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Analyse der Lineage-Tags nach der Transplantation

Analyse der Lineage-Tags nach der Transplantation



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Ich habe einige Probleme, einige Teile einer Studie, hauptsächlich über das Dornröschen-System und das TARIS-Modell, aus diesem Papier zu verstehen: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4408613/

Ich verstehe das Konzept, aber nicht, wie es technisch funktioniert. Kann es mir jemand erklären?


Ich kann in dem von Ihnen verlinkten Papier keinen Hinweis auf ein "TARIS-Modell" finden, aber wir können die molekularen Schaltkreise dieses Lineage-Tag-Tracking-Systems Schritt für Schritt aufschlüsseln.

  1. Die Autoren verwenden eine Art Tet-Expressionssystem, um die Expression eines hyperaktiven Dornröschens (HSB) Transposase. In Abwesenheit von Doxycyclin ist der umgekehrte Tetracyclin-kontrollierte Transaktivator M2-rtTA bindet nicht TetO Operator. Jackson Labs hat eine sehr gute Zusammenfassung von Tet-On (und Tet-Off) Systemen:

… rtTA ein Fusionsprotein ist, das aus dem TetR-Repressor und der VP16-Transaktivierungsdomäne besteht; jedoch verändert eine Veränderung von vier Aminosäuren in der tetR-DNA-Bindungskomponente die Bindungseigenschaften von rtTA, so dass es nur die tetO-Sequenzen im [Tetracyclin-responsiven Promotorelement (TRE)] des Zieltransgens in Gegenwart des Dox-Effektors erkennen kann. Somit wird im Tet-On-System die Transkription des TRE-regulierten Zielgens durch rtTA nur in Gegenwart von Dox stimuliert.

  1. In Gegenwart von Doxycyclin steuert der Transaktivator die Expression von HSB von den konstituierenden Förderern der TetO Operator. HSB enthält DNA-Bindungsmotive, die spezifisch die direkten Wiederholungen (weiße Dreiecke) erkennen, und eine katalytische Domäne, die die direkten Wiederholungen und die von ihnen flankierte DNA ausschneidet, die ein Transkriptionsstoppsignal (Tn-STOP) enthält.
  2. Exzision des Tn-STOP-Signals ermöglicht die Expression von DsRed angetrieben von einem starken synthetischen Promotor (CAGGS, hier zuerst beschrieben). Die ausgeschnittene Sequenz wird dann an anderer Stelle im Genom eingefügt.
  3. Da eine erfolgreiche Tn-STOP-Exzision gleichzeitig mit der Transkription von DsRedkönnen rot fluoreszierende Zellen selektiert und für NGS vorbereitet werden. HSB die Transposition ist "zufällig", so dass es unwahrscheinlich ist, dass zwei verschiedene Transpositionsereignisse auf denselben Insertionslocus abzielen. Die spezifische Insertionsstelle kann dann als molekularer Fingerabdruck verwendet werden, um die Vorläufer-Stammzelle nach Replikation und Differenzierung zu identifizieren.


Grenzen in der Immunologie

Die Zugehörigkeiten der Herausgeber und Gutachter sind die neuesten Angaben in ihren Loop-Forschungsprofilen und spiegeln möglicherweise nicht ihre Situation zum Zeitpunkt der Überprüfung wider.


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    TEILEN EIN

    Abstrakt

    Hintergrund

    Eine diabetische Nierenerkrankung ist mit Glomerulosklerose und schlechter Nierendurchblutung verbunden. Erhöhte Kapillarbildung und verbesserte Durchblutung können helfen, die Verletzung zu stoppen oder umzukehren. Die Transplantation apoptoseresistenter p53‐stummgeschalteter endothelialer Vorläuferzellen (p53sh‐EPCs) kann zur Verbesserung der Vaskularisierung und renalen Perfusion beitragen und könnte vorteilhafter sein als eine andere Stammzelle wie die mesenchymale Stromazelle (mMSC) der Maus.

    Methoden und Ergebnisse

    Hyperglykämie und Proteinurie wurden bei Streptozotocin‐induzierten Typ1 diabetischen C57Bl/6‐Mäusen nach 8–10 Wochen bestätigt, gefolgt von einer Transplantation von 0,3 Millionen p53sh‐EPCs, Null‐EPCs (Kontrolle) oder mMSC unter jede Nierenkapsel. Urin wurde wöchentlich für Kreatinin- und Proteinspiegel gesammelt. Der Blutdruck wurde durch direkte arterielle Kanülierung gemessen und die Nierenperfusion wurde durch Nierenultraschall gemessen. Die Nieren wurden für Histologie und mRNA-Expression geerntet. Eine Reduktion von Protein/Kreatinin (AUC) wurde bei p53sh‐EPC‐transplantierten Mäusen mehr als bei Null‐EPC beobachtet (1,8‐fach, P=0,03) oder null‐mMSC (1,6‐fach, P= 0,04, n = 4) transplantierte Mäuse. Marker für die Angiogenese, wie die endotheliale Stickoxidsynthase (1,7‐fach, P=0.06), wurden nach p53sh‐EPC‐Transplantation im Vergleich zu Null‐EPC hochreguliert. Allerdings war die Expression des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors A reduziert (7-fach, P=0,0004) bei mMSC‐transplantierten Mäusen im Vergleich zu p53sh‐EPC‐transplantierten Mäusen. Isolectin‐B4‐Färbung des Nierenschnitts zeigte eine Verbesserung der glomerulären Sklerose, wenn p53sh‐EPC transplantiert wurde, im Vergleich zu Null‐EPC oder mMSC. Darüber hinaus sind die mittlere und maximale renale Blutgeschwindigkeit (1,3-fach, P=0,01, 1,4‐fach, P=0,001 bzw.) waren bei p53sh‐EPC‐transplantierten Mäusen im Vergleich zu null‐EPC‐transplantierten Mäusen erhöht.

    Schlussfolgerungen

    Eine Apoptose‐resistente p53sh‐EPC‐Transplantation könnte bei der Behandlung von diabetischer Nierenerkrankung von Vorteil sein, indem sie die Proteinurie verringert und die Nierenperfusion und die glomeruläre Architektur verbessert.


    Abstrakt

    Zielsetzung- Die therapeutische Angiogenese mit autologen Stamm-/Vorläuferzellen stellt eine neuartige Strategie für schwere ischämische Erkrankungen dar. Jüngste Berichte zeigten, dass Fettgewebe adipose-derived regenerative Zellen (ADRCs) liefern könnte. Dementsprechend untersuchten wir, ob die Implantation von ADRCs die Ischämie-induzierte Angiogenese verstärken würde.

    Methode und Ergebnisse— Fettgewebe wurde von C57BL/6J-Mäusen erhalten und ADRCs wurden unter Verwendung von Standardmethoden isoliert. ADRCs exprimierten von Stromazellen abgeleitete Faktor-1-(SDF-1)-mRNA und -Proteine. Eine Ischämie der Hintergliedmaßen wurde induziert und kulturexpandierte ADRCs, PBS oder reife Adipozyten (MAs) als Kontrollzellen wurden in die ischämischen Muskeln injiziert. Nach 3 Wochen hatte die ADRC-Gruppe einen höheren Laser-Doppler-Blutperfusionsindex und eine höhere Kapillardichte im Vergleich zu den Kontrollen. Die Implantation von ADRCs erhöhte die zirkulierenden endothelialen Vorläuferzellen (EPCs). Die SDF-1-mRNA-Abundanz in ischämischen Geweben und die Serum-SDF-1-Spiegel waren in der ADRC-Gruppe größer als in der Kontrollgruppe. Schließlich reduzierte die intraperitoneale Injektion eines anti-SDF-1-neutralisierenden Antikörpers die Zahl der zirkulierenden EPCs und die therapeutische Wirksamkeit von ADRCs.

    Schlussfolgerungen— Fettgewebe wäre eine wertvolle Quelle für die zellbasierte therapeutische Angiogenese. Darüber hinaus könnte das Chemokin SDF-1 eine zentrale Rolle bei der ADRC-vermittelten Angiogenese spielen, zumindest teilweise, indem es die Mobilisierung von EPCs erleichtert.

    Wenn Gewebe einer schweren Ischämie ausgesetzt ist, entwickeln sich neue Blutgefäße zu den ischämischen Herden, um eine Gewebenekrose zu verhindern. Da gezeigt wurde, dass zirkulierende endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) an der postnatalen Neovaskularisation nach Mobilisierung aus dem Knochenmark (KM) beteiligt sind,1,2 haben wir grundlegende und klinische Studien zur therapeutischen Angiogenese mit EPCs oder BM-Zellen durchgeführt. 3–5 Wir haben eine therapeutische Angiogenese unter Verwendung autologer mononukleärer BM-Zellen (BM-MNCs) in die ischämischen Muskeln bei Patienten mit kritischer Extremitätenischämie (TACT) durchgeführt. 6–8 Obwohl die Sicherheit und Effizienz des TACT-Protokolls nachgewiesen wurde, berichteten wir kürzlich, dass Patienten mit einer sehr schweren peripheren arteriellen Verschlusskrankheit schlecht auf das TACT-Verfahren ansprachen. 7 Darüber hinaus zeigten neuere Daten, dass Patienten mit schwerer obstruktiver Gefäßerkrankung oder mehreren koronaren Risikofaktoren eine verminderte Funktion der EPCs und ein schlechtes Ansprechen auf eine angiogene Zelltherapie aufwiesen. 9–12 Daher wurde intensiv nach alternativen Quellen von Stamm-/Vorläuferzellen für die therapeutische Angiogenese gesucht.

    Kürzlich haben mehrere Forscher berichtet, dass Fettgewebe multipotente mesenchymale Stammzellen enthalten, die als adipose-derived regenerative Zellen (ADRCs) bezeichnet werden und die Fähigkeit haben, geschädigtes Gewebe zu regenerieren. 13–15 Es ist jedoch wenig darüber bekannt, wie die Implantation von ADRCs die Angiogenese in ischämischen Geweben induzieren würde. Es ist bekannt, dass ADRCs mehrere angiogene Wachstumsfaktoren wie den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und den Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) sezernieren. 13,14 Solche Wachstumsfaktoren würden EPCs aus dem BM in das periphere Blut (PB) und schließlich in ischämische Gewebe mobilisieren. Es gibt jedoch nur begrenzte Beweise bezüglich der Auswirkungen der In-vivo-Implantation von ADRCs auf die EPC-Kinetik während der durch Ischämie induzierten Angiogenese.

    Dementsprechend untersuchten wir, ob die Implantation von ADRCs die Angiogenese, die kollaterale Gefäßbildung und die Mobilisierung von EPCs in einem Mausmodell der Hintergliedmaßen-Ischämie steigern könnte.

    Methoden

    Isolierung von Maus-ADRCs

    Alle Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Nagoya University School of Medicine genehmigt. ADRCs wurden aus den Leistenfettpolstern von C57BL/6J-Mäusen (n=32) und von GFP-transgenen Mäusen mit C57BL/6J-Hintergrund (n=3 freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. M. Okabe von der Universität Osaka) wie zuvor beschrieben isoliert 15–17 Methoden im Detail sind in den ergänzenden Materialien beschrieben (online verfügbar unter http://atvb.ahajournals.org).

    Adipozyten-Differenzierungsassay

    Die adipogene Differenzierung von ADRCs wurde wie zuvor beschrieben eingeführt (siehe ergänzende Materialien). 15 Die adipogene Differenzierung wurde durch Oil Red O-Färbung bestätigt. Um zu untersuchen, ob ADRCs zu EPCs oder reifen Endothelzellen (ECs) führen können, wurden ADRCs in EBM-2 (Endothelzell-Basalmedium Clonetics), ergänzt mit EGM-2 MV, kultiviert. An Tag 7 wurden anheftende Zellen durch Einbau von 1,1′-Dioctadecyl-1 an 3,3,3′,3′-Tetramethylindo-Carbocyanin-Perchlorat-markiertes acetyliertes LDL (DiI-acLDL, Biomedical Technology Inc) und Bindung von . gefärbt Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-markiert Bandeiraea simplicifolia Lectin 1 (FITC-BS-1-Lectin, Vector Laboratories) und Antithrombozyten-Endothelzell-Adhäsionsmolekül-1 (PECAM-1 oder CD31), monoklonaler Antikörper (mAb) (Becton Dickinson) und Anti-α-Smooth-Muskel-Aktin (α-SMA .) ) mAb (Abcam). 1,18 Nach der Immunfluoreszenzfärbung wurden die Kerne mit DAPI (Invitrogen) gefärbt.

    Charakterisierung von ADRCs durch Durchflusszytometrie

    Insgesamt wurden 5×10 5 Zellen 30 Minuten bei 4°C mit mAbs gegen Ly-6A/E inkubiert (ScaI), CD31, CD34, c-kit, flk-1 und Lin (BD Biosciences). Um die Phänotypen von ADRCs zu charakterisieren, wurde eine fluoreszenzaktivierte Zellsortieranalyse (FACS) unter Verwendung des FACS Calibre-Instruments (Becton Dickinson) und der Cell Quest-Software (BD Biosciences) durchgeführt. 18

    Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionsanalyse in Echtzeit

    Gesamt-RNA wurde aus kultivierten ADRCs und differenzierten MAs unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Invitrogen Life Technologies) isoliert. Gesamt-RNA aus den gefrorenen Geweben mit flüssigem Stickstoff (LN2), erhalten an den Tagen 0, 3 und 7 nach der Ischämie der Hinterbeine, wurde unter Verwendung des FastPrep-Systems (BIO 101) extrahiert. Die Echtzeit-RT-PCR-Analyse der VEGF-, SDF-1- und GAPDH-mRNAs wurde mit 2 µg Gesamt-RNA auf dem Mx3000P Real-Time PCR System (Stratagene) unter Verwendung von SYBR Green I als doppelsträngigem DNA-spezifischem Farbstoff gemäß durchgeführt Anweisungen des Herstellers (Applied Biosystem). 19 mRNA-Spiegel wurden relativ zu den GAPDH-Spiegeln exprimiert. Weitere Informationen sind in den ergänzenden Materialien beschrieben.

