel.
  5. Kippen Sie den Objektträger, gießen Sie das überschüssige Jod ab und entfärben Sie es vorsichtig mit dem Entfärber von Gram, bis es gerade anfängt, klar zu laufen.
    • Dies ist der schwierige Teil!
  6. Kippen Sie Ihre Folie auf einigen Papiertüchern, um überschüssiges Entfärbemittel zu entfernen.
  7. Fluten Sie Ihren Objektträger 1 Minute lang mit dem Safranin.
  8. Kippen Sie den Objektträger, um das überschüssige Safranin abzugießen, und spülen Sie ihn vorsichtig mit Wasser ab, bis er klar ist.
  9. Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen
  10. Unter Ölimmersion beobachten.
    • Die Gram-Positivkontrolle sollte lila und die Gram-Negativkontrolle sollte rosa sein.
  11. Entsorgen Sie Ihren gebrauchten Objektträger im Desinfektionsmitteleimer.

Kongoroter Kapselfleck

Die Kongorot-Kapselfärbung ist eine Modifikation der Nigrosin-Negativfärbung, die Sie möglicherweise zuvor durchgeführt haben. Die Bakterien nehmen den Kongorot-Farbstoff auf und der Hintergrund wird dann mit saurem Fuchsin-Farbstoff angefärbt. Die Kapsel- oder Schleimschichten, stark hydratisierte Polymere, schließen beide Farbstoffe aus. Der Hintergrund erscheint blau, die Bakterienzellen erscheinen rosa und die klaren Höfe sind die Kapseln.

Klinisch sind die Kapseln einiger hochpathogener Bakterien (z. B. Pneumokokken, Hämophilis influenzaeund Meningokokken) können durch die Verwendung von Antiseren, die für diesen Kapseltyp spezifisch sind, unterschieden werden. Die Bakterien werden in den Antiseren suspendiert und anschließend mit Methylenblau vermischt. Bei der Antiseren-Färbung erscheinen die Bakterien blau, umgeben von einem klaren Halo und dann umgeben von einer dünnen blauen Linie, wo die Antiseren an der Kapsel angeheftet sind.

Materialien

  • Kongoroter Fleck
  • Saurer Fuchsinfleck
  • Säurealkohol
  • Klebsiella pneumoniae Kultur
  • Enterobacter aerogenes Kultur

Kongorotes Kapselfärbeverfahren

  1. Legen Sie eine Schleife voller Kongorot auf eine Folie
  2. Mischen Sie eine kleine Menge Ihres Organismus in den Tropfen Congo Red.
    • Die Organismus-/Farbstoffsuspension gut auf dem Objektträger verteilen
  3. Lassen Sie den Objektträger gründlich an der Luft trocknen.
    • Nicht Methanol fixieren!
  4. Fixieren Sie den getrockneten Objektträger 15 Sekunden lang mit saurem Alkohol.
  5. Spülen Sie mit destilliertem Wasser und bedecken Sie den Objektträger 1-5 Minuten lang mit Säurefuchsin.
  6. Mit Wasser abspülen und an der Luft trocknen lassen.
  7. Untersuchen Sie den Objektträger unter Ölimmersion.
    • Die Zellen färben sich rot/rosa und die Kapseln erscheinen als farblose Höfe vor einem dunkelblauen Hintergrund.

Wirtz's Endosporen-Färbung

Die Bildung von Endosporen ist charakteristisch für Clostridum und Bazillus spp. Die Fähigkeit, ihr Protoplasma zu konzentrieren und zu beschichten, ermöglicht es ihnen, die widrigen Umweltbedingungen zu überleben, denen sie in ihrem Bodenlebensraum ausgesetzt sind. Dadurch können die Sporen auch der Verfärbung widerstehen. Die „lebenden“ Organismen lassen sich leicht mit einfachen Färbungen und Gram-Färbungen visualisieren.