    ELISA

    Konditioniertes Medium wurde aus kultivierten ADRCs und MAs 72 Stunden nach dem letzten Wechsel von frischem DMEM/10% FBS erhalten. Die Konzentrationen von SDF-1α- und VEGF-Proteinen in den Medien wurden durch ELISA (Maus-CXCL12/SDF-1α-Quantikine-ELISA-Kit und Maus-VEGF-ELISA-Kit, R&D Systems) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die Plasmaspiegel von SDF-1α und VEGF an den Tagen 0, 3 und 7 nach der Ischämie der Hinterbeine wurden ebenfalls gemessen.

    Mausmodell der einseitigen Ischämie der Hintergliedmaßen

    Bei männlichen C57BL/6J-Mäusen (6 bis 10 Wochen alt, n = 32 Nihon Crea) wurde, wie zuvor beschrieben, eine einseitige Ischämie der Hinterbeine induziert. 20 Keine Mäuse starben während des Experiments. Mäuse wurden zufällig in 3 Gruppen eingeteilt. Die Kontrollgruppe (n=8) erhielt phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). Die ADRC-Gruppe (n = 8) erhielt ADRCs (1 × 10 6 Zellen pro Tier), und die MA-Gruppe (n = 6) erhielt reife Adipozyten (MA) (1 × 10 6 Zellen pro Tier), die an 3 vorbestimmten Punkten von . implantiert wurden die ischämischen Muskeln am postoperativen Tag 1. Nach der Behandlung wurden die Angiogenese und die kollaterale Gefäßbildung in den ischämischen Geweben wie zuvor beschrieben analysiert. 20 Darüber hinaus untersuchten wir, ob SDF-1 zur Steigerung der Angiogenese in ischämischen Geweben durch ADRC-Implantation notwendig ist. Einige Mäuse erhielten dreimal pro Woche bis zu 14 Tage nach der Operation intraperitonealen anti-SDF-1-neutralisierenden mAb (50 μg R&D-System). Als Kontrolle wurde unspezifisches Ratten-IgG auf ähnliche Weise verabreicht. Weitere Informationen sind in der Online-Ergänzung beschrieben. Bitte beachten Sie die ergänzenden Materialien.

    Um zu untersuchen, ob implantierte ADRCs überleben, sich in ECs oder Perizyten differenzieren und angiogene Zytokine in ischämischem Gewebe sezernieren könnten, erhielten einige Mäuse von GFP-transgenen Mäusen abgeleitete ADRCs. Diese Untergruppe von Mäusen wurde an den postoperativen Tagen 3 und 28 (jeweils n = 5) eingeschläfert. Am Tag 28 erhielten 2 Mäuse 50 &mgr;g Rhodamin-markiertes BS-1-Lectin (Rhodamin-BS-1-Lectin, Vector Laboratories) intravenös 30 Minuten vor der Tötung, um Gefäße sichtbar zu machen. Gefrorene Schnitte wurden weiter mit Anti-CD31, Anti-CD140b (Thermo Scientific), Anti-SDF-1-mAbs (BioVision) oder Anti-VEGF-mAb (Thermo Scientific) gefärbt und die Kerne wurden mit DAPI gefärbt. Angrenzende Schnitte wurden mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) gefärbt.

    EPC-Kinetik-Assay durch Zellkultur und Durchflusszytometrie

    PB-MNCs und BM-MNCs, die vor der Extremitätenischämieoperation und an den Tagen 3 und 7 nach der Extremitätenischämie erhalten wurden, wurden isoliert und mit EGM2-MV wie zuvor beschrieben kultiviert. 21,22 Nach 4 Tagen Kultur wurden EPCs durch Aufnahme von DiI-Ac-LDL und Bindung von FITC-BS-1-Lectin identifiziert. 23

    EPC-Populationen in BM-MNCs und PB-MNCs wurden mit FACS mit FITC-markiertem anti-Sca-1-mAb und PE-markiertem anti-flk-1-mAb (BD Bioscience) weiter analysiert. Als Negativkontrollen wurden 22 Isotyp-angepasste IgGs verwendet. Immunfluoreszenz-markierte Zellen wurden mit FACS und Cell Quest Software analysiert, wobei 10 000 Ereignisse pro Probe gezählt wurden. 24 Darüber hinaus untersuchten wir, ob die EPC-Kinetik durch die Blockierung von SDF-1 nach ADRC-Implantation in ischämische Gewebe beeinflusst wird. Einige Mäuse erhielten intraperitonealen anti-SDF-1-neutralisierenden mAb (50 μg R&D-System) oder unspezifisches Ratten-IgG wie oben beschrieben.

    Statistiken

    Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wurde mit ungepaartem Student . bewertet T Test zum Vergleich zwischen 2 Mittelwerten und ANOVA zum Vergleich zwischen 3 Gruppen. Werte von P<0,05 bezeichnet statistische Signifikanz.

    Ergebnisse

    Charakterisierung von kultivierten ADRCs

    ADRCs sahen aus wie fibroblastenähnliche Anheftungszellen und waren kulturexpandierbar (ergänzende Abbildung IAa und IAb). Diese Zellen konnten unter adipogenem Differenzierungsmedium mit hoher Glucosekonzentration zu reifen Adipozyten (MA) differenzieren. Die Differenzierung von ADRCs in MAs wurde durch mikroskopische Beobachtung intrazellulärer Lipidtröpfchen und positiver Färbung mit Oil Red O bestätigt (ergänzende Abbildung IAc und IAd).

    Die Immunzytochemie zeigte, dass diese adhärenten Zellen positiv für α-SMA waren (ergänzende Abbildung IAe), aber Zellen, die in endothelialem Differenzierungsmedium (EGM2-MV) kultiviert wurden, waren negativ für CD31 (ergänzende Abbildung IAf), DiI-acLDL-Einbau und FITC-BS1-Lectinbindung (Ergänzende Abbildung IAg), was darauf hinweist, dass der Zustand der EGM2-Endothelkultur nicht dazu führen konnte, dass ADRCs in die Endothellinie differenzieren. Darüber hinaus war die FACS-Analyse von kulturexpandierten ADRCs positiv für Sca-1, aber nicht für CD31, CD34, c-kit, Lin und flk-1, Marker differenzierter Zellen (ergänzende Abbildung IAh).

    Angiogene Zytokinproduktion durch ADRCs

    Als nächstes untersuchten wir die Expression von VEGF- und SDF-1-mRNAs in kultivierten ADRCs und MAs durch Echtzeit-RT-PCR. Die Menge an VEGF-mRNA von ADRCs unterschied sich nicht signifikant von der von MAs. Allerdings war die Häufigkeit von SDF-1-mRNA von ADRCs signifikant größer (2,7-fach, n=4, P< 0,01) als die von MAs (Fig. 1A). Um dann zu untersuchen, ob ADRCs SDF-1α- und VEGF-Proteine ​​sezernieren, führten wir einen ELISA-Test in kulturkonditionierten Medien durch. Obwohl die Konzentrationen von VEGF in konditioniertem Medium aus ADRCs keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zu denen von MAs zeigten, waren die Konzentrationen von SDF-1α in konditionierten Medien aus ADRCs signifikant höher (5,4-fach, n=4, P< 0,01) als die von MAs (Fig. 1B). Diese Daten stimmten mit denen der mRNA-Expression überein.

    Abbildung 1. A, adipogene Induktion reduzierte signifikant die SDF-1-mRNA, jedoch nicht die VEGF-mRNA, die durch quantitative RT-PCR bestimmt wurde. B, Sekretion von SDF-1&agr; und VEGF durch kultivierte ADRCs signifikant reduziert durch adipogene Induktion. (ADRCs ohne adipogene Induktion schwarze Säulen, ADRCs mit adipogenen Induktion weiße Säulen).

    Steigerung der Ischämie-induzierten Neovaskularisation durch ADRC-Implantation

    Wir untersuchten, ob die In-vivo-Implantation von ADRCs die Ischämie-induzierte Angiogenese unter Verwendung eines Mausmodells der Ischämie der Hinterbeine verstärken könnte. Repräsentative Bilder des Laser-Doppler-Blutperfusionsbildsystems (LDPI) sind in der ergänzenden Abbildung IIA gezeigt. In der ischämischen Extremität von ADRCs-implantierten Mäusen wurde im Vergleich zu Kontroll- oder MAs-implantierten Mäusen ein höherer Grad an Blutperfusion beobachtet. 2A zeigt zusammengefasste Daten des LDPI-Verhältnisses von ischämischer/normaler Hintergliedmaße. Obwohl in der Gruppe mit implantierten ADRCs eine deutliche Erholung der Blutperfusion beobachtet wurde, blieb das LDPI-Verhältnis in den anderen 2 Gruppen niedrig (*P<0.05,P< 0,01 gegenüber Kontrolle). Interessanterweise zeigte die Erholung des Blutflusses bei Mäusen der MA-implantierten Gruppe eine schwächere Erholung des LDPI-Verhältnisses im Vergleich zu Kontrolltieren, denen Kochsalzlösung injiziert wurde.

    Figur 2. Die Implantation von ADRCs verstärkte die Ischämie-induzierte Angiogenese. A: Die quantitative Analyse des Blutflusses in der ischämischen Hintergliedmaße wurde als das LDPI-Verhältnis der ischämischen/nichtischämischen Hintergliedmaße ausgedrückt. (*P<0.05,P< 0,01 vs. Kontrolle) B, Quantitative Analyse des Kapillar/Muskelfaser-Verhältnisses.

    Wir haben auch die Kapillardichte in histologischen Schnitten gemessen, die aus den ischämischen Geweben entnommen wurden. Repräsentative Mikrophotographien sind in der ergänzenden Abbildung IIB gezeigt. Die quantitative Analyse ergab, dass die Kapillardichte an der ischämischen Skelettmuskulatur in der ADRCs-Gruppe im Vergleich zu den anderen 2 Gruppen signifikant höher war (n=5 für jede Gruppe, *P<0.05, **P< 0,01 gegenüber der Kontrolle (Fig. 2B). Auch hier war die Kapillardichte in der MA-implantierten Gruppe niedriger als in der Kontrollgruppe (Abbildung 2B), was mit den Daten des LDPI-Verhältnisses übereinstimmt.

    Auswirkungen der ADRC-Implantation auf zirkulierende und BM-EPCs im Hintergliedmaßen-Ischämiemodell

    Um die EPC-Kinetik zu beurteilen, führten wir einen Kulturassay von PB- und BM-MNCs durch Doppelfärbung auf DiI-acLDL-Einbau und BS-1-Lectin-Bindung durch. Repräsentative Bilder von kultivierten EPCs sind in ergänzender Abbildung IIIA gezeigt. Am postoperativen Tag 3 wurde in der ADRC-Gruppe eine größere Anzahl von EPCs im BM beobachtet als in der Kontrollgruppe (2,8-fache Zunahme in der ADRC-Gruppe gegenüber 1,7-fache Zunahme in der Kontrollgruppe, n=6 für jede Gruppe, P<0,05 Abbildung 3A links). In der PB erhöhte sich die Anzahl der EPCs an den Tagen 3 und 7 (1,6-facher Anstieg an Tag 3 in der ADRCs-Gruppe gegenüber 1,2-facher Anstieg an Tag 3 in der Kontrollgruppe, P< 0,01- und 2,7-fache Zunahme an Tag 7 in der ADRC-Gruppe gegenüber 1,6-fache Zunahme an Tag 7 in der Kontrollgruppe, n = 6 bis 8 für jede Gruppe, P<0,05 Abbildung 3A rechts). Diese Ergebnisse wurden durch die Daten der FACS-Analyse von BM- und PB-Proben bestätigt, die zu gleichen Zeitpunkten gesammelt wurden, was darauf hindeutet, dass die Anzahl der Sca-1 + /Flk-1 + -Zellen bei den mit ADRCs implantierten Mäusen durchweg größer war als bei den mit PBS behandelten Tiere (Abbildung 3B). Repräsentative Bilder der FACS-Analyse sind in ergänzender Abbildung IIIB gezeigt.

    Figur 3. Quantitative Analyse von EPCs in BM und zirkulierendem PB durch Kulturassay (A: weiße Säule der Kontrollgruppe, schwarze Säule der ADRCs-Gruppe) und Durchflusszytometrie (B, *P<0.05,P<0.01). Die Zahl der von BM zu PB mobilisierten EPCs stieg durch die Implantation von ADRCs.

    Implantierte ADRCs steigern die Sekretion angiogener Zytokine aus ischämischem Gewebe

    Wir untersuchten, ob die ADRC-Implantation die SDF-1- und VEGF-mRNA-Expression in ischämischen Hinterbeinmuskeln hochreguliert. Am postoperativen Tag 3 erhöhte sich die SDF-1-mRNA-Abundanz signifikant (2,8-fach, n = 7 bis 8 für jede Gruppe, P<0,05) in der ADRCs-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 4A links). An den Tagen 3 und 7 stieg die VEGF-mRNA-Abundanz ebenfalls signifikant an (1,6-fach, n = 7 bis 8 für jede Gruppe, P<0,01) in der ADRCs-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 4A rechts). Plasma-SDF-1α (n=4 bis 5 für jede Gruppe, P<0.01) und VEGF (n=4 bis 5 für jede Gruppe, P<0,01) Proteinspiegel waren auch an Tag 3 in der ADRCs-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht ( 4B ). Um zu bestätigen, ob implantierte ADRCs SDF-1- oder VEGF-Proteine ​​in den ischämischen Geweben sezernieren, wurden Gefrierschnitte aus ischämischen Geweben von Mäusen, die von GFP-transgenen Mäusen abgeleitete ADRCs erhielten, mit Anti-SDF-1- oder Anti-VEGF-mAbs gefärbt. Einige dieser Zellen waren am Tag 3 in den ischämischen Geweben positiv für SDF-1 (ergänzende Abbildung IVA). Obwohl die meisten dieser Zellen VEGF-negativ waren, wurde VEGF im Zytoplasma von Skelettmuskelfasern in der Nähe von GFP-positiven Zellen in den ischämischen nachgewiesen Muskeln (ergänzende Abbildung IVB). Die Anzahl der Zellen, die entweder für SDF-1 oder VEGF positiv gefärbt waren, war in der Kontrollgruppe im Vergleich zur ADRCs-Gruppe signifikant niedriger (ergänzende Abbildungen IVA und IVB).

    Figur 4. A, Expressionen von SDF-1 (links) und VEGF (rechts) mRNA, bestimmt durch Echtzeit-RT-PCR in den Kontrollgruppen (weiße Säulen) und ADRCs (schwarze Säulen), die relativ zum Ausgangswert (Tag 0) exprimieren. B, Plasmakonzentrationen von SDF-1α (links) und VEGF (rechts), gemessen in den Kontrollgruppen (weiße Säulen) und ADRCs (schwarze Säulen) durch ELISA.

    Lokalisation implantierter ADRCs in der chronischen Phase

    Wir untersuchten, ob in vivo implantierte ADRCs überleben und sich in der chronischen Phase in ECs differenzieren könnten, indem wir Mäuse verwenden, die von GFP-transgenen Mäusen abgeleitete ADRCs erhielten. GFP-positive Zellen wurden im ischämischen Bereich am 28. postoperativen Tag gefunden (ergänzende Abbildung VA) und einige dieser Zellen schienen in Rhodamion-BS-1-Lectin-positiven Kapillaren eingebaut zu sein. (Ergänzungsbild VB und VC). Die Immunfluoreszenz-Färbung zeigte, dass einige der GFP-positiven Zellen in der Nähe von Gefäßstrukturen und Kapillaren, die mit CD31 gefärbt waren (ergänzende Abbildung VD), und einige dieser Zellen mit Anti-CD31 gefärbt waren (ergänzende Abbildung VE). Außerdem waren diese Zellen positiv für CD 140b, einen Perizytenbildner (Ergänzungsabbildung VF). Diese Ergebnisse zeigten, dass implantierte ADRCs zumindest teilweise als Perizyten in der chronischen Phase zur Gefäßbildung beitragen könnten. Darüber hinaus konnten wir bei transplantierten Tieren bis mindestens Tag 60 (n=3, Daten nicht gezeigt) keine Tumorbildung nachweisen.

    SDF-1α ist für die implantationsinduzierte Neovaskularisation von ADRCs erforderlich

    Die intraperitoneale Injektion eines anti-SDF-1-neutralisierenden mAb unterdrückte die durch die ADRC-Implantation vermittelte Angiogenese signifikant auf das Niveau, das Tieren ohne ADRCs entsprach. Repräsentative Bilder von LDPI sind in der ergänzenden Abbildung VA gezeigt. Das LDPI-Verhältnis zeigte, dass die Erholung des Blutflusses durch die Anti-SDF-1-mAb-Behandlung signifikant unterdrückt wurde (n=4 bis 5, *P<0.05,P< 0,01 gegenüber der Kontrolle (Fig. 5A). Darüber hinaus reduzierte der Anti-SDF-1-mAb die Zahl der zirkulierenden EPCs am 7. postoperativen Tag signifikant, wie durch einen Kulturtest und eine FACS-Analyse festgestellt wurde (n = 5 bis 7 für jede Gruppe, *P<0.05,P< 0,01 gegenüber der Kontrolle (Fig. 5B).

    Abbildung 5. A, Quantitative Analyse des LDPI-Verhältnisses nach Implantation von ADRCs mit anti-SDF1mAb, Implantation von ADRCs mit Kontrollratten-IgG und PBS mit anti-SDF1mAb (*P<0.05,P<0,01 vs. Kontrolle). B, Quantitative Analyse von EPCs in zirkulierendem PB durch Kulturassay (links) und FACS-Analyse (rechts).

    Diskussion

    Die wichtigsten Ergebnisse der vorliegenden Studie sind wie folgt: (1) Kultivierte ADRCs exprimierten in vitro mesenchymale Marker, aber keine endothelialen Linienmarker. (2) ADRCs konnten sich in reife Adipozyten (MAs) differenzieren, aber diese Zellen führten in vitro weder zu EPCs noch zu reifen ECs. (3) Die direkte lokale Implantation von ADRCs, aber nicht von MAs in ischämische Hintergliedmaßenmuskeln steigerte die Neovaskularisation signifikant. Die angiogene Wirkung von ADRCs wurde durch eine anti-SDF-1-neutralisierende mAb-Behandlung deutlich unterdrückt. Schließlich (4) erhöhte die ADRC-Implantation die SDF-1-Freisetzung aus ischämischen Geweben, wodurch EPCs in vivo mobilisiert wurden.

    Fettgewebe umfasst hauptsächlich 2 Klassen von Zellpopulationen: eine sind reife Adipozyten (MAs) und die andere sind Stromazellen, die als „stromale vaskuläre Fraktion“ (SVF) bezeichnet werden. Studien haben gezeigt, dass SVF multipotente mesenchymale Zellen enthält, die sich in verschiedene Zelllinien wie Fibroblasten, Perizyten, Osteoblasten und Myozyten differenzieren. 16 Wir haben zuvor gezeigt, dass ADRCs aus kleinen Mengen menschlichen subkutanen Fettgewebes isoliert werden können. 15 Obwohl einige Studien berichteten, dass sich Fettzellen in ECs oder EPCs differenzieren könnten, 25,26 konnten wir in der vorliegenden Studie nicht bestätigen, dass ADRCs in endotheliale Linien differenzieren. Der Grund für diese Diskrepanz ist unbekannt, jedoch verwendeten Miranville und Mitarbeiter 26 ein Medium mit niedrigem Serumspiegel, ergänzt mit VEGF und insulinähnlichem Wachstumsfaktor-1 (IGF-1). Der Unterschied dieser Kulturbedingungen kann die Reifung von ADRCs zu ECs beeinflussen. Dennoch deutete eine kürzlich durchgeführte Studie darauf hin, dass sich menschliche ADRCs selbst unter Kultur mit EGM-2 nicht in ECs differenzieren konnten, 27 stimmt mit unseren Ergebnissen überein. Darüber hinaus konnten wir die Differenzierung von ADRCs in ECs in vivo nicht bestätigen. Implantierte ADRCs exprimierten keinen Endothel-Hersteller, aber implantierte ADRCs waren positiv für CD140b und kolokalisiert mit Gefäßen wie Perizyten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ADRCs möglicherweise nicht in der Lage sind, sich in ECs, sondern in Zellen der glatten Muskellinie zu differenzieren. In ähnlicher Weise zeigten mehrere neuere Studien, dass sich ADRCs in vitro und in vivo in Perizyten differenzierten. 28–30

    Nakagimi und Mitarbeiter und Sumi und Mitarbeiter berichteten, dass die Implantation von aus Fettgewebe stammenden Mesenchymzellen die Angiogenese über die Sekretion angiogener Zytokine induziert. 14,31 In der vorliegenden Studie fanden wir auch, dass die Implantation von ADRCs die Angiogenese in einem Mausmodell der Hinterbeinischämie signifikant steigerte. Unsere Daten zeigen, dass die Implantation von ADRCs die Angiogenese nicht durch eine endotheliale Differenzierung, sondern durch Chemokine wie SDF-1 induzierte. Interessanterweise fanden wir heraus, dass die Implantation von MAs in die Skelettmuskulatur die Angiogenese im Vergleich zu Kontrollmäusen, denen Kochsalzlösung injiziert wurde, sogar verschlechterte. Wir fanden heraus, dass ADRCs SDF-1 exprimierten und die Häufigkeit von mRNA und Protein in ADRCs signifikant größer war als in MAs. Im Gegensatz dazu unterschied sich die mRNA- und Proteinhäufigkeit von VEGF nicht zwischen ADRCs und MAs. Diese Ergebnisse legen nahe, dass von ADRCs sezerniertes SDF-1 zumindest teilweise für den Unterschied in der angiogenen Potenz zwischen ADRCs und MAs verantwortlich sein kann. 32 Darüber hinaus zeigten neuere Studien, dass MAs andere Adipozytokine freisetzen, darunter Tumornekrosefaktor (TNF)-α und Interleukin (IL)-6. Diese potenziell schädlichen inflammatorischen Zytokine könnten die Angiogenese durch MA-Implantation, die in der vorliegenden Studie beobachtet wurde, negativ beeinflusst haben. 28

    SDF-1 ist ein Mitglied von CXC-Chemokinen, die ursprünglich aus murinen BM-Stromazellen isoliert wurden. 33 CXCR4 ist der Rezeptor für SDF-1 und ein Korezeptor für die HIV-Typ-1-Infektion. 34 Die Wechselwirkung von SDF-1/CXCR4 reguliert mehrere physiologische Prozesse, einschließlich der Embryonalentwicklung und der Organhomöostase. Interessanterweise gilt SDF-1 als einer der wichtigsten Regulatoren des Handels mit EPCs von BM in PB. 19 Somit wurde gezeigt, dass SDF-1 die Neovaskularisation durch Beschleunigung der EPC-Rekrutierung in ischämische Gewebe verstärkt. 19,32 Darüber hinaus ist VEGF eines der leistungsstarken angiogenen Zytokine, das EPCs aus dem KM mobilisieren und die EPC-Apoptose hemmen kann. 18,23 Im ischämischen Hinterbeinmodell der Maus hängt die VEGF-A-vermittelte Angiogenese teilweise von der Aktivierung des SDF-1–CXCR4-Signalwegs ab. 35,36 Zusammengenommen spielt SDF-1 eine zentrale Rolle für die Zelltherapie-vermittelte Angiogenese. Tatsächlich wurden die therapeutische Wirksamkeit und die Mobilisierung von EPCs der ADRC-Implantation durch i.p. Injektion eines anti-SDF-1 neutralisierenden mAb in der vorliegenden Studie.

    In Bezug auf klinische Studien zur Angiogenese haben wir über die Sicherheit und Effizienz der therapeutischen Angiogenese mit autologen BM-MNCs (TACT) berichtet. 6 Es gibt jedoch einige Patienten, die auf dieses Verfahren nicht gut ansprechen. 7 Zeiher und Mitarbeiter zeigten, dass EPC-Mobilisierung und -Funktionen bei Patienten mit ischämischer Kardiomyopathie im Vergleich zu nicht-ischämischen Patienten reduziert waren, 9,12 was darauf hindeutet, dass die Implantation von autologen BM-Zellen für die Angiogenese möglicherweise nur begrenzt wirksam ist. Unsere aktuelle Studie zeigt, dass autologe ADRCs gute Alternativen zu BM oder zirkulierenden Vorläuferzellen sind, um Angiogenese zu induzieren.

    Original eingegangen am 7. März 2008 endgültige Fassung angenommen 15. Oktober 2008.


    Diskussion

    Hier präsentieren wir eine breit anwendbare Toolbox, CellTag Indexing, um biologische Proben für die Einzelzellanalyse zu kennzeichnen, wobei jede Probe mit einem vordefinierten lentiviralen GFP-Barcode genetisch markiert wird, um ihre Probenidentität zu markieren. Wir zeigen, dass die CellTag-Indexierung die Zellphysiologie nicht stört, und validieren den Nutzen unseres Multiplexing-Ansatzes über das Mischen von Spezies und zeigen, dass er verwendet werden kann, um Proben für scRNA-seq genau zu multiplexen, mit anschließendem Demultiplexen mit hoher Effizienz. Wir demonstrieren die einzigartige Eigenschaft dieses erblichen Markierungsansatzes, indem wir Zellen in einer kompetitiven In-vivo-Transplantationsumgebung verfolgen, das reprogrammierte Zellpotenzial und die Mechanismen der Transplantation aufdecken und gleichzeitig interne Kontrollen bereitstellen, um sowohl biologische als auch technische Batch-Effekte zu mildern. CellTag-Multiplexing ist komplementär zu aktuellen Strategien, die auf transienten Zelloberflächeninteraktionen zur Markierung von Zellen unmittelbar vor der scRNA-seq basieren, jedoch einzigartig, da CellTag-Barcodes stabil integriert und durch Zellteilung vererbbar sind. Das flexible Timing der lentiviralen Barcode-Transduktion, gepaart mit einer stabilen Barcode-Expression, macht unser System einzigartig geeignet für Langzeit-Tracing-Experimente und Transplantationsmodelle, bei denen temporäre Tags nicht zurückgehalten werden.

    CellTag Indexing bietet die Vorteile einer minimierten technischen Variation durch experimentelles Design, die Möglichkeit, biologische Proben für eine kompetitive Transplantation zu multiplexen, eine breite Kompatibilität mit verschiedenen Zelltypen und Einzelzelltechnologien, eine langfristige Barcode-Expression, einen optimierten Workflow und eine optimierte Bibliotheksvorbereitung, reduzierte Sequenzierungskosten und direktes Demultiplexen. CellTag Indexing wurde für breite Anwendungen entwickelt. Die Verwendung von Lentiviren als Markierungsmethode stellt ein häufig verwendetes und zugängliches biologisches Werkzeug mit minimalen Einrichtungskosten und minimalen Reagenzienanforderungen dar. Da Lentivirus sowohl sich teilende als auch sich nicht teilende Zellen transduzieren kann, können CellTag-Barcodes in eine Vielzahl von Zelltypen eingeführt werden. Um die Effizienz der Etikettierung zu schätzen, verwendet CellTag Indexing GFP bequem als Barcode-Träger, der als visuelle Anzeige für die Transduktionseffizienz dienen kann. Im Allgemeinen werden CellTag-Transkripte reichlich exprimiert und können optional während der Bibliotheksherstellung amplifiziert werden, um die Nachweisrate weiter zu erhöhen.