Endosporen sind typischerweise stark lichtbrechend, auf sie treffendes Licht wird abgelenkt. Viele Bazillus Arten haben Einschlusskörper, die hochgradig lichtbrechend sind. Diese Einschlusskörperchen können bei regelmäßiger Färbung wie Endosporen aussehen. Das Vorhandensein von Endosporen muss mit endosporenspezifischen Färbungen bestätigt werden. Das Vorhandensein und die charakteristische Form und Position von Endosporen erfordern spezielle Verfahren, um die Endosporenhülle zu durchdringen. Bei den meisten Endosporen-Färbungen werden die Objektträger erhitzt, während sie kontinuierlich mit dem Farbstoff feucht gehalten werden. Obwohl es schneller ist, produziert es flüchtige Chemikalien und ist nur ein großes Durcheinander. Die gleichen Ergebnisse können erzielt werden, indem man den Farbstoff 30 Minuten lang auf dem Objektträger einwirken lässt. Es ist eine gute Idee, zuerst mit diesem Objektträger zu beginnen und an einem anderen Fleck zu arbeiten, während Sie darauf warten, dass der Farbstoff die Endosporen durchdringt.

Allgemeine Überlegungen

Sie werden a . verwenden Bazillus Spezies für die Endosporenfärbung. Die Form und Position von B. cereus Sporen sind denen von . sehr ähnlich B. anthrazit. Bazillus beginnt erst dann Sporen zu bilden, wenn ihm die Nahrung ausgeht. Sind die Kulturen zu jung, sieht man meist nur die rosafarbenen Stäbchen der Bakterien. Sind die Kulturen zu alt, sieht man meist nur die kleinen grünen Ovale der Endosporen. Idealerweise sollten Sie die grünen ovalen Körper der Endosporen sehen, die von der rosa vegetativen Bakterienzelle umgeben sind. Wählen Sie mit der geraden Impfnadel eine Probe aus der Mitte einer Kolonie, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Der Rand der Kolonie wächst noch aktiv und weist wenige Endosporen auf.


KAPSELFÄRBETECHNIK – EINFÜHRUNG, METHODEN, PRINZIP, VERFAHREN & ERGEBNISSE

Eine Kapsel in Bakterien ist das Ergebnis einer amorphen viskosen Sekretion, die von den Bakterien freigesetzt wird. Bleibt dieses Sekret locker und unabgegrenzt, wird es Schleimschicht genannt, und wenn es zu einer scharf definierten Struktur organisiert ist, wird es als Kapsel bezeichnet.

Die meisten Kapseln bestehen aus Polysacchariden, aber viele bestehen aus Polypeptiden (Proteinen).

Kapseln sind normalerweise zerbrechlich und können durch Erhitzen leicht zerstört oder verzerrt werden. Daher ist die Kapselfärbung so konzipiert, dass die Gesamtmorphologie der Bakterien sowie die Kapselstruktur erhalten bleiben, sodass wir sie leicht identifizieren können.

Um bessere Ergebnisse zu erzielen und die Größe der Bakterienkapsel zu erhöhen, kann auch ein Tropfen Serum verwendet werden, während ein Abstrich hergestellt wird, was es bequemer macht, Bakterienkapseln mit einem typischen Verbindungs-/Lichtmikroskop zu beobachten.

Beim Kapselfärbeprozess werden keine komplexen Prozesse und mehrere starke Reagenzien oder Farbstoffe verwendet, und einfachste Methoden wie die Tuschemethode liefern zufriedenstellende Ergebnisse, so dass wir leicht das Vorhandensein oder Fehlen einer Kapsel in der Bakterienzelle feststellen können.

Hitzefixierung wird auch vermieden, da sie die Kapsel zerstört oder verzerrt, was es bequemer macht und außerdem können Neulinge in der Mikrobiologie dies leicht tun und mehr in der mikrobiellen Welt erforschen….

Kurz gesagt, bei der Kapselfärbetechnik werden der Hintergrund und der Bakterienzellkörper gefärbt, während die Kapsel farblos bleibt. Das Ergebnis variiert jedoch je nach der für die Kapselfärbung verwendeten Methodik.

PRINZIP DER KAPSELFÄRBUNG

Lassen Sie uns zunächst die bakteriellen Zellstrukturen besprechen, die an dieser Färbetechnik beteiligt sind, und später werden wir zu den Prinzipien der Kapselfärbungstechnik übergehen.

Ein verkapseltes Bakterium erhält eine Kapsel um seinen Körper, die als klarer Halo erscheint. Eine Bakterienkapsel ist von Natur aus nichtionisch, daher besteht keine oder nur eine sehr geringe Möglichkeit, dass die sauren oder basischen Flecken an ihren Oberflächen haften bleiben, sodass sie farblos bleiben.

Die hervorragende Möglichkeit, die Kapsel zu demonstrieren, besteht darin, den Bakterienzellkörper und den Hintergrund zu färben, wodurch die Bakterienkapsel farblos bleibt.