    Wichtig ist, dass CellTag-Transkripte aus dem Zellkern gewonnen werden können, was diesen Ansatz auf die Einzelkern-RNA-Sequenzierung ausdehnt. Darüber hinaus können Zellen, die mit CellTag-Indizes markiert sind, kultiviert und in Experimenten verwendet werden, bevor sie zur Sequenzierung entnommen werden, zum Beispiel in dem hier demonstrierten kompetitiven Transplantat-Assay, bei dem markierte Proben als interne Kontrollen füreinander fungieren, um unerwünschte biologische Variationen zu minimieren. Dies ist komplementär zu bestehenden Markierungsverfahren, die Zell-/Kernoberflächenchemie oder transiente Transfektion für die temporäre Markierung verwenden [7,8,9,10,11,12], bei denen die Markierungen in vitro und in vivo nach und nach verloren gehen würden. Darüber hinaus erwarten wir als zukünftige Anwendung, dass das CellTag-Multiplexing mit Einzelgenom-basierten Assays wie Einzelzell-ATAC-seq. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CellTag Indexing ein breit anwendbares Werkzeug ist, das bestehende Methoden zum Multiplexing und Tracking von Zellen ergänzt und ein vielfältiges Spektrum an experimentellen und analytischen Strategien bietet.


    Ein Leitfaden für Anfänger zur Analyse von RNA-Sequenzierungsdaten

    Seit den ersten Veröffentlichungen, die den Begriff prägten RNA-seq (RNA-Sequenzierung) im Jahr 2008 erschien, ist die Zahl der Veröffentlichungen mit RNA-seq-Daten exponentiell gewachsen und erreichte 2016 mit 2.808 Veröffentlichungen ein Allzeithoch (PubMed). Bei dieser Fülle von RNA-seq-Daten, die generiert werden, ist es eine Herausforderung, die maximale Bedeutung aus diesen Datensätzen zu extrahieren, und ohne die entsprechenden Fähigkeiten und den entsprechenden Hintergrund besteht die Gefahr einer Fehlinterpretation dieser Daten. Ein allgemeines Verständnis der Prinzipien, die jedem Schritt der RNA-Seq-Datenanalyse zugrunde liegen, ermöglicht es Forschern jedoch ohne Vorkenntnisse in Programmierung und Bioinformatik, ihre eigenen Datensätze sowie veröffentlichte Daten kritisch zu analysieren. Unser Ziel in diesem Review ist es, die Schritte einer typischen RNA-seq-Analyse aufzuschlüsseln und die Fallstricke und Kontrollpunkte auf dem Weg aufzuzeigen, die für Laborwissenschaftler und biomedizinische Forscher, die Experimente mit RNA-seq durchführen, von entscheidender Bedeutung sind.

    Die RNA-Sequenzierung (RNA-seq) wurde erstmals 2008 eingeführt (1–4) und hat in den letzten zehn Jahren aufgrund der sinkenden Kosten und der Popularisierung von Sequenzierungskernen mit gemeinsam genutzten Ressourcen an vielen Forschungseinrichtungen immer mehr Verbreitung gefunden. Die zunehmende Popularität von RNA-seq hat zu einem schnell wachsenden Bedarf an Bioinformatik-Know-how und Rechenressourcen geführt. Damit Laborwissenschaftler große Datensätze korrekt analysieren und verarbeiten können, müssen sie die bioinformatischen Prinzipien und Einschränkungen verstehen, die mit dem komplexen Prozess der RNA-Seq-Analyse einhergehen. Obwohl die RNA-Seq-Analyse unglaublich leistungsstark sein kann und viele aufregende neue Erkenntnisse aufdecken kann, unterscheidet sie sich von den üblichen Analysebank-Wissenschaftlern darin, dass sie einen sehr großen Datensatz darstellt, der ohne umfassende Analyse nicht interpretiert werden kann.

    Das Protokoll von RNA-seq beginnt mit der Umwandlung von RNA, entweder total, an mRNA angereichert oder an rRNA verarmt, in cDNA. Nach Fragmentierung, Adapterligation und Indexligation wird jedes cDNA-Fragment anschließend mit einer Hochdurchsatzplattform sequenziert oder „gelesen“. Die gelesenen Rohdaten werden dann demultiplexiert, ausgerichtet und Genen zugeordnet, um eine Rohzähltabelle zu erstellen. An diesem Punkt werden die Daten oft an den Laborforscher übergeben, um seine eigene Analyse zu starten. Es besteht noch kein wirklicher Konsens über die am besten geeignete Pipeline für die RNA-seq-Datenverarbeitung, jedoch stehen zahlreiche halbautomatische Online-Tools wie BaseSpace (Illumina), MetaCore (Thomson Reuters) oder Bluebee (Lexogen) zur Verfügung. Obwohl diese Tools ohne die Hilfe eines Bioinformatikers Plots der Hauptkomponentenanalyse (PCA) erstellen, Heatmaps anzeigen und differenzielle Genexpressionsanalysen durchführen, ermöglichen sie es den Benutzern nicht, die Qualität ihrer Daten vollständig zu beurteilen und die Genauigkeit ihrer eigenen Analyse zu bestimmen , und passen Sie die Analyse an ihre biologische Fragestellung an, was zu einer Fehlinterpretation des Datensatzes führen kann. Es ist wichtig, dass die Ermittler verstehen, wie sie mit ihrem Datensatz umgehen, die Eigenschaften ihres Datensatzes schätzen und auf Schwachstellen in den Daten achten, die die Fähigkeit, Schlussfolgerungen zu ziehen, einschränken können. Darüber hinaus ist es zwingend erforderlich, dass jeder Datensatz analysiert wird de novo, in dem Sinne, dass Schwellenwerte und Methoden neu angepasst werden müssen, was mit generischen Online-Apps oder -Tools nicht erreicht werden kann.

    Für die Zwecke dieses Methodenpapiers haben wir einen Beispieldatensatz aus einem Experiment innerhalb unserer Forschungsgruppe verwendet, in dem naive murine alveoläre Makrophagen mit denen verglichen wurden, die 2 und 24 Stunden nach der Reperfusion aus transplantierten Lungen isoliert wurden. Wir präsentieren unsere Analyse mit diesem Datensatz, um einen benutzerfreundlichen Ansatz für die RNA-Seq-Analyse für einen Laborwissenschaftler zu beschreiben.

    Männlich Cx3cr1 gfp/+ Es wurden Mäuse auf einem C57BL/6-Hintergrund und Wildtyp-BALB/c-Mäuse im Alter von 12–14 Wochen verwendet. Alle Mäuse wurden in einer speziellen pathogenfreien Einrichtung untergebracht. Alle Reagenzien wurden vom Hersteller als endotoxinfrei zertifiziert. Alle Studien wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Animal Care and Use Committee der Northwestern University durchgeführt.

    Transplantationen wurden zwischen allogenen fehlgepaarten Spender-Empfänger-Paaren durchgeführt, wie zuvor beschrieben (5). Insbesondere Spenderlungen von Cx3cr1 gfp/+ Mäuse wurden als Allotransplantate verwendet und in Wildtyp-BALB/c-Empfänger implantiert. Kurz gesagt, Spendermäuse wurden heparinisiert und antegrad durch die Pulmonalarterie gespült, die Trachea wurde ligiert, nachdem die Lungen rekrutiert wurden, und dann wurde der Herz-Lungen-Block geerntet und bei 4°C für einen Zeitraum von 2 Stunden kalter Ischämie gehalten. Anastomosen für die einzelne linke Lungentransplantation wurden unter Verwendung der Manschettentechnik durch eine linke Thorakotomie durchgeführt, die Lunge wurde reperfundiert und rekrutiert und dann wurde die Thorakotomie schichtweise verschlossen. Mäuse wurden vom Beatmungsgerät entwöhnt und während der Genesung extubiert, sobald sie gehfähig waren. Zu bestimmten Zeitpunkten nach der Reperfusion wurden die Empfängermäuse getötet und das Lungenallotransplantat wurde geerntet.

    Lungen wurden wie zuvor beschrieben (5) für Einzelzellsuspensionen verarbeitet. Kurz gesagt wurde der rechte Ventrikel mit 10 ml eiskalter Hanks-Balance-Salzlösung gespült, dann wurden die Lungen mit einer Gewebeverdauungsmischung, die Kollagenase D (Roche) und DNase I (Roche) enthielt, infiltriert. Es wurde eine Kombination aus mechanischer Dissoziation unter Verwendung des GentleMACS (Miltenyi Biotec) und enzymatischer Verdauung bei 37 °C für 30 Minuten durchgeführt. Die Proben wurden dann vor der Antikörperfärbung mit CD45-Mikrokügelchen (Miltenyi Biotec) und dem AutoMACS-System (Miltenyi Biotec) angereichert.

    Sehen Tabelle E1 in der Datenergänzung für Antikörper und Verdünnungen zur Färbung von Einzelzellsuspensionen und Abbildung E1 für die Gating-Strategie zur Sortierung von Alveolarmakrophagen. Die Zellen wurden in magnetisch aktivierten Zellsortierungspuffer bei 4 °C unter Verwendung eines BD FACSAria II SORP-Vierlaser-Durchflusszytometers (BD Biosciences) sortiert.

    Frisch sortierte Zellen wurden sofort pelletiert, in 100 µl PicoPure Extraktionspuffer (Thermo Fisher Scientific) resuspendiert und dann bei –80°C gelagert. Die RNA-Isolierung wurde mit dem PicoPure RNA-Isolierungskit (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt, und Proben mit hochwertiger RNA (RNA-Integritätszahl, >7,0), gemessen mit der 4200 TapeStation (Agilent Technologies), wurden für die Bibliotheksvorbereitung verwendet. Die mRNA wurde aus der Gesamt-RNA unter Verwendung von NEBNext Poly(A)-mRNA-Magnetisolationskits (New England BioLabs) erhalten, und cDNA-Bibliotheken wurden anschließend unter Verwendung des NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit für Illumina (New England BioLabs) hergestellt. Bibliotheken wurden auf einer NextSeq 500-Plattform unter Verwendung eines 75-Zyklus-Single-End-High-Output-Sequenzierungskits (Illumina) sequenziert. Die Sequenzierung ergab Bibliotheken mit einer durchschnittlichen Größe von 8 Millionen Reads nach dem Alignment. Die RNA-Seq-Analyse basierte auf eindeutig ausgerichteten Reads.

    Reads wurden demultiplexiert (bcl2fastq), und fastq-Dateien wurden auf das mm10-Maus-Genom (TopHat2 [6]) ausgerichtet und unter Verwendung der Ensembl-Genannotation auf Gene (HTSeq [7]) kartiert. Paarweise Vergleiche zwischen den verschiedenen Bedingungen wurden unter Verwendung eines negativen binomialen generalisierten log-linearen Modells durch die glmLRT-Anpassungsfunktion in edgeR durchgeführt (8, 9).

    Die in diesem Artikel berichteten RNA-Seq-Daten wurden im Gene Expression Omnibus (GEO) des NCBI hinterlegt und sind über die Zugangsnummer GSE116583 der GEO-Serie zugänglich.

    Ein wesentliches Ziel der RNA-Seq-Analyse ist es, differentiell exprimierte und koregulierte Gene zu identifizieren und die biologische Bedeutung für weitere Studien abzuleiten. Ausgangsmaterial können Zellen sein, die kultiviert werden in vitro, Ganzgewebehomogenate oder sortierte Zellen. Die Fähigkeit, Ergebnisse zu interpretieren, hängt von einem geeigneten experimentellen Design, der Implementierung von Kontrollen und einer korrekten Analyse ab. Es sollten alle Anstrengungen unternommen werden, um den Batch-Effekt zu minimieren, da kleine und unkontrollierte Veränderungen in einer Umgebung zur Identifizierung von differentiell exprimierten Genen (DEGs) führen können, die nicht mit dem entworfenen Experiment zusammenhängen. Ursachen für Batch-Effekte können während des Experiments, während der Vorbereitung der RNA-Bibliothek oder während des Sequenzierungslaufs auftreten und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die in Tabelle 1 aufgeführten Der Datensatz ermöglicht eine Qualitätskontrolle, gefolgt von einer unvoreingenommenen Analyse der Daten. In der vorliegenden Analyse verwenden wir einen Ansatz, der das Einstellen von Low-Count-Filtern, das Festlegen eines Rauschschwellenwerts, das Prüfen auf potenzielle Ausreißer, die Durchführung geeigneter statistischer Tests zur Identifizierung von DEGs, das Clustern von Genen nach Expressionsmustern und das Testen auf Genontologie (GO)-Anreicherung umfasst . Für jede dieser Analysekomponenten möchten wir wichtige Kontrollpunkte und Qualitätskontrollen hervorheben, die die Datenanalyse rationalisieren und stärken, Verzerrungen vermeiden und es den Ermittlern ermöglichen, ihre Datensätze maximal zu nutzen.

    Tabelle 1. Ursachen von Batch-Effekten und vorgeschlagene Strategien zu deren Abschwächung

    Für dieses Tutorial verwenden wir einen Datensatz, der drei Gruppen von alveolären Makrophagen umfasst, die in einem Mausmodell der Lungentransplantation während der ersten 24 Stunden der Reperfusion untersucht wurden. Dieser Ansatz (von dem wir keinen Anspruch auf Originalität erheben und den Leser auf eine ausgezeichnete Übersicht von Conesa und Kollegen [10] verweisen, die die wichtigsten Schritte der RNA-Seq-Datenanalyse skizziert) ermöglicht es dem Forscher, die Daten auf unvoreingenommene Art und Weise zu untersuchen Bemühungen, Transkriptionssignaturen zu identifizieren und weitere nachgelagerte Analysen zu ermöglichen.

    Bei der Bewertung der Variabilität innerhalb des Datensatzes ist es vorzuziehen, dass die Variabilität zwischen den Gruppen, die Unterschiede zwischen experimentellen Bedingungen im Vergleich zu Kontrollbedingungen darstellt, größer ist als die Variabilität innerhalb der Gruppe, die die technische oder biologische Variabilität darstellt. Ein globaler Überblick über die Daten ermöglicht die Charakterisierung der Variation zwischen den Replikaten und ob die vom Prüfer definierten experimentellen Gruppen tatsächliche Unterschiede zwischen den Gruppen aufweisen (eine Gruppe ist eine Gruppe von Replikaten derselben Bedingung oder des gleichen Zelltyps). Eine Möglichkeit, die Variation in einem Datensatz zu visualisieren, ist die PCA (11). PCA nimmt einen großen Datensatz als Eingabe und reduziert die Anzahl der Gen-„Dimensionen“ auf einen minimalen Satz linear transformierter Dimensionen, die die Gesamtvariation des Datensatzes widerspiegeln. Die Ergebnisse werden üblicherweise als zweidimensionales Diagramm dargestellt, in dem die Daten entlang von Achsen visualisiert werden, die die Variation innerhalb des Datensatzes beschreiben, bekannt als Hauptkomponenten (Stck). PC1 beschreibt die meisten Variationen innerhalb der Daten, PC2 die zweitmeisten und so weiter. Die von jedem PC dargestellte Variation kann als Prozentsatz der Gesamtvarianz berechnet und durch einen Scree-Plot visualisiert werden. Wenn die ersten beiden PCs nicht den Großteil der Varianz erfassen, kann es hilfreich sein, zusätzliche zweidimensionale PCA-Plots zu erstellen, die andere PCs anzeigen. Auf diese Weise kann ein PCA-Plot helfen, die Gruppierung zwischen Replikaten zu visualisieren und technische oder biologische Ausreißer zu identifizieren.

    Ein anderer Ansatz zur Bestimmung der Variabilität zwischen und innerhalb von Gruppen besteht darin, die Distanz zu berechnen, die durch die Korrelation zwischen den Stichproben dargestellt wird. Zwei häufig verwendete Korrelationsmaße sind der Pearson-Koeffizient und der Spearman-Rangkorrelationskoeffizient (12–14), die die Richtung und Stärke der Beziehung zwischen zwei Variablen beschreiben. Die Korrelation nach Pearson spiegelt die lineare Beziehung zwischen zwei Variablen wider, die Unterschiede in ihrem Mittelwert und der Standardabweichung berücksichtigen, während die Rangkorrelation nach Spearman ein nichtparametrisches Maß ist, das die Rangwerte der beiden Variablen verwendet. Je ähnlicher die Expressionsprofile für alle Transkripte zwischen zwei Proben sind, desto höher ist der Korrelationskoeffizient. Diese Korrelationskoeffizienten werden zwischen allen Proben berechnet und können entweder als Tabelle oder als Heatmap visualisiert werden, sodass der Untersucher beurteilen kann, ob Replikate (technisch oder biologisch) zusammen gruppieren. Neben der Bewertung der Variabilität können sowohl die PCA- als auch die Stichprobenkorrelationsanalyse helfen, Ausreißer zu identifizieren, die in vorgelagerten Schritten wie dem Alignment nicht ausgeschlossen wurden. Zum Beispiel könnte eine Probe, die gut ausgerichtet ist und eine gute Lesetiefe zeigt, bis zu diesem Schritt der Pipeline gelangen, eine PCA- oder Korrelationsanalyse kann diese Bibliothek jedoch als falsch markierte oder kontaminierte Probe identifizieren, wodurch der Ausreißer innerhalb einer anderen Gruppe gruppiert wird. Es ist auch möglich, dass eine korrekt gekennzeichnete Probe als biologischer Ausreißer herausfällt, beispielsweise wenn sie von einem Tier stammt, von dem angenommen wird, dass es eine Herausforderung erhalten hat, aber keine Symptome zeigte. Zusammenfassend bieten diese Analysen einen globalen Überblick über alle Proben, ermöglichen die Bestimmung von Ausreißern und präsentieren die Daten in einem leicht verständlichen Format für Untersucher und Leser.

    Unter Verwendung unseres alveolären Makrophagen-Datensatzes zeigen wir einen PCA-Plot und eine Heatmap von Pearsons Korrelation zwischen alveolären Makrophagenproben: Probengruppen naiv, Transplantation 2 Stunden nach Reperfusion und Transplantation 24 Stunden nach Reperfusion (Abbildung 1A). Sowohl der PCA-Plot als auch die Korrelations-Heatmap nach Pearson wurden unter Verwendung von normalisierten Reads pro Kilobasen Transkript pro 1 Million Mapped Reads (RPKM)-Zählungen erstellt (sehen Feld "N ormalisierte Zählungen"). Die PCA zeigte die erwartete Gruppierung zwischen Replikaten innerhalb der Proben und Probengruppen, die über die beiden PCs verteilt waren. PC1 macht 68,1 % der Varianz aus und PC2 macht weitere 20,3 % aus. Der Screeplot (Abbildung E2) bestätigte, dass der Großteil der Varianz innerhalb des Datensatzes von den ersten beiden PCs beschrieben wurde. Obwohl das PCA-Plot die Variabilität zwischen den Gruppen betont, bietet die Korrelationsanalyse nach Pearson ( Abbildung 1B ) einen Überblick über alle Variationen zwischen den Stichproben mit einem Korrelationswert von R > 0,9 (Tabelle 2), im Einklang mit jeder Gruppe, die zum gleichen Zelltyp gehört.

    Abbildung 1. Bewertung der Variabilität zwischen und innerhalb der Gruppe. (EIN) Hauptkomponentenanalyse-Plot (PC) mit allen 12 Proben entlang PC1 und PC2, die 68,1% bzw. 20,3% der Variabilität innerhalb des Expressionsdatensatzes beschreiben. Die PC-Analyse wurde auf normalisierte (Reads pro Kilobasen Transkript pro 1 Million abgebildete Reads) und log-transformierte Zähldaten angewendet. (B) Korrelationsdiagramm nach Pearson, das die Korrelation visualisiert (R) Werte zwischen den Proben. Der Maßstabsbalken repräsentiert den Bereich der Korrelationskoeffizienten (R) angezeigt.


    Transplantation von epithelialen Stamm-/Vorläuferzellen der Atemwege: Eine Zukunft für die zellbasierte Therapie

    Die Zelltherapie hat das Potenzial, Krankheiten durch den Ersatz funktionsgestörter Zellen zu heilen. Obwohl die Gewebestammzelle (TSC) als die optimale therapeutische Zelle angesehen wird, hat die Transplantation von TSC/Vorläuferzell-Mischungen Leben gerettet. Wir haben zuvor die tracheobronchialen epithelialen TSCs der Maus gereinigt und berichtet, dass in vitro Amplifikation erzeugte zahlreiche TSCs. Diese Kulturen enthielten jedoch auch TSC-abgeleitete Vorläuferzellen und die TSC-Rereinigung durch Durchflusszytometrie beeinträchtigte die TSC-Selbsterneuerung. Diese Einschränkungen veranlassten uns zu bestimmen, ob ein TSC/Vorläuferzell-Gemisch das verletzte Atemwegsepithel wieder bevölkern würde. Wir haben ein Zelltransplantationsprotokoll entwickelt und zeigen, dass transplantierte tracheobronchiale epitheliale TSC/Vorläuferzell-Mischungen von Mäusen und Menschen 20–25% der Atemwegsepithelzellen ausmachen, aktiv zur Epithelreparatur beitragen und mindestens 43 Tage bestehen bleiben. 2 Wochen nach der Transplantation differenzierten sich TSCs/Vorläuferzellen in die drei wichtigsten Epithelzelltypen: basal, sekretorisch und mit Flimmerhärchen. Wir schließen daraus, dass eine Zelltherapie, die adulte tracheobronchiale TSCs/Vorläuferzellen verwendet, eine wirksame therapeutische Option ist.

    Die in dieser Studie präsentierten Daten stützen die Schlussfolgerung, dass eine Zelltherapie mit adulten tracheobronchialen Gewebestamm-/Vorläuferzellen eine wirksame therapeutische Option ist.

    Die Zelltherapie für chronische Erkrankungen wird wahrscheinlich die Transplantation einer Zelle erfordern, die ein umfangreiches Mitose- und Differenzierungspotential besitzt. Eine Gewebestammzelle (TSC) ist ein Vorläufer-Subtyp, der sich selbst erneuert (sich selbst ersetzt) ​​und jeden der im Heimatgewebe des TSC gefundenen Zelltypen erzeugt (wirkt als multipotenter Vorläufer) (1). Daher konzentrieren sich Zelltherapieinitiativen häufig auf TSCs.

    Funktionsanalysen unserer Gruppe und anderer zeigten, dass das tracheobronchiale Epithel der adulten Maus durch ein TSC erhalten und repariert wird (2–9). Wir berichteten, dass der tracheobronchiale epitheliale TSC der Maus ein CD49f Bright /Sca1 + /Aldefluor Bright-Basalzellsubtyp ist (3). Diese TSCs sind äußerst selten: Es gibt ungefähr 100 TSCs pro Atemweg und TSCs machen nur 0,05% aller Epithelzellen aus.

    Wir berichteten auch, dass die tracheobronchialen TSCs der Maus einen einzigartigen Klontyp, den Randklon, erzeugten, wenn sie kultiviert wurden in vitro (2,3). Die TSC-Kultur als Rim-Klone ermöglichte die TSC-Amplifikation und bewahrte die TSC-Selbsterneuerung und das multipotente Differenzierungspotential, die funktionellen Eigenschaften, die von einer therapeutischen Zelle benötigt werden. Jedoch enthielten TSC-abgeleitete Randklone auch nicht-TSC basale Vorläuferzellen, und die Wiederreinigung amplifizierter TSCs aus Randklonen durch Fließsortierung beeinträchtigte die TSC-Selbsterneuerung, wie durch Klonbildung untersucht. Diese Einschränkungen führten zu der Frage, ob eine Zelltherapie mit einem TSC/Vorläufer-Inokulum durchführbar ist.

    Der Zweck dieser Studie war es, die Hypothese zu testen, dass eine Mischung aus adulten TSCs/Vorläuferzellen das Atemwegsepithel nach einer Verletzung wieder bevölkern würde. Wir berichten über die erfolgreiche Entwicklung eines Transplantationsassays, der ein gut charakterisiertes Modell für epitheliale Verletzung/Reparatur verwendet. Mit diesem Modell zeigen wir, dass Maus-TSCs/Vorläuferzellen das leitende Atemwegsepithel von Mäusen nach der Transplantation rekonstituieren und eine Multiliniendifferenzierung aufweisen. Wir übertragen diese Ergebnisse auf den Menschen, indem wir zeigen, dass auch unfraktionierte humane basale Vorläuferzellen als wirksame Form der Zelltherapie eingesetzt werden können.

    Vollständige Methoden finden Sie im Online-Supplement.

    Alle Verfahren, die die Verwendung von Tieren beinhalten, wurden vom National Jewish Health (Denver, CO) Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Die Mäuse wurden in einer von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care anerkannten Einrichtung gehalten und vierteljährlich auf Krankheitserreger untersucht. Die Stämme variierten durch das Experiment und werden nachfolgend hier detailliert beschrieben.

    Naphthalin (NA) wurde wie zuvor berichtet hergestellt und verabreicht (10). Die NA-Dosis wurde so ausgewählt, dass sie bis zum Erholungstag 3 eine Erschöpfung des Clara-Zell-Sekretorischen Proteins (CCSP) + der Zellpopulation von mehr als 95 % verursachte.

    Weibliche FVB/n-Mäuse, 6–8 Wochen alt, wurden mit NA behandelt. An den Erholungstagen 6, 40 und 80 wurden Trachealepithelzellen durch Dispase/Kollagenase/Trypsin-Verdau gewonnen und die Häufigkeit klonbildender Zellen durch Grenzverdünnung bestimmt (3).

    CD49f Bright /Sca1 + /Aldefluor Bright Tracheal-TSCs wurden aus Rosa-LacZ-Mäusen durch Fließsortierung gereinigt (3). TSC wurden auf bestrahlten NIH3T3-Feeder-Schichten expandiert (3). Stamm-/Vorläuferzellen wurden durch doppelte Trypsinierung gewonnen und in 1 × PBS resuspendiert.

    Testzellen, 1 × 10 6 bestrahlte Fibroblasten-Feeder-Zellen oder Maus-Stamm-/Vorläuferzellen wurden in das Lumen von gefrier-aufgetauten Swiss-Webster-Rattenluftröhren eingeführt. Dieses Xenotransplantat wurde in einer subkutanen Tasche bei Mäusen mit nicht fettleibiger diabetischer (NOD)/schwerer kombinierter Immunschwäche (SCID) positioniert. Das Xenotransplantat und die Trachea des Wirts wurden zu verschiedenen Zeitpunkten gewonnen.

    Menschliches Tracheobronchialgewebe wurde vom National Disease Research Interchange im Rahmen der vom National Jewish Institutional Review Board genehmigten Protokolle beschafft. Epithelzellen wurden gereinigt und in Bronchialepithel-Wachstumsmedium kultiviert (11, 12). Passage 3-Zellen wurden mit MISSION pLKO.1-puro TurboGFP lentiviralen Partikeln gemäß den Anweisungen des Herstellers (Sigma, St. Louis, MO) transduziert. 72 Stunden nach der Transduktion wurden die Zellen gesammelt und in sterilem 1 × PBS resuspendiert. Ungefähr 80% der Zellen waren grün fluoreszierendes Protein (GFP) + .