Der Bakterienzellkörper wird am besten mit den Basisfarben wie Kristallviolett, Safranin, Methylenblau usw. gefärbt, während der Hintergrund am besten mit den sauren Färbungen gefärbt wird, die Tusche, Nigrosin, Eosin, Kongorot usw. umfassen.

Für den Nachweis der Kapsel in Bakterienzellen stehen zahlreiche Methoden zur Verfügung. Das Ergebnis der Färbung variiert je nach angewandter Methode, aber im Allgemeinen haben alle Methoden eines gemeinsam, dass sie die Bakterienzelle, die Kapsel und/oder den Hintergrund färben. Die zwei am häufigsten verwendeten Methoden sind wie folgt:

Tuschemethode / Nigrosin-Methode

Dies ist die einfachste Methode zur Kapselfärbung. Bei dieser Technik werden zwei Farbstoffe verwendet, nämlich Kristallviolett und die Tusche / Nigrosin.

Die Kapsel der Bakterienzelle erscheint als klarer Halo um den gefärbten Bakterienzellkörper und den dunklen Hintergrund (Farbe hängt vom verwendeten Farbstoff ab – Tusche oder Nigrosin).

AnthonysFleckenmethode

Dies ist eine weitere am häufigsten verwendete Methode der Kapselfärbung. Bei dieser Technik wird die Kristallviolettfärbung als Primärfärbung verwendet.

Außerdem wird eine 20%ige Kupfersulfatlösung verwendet, die eine wichtige Rolle bei der Färbung spielt, indem sie sowohl als Entfärbungsmittel als auch als Gegenfärbung wirkt.

20% CuSO4 entfärbt die Bakterienkapseln, indem es das daran haftende Kristallviolett entfernt, das aber keine solche Wirkung auf den Bakterienzellkörper hat, und es färbt auch die Kapsel, die später als schwach blaue Farbzone oder Halo um den violetten Bakterienzellkörper erscheint.

Wichtig hierbei ist, dass keine Beizmittel und keine starken Entfärber verwendet werden.

BENÖTIGTE MATERIALIEN FÜR DAS KAPSELFÄRBEVERFAHREN

  • Mikroskopischer Glasobjektträger.
  • Impföse.
  • Zauberlampe.
  • Färbegestell.
  • Waschflasche.
  • Mikroskop (mit 100X-Objektiv).

Für Tusche / Nigrosin-Methode

Für Anthony’s Stain-Methode

VERFAHREN DER KAPSELFÄRBETECHNIK

Das Verfahren der Kapselfärbung mit Tusche / Nigrosin-Methode

Nehmen Sie einen sauberen, trockenen, kratz- und fettfreien Mikroskop-Objektträger und geben Sie einen Tropfen Tusche oder Nigrosin darauf an einem Ende nahe dem Rand.

Nehmen Sie mit Hilfe einer sterilisierten Impföse einen kleinen Teil der Bakterienkolonie oder eine Öse voller Kulturbrühe.

Die Kultur mit dem auf dem Objektträger aus Glas entnommenen Farbstoff gut mischen.

Nehmen Sie nun einen weiteren Objektträger aus Mikroskopglas und legen Sie ihn in einem Winkel von ca. 30° – 45° in die Nähe der Präparat-Farbstoff-Mischung.

Bewegen Sie den Objektträger in Richtung des Tropfens der Probe-Farbstoff-Mischung, bis der Kontakt mit dem Tropfen in dem bestimmten Winkel hergestellt wird. Bewegen Sie dann den Streuschieber gleichmäßig und schnell über den Objektträger nach vorne und ziehen Sie die Farbstoffmischung dahinter zu einem dünnen Film auf.

Lassen Sie den Ausstrich an der Luft trocknen.

HINWEIS: Nicht erhitzen, da Hitze die Kapsel schmilzt und die tatsächliche Form der Bakterienzelle verzerrt.

Fluten Sie nun den Abstrich-Objektträger 1 Minute lang mit Kristallviolettlösung und spülen Sie ihn vorsichtig und vorsichtig mit Wasser ab.

HINWEIS: Seien Sie bei diesem Schritt vorsichtig, da Wasser die Kapsel aus der Zelle entfernen und den Ausstrich auswaschen kann

Lassen Sie den Abstrich-Objektträger an der Luft trocknen.

HINWEIS: Den Objektträger nicht trocken tupfen, da dies die Kapsel sowie den Ausstrich verformen kann.