    Das Protokoll wurde unter Verwendung von Passage 1-Stamm-/Vorläuferzellen (Testzellen) entwickelt, die aus transgenen ROSA26-LacZ-Mäusen gewonnen wurden. Pilotstudien verwendeten NOD/SCID- und C57Bl/6-Mäuse, die mit Maisöl oder NA behandelt wurden. Am Erholungstag 2 oder 4 wurden die Mäuse anästhesiert und die Stimmbänder visualisiert. Aliquots von 5 × 10 4 , 2,5 × 10 5 oder 10 6 Zellen in 30 μl 1 × PBS wurden in die Trachea instilliert (13). Für Studien zur intravenösen Zellabgabe wurden Zellen mit einer 26-Gauge-Nadel in die Schwanzvene injiziert. Nachfolgende Studien verwendeten das optimale Transplantationsprotokoll, NOD/SCID-Wirtsmäuse und ein Inokulum von 2,5 × 10 5 Testzellen.

    Xenotransplantate, Trachealgewebe und Lungengewebe wurden fixiert, in Paraffin eingebettet und mit veröffentlichten Methoden immungefärbt (10, 14–18). Maustestzellen wurden durch 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid-Färbung nachgewiesen (14, 15). Humane Testzellen wurden durch Immundetektion des GFP-Tags identifiziert. Differenzierte Zelltyphäufigkeit und Beitrag zum Epithelzellpool wurden wie zuvor beschrieben quantifiziert (15, 16).

    Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) durchgeführt. Bei normalverteilten Datensätzen wurden die Unterschiede mit Student's . ausgewertet T Prüfung. Bei nicht normalverteilten Datensätzen wurden die Unterschiede mit dem Mann-Whitney-Test bewertet. P Werte unter 0,05 wurden als signifikant angesehen. Alle Analysen schlossen Trachea- oder Lungengewebeproben ein, die von drei bis vier Mäusen gewonnen wurden.

    Die Lunge verfügt über ein bemerkenswertes Abwehrsystem des Wirts, das einer erfolgreichen Zelltransplantation mehrere Barrieren auferlegt. Daher bewerteten wir zuerst die Differenzierung von Maus-TSC/Vorläuferzellen unter Verwendung des Tracheal-Xenograft-Systems der Ratte (19, 20).

    Die histologische Analyse der Trachea der Wirtsmaus zeigte, dass die meisten Basalzellen der Maus Keratin (K) 5 + /K14 – /Tumorprotein 63 (Trp63) + waren ( 1 , linke Spalte). Luminale Zellen exprimierten K8 und K19 und Untergruppen von Zellen waren positiv für den Flimmerzellmarker acetyliertes Tubulin und den sekretorischen Zellmarker CCSP. Luftröhrengerüste, die mit bestrahlten Fibroblasten-Feeder-Zellen besät wurden, entwickelten keine epitheliale Auskleidung (Abbildung 1, mittlere Spalte). Im Gegensatz dazu entwickelten Gerüste, die mit TSCs/Vorläuferzellen besät wurden, eine Epithelauskleidung, die von K5 + /K14 + /TRP63 + -Basalzellen sowie K8 + - und K19 + -Luminalzellen bevölkert war ( Abbildung 1 , rechte Spalte). Obwohl seltene Flimmerzellen beobachtet wurden, wurden keine CCSP + -Zellen festgestellt. Diese Daten stimmen mit unserem Bericht überein, dass die Differenzierung von TSC/Vorläufern parakrine Signale von einem noch nicht definierten Trachealzelltyp erforderte (3) und legten nahe, dass ein Lungentransplantationsassay erforderlich war, um das therapeutische Potenzial von Maus-TSCs/Vorläuferzellen zu testen.

    Abbildung 1. Differenzierung von Mausgewebestammzellen (TSC)/Vorläuferzellen in Tracheal-Xenotransplantaten von Ratten. Trachealgerüste von Ratten wurden mit 1 × 10 6 bestrahlten NIH3T3-Fibroblasten oder lebensfähigen Maus-TSCs/Vorläuferzellen beimpft und in eine dorsal-laterale subkutane Tasche von nicht adipösen diabetischen (NOD)/schweren kombinierten Immundefekt (SCID)/TSC-γ-Knockout-Mäusen implantiert. Xenotransplantate und die Trachea des Wirts wurden am Tag 14 gewonnen. Histologische Schnitte wurden wie angegeben gefärbt. Alle Bilder haben eine 200-fache Vergrößerung. Die Daten sind repräsentativ für vier Experimente. CCSP, Clara cell sekretorisches Protein H&E, Hämatoxylin und Eosin Trp63, Tumorprotein 63.

    Es wird angenommen, dass die Erschöpfung der Wirts-TSC die Geweberepopulation durch transplantierte TSCs fördert (siehe Referenz 21), ein Konzept, das kürzlich im Zusammenhang mit der Transplantation embryonaler Stammzellen (ESC) in die Atemwege verstärkt wurde (22). Da NA-Verletzungen häufig verwendet werden, um epitheliale TSCs der Atemwege der Maus zu aktivieren in vivo (2, 14, 15) und dieses Modell wurde auch in Kombination mit einer Ganzkörperbestrahlung für die ESC-Transplantation verwendet, stellten wir fest, ob die NA-Behandlung die TSC-Population erschöpfte.

    Gruppen von erwachsenen weiblichen FVB/n-Mäusen wurden mit Vehikel oder 300 mg/kg NA behandelt und 6, 40 oder 80 Tage lang erholt. Trachealzellen wurden durch Dispase/Kollagenase/Trypsin-Verdau gewonnen und die TSC-Häufigkeit wurde durch das limitierende Verdünnungsverfahren bestimmt (3). Diese Studie zeigte, dass die NA-Behandlung die TSC-Häufigkeit an den Erholungstagen 6 und 40 signifikant verringerte (Abbildung 2). Im Gegensatz dazu war die TSC-Häufigkeit am Erholungstag 80 normal. Diese Daten legten nahe, dass eine NA-Schädigung verwendet werden könnte, um den Wirt vor der Transplantation von TSCs/Vorläuferzellen zu konditionieren.

    Figur 2. Die Behandlung mit Naphthalin (NA) erschöpft TSCs. Weibliche FVB/n-Mäuse wurden mit Maisöl oder 300 mg/kg NA behandelt und 6, 40 oder 80 Tage lang erholt.Die Luftröhre wurde gewonnen, Einzelzellsuspensionen wurden erzeugt und die Zellen wurden auf bestrahlte NIH3T3-Fibroblasten-Feeder-Schichten ausplattiert. Die Häufigkeit der Vorläuferzellen wurde unter Verwendung der limitierenden Verdünnungsmethode bestimmt. Die Kulturen wurden am Tag 12 fixiert, gefärbt und quantifiziert. Die Daten sind als Mittelwert (±SD) dargestellt (n = 4). Symbole geben den Wert für einzelne Mäuse an.

    Unser erstes Ziel war es zu bestimmen, ob die Repopulation des leitenden Atemwegsepithels durch eine NA-Verletzung erleichtert wurde. Pilotstudien (in 3 zusammengefasst) zeigten, dass LacZ-markierte TSCs/Vorläufer(Test)-Zellen die Atemwege von Vehikel-behandelten Mäusen (unverletzt) ​​nicht wiederbesiedelten. Im Gegensatz dazu wurden die Luftröhre und die intrapulmonalen Atemwege von NA-verletzten Mäusen mit Testzellen neu besiedelt. Testzellen besiedelten das Parenchym, eine Lungenregion, die durch NA-Exposition nicht verletzt wird, nicht wieder.

    Figur 3. Optimales Transplantationsprotokoll. (EIN) Vorbereitung der Testzelle. (B) Die Schritte zur Bestimmung der optimalen Transplantationsparameter. IT, intratracheal IV, intravenös KO, Knockout Lin − , Zellen sind negativ für CD45/CD31/Ter119 NA, nicht zutreffend TCRγ, T-Zell-Rezeptor-γ. Grüner Text gibt den optimalen Zustand in jeder Unterkategorie an.

    Zweitens haben wir den optimalen Weg, die Dosis und den optimalen Zeitpunkt für die Transplantation von Testzellen bestimmt. Wir zeigen, dass die Transplantation am Recovery Day 2 erfolgreich war. Im Gegensatz dazu wurden weder die Atemwege noch das Parenchym mit Testzellen, die am Erholungstag 4 transplantiert wurden, repopuliert. Die intratracheale Instillation ermöglichte eine atemwegsspezifische Repopulation, während die intravenöse Infusion nicht erfolgreich war. Eine Dosis-Wirkungs-Studie verwendete am Erholungstag 2 eine intratracheale Instillation und zeigte, dass nur 50.000 TSCs/Vorläuferzellen das Atemwegsepithel wieder besiedelten und bis zu einer Million Zellen gut vertragen wurden.

    Drittens stellten wir fest, ob Testzellen das Atemwegsepithel von syngenen C57Bl/6-Mäusen oder immungeschwächten NOD/SCID/T-Zell-Rezeptor (TCR)-γ-Knockout-(NOD/SCID)-Wirten repopulierten. Diese Studien zeigten eine erfolgreiche und spezifische Repopulation des trachealen und intrapulmonalen Atemwegsepithels durch Testzellen bei beiden Wirtstypen. Schließlich verwendeten wir die optimalen Transplantationsparameter ( 3 ), NOD/SCID-Wirtsmäuse und ein Inokulum von 2,5 × 10 5 Testzellen wurden verwendet, um die Persistenz der Testzellen zu bewerten. Vom Test abgeleitete Zellen wurden 7, 14, 35 und 43 Tage nach der Transplantation nachgewiesen ( 3 ).

    Wir verwendeten das optimale Transplantationsprotokoll (Abbildung 3), NOD/SCID-Wirtsmäuse und ein Inokulum von 2,5 × 10 5 Testzellen, um die Lage, Häufigkeit und Differenzierung der Testzellen zu bewerten. Eine Gesamtanalyse der tracheobronchialen Atemwege identifizierte Cluster von aus dem Test stammenden Zellen in der Trachea und den Hauptstammbronchien (Abbildungen 4A–4C). Diese Cluster waren in der Trachea und ihren Unterregionen verbreitet ( 4E ). Die Clustergröße variierte jedoch innerhalb eines einzelnen Wirtstiers und zwischen den Wirten ( 4F ). Die bronchialen Atemwege wurden auch mit Clustern von Test-abgeleiteten Zellen neu besiedelt ( 4D und 4E ). Was die Luftröhre betrifft, variierte die Häufigkeit von aus dem Test stammenden Zellen im Bronchialepithel innerhalb und zwischen den Wirten ( 4G ). In den terminalen Bronchiolen wurden nur wenige aus dem Test stammende Zellen identifiziert, und keine wurden im Parenchym lokalisiert.

    Figur 4. Transplantierte Maus-TSCs/Vorläuferzellen bevölkern die tracheobronchialen und intrapulmonalen Atemwege. Maus-TSCs wurden aus transgenen ROSA26-LacZ-Mäusen gewonnen, als Randklone vermehrt, und diese „Test“-Zellen wurden am NA Recovery Day 2 in die Luftröhre von Nod/SCID/TCR-γ-Knockout-Mäusen instilliert.EIN) Whole-mount-Analyse der Luftröhre und der Lunge. Vom Test abgeleitete Zellen sind positiv für das LacZ-Proteinprodukt β-Gal + (Blau). (B) Whole-mount-Analyse der Trachea und der luminalen Oberfläche des rechten Bronchus. (C) Whole-mount-Analyse der luminalen Oberfläche des linken Bronchus. (D) Gewebeschnittanalyse des rechten unteren Lungenlappens. Pfeile: Dunkelblau, Bronchialbereich, hellblau, Bronchiolenregion. (E) Schnittanalyse von Tracheal- und Lungenunterregionen. Originalvergrößerung, ×200. (F und g) Volumenanteil der Tracheal (F) und Lunge (g) Epithel, das von transplantierten Zellen neu besiedelt wird. Mittelwert (±SD). Punkte bezeichnen einzelne Hochleistungsfelder. (EINC) Ausgeprägte Wirtsmäuse, denen Klonzellen der Mausränder transplantiert wurden.

    Die aus dem Test abgeleitete Zelldifferenzierung wurde durch Kodetektion des LacZ-Tags und der Differenzierungsmarker in der Luftröhre ( 5A – 5C ) und den intrapulmonalen Atemwegen ( 5E – 5H ) 2 Wochen nach der Transplantation bewertet. Die Quantifizierung zeigte, dass aus dem Test stammende Zellen basale und sekretorische Zellen mit einer Frequenz erzeugten, die der von vom Wirt stammenden (LacZ – ) Trachealzellen äquivalent war ( 5D ). Im Gegensatz dazu war die Differenzierung von aus dem Test stammenden Zellen zum Flimmerzell-Phänotyp signifikant geringer als die für vom Wirt stammende Zellen beobachtete. In den intrapulmonalen Atemwegen war die vom Test abgeleitete Zelldifferenzierung zu Basal- und Flimmerzellen ähnlich wie beim Wirt ( 5I ). Jedoch erzeugten vom Test abgeleitete Zellen signifikant weniger sekretorische Zellen als vom Wirt abgeleitete Zellen.

    Abbildung 5. Transplantierte Maus-TSCs/Vorläuferzellen weisen nach der Transplantation eine Differenzierung nach mehreren Linien auf. Mäuse wurden wie in 4 gezeigt transplantiert. (EINC) Schnittanalyse des Trachealepithels: Testabgeleitete Zellen sind positiv für das LacZ-Proteinprodukt β-Galactosidase (β-Gal) + (Blau). (EIN) Keratin 5 (Braun) (B) CCSP (Braun) (C) acetyliertes Tubulin (ACT Braun). (D) Quantifizierung der vom Wirt abgeleiteten (Weiß) und von Tests abgeleitete (Blau) Basalzellen (Keratin 5), sekretorische Zellen (CCSP) und Flimmerzellen (ACT). Mittelwert (±SD) n = 3 β-gal (Blau). (Eh) Schnittanalyse des intrapulmonalen Atemwegsepithels: Testabgeleitete Zellen sind β-gal + (Blau). (E und F) CCSP (Braun) (g und h) GESETZ (Braun). (E und g) 20× (F und h) 40×. (ich) Quantifizierung von Wirts- (Weiß) und von Tests abgeleitete (Blau) Basalzellen (Keratin 5), sekretorische Zellen (CCSP) und Flimmerzellen (ACT). Mittelwert (±SD) n = 15–50 Hochleistungsfelder. Pfeile bedeuten zelltypspezifische Antigen-positive Testzellen.