Beobachten Sie unter dem Mikroskop bei Hochleistungsobjektiven (45X) und Ölimmersionsobjektiven (100X). Um die Kapsel leicht sichtbar zu machen, stellen Sie sicher, dass die Lichtmenge verringert wird, während Sie unter dem Mikroskop beobachten.

Das Verfahren der Kapselfärbung mit Anthonys Fleckenmethode

Das Verfahren von Anthonys Färbemethode ist dem der Tusche- / Nigrosin-Methode anfangs ziemlich ähnlich, das wie folgt lautet:

Nehmen Sie einen sauberen, trockenen, kratz- und fettfreien Mikroskop-Objektträger und geben Sie einen Tropfen Crystal Violet an einem Ende in der Nähe des Randes darauf.

Take a small portion of the bacterial colony or a loopful of broth culture with the help of sterilized Inoculating loop.

Mix well the culture with dye taken on the Glass slide.

Now, take another Microscopic Glass slide, place it near to the specimen-dye mixture at an angle of about 30° – 45°.

Move the slide toward the drop of the specimen-dye mixture until the contact is made with the drop at the specific angle. Then move the spreader slide smoothly and rapidly forward over the specimen slide, drawing the dye mixture behind it into a thin film.

Allow the smear to Air dry.

NOTE: Do not Heat as heat will melt the capsule and distorts the actual shape of the bacterial cell.

Now, Tilt the smear slide and rinse it with the 20% copper sulfate (CuSO4) solution.

NOTE: Do not Blot dry the slide as it may distort the capsule as well as the smear.

Observe under the microscope at High power objective (45X) and oil immersion (100X) objectives. To easily visualize the capsule make sure to decrease the amount of light while observing under the microscope.

OBSERVATIONS & RESULTS OF CAPSULE STAINING

Results of Capsule staining using India ink / Nigrosin Method

The capsule appears as the Clear halo or clear zone around the purple colored bacterial cell body on a dark background. The Background color is due to the India ink or Nigrosin whatever you’ll use.

MICROSCOPIC VIEW OF INDIA INK PREPARATION SHOWING CAPSULE, BACTERIAL CELL BODY (PURPLE) & BLUISH BACKGROUND

Results of Capsule staining using Anthony’s stain Method

The capsule appears as the Faint blue halo around the purple bacterial cell body on a transparent background as there is no background stain is used in this technique.

MICROSCOPIC VIEW OF ANTHONY’s CAPSULE STAIN PREPARATION SHOWING PURPLE BACTERIAL CELL BODY AND LIGHT BLUE CAPSULE

THINGS TO BE NOTED…..

By using India ink / Nigrosin technique, we stain the background and bacterial cell body, not the bacterial capsules actually.

By Anthony’s Stain method we stain the Bacterial cell body as well as the Capsule but not the Background.


Further Reading:

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Capsule Stain:

Capsules are the gelatinous outer layer of the bacterial cells and these structures cannot retain the color of the staining agents. The capsules can be visualized by means of two methods.

Positive Capsule Staining

Since capsule is water soluble in nature, it is too difficult to stain the capsule with normal staining methods. The positive capsule staining method (Anthony Method) uses two reagents to stain the capsular material. The primary stain Crystal violet is applied over a non heat fixed bacterial smear so that both the bacterial cells and capsular material take up the color of the primary stain. The ionic nature of the bacterial cell binds the crystal violet stain more strongly while the non-ionic nature of the capsule get adhere with the crystal violet stain. When the decolorizing agent copper sulfate is added over the bacterial smear, the loosely adhered crystal violet stain is washed off from the capsular material without removing the tightly bound crystal violet from the cell wall. The capsular material absorbs the light blue color of the copper sulfate in contrast to the purple bacterial cell.

Negative Capsule Staining

Another simple method to visualize the bacterial capsules is by using negative staining Technique. During staining the non heat fixed bacterial smear with the acidic stains such as Nigrosin will not penetrate the bacterial cells (since both acidic stain and bacterial surface has negative charge). Instead the acidic stain deposits around the bacterial cells and create a dark back ground and the bacteria appear as unstained with a clear area around them, capsule.


Notiz: If you heat fix the bacterial smear for capsule staining, the cells will shrink creating a hallow zone around the bacterial cell and will be mistaken for the capsule.


What are Acid Fast Bacteria

The acid fast bacteria are a type of bacteria that resist decolorizing by acid after staining. Acid fastness is a physical property of bacteria, which rely on the structure of the bacterial cell wall. Typically, the cell wall of bacteria is made up of proteins, carbohydrates, and lipids. Acid fast bacteria comprise a thin layer of peptidoglycans. The mycolic acid is a long chain of fatty acids, attached to the peptidoglycans. Once the primary stain, carbol-fuchsin is added to the slide containing bacteria, the mycolic acid is attached to carbol-fuchsin. This makes the acid fast bacteria to stain in pink even after decolorization.

Figure 1: Acid Fast Bacteria

Mycobacteria is a common type of bacteria, which grows slowly hence, they are composed of a thick layer of mycolic acid. In addition to mycolic acid, acid fast bacteria consist of a large amount of fatty acids, complex lipids, and waxes. Due to the presence of thick bacterial cell wall, acid fast bacteria are highly resistant to disinfectants as well as dry conditions. The cell wall structure and the staining of acid fast bacteria are shown in Abbildung 1.


Biochemical properties (continued)

Another test is whether or not your unknown has an hemolytic reaction. Most bacteria are gamma-hemolytic, which means that they do not have an hemolytic reaction. This test is mostly used on streptococci species: it differentiates non pathogenic streptococci from pathogenic streptococci. This is tested on a blood agar plate: a beta-hemolysis creates a white discoloration around the colony whereas an alpha-hemolysis has a brownish green zone around the colony. Streptococcus pyogenes is not a pathogen and therefore is beta-hemolytic whereas Streptococcus pneumoniae oder Streptococcus salivarius are alpha-hemolytic.

Another biochemical property is the production of H2S from the oxidation of sulfur containing compounds like cysteine or the reduction of inorganic compounds like thiosulfates, sulfates or sulfites. The media used is peptone-iron agar. The peptone has sulfur containing amino acids which are used by the bacteria to produce H2S and the iron detects the H2S by forming a black residue along the stab line. Proteus vulgaris for example produces H2S.

The following test is the coagulase test which shows if bacteria are capable of coagulating oxolated plasma. It is an indication of pathogenicity since if a bacteria can coagulate the blood, it can wall off from the immune system. Staphylococcus aureus can coagulate oxolated plasma and therefore blood. It is also capable of secreting gelatinase which is the enzyme that hydrolyzes gelatine into polypeptides and amino acids.

The following series of tests is called IMVIC which stands for Indole, Methyl red, Voges-Proskauer and Citrate.

  • The indole production test shows if the bacterial strain is capable of breaking down tryptophan by tryptophanophase into indole, ammonia and pyruvate. We can detect this reaction by using Kovac&aposs reagent which is contained in amyl alcohol (not miscible in water). Kovac&aposs reagent reacts with indole to form Rosindol dye, forming a red color that will rise to the top of the broth culture. This test is positive for Escherichia coli und Proteus vulgaris but negative for Enterobacter aerogenes for example.
  • The methyl red test tests for glucose fermentors. It turns red when the pH is inferior to 4,3. It is positive for E coli but negative for E. aerogenes.
  • The Voge-Proskauer tests shows the production of acetoin. The reagent used is potassium hydroxide, a creatine solution. The medium turns red if the test is positive for E. aerogenes for example. It is negative for E coli.
  • Finally, the citrate test is used to differentiate enterics. It tests if the bacterium has the permease required to take up the citrate and use it as the sole carbon source. The indicator used is bromothymol blue: the black medium turns blue if the citrate is used. E. aerogenes has the permease however E coli doesn&apost.

Preparing Specimens for Electron Microscopy

Samples to be analyzed using a TEM must have very thin sections. But cells are too soft to cut thinly, even with diamond knives. To cut cells without damage, the cells must be embedded in plastic resin and then dehydrated through a series of soaks in ethanol solutions (50%, 60%, 70%, and so on). The ethanol replaces the water in the cells, and the resin dissolves in ethanol and enters the cell, where it solidifies. Nächste, thin sections are cut using a specialized device called an ultramicrotome (Abbildung 9). Finally, samples are fixed to fine copper wire or carbon-fiber grids and stained—not with colored dyes, but with substances like uranyl acetate or osmium tetroxide, which contain electron-dense heavy metal atoms.

Figure 9. (a) An ultramicrotome used to prepare specimens for a TEM. (b) A technician uses an ultramicrotome to slice a specimen into thin sections. (credit a: modification of work by “Frost Museum”/Flickr credit b: modification of work by U.S. Fish and Wildlife Service Northeast Region)

When samples are prepared for viewing using an SEM, they must also be dehydrated using an ethanol series. However, they must be even drier than is necessary for a TEM. Critical point drying with inert liquid carbon dioxide under pressure is used to displace the water from the specimen. After drying, the specimens are sputter-coated with metal by knocking atoms off of a palladium target, with energetic particles. Sputter-coating prevents specimens from becoming charged by the SEM’s electron beam.

Denk darüber nach

  • Why is it important to dehydrate cells before examining them under an electron microscope?
  • Name the device that is used to create thin sections of specimens for electron microscopy.

Using Microscopy to Diagnose Syphilis

The causative agent of syphilis ist Treponema pallidum, a flexible, spiral cell (spirochete) that can be very thin (<0.15 μm) and match the refractive index of the medium, making it difficult to view using brightfield microscopy. Additionally, this species has not been successfully cultured in the laboratory on an artificial medium therefore, diagnosis depends upon successful identification using microscopic techniques and serology (analysis of body fluids, often looking for antibodies to a pathogen). Since fixation and staining would kill the cells, darkfield microscopy is typically used for observing live specimens and viewing their movements. However, other approaches can also be used. For example, the cells can be thickened with silver particles (in tissue sections) and observed using a light microscope. It is also possible to use fluorescence or electron microscopy to view Treponema (Abbildung 10).

Figure 10. (a) Living, unstained Treponema pallidum spirochetes can be viewed under a darkfield microscope. (b) In this brightfield image, a modified Steiner silver stain is used to visualized T. pallidum spirochetes. Though the stain kills the cells, it increases the contrast to make them more visible. (c) While not used for standard diagnostic testing, T. pallidum can also be examined using scanning electron microscopy. (credit a: modification of work by Centers for Disease Control and Prevention credit b: modification of work by Centers for Disease Control and Prevention credit c: modification of work by Centers for Disease Control and Prevention)

In clinical settings, indirect immunofluorescence is often used to identify Treponema. A primary, unstained antibody attaches directly to the pathogen surface, and secondary antibodies “tagged” with a fluorescent stain attach to the primary antibody. Multiple secondary antibodies can attach to each primary antibody, amplifying the amount of stain attached to each Treponema cell, making them easier to spot (Figure 11).

Figure 11. Indirect immunofluorescence can be used to identify T. pallidum, the causative agent of syphilis, in a specimen.


Lab 4: Acid-Fast, Spores, and Capsule Stains - Biology

Before staining, the specimen must be mounted and fixed on the slides, as previously done in the simple staining technique. Because of the 2 dyes used in the procedure–crystal violet and safrinin—as well as the decolorizer acetone-alcohol, bacteria will fall into 2 groups based on their gram reactivity. Gram positive bacteria retain the crystal violet even through the decolorizor step: gram negative bacteria do not retain the crystal violet, are decolorized, and then pick up the safrinin dye. Both gram + and – bind to the crystal violet: the key step to their differentiation is the decolorization.

Take a look at the accompanying diagram of the stain procedure and its effects on the bacterial color. During the crystal violet-iodine step, the bound molecules within the peptidoglycan of the gram + cell wall and within the membrane are held tightly. The acetone-alcohol actually causes the peptidoglycan molecules (arranged in a latticework) to shrink, thereby holding the crystal violetiodine even tighter. In the gram – cell, the outer lipopolysaccharide layer of the wall is dissolved by the decolorizer agents, and because the peptidoglycan layer is so thin in that group of bacteria, the crystal violet is leached out of the wall.

Although there is a standard routine and set reagents used in this stain, each person has to find a particular method that works best for them. The many variables that can affect this stain are age of the culture, amount of decolorizer used, the time of decolorization, the type of organism (acid-fast bacteria and spores do not stain well), thickness of the smear, and the general care of the stainer.



Bemerkungen:

  1. Dorren

    Verschlichen Sie nicht Ihr Gehirn darüber!

  2. Tracy

    Ja, die Antwort ebenso wie bei mir.

  3. Shashakar

    die leuchtende Idee und ist rechtzeitig

  4. Gyamfi

    schau auf die große Leinwand!

  5. Dennison

    Ich denke du liegst falsch. Ich bin sicher. Lassen Sie uns dies diskutieren. Senden Sie mir eine E -Mail an PM.



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