    Eine Million GFP-markierte menschliche TSCs/Vorläufer-(Test-)Zellen wurden unter Verwendung des optimalen Transplantationsprotokolls transplantiert. Histologische Studien identifizierten GFP + -Test-abgeleitete Zellen in der Luftröhre (Abbildungen 6A–6C) und den intrapulmonalen Atemwegen (Abbildungen 6G–6I) 2 Wochen nach der Transplantation. Vom Test abgeleitete Zellen wurden im Parenchymepithel nicht nachgewiesen.

    Abbildung 6. Transplantierte humane TSCs/Vorläuferzellen besiedeln das Tracheal- und das intrapulmonale Epithel wieder. Grün fluoreszierende Protein-positive humane bronchiale Basalzellen wurden wie in Abbildung 4 gezeigt transplantiert. (EINC) Immunfluoreszenz-Nachweis von Differenzierungsantigenen in der Trachea (80×). (D) Quantifizierung des Ursprungs von Trachealepithelzellen. Minimum/Maximum mit Leitung bei Mittelwert n = 3. (E) Quantifizierung des vom Wirt abgeleiteten (H blaue Balken) und testabgeleitet (T grüne Balken) Zellverteilung in der proximalen (Prox) und distalen (Dist) Trachea. (F) Differenzierung von Wirts- und Testzellen zu Basalzellen (Keratin 5), sekretorischen Zellen (Mucin 5B [MUC5B]) oder Flimmerzellen (ACT). Kasten gibt die Reichweite an Leitung zeigt den Mittelwert an n = 45 Hochleistungsfelder. (gich) Immunfluoreszenz-Nachweis von Differenzierungsantigenen in den intrapulmonalen Atemwegen (80×). (J) Quantifizierung des Ursprungs von intrapulmonalen Epithelzellen. (K) Quantifizierung des Ursprungs von Epithelzellen in Atemwegsunterregionen. BO, bronchioläre BR, bronchial H, Wirt T, Test-TB, terminale Bronchiolen. Minimum/Maximum mit Leitung bei Mittelwert n = 3. (L) Quantifizierung der Zelldifferenzierung. Riegel die Reichweite angeben Kasten zeigt den Mittelwert an Leitung zeigt den Mittelwert an n = 15–26 Hochleistungsfelder. Pfeile bedeuten zelltypspezifische Antigen-positive Testzellen. DAPI, 4′,6-Diamidino-2-phenylindol GFP, grün fluoreszierendes Protein.

    In der Luftröhre waren vom Test abgeleitete Zellen typischerweise weniger häufig als vom Wirt abgeleitete Zellen ( 6D ). Bei Mäusen, die gut repopuliert waren, waren vom Wirt und vom Test abgeleitete Zellen gleichermaßen über die proximal-distale Achse der Trachea verteilt ( 6E ). Die Mehrheit der aus dem Test stammenden Zellen exprimierte nicht die Basalzellmarker K5 ( 6F ) oder K14 (Daten nicht gezeigt). Die Differenzierung von Test-abgeleiteten Zellen zu einem Schleimzell-Phänotyp war signifikant größer als die der Wirtszellen ( 6F ), wohingegen die Differenzierung von Test-abgeleiteten Zellen zum Flimmerzell-Phänotyp signifikant geringer war als die der Wirtszellen ( 6F ). In Übereinstimmung mit diesen Daten war der Beitrag der aus dem Test stammenden Zellen zu den Basal- und Flimmerzellpools geringer als bei den vom Wirt stammenden Zellen, während ihr Beitrag zum Schleimzellpool größer war als bei den vom Wirt stammenden Zellen (Daten nicht gezeigt).

    Humane Testzellen wurden auch in den intrapulmonalen Atemwegen identifiziert (Abbildungen 6A–6C). Vom Test abgeleitete Zellen waren am häufigsten entlang des axialen Hauptweges, wo sie ungefähr die Hälfte des Epithels ausmachten ( 6J ). Jedoch waren vom Test abgeleitete Zellen weniger häufig als vom Wirt abgeleitete Zellen im Bronchial- und terminalen Bronchiolenepithel ( 6K ). Im axialen Hauptluftweg exprimiert eine Minderheit der aus dem Test stammenden Zellen K5 ( 6L ), während die Mehrheit sekretorische (Mucin 5B) und Flimmerzellmarker ( 6L ) exprimierte. Vom Test abgeleitete Zellen trugen selten zum Basalzellpool in den Bronchien bei, umfassten jedoch ungefähr die Hälfte der sekretorischen und Flimmerzellpools ( 6F , 6H und 6J ).

    Die Zelltherapie hat das Potenzial, Lungenkrankheiten durch den Ersatz funktionsgestörter Zellen zu heilen. Obwohl die TSC als die optimale therapeutische Zelle angesehen wird, zeigten Beweise aus Nichtpulmonalgeweben, dass die Transplantation von TSC/Vorläuferzell-Mischungen ein wirksamer Behandlungsansatz war (z. sehen Referenz 23). Wir zeigen nun, dass transplantierte tracheobronchiale TSC/Vorläuferzell-Mischungen von Mäusen und Menschen das verletzte Atemwegsepithel innerhalb von 2 Wochen rekonstituieren. Wir schließen daraus, dass adulte tracheobronchiale TSCs/Vorläuferzellen als Zelltherapie verwendet werden können.

    Da bei chronischen Lungenerkrankungen häufig das leitende Atemwegsepithel involviert ist, hat sich die Zelltherapie häufig auf dieses Gewebe konzentriert (Tabellen 1 und 2). In früheren Studien wurde eine Vielzahl von Methoden verwendet (Wirtskonditionierung, Verabreichungsweg und Behandlungszeit [22, 24–26]). Die vorliegende Studie grenzt diese Möglichkeiten ein und stellt ein Transplantationsmodell zur Verfügung, mit dem zusätzliche Stamm- und Vorläuferzellpräparate getestet werden können.

    Tabelle 1. Studien zur Maustransplantation

    Definition von Abkürzungen: KO, Knockout Nod, nicht adipöser diabetischer SCID, schwerer kombinierter Immundefekt TCRγ, T-Zell-Rezeptor-γ Trp63, Tumorprotein 63.

    Tabelle 2. Studien zur Transplantation menschlicher Zellen

    Definition von Abkürzungen: KO, Knockout Nod, nicht übergewichtiger diabetischer SCID, schwerer kombinierter Immundefekt TCRγ, T-Zell-Rezeptor-γ.

    Wir und andere haben berichtet, dass eine NA-induzierte Schädigung von der Dosis und dem genetischen Hintergrund abhängt (27–30). Zum Beispiel führt eine hochdosierte NA-Behandlung zu einer 95-%-Depletion der CCSP + -Zellpopulation am Erholungstag 3. Dieses Verletzungsniveau kann erreicht werden, indem die NA-Dosis entsprechend dem genetischen Hintergrund variiert wird (z. B. FVB/n-Mäuse, 300 mg/ kg [10] C57Bl/6 Mäuse, 250 mg/kg [30]). In der vorliegenden Studie wurden NOD/SCID-Wirtsmäuse mit 275 mg/kg NA behandelt. Diese Dosis verursachte eine ausgedehnte Erschöpfung des Vorläuferzellenpools des Atemwegsepithels und war mit einer wirksamen Repopulation durch transplantierte TSCs/Vorläuferzellen verbunden. Im Gegensatz zu unserer Studie berichteten Rosen und Kollegen (22), dass eine NA-Verletzung keine wirksame Zelltherapie durch ESC zuließ. Basierend auf unserem Wissen über NA-Schäden spekulieren wir, dass eine ineffektive Transplantation bei C57Bl/6-Mäusen, die mit 200 mg/kg NA konditioniert waren, auf eine suboptimale Schädigung des Atemwegsepithels zurückzuführen war.

    Frühere Studien zeigten auch, dass die Toxizität von NA auf das Epithel der leitenden Atemwege beschränkt ist und das Parenchym nicht verletzte. In der vorliegenden Studie besiedelten transplantierte TSCs/Vorläuferzellen das Atemwegsepithel, jedoch nicht Parenchymgewebe. Diese Daten legen nahe, dass das Fehlen einer Parenchymverletzung bei NA-behandelten Mäusen eine abweichende Aussaat des Alveolarepithels verhindert. Darüber hinaus schlagen sie auch vor, dass die Zelltherapie für chronische Atemwegserkrankungen ein Wirts-Konditionierungsschema verwenden sollte, das eine ausgedehnte und spezifische Verletzung des leitenden Atemwegsepithels verursacht.

    Frühere Studien und vorläufige Analysen (Daten nicht gezeigt) weisen darauf hin, dass NA-Schäden keine nachweisbare Wirkung auf die Gefäßintegrität haben, wohingegen viele Wirkstoffe, die zur Untersuchung von Epithelschäden und -reparaturen verwendet werden (Bleomycin, Influenza und Bestrahlung), auf mehrere Lungengewebe, einschließlich des Gefäßsystems, abzielen . In der vorliegenden Studie berichten wir, dass die intravenöse Verabreichung von TSCs/Vorläuferzellen an NA-behandelte Mäuse nicht zu einer effektiven Repopulation durch transplantierte TSCs/Vorläuferzellen führte. Diese Daten stehen im Gegensatz zu dem Bericht, dass die intravenöse Verabreichung ein wirksamer Weg bei Mäusen war, die mit einer Kombination aus niedrig dosierter NA und Ganzkörperbestrahlung konditioniert wurden (22). Da wir wissen, dass Strahlung die Gefäßintegrität beeinträchtigt, vermuten wir, dass die erfolgreiche Verwendung von infundierten Zellen durch die Rosen-Gruppe auf den strahlungsinduzierten Verlust der Gefäßintegrität zurückzuführen ist. Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass das Wirtskonditionierungsverfahren den effektiven Zelltransportweg bestimmt.

    Eine hochdosierte NA-induzierte Schädigung des Atemwegsepithels wird in zwei Stufen repariert. Zunächst breiten sich die unverletzten Epithelzellen aus und stellen die Epithelbarriere wieder her (29, 31). Zweitens proliferieren tracheobronchiale und bronchioläre TSCs und erzeugen differenzierte Nachkommen, die das Epithel neu besiedeln (14–16). Ciliated-Zellen gehören zu den ersten differenzierten Zellen, die durch die tracheobronchialen TSCs ersetzt werden und werden erstmals am Recovery Day 3 nachgewiesen (10).

    Wir berichten, dass die Transplantation am Recovery Day 2 zu einer effektiven Repopulation führte, während die Transplantation am Recovery Day 4 nicht erfolgreich war. Da wir wissen, dass Flimmerzellen die extrazelluläre Auskleidungsflüssigkeit und assoziierte Partikel aus dem Atemwegslumen entfernen, spekulieren wir, dass der effektive Zeitrahmen für die Zelltransplantation durch die durch Flimmerzellen vermittelte Clearance der transplantierten Zellen begrenzt ist. Diese Daten legen nahe, dass eine wirksame Wirtskonditionierung bei Krankheiten, die eine Flimmerzellhypoplasie aufweisen, nur eine geringe Wirtskonditionierung erfordert, während ein Wirtskonditionierungsschema, das die Flimmerzellfunktion beeinträchtigt, bei Patienten mit normaler Flimmerzellfrequenz und -funktion erforderlich ist.

    Es wird angenommen, dass eine erfolgreiche TSC-Transplantation von Wirtskonditionierungsregimen abhängt, die die TSC-Häufigkeit in der Nische verringern. In der vorliegenden Studie zeigen wir, dass eine hochdosierte NA-Exposition die TSC-Population am Erholungstag 6 um etwa 75 % verringert (Abbildung 2). Diese Erschöpfung weist darauf hin, dass die NA-Behandlung ein Kriterium für eine wirksame Wirtskonditionierung erfüllt.

    Es wird auch angenommen, dass die TSC-Erschöpfung das Homing der TSC in die Nische nach der Transplantation erhöht. Zu den zuvor identifizierten respiratorischen epithelialen TSC-Nischen gehören die submuköse Drüsengangverbindung, der bronchioläre neuroepitheliale Körper und die bronchoalveoläre Gangverbindung (32–36). In der vorliegenden Studie berichten wir, dass aus Tests stammende Maus- und Humanzellen im gesamten leitenden Atemwegsepithel gefunden werden. Diese Daten legen nahe, dass transplantierte TSCs/Vorläuferzellen nicht bevorzugt die bekannten Nischen wiederbevölkerten. Angesichts unseres früheren Berichts, dass TSCs im gesamten knorpeligen Trachealepithel lokalisiert waren (2), schlagen wir zwei Erklärungen für die relativ gleichmäßige Verteilung von Testzellen in der tracheobronchialen Region vor. Erstens kann das tracheobronchiale Epithel mehrere Nischen enthalten, die unterschiedlich empfindlich auf Epithelverletzungen reagieren. Die Nische des submukösen Drüsengangs wurde durch Verletzungen definiert, die TSCs und Vorläufer im oberflächlichen Atemwegsepithel eliminierten (z. B. 350 mg/kg NA bei FVB/n-Mäusen [33], Säure oder Detergens [32]). Im Gegensatz dazu könnte die in unseren Transplantationsstudien erzielte Verletzung die Nische des submukösen Drüsengangs verschont haben, und die TSC-Retention könnte die Repopulation durch Testzellen verhindert haben. Zweitens kann die TSC ihre eigene Nische generieren (3, 9). Wir haben zuvor berichtet, dass TSCs Randklone erzeugten und dass die Randdomäne des Randklons markierte Zellen sequestriert (3). Die anschließende Reinigung dieser markierungserhaltenden Zellen zeigte, dass sie den TSC-spezifischen Phänotyp aufwiesen und dass sie Randklone mit markierungserhaltenden TSCs erzeugten in vitro (2). Diese Daten deuten darauf hin, dass die beobachtete Verteilung von Testzellen auf die intrinsische Fähigkeit des TSC zurückzuführen ist, die Nische zu schaffen de novo.

    Wie zuvor für nichtpulmonales Gewebe gezeigt, untermauert die vorliegende Studie die Vorstellung, dass TSC/Vorläuferzell-Mischungen als Zelltherapie für Lungenerkrankungen verwendet werden können. In dem Wissen, dass die Epithelzellen der Atemwege langlebig sind, sind zusätzliche Studien erforderlich, um festzustellen, ob transplantierte Zellen die gleiche Langlebigkeit aufweisen. In ähnlicher Weise erfordern die Vorteile der Zelltherapie die Aufrechterhaltung der TSCs nach der Transplantation. Um diesen Aspekt der Zelltherapie zu behandeln, die eine TSC/Vorläuferzellmischung verwendet, sind zusätzliche Einzelzelllinienverfolgungs- und Selbsterneuerungsstudien erforderlich.

    Obwohl das aktuelle Transplantationsmodell für Studien geeignet ist, die die grundlegenden Aspekte der Zelltherapie bewerten, werden mindestens zwei Einschränkungen bei der Verwendung von NA erkannt. Zuerst wurde eine NA-induzierte Verletzung verwendet, um den Wirt zu konditionieren. Obwohl diese Behandlung die Mauslunge effektiv auf die Zelltherapie vorbereitete, macht es das CyP-450-Enzymprofil des menschlichen Atemwegsepithels (37) unwahrscheinlich, dass die NA-Exposition die menschliche Lunge effektiv konditioniert. Umfangreiches Wissen über NA-induzierte Verletzungen bei Mäusen ermöglicht es uns jedoch, die Eigenschaften einer effektiven Wirtskonditionierungsstrategie für die auf die Atemwege gerichtete Zelltherapie zu ermitteln. Wir gehen davon aus, dass für eine effektive Konditionierung umfangreiche atemwegsspezifische Epithelverletzungen erforderlich sind. Zweitens verwendete die vorliegende Studie NA-Schäden, um die bei einigen chronischen Lungenerkrankungen beobachtete Epithelschädigung nachzuahmen. Obwohl NA ein gut etabliertes akutes Verletzungsmodell ist, rekapituliert es nicht die chronische Epithelverletzung und den Umbau, die charakteristisch für menschliche Lungenerkrankungen oder den bei vielen dieser Erkrankungen vorhandenen Entzündungsprozess sind. Folglich sind zusätzliche Studien erforderlich, um die TSC/Vorläuferzelltherapie unter Bedingungen zu testen, die diese Aspekte der menschlichen chronischen Lungenerkrankung nachahmen.

    Die Autoren danken Russell W. Smith für die Zellinstillation, Bilan Li für die Immunfluoreszenzfärbung und Douglas Hicks für die Tierhaltung (Department of Pediatrics, National Jewish Health, Denver, CO).


    Was verraten die Hunderassen über die Begabung unserer besten Freunde – und uns?

    Eine neue Studie, die die genetische Vielfalt innerhalb von Hunderassen untersucht, ermutigt Hundezüchter, den Austausch von Hunden zwischen Ländern in Betracht zu ziehen. Jaakko Pohjoismäki, korrespondierender Autor der Studie, führt uns durch die neue Analyse von Zuchtpraktiken.

    In unserer in Hundemedizin und Genetik, verwendeten wir kommerziell erhaltene Genomdaten, um die Differenzierung von Subpopulationen bei sechs beliebten Hunderassen zu untersuchen: Belgischer Schäferhund, Englischer Windhund, Finnischer Lapphund, Italienischer Windhund, Labrador Retriever und Shetland Sheepdog.

    Bei all diesen Rassen fanden wir eine starke Subpopulationsdifferenzierung, die entweder der geografischen Herkunft oder den spezialisierten Rassenlinien innerhalb der Rassen entsprach. Obwohl wir eine gewisse Differenzierung erwartet hatten, insbesondere da die Populationen in einigen Ländern auf einer relativ kleinen Anzahl von Gründern basieren, war es überraschend zu sehen, wie unterschiedlich diese Subpopulationen genetisch waren und wie schnell die genetische Differenzierung bei einigen Rassen war. Zum Beispiel hat sich die sogenannte Herdenlinie des Finnischen Lapphundes in nur drei Jahrzehnten ohne geografische Barrieren von der Begleitlinie unterschieden, nur getrieben durch unterschiedliche Zwingerpräferenzen.

    Unsere Beobachtungen haben sowohl praktische als auch philosophische Ergebnisse für die Zwingerpraxis. Das Züchten von Hunden, um bestimmte Rasseideale zu erfüllen, führt per Definition zum Verlust unerwünschter Variationen und ist die Grundlage für die Zucht bei allen domestizierten Tieren. Im Allgemeinen ist die Rassendifferenzierung und -homogenität an sich nicht schlecht, aber viele Rassen sind standardmäßig klein und laufen Gefahr, unter den kumulierten Auswirkungen der Inzuchtdepression über die Generationen hinweg zu leiden. Spezialisierte Abstammungslinien müssen nicht abgeschafft werden, aber die Zuchtorganisationen sollten proaktiver bei der Vermischung der Hunde zwischen den Abstammungslinien oder zwischen eng verwandten Rassen sein. Während die Aufrechterhaltung spezialisierter Abstammungslinien beispielsweise bei Arbeitsrassen gerechtfertigt sein kann, dient die Mehrheit der phänotypischen Differenzierung von Rassen nur unserem Wunsch, Spezialität zu schaffen. Darüber hinaus sind viele dieser besonderen Merkmale, wie Fellfarbe oder Felltyp, rezessive Einzelgenmerkmale. Die rezessiven Phänotypen können aus geplanten Kreuzungen heterozygoter Individuen gewonnen werden, die mit Hilfe von Gentests identifiziert werden können. Dabei ist zu bedenken, dass Hunderassen aus menschengemachten Kriterien resultieren, deren Zuchtbegründungen kritisch zu hinterfragen sind und vielfältige Zuchtmöglichkeiten engen Idealen vorzuziehen sind.

    Im Gegensatz zu den weit verbreiteten Idealen diskreter, eng definierter Rassen gibt es einige Rassen wie den Nordischen Spitz oder Norrbottenspets, deren Zucht versucht, die bei verwilderten Hunden wirkende natürliche Selektion nachzuahmen und als Beispiel für einen Paradigmenwechsel angesehen werden kann in Zwingerpraxen. Diese kleine Jagdrasse wird in Finnland durch strenge Inzuchtbeschränkungen gepflegt, die die Anzahl der Welpen pro Vater auf 30 begrenzt, ein offenes Zuchtbuch hat und die Arbeit von Jagdhunden auf Aussehen oder Qualifikationen in Hundeausstellungen betont, während sie obligatorische Gesundheitschecks für die Zucht vorschreiben Hunde. Obwohl sie einst kurz vor dem Aussterben stand, ist sie derzeit eine der genetisch vielfältigsten Hunderassen der Welt.

    Unsere Studie ist auch ein Beispiel dafür, wie kommerziell gewonnene Genomdaten genutzt werden können, um wertvolle Informationen über die Differenzierung von Subpopulationen und die genetische Diversität von Hunderassen zu liefern. Die Daten helfen uns auch, die genetischen Beziehungen und den genetischen Fluss der Vorfahren unter den heutigen Hunderassen zu verstehen, über die unter den Rasseliebhabern oft spekuliert wird.

    Aus einer allgemeineren Perspektive ist die kombinierte Wirkung von Populationsengpässen und Selektion auf die genetische Differenzierung erstaunlich in Aktion zu sehen. Obwohl weithin bekannt, ist die Tatsache, dass die meisten Hunderassen mit ihrer erstaunlichen phänotypischen Variation hauptsächlich in den letzten 200 Jahren entstanden sind, vielleicht immer noch ein unterschätztes Beispiel für evolutionäre Kräfte in Aktion. Das Verständnis der genetischen Differenzierung bei Hunderassen könnte interessante Einblicke in die Evolution natürlicher Populationen geben, wie beispielsweise die adaptive Strahlung von Arten oder die Artbildung von einigen wenigen Gründerindividuen in abgelegenen Insellebensräumen. Ebenso unterstreicht die rasche Differenzierung von Hunderassen-Subpopulationen, die mit dem Verlust der genetischen Vielfalt einhergeht, die Auswirkungen des Lebensraumverlustes und der Fragmentierung auf die Populationsgenetik gefährdeter Arten. Die Hunde-Subpopulationen mit relativ wenigen Brutindividuen ähneln der Situation vieler räumlich verstreuter Populationen gefährdeter Arten. Hunde könnten auch praktische, kontrollierte Modelle anbieten, um die Auswirkungen der genetischen Rettung gefährdeter Populationen zu untersuchen und die Gerätepraxis in Bezug auf die Anzahl der übertragenen Individuen und die erforderlichen genetischen Unterschiede zu unterstützen, um die gewünschten Rettungsziele zu erreichen.

    Directional Züchtung ist ein mächtiges Werkzeug, das Menschen seit Jahrtausenden anwenden, um Tiere und Pflanzen gleichermaßen zu formen. Mit Macht kommt jedoch die Verantwortung, keinen Schaden anzurichten. Unsere größten tierischen Gefährten verdienen es, sie aus einer breiteren Perspektive zu sehen.


    Abstrakt

    Es wird angenommen, dass die Nische das Verhalten von Stammzellen beeinflusst. Bei selbsterneuernden Systemen, für die funktionelle Transplantationsassays zur Verfügung stehen, wurde lange angenommen, dass Stammzellen in der Nische fixiert werden und für eine erfolgreiche Spendertransplantation eine ablative Behandlung zur Entfernung endogener Stammzellen erforderlich ist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass angereicherte Populationen von Spenderstammzellen in Hoden von unreifen und reifen, nicht abgetragenen Mäusen lang anhaltende spermatogene Kolonien bilden können, wenn auch in geringerer Häufigkeit als bei abgetragenen Mäusen. Die Besiedelung von nicht ablatierten Empfängerhoden durch Samenzellen von Neugeborenen, Welpen und kryptogonalen adulten Spendern zeigt, dass die Konkurrenz um eine Nische kurz nach der Geburt beginnt und dass endogene Stammzellen den Grad und das Muster der Besiedelung von Spenderzellen beeinflussen. Somit besteht im Hoden eine dynamische Beziehung zwischen Stammzelle und Nische, wie sie für die Hämatopoese vorgeschlagen wurde. Daher können ähnliche kompetitive Eigenschaften von Spenderstammzellen für alle sich selbst erneuernden Systeme charakteristisch sein.


    Postdoktorand

    Unsere Gruppe ist an vergleichenden Analysen der normalen Lymphozytenentwicklung und der malignen Transformation zu Leukämie interessiert. Wir decken Forschungsgebiete mit Relevanz für Immunologie, Hämatologie und Krebsbiologie ab. Unsere Forschung umfasst Experimente mit primären menschlichen Leukämiezellen, normale Lymphozytenentwicklung in humanisierten Mäusen, Leukämie- und Stammzelltransplantationsmodelle, Mausgenetik, Gen-Editierung, genetische Biosensoren der Signalübertragung, Optogenetik, klassische Molekular- und Zellbiologie, ein starker Schwerpunkt auf mechanistischen Studien bei der onkogenen Signaltransduktion. Wir sind bestrebt, eine Kultur der Vielfalt und Inklusivität für alle Mitglieder zu fördern, wobei wir uns auf Karriereentwicklung und innovative Ansätze in der Wissenschaft konzentrieren.

    Qualifikationen: Promotion in Zell- oder Molekularbiologie, Begeisterung für Wissenschaft, Bereitschaft, über etablierte Konzepte hinaus zu denken und neue experimentelle und analytische Werkzeuge auszuprobieren und zu erlernen. Das Labor verfolgt einen teamwissenschaftlichen Ansatz, Zusammenarbeit ist ebenfalls wichtig.

    Ihre Bewerbung sollte in einer einzigen enthalten sein PDF:

    Lebenslauf, kurzes Motivationsschreiben, Koordinaten von drei wissenschaftlichen Mentoren (Referenzen)

    Methoden/Techniken: Durchflusszytometrie, Massenspektrometrie/quantitatives Phosphoprofiling, genetische Biosensoren der Signaltransduktion, Optogenetik, Mausgenetik, Knochenmarktransplantationsassays, retrovirale Genabgabe, Sequenzierung des gesamten Exoms und RNA-Seq-Analyse der klonalen Evolution von Leukämie, präklinische Arzneimittelprüfung in Xenotransplantationsmodelle.

    Aktuelle Arbeiten des Labors: Um die Produktion schädlicher Autoantikörper und Autoimmunerkrankungen zu verhindern, werden autoreaktive B-Zellen und prämaligne Klone durch einen als negative Selektion bezeichneten Prozess eliminiert. Trotz strenger und rigoroser negativer Selektion führen B-Zellen häufig zu Autoimmunerkrankungen und B-Zell-Malignomen wie Leukämie und Lymphomen. Da der Mensch über längere Zeit ohne B-Zellen leben kann, untersuchte das Müschen-Labor systematisch linienspezifische Schwachstellen, die bei B-Zell-Leukämie/Lymphom, aber bei keinem anderen Zelltyp vorkommen. Entgegen dem etablierten Dogma sind diese Mechanismen nicht nur aktiv bei der Prävention von Autoimmunerkrankungen, sondern stellen auch eine neue Klasse therapeutischer onkogener Ziele bei malignen B-Zell-Tumoren dar. In den letzten fünf Jahren hat das Labor Müschen innovative konzeptionelle Rahmenbedingungen zum Verständnis von B-Zell-Signalmechanismen und negativer Selektion etabliert, von denen einige im Folgenden zusammengefasst sind: