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9.11: Blotting - Biologie


Blotting bietet ein Mittel zur Identifizierung spezifischer Moleküle aus einer Mischung. Die Mischung könnte DNA (Southern Blot), RNA (Nothern Blot) oder Protein (Western Blot) sein und das Gel könnte Agarose (für DNA/RNA) oder Polyacrylamid (für Protein) sein. Dieser so genannte „Blot“ weist einen Abdruck der im Gel befindlichen Nukleinsäure- oder Proteinbanden auf (siehe Abbildung links). Befindet sich das interessierende Molekül in der Originalmischung, „leuchtet“ es auf und offenbart sich.


Hochfrequente, präzise Modifikation des Tomatengenoms

Die Verwendung der homologen Rekombination zur präzisen Modifizierung von Pflanzengenomen war aufgrund des Mangels an effizienten Methoden zur Abgabe von DNA-Reparaturmatrizen an Pflanzenzellen eine Herausforderung. Auch mit dem Aufkommen sequenzspezifischer Nukleasen, die durch gezielte DNA-Doppelstrangbrüche die homologe Rekombination an vordefinierten Genomstellen stimulieren, gibt es nur eine Handvoll Studien, die über eine präzise Editierung endogener Gene in Nutzpflanzen berichten. Es werden effizientere Methoden benötigt, um Pflanzengenome durch homologe Rekombination zu modifizieren, idealerweise ohne zufällige Integration fremder DNA.

Ergebnisse

Hier verwenden wir Geminivirus-Replikons, um vererbbare Modifikationen des Tomatengenoms mit einer zehnfach höheren Frequenz als bei herkömmlichen Methoden der DNA-Lieferung (d. h. Agrobakterium). Ein starker Promotor wurde stromaufwärts eines Gens eingefügt, das die Anthocyanin-Biosynthese steuert, was zu einer Überexpression und ektopischen Akkumulation von Pigmenten in Tomatengeweben führte. Mehr als zwei Drittel der Insertionen waren präzise und wiesen keine unerwarteten Sequenzmodifikationen auf. Sowohl TALENs als auch CRISPR/Cas9 erreichten eine ähnliche Effizienz beim Gen-Targeting. Außerdem wurde die gezielte Modifikation auf mendelsche Weise an die Nachkommen weitergegeben. Obwohl Donormoleküle in den Vektoren repliziert wurden, wurden keine Hinweise auf persistente extrachromosomale Replikons oder Off-Target-Integration von T-DNA oder Replikonsequenzen gefunden.

Schlussfolgerungen

Mithilfe von Geminivirus-Replikons wurde eine hochfrequente, präzise Modifikation des Tomatengenoms erreicht, was darauf hindeutet, dass diese Vektoren die Effizienzbarriere überwinden können, die das Gen-Targeting in Pflanzen zu einer Herausforderung gemacht hat. Diese Arbeit bietet eine Grundlage für eine effiziente Genom-Editierung von Kulturpflanzengenomen ohne die zufällige Integration fremder DNA.


Abstrakt

Seit 2010 sind Bachelor-Studenten im zweiten Studienjahr eines achtjährigen Ausbildungsprogramms, das zu einem Doktor der Medizin oder einem Doktor der Philosophie am Peking University Health Science Center (PKUHSC) führt, für die Teilnahme am „Innovative Talent Training Project“ erforderlich. Während dieser Zeit traten die Studenten einem Forschungslabor bei und nahmen an einigen originellen Forschungsarbeiten teil. Es besteht ein entscheidender Bildungsbedarf, um diese Studierenden auf die zunehmende Zugänglichkeit von Forschungserfahrungen vorzubereiten. Der neu gestaltete experimentelle Lehrplan für Biochemie und Molekularbiologie wurde entwickelt, um eine solche Anforderung zu erfüllen, der zwei ursprüngliche biochemische Experimente (Gelfiltration und Enzymkinetik) beibehält und eine neue Komponente mit zwei Experimenten namens „Analyse der durch Antitumormittel induzierten Apoptose“ hinzufügt. Die zusätzliche Komponente, auch als „projektorientiertes Experiment“ oder „umfassendes Experiment“ bekannt, besteht aus Western-Blotting und einem DNA-Laddering-Assay, um die Auswirkungen von Etoposid (VP16) auf die Apoptose-Signalwege zu untersuchen. Dieses reformierte Laborlehrsystem zielt darauf ab, das Gesamtverständnis der teilnehmenden Studierenden über wichtige biologische Forschungstechniken und die damit verbundene Instrumentierung zu verbessern und ein besseres Verständnis des Forschungsprozesses innerhalb eines Klassenzimmers zu fördern. Das Feedback der Studierenden zeigte, dass das aktualisierte Curriculum ihnen half, ihre betrieblichen und selbstlernenden Fähigkeiten zu verbessern und ihr Verständnis des theoretischen Wissens und der tatsächlichen Forschungsprozesse zu verbessern, was die Grundlage für ihre zukünftige Forschungsarbeit legte. © 2015 von The International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 43:428–433, 2015.


DISKUSSION

GRP78, das Schlüsselprotein im ER, ist an verschiedenen Krankheiten wie Tumoren und neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt (Hebert-Schuster et al., 2018 Casas, 2017). In der aktuellen Studie fanden wir, dass GRP78 in Lungenadenokarzinomen und Plattenepithelkarzinomen der Lunge stark exprimiert wurde und mit einer schlechten Prognose verbunden war. Darüber hinaus verringerte die Hemmung von GRP78 durch HA15 die Lebensfähigkeit von A549-, H460- und H1975-Zellen in einer dosis- und zeitabhängigen Weise. HA15 hemmte die Zellproliferation von A549, H460 und H1975 und förderte die Apoptose. ER-Stress und Autophagie wurden durch HA15 in A549-Zellen ausgelöst und diese Prozesse waren an der HA15-induzierten Apoptose beteiligt.

Es wurde berichtet, dass eine hohe Expression von GRP78 die Tumorentstehung und Medikamentenresistenz fördern könnte und die Hemmung von GRP78 die Wirksamkeit von Chemotherapeutika verbessern könnte (Huang et al., 2016 Dauer et al., 2018 Cook und Clarke, 2015). Eine klinische Studie mit 163 peripheren Blutproben von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs zeigte, dass GRP78 in fortgeschrittenen Stadien stark angereichert ist, deutlich höher als bei Patienten im Frühstadium, was für die Karzinogenese von nicht-kleinzelligen Patienten wichtig sein könnte -zelliger Lungenkrebs und ist mit einer schlechten Prognose verbunden (Ma et al., 2015). Unsere bioinformatische Analyse zeigte, dass GRP78 bei Patienten mit Lungenkrebs auch auf transkriptomischer Ebene höher war als bei gesunden Menschen, was darauf hindeutet, dass GRP78 mit der Entstehung und Entwicklung von Lungentumoren in Verbindung stehen könnte.

Es wurde berichtet, dass HA15, ein neuartiger Inhibitor, der auf GRP78 abzielt, das ER-Stressniveau in malignen Pleuramesotheliomzellen hochregulieren, die pro-apoptotische UPR und Autophagie induzieren und den Zelltod induzieren könnte (Xu et al., 2019). In ähnlicher Weise ging die durch HA15 induzierte Lungenkrebszell-Apoptose mit ER-Stress einher. In dieser Studie fanden wir, dass nach der HA15-Behandlung die pro-apoptotische UPR-Signalgebung aktiviert wurde, was zu einer signifikant erhöhten Expression von CHOP führte. Elektronenmikroskopische Bilder von A549-Zellen, die HA15 ausgesetzt waren, zeigten typische dilatierte ER-Zisternen, die ein klassisches Merkmal von ER-Stress sind, was darauf hindeutet, dass ER-Stress auch an der HA15-induzierten Apoptose in Lungenkrebszellen beteiligt ist. Es erscheint seltsam, dass HA15 GRP78 hemmen und gleichzeitig ER-Stress auslösen kann. Cerezo et al., (2016) zeigten, dass, während HA15 die Dissoziation von GRP78, Proteinkinase-RNA (PER)-ähnlicher ER-Kinase (PERK), IRE1α und ATF6-Komplex induzierte und somit ER-Stress induziert, GRP78 ATP mit hoher Affinität bindet und seine ATPase-Aktivität, die durch die Bindung an das ungefaltete Protein stimuliert wird, katalysiert die Rückfaltung. HA15 ist in der Lage, die ATPase-Aktivität von GRP78 dosisabhängig zu hemmen, was zur Akkumulation von ungefalteten Proteinen führt und den ER-Stress verschlimmert.

Die HA15-induzierte Apoptose steht nicht nur in engem Zusammenhang mit ER-Stress, sondern auch mit Autophagie (Cerezo et al., 2016 Xu et al., 2019). Analog fanden wir, dass die HA15-Behandlung der Lungenkrebszelllinie A549 die Autophagie aktiviert und die Bildung von Autophagosomen auslöst. Da die Autophagie in Bezug auf den Zelltod als zweischneidiges Schwert angesehen wird, haben wir Chloroquin verwendet, um den Autophagieprozess zu blockieren, und fanden heraus, dass die Zelllebensfähigkeit von HA15 zusammen mit der CHQ-Behandlung im Vergleich zur HA15-Behandlung allein wiederhergestellt wurde, was die hochregulierte Autophagie in dieser Zustand förderte den programmierten Zelltod. Es wurde berichtet, dass die Transkriptionsfaktoren ATF4 und CHOP die Transkription des Autophagie-Gens erhöhen könnten MAP1LC3B, das LC3B und ATG5, phagozytische Expansion und Autophagosomenbildung kodiert (Rouschop et al., 2010). Interessanterweise fanden wir, dass ATF4 und CHOP nach der Behandlung mit HA15 hochreguliert wurden, was die Autophagie verstärken kann. Die ATG Gene, die die Bildung von Autophagosomen durch Atg12-Atg5- und LC3B-Komplexe kontrollieren, wurden nach HA15-Behandlung hochreguliert.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass GRP78 bei Patienten mit Lungenkrebs stark exprimiert wird und mit einer schlechten Prognose verbunden ist. Die gezielte Hemmung von GRP78 durch HA15 förderte die Apoptose von Lungenkrebszellen durch Beteiligung von ER-Stress und Autophagie. Die gezielte Hemmung von GRP78 mit HA15 könnte in Zukunft ein neues Ziel für die klinische Behandlung und Arzneimittelentwicklung werden.


Abstrakt

Pädiatrie MLL-rearrangierte akute monoblastische Leukämie mit t(911)(p22q23) hat im Vergleich zu anderen ein gutes Ergebnis MLL-AML neu geordnet. Der biologische Hintergrund für diesen Unterschied ist unbekannt. Daher verglichen wir Genexpressionsprofile (GEP) von -t(911)(p22q23)-Patienten mit anderen MLL-umgeordnete AML-Patienten, um differenziell exprimierte Gene zu identifizieren.

Wir führten GEP (Affymetrix HG U133 plus 2.0) bei 245 pädiatrischen AML-Patienten (237 de novo und 8 sekundäre AML-Patienten) durch und verwendeten RT-qPCR und Western Blot, um die Expression zu validieren. Zur Untersuchung der epigenetischen Regulation wurde eine methylierungsspezifische PCR verwendet. Wir testeten die Wirkung des Demethylierungsmittels Decitabin und die Wirkung des Knockdowns durch siRNA sowohl auf die Proliferation als auch auf die Arzneimittelsensitivität in AML-Zelllinien.

IGSF4, ein Zell-Zell-Adhäsionsmolekül, wurde in AML-t(911) stark exprimiert. Die Expression innerhalb von AML-t(911) war bei FAB-M5 18,5-mal höher als bei anderen FAB-Typen (p=0,013). RT-qPCR und Western Blot bestätigten dies. Die Untersuchung des Methylierungsstatus zeigte, dass Patienten mit hoher IGSF4-Expression von AML-t(911) mit FAB-M5 keine Promotor-Hypermethylierung aufweisen, wohingegen alle anderen Fälle dies tun. Dies wurde auch in Zelllinien beobachtet. Die Inkubation der Zelllinie mit Decitabin führte zu einer Demethylierung des Promotors und einer erhöhten Expression von IGSF4. Herunterregulierung von IGSF4 durch siRNA beeinflusste weder die Proliferation noch die Arzneimittelempfindlichkeit in Suspensionskulturen.

Zusammenfassend haben wir identifiziert IGSF4 Überexpression als diskriminierend für AML-t(911) mit FAB-M5, teilweise reguliert durch Promotormethylierung.


Molekulare und zytogenetische Analyse

11q23-Anomalien

Umlagerungen der Lysin (K)-spezifischen Methyltransferase 2A ( KMT2A , früher als gemischtes Leukämie-Lymphom bekannt, MLL oder ALL1, HRX oder Htrx1) auf Chromosom 11q23 und multiple Partnergene finden sich in Vorläufer-B-ALL, T-ALL, AML, MDS und bei sekundärer Leukämie. Das Vorhandensein von KMT2A Umlagerungen sind in der Regel mit einer schlechten Prognose verbunden.

In ALL der häufigste Translokationspartner von KMT2A ist die AF4/FMR2-Familie, Mitglied 1 (AFF1) Gen auf Chromosom 4q21, obwohl andere Partnerchromosomen beschrieben wurden. 68 Etwa 50–70 % der ALL-Fälle bei Säuglingen und etwa 5 % der ALL-Fälle bei Kindern und Erwachsenen sind positiv für die KMT2A-AFF1 Fusionsgen, das mit einem pro-B-ALL („null“) Phänotyp assoziiert ist (CD19 +, CD34 +, terminale Desoxynukleotidyltransferase +, zytoplasmatisches CD79a +, CD10 –). Auch myeloische Antigene (CD15 und/oder CD65) werden häufig exprimiert.

Die KMT2A und AFF1 Gene bestehen aus 37 bzw. 20 Exons, und mindestens 10 verschiedene Fusionstranskripte wurden aufgrund von Translokationsbruchpunkten identifiziert, die in verschiedenen Introns der beiden Gene auftreten. Haltepunkte hinter dem KMT2A Exon 9 bei ALL bei Erwachsenen und Kindern, aber stromabwärts von Exon 11 bei ALL bei Säuglingen und stromaufwärts von Exon 4 des AFF1 Gen werden häufig durch PCR nachgewiesen. Variables Spleißen ist ein häufiger Befund, der bei einigen Patienten zu mehr als einem Fusionstranskript führt. Alle t(411)-positiven Fälle transkribieren die KMT2A-AFF1 Fusionsgen, während nur 70 % der Fälle das reziproke, AFF1-KMT2A Produkt. Interessanterweise sind niedrige Werte der KMT2A-AFF1 Transkript wurden in einigen ALL-Fällen ohne zytogenetisch nachweisbares t(411) und in hämatopoetischen Geweben gesunder Personen nachgewiesen.

Mit einer verschachtelten PCR-Strategie können die verschiedenen KMT2A-AFF1 Transkripte können mit einer Nachweisgrenze von 1 in 10 4 –10 5 identifiziert werden. Für eine umfassende Beschreibung der Methodik zum Nachweis und zur molekularen Überwachung dieser und anderer Translokationen in diesem Abschnitt verweisen wir auf einen sehr umfassenden Bericht. 42 MRD-Studien haben gezeigt, dass eine frühe Konversion und anhaltende MRD-Negativität konsistent mit CCR verbunden sind.


Materialen und Methoden

Epitop-Tagging von Genen und Isolierung von Proteinkomplexen

Transformationen für beide Hefen wurden wie beschrieben durchgeführt [7, 9]. Gene von Interesse wurden durch In-Frame-Fusion der ORFs mit einer PCR-erzeugten Targeting-Kassette, die den TAP-Tag und einen selektierbaren Marker codiert, markiert. Korrekte Kassettenintegrationen wurden durch PCR und Western-Blot-Analyse bestätigt. Zwei S. cerevisiae Stämme mit TAP-markierten Genen YGR099W und YJR136C wurden von Euroscarf (Frankfurt am Main, Deutschland) bezogen. Das Aufbrechen und Extrahieren von Hefezellen erfolgte wie beschrieben [7] mit Modifikationen [10]. Gereinigte Proteine ​​wurden nach Wessel und Fluegge [93] konzentriert und auf Polyacrylamidgele mit einem eindimensionalen Gradienten (6-18 %) geladen.

Proteintrennung und In-Gel-Verdau

Proteinbanden wurden durch Anfärben mit Coomassie sichtbar gemacht. Vollständige Bahnen wurden in ungefähr 30-40 Scheiben geschnitten, um den Dynamikbereich der Detektion zu verbessern, sichtbare Banden wurden immer separat geschnitten. Ausgeschnittene Gelpfropfen wurden in etwa 1 mm × 1 mm × 1 mm große Würfel geschnitten und mit modifiziertem Schweinetrypsin von Sequenzqualität (Katalognummer V5111, Promega, Mannheim, Deutschland) im Gel verdaut, wie in [94] beschrieben. Anschließend wurden 1-ul-Aliquots direkt aus In-Gel-Verdaus für die Proteinidentifizierung durch MALDI-Peptid-Mapping entnommen. Der Rest des Peptidmaterials wurde mit 5% Ameisensäure und Acetonitril aus den Gelstücken extrahiert und die gewonnenen Peptide in einer Vakuumzentrifuge getrocknet.

Proteinidentifizierung durch MALDI-Peptid-Massenkartierung

Sofern angegeben, wurden 1-μl-Aliquots von In-Gel-Verdaus auf einem REFLEX IV-Massenspektrometer (Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland) unter Verwendung von AnchorChip-Sonden (Bruker Daltonics) wie in [95, 96] beschrieben analysiert. Peaks wurden manuell ausgewählt und ihre m/z durchsucht in der MSDB-Proteindatenbank von S. cerevisiae oder S. pombe Spezies mit der Software MASCOT 2.0 (Matrix Science Ltd, London, UK), die auf einem lokalen Server mit zwei CPUs installiert ist. Die Massentoleranz wurde auf 50 ppm variable Modifikationen eingestellt: oxidierte Methionine eine Fehlspaltung pro tryptischer Peptidsequenz war erlaubt. Spektren wurden extern kalibriert mit m/z von bekannten, reichlich vorhandenen Trypsin-Autolyseprodukten als Referenzen. Proteintreffer, deren MOWSE-Wert den Wert von 51 überschreitet (der von MASCOT vorgeschlagene Schwellenwert für P < 0,05 und die entsprechende artspezifische Datenbank) wurden als signifikant angesehen, aber erst nach weiterer manueller Überprüfung akzeptiert, die sicherstellte, dass die m/z aller Hauptpeaks im Spektrum stimmten mit den Massen der Peptide aus den entsprechenden Proteinsequenzen oder bekannten tryptischen Autolyseprodukten überein.

Proteinidentifikation durch LC-MS/MS

Getrocknete Peptidextrakte wurden in 20 μl 0,05% (v/v) Trifluoressigsäure wieder aufgelöst und 4 μl wurden mit einem FAMOS-Autosampler in ein nanoLC-MS/MS Ultimate-System (Dionex, Amsterdam, Niederlande) mit Online-Schnittstelle injiziert an ein lineares Ionenfallen-LTQ-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA). Die mobile Phase war 95:5 H2O:Acetonitril (v/v) mit 0,1% Ameisensäure (Lösungsmittel A) und 20:80 H2O:Acetonitril (v/v) mit 0,1% Ameisensäure (Lösungsmittel B, Lichrosolv Grad). Peptide wurden zuerst auf eine Einfang-Mikrosäule C18 PepMAP100 (1 mm × 300 mm ID, 5 mm, Dionex) in 0,05% Trifluoressigsäure mit einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/Minute geladen. Nach 4 Minuten wurden sie rückspüleluiert und auf einer Nanosäule C18 PepMAP100 (15 cm × 75 µm ID, 3 µm, Dionex, Sunnyville, CA, USA) bei einer Flussrate von 200 nl/Minute im mobilen Phasengradienten aufgetrennt: von 5-20 % Lösungsmittel B in 20 Minuten, 20-50 % B in 16 Minuten, 50-100 % B in 5 Minuten, 100 % B während 10 Minuten und zurück auf 5 % B in 5 Minuten %B bezieht sich auf der Lösungsmittel-B-Gehalt (v/v) im A+B-Gemisch. Peptide wurden über eine dynamische Nanospray-Sonde (Thermo Fisher Scientific) in das Massenspektrometer infundiert und im positiven Modus analysiert. Unbeschichtete Nadeln Silicatip, 20 µm ID, 10 µm Spitze (New Objective, Woburn, MA, USA) wurden mit einer Sprühspannung von 1,8 kV verwendet und die Kapillartransfertemperatur wurde auf 200°C eingestellt. In einem typischen datenabhängigen Erfassungszyklus, der von der Xcalibur 1.4-Software (Thermo Fisher Scientific) gesteuert wird, werden die vier am häufigsten vorkommenden Vorläuferionen im vollständigen MS-Survey-Scan (m/z Bereich von 350-1.500) wurden innerhalb eines 4,0-amu-Fensters isoliert und fragmentiert. Die MS/MS-Fragmentierung wurde durch eine minimale Signalintensitätsschwelle von 500 Zählungen ausgelöst und bei der normalisierten Kollisionsenergie von 35% durchgeführt. Die Spektren wurden unter automatischer Verstärkungsregelung in einem Mikroscan für Vermessungsspektren und in drei Mikroscans für MS/MS-Spektren mit einer maximalen Ioneninjektionszeit von 100 ms pro Mikroscan aufgenommen. M/z der fragmentierten Vorstufen wurden dann für weitere 60 s dynamisch ausgeschlossen. Es wurden keine vorkompilierten Ausschlusslisten angewendet.

MS/MS-Spektren wurden als dta-Dateien (Textformat) mit der Software BioWorks 3.1 (Thermo Fisher Scientific) unter den folgenden Einstellungen exportiert: Peptidmassenbereich, 500-3.500 Da minimaler Schwellenwert für die Gesamtionenintensität, 1.000 minimale Anzahl von Fragmentionen, 15 Vorläufer Massentoleranz, 1,4-amu-Gruppenscan, 1 Mindestgruppenzahl, 1.

Verarbeitung von MS/MS-Spektren und Datenbankrecherchen

Dta-Dateien wurden zu einer einzigen MASCOT-Datei im generischen Format (mgf) zusammengeführt und in einer Datenbank mit S. cerevisiae oder S. pombe Proteine, die MASCOT v.2.2 verwenden, das auf einem lokalen Server mit zwei CPUs installiert ist. Toleranz für Vorläufer- und Fragmentmassen betrug 2,0 bzw. 0,5 Da, Instrumentenprofil, ESI-Trap-Variablenmodifikation, Oxidation (Methionin) erlaubte Anzahl von Fehlspaltungen, 1 Peptidionen-Score-Cut-off, 15.

Treffer wurden als sicher angesehen, wenn zwei oder mehr MS/MS-Spektren mit den Datenbanksequenzen übereinstimmten und ihre Peptidionenwerte den Wert von 31 überschritten (der von MASCOT vorgeschlagene Schwellenwert für die sichere Übereinstimmung einer einzelnen Peptidsequenz bei P < 0,05). Für jedes identifizierte Protein wurde die Anzahl der übereinstimmenden Peptide und der MS/MS-Spektren mithilfe eines intern entwickelten Skripts aus der MASCOT-Ausgabe in Excel-Tabellen exportiert gleiche IP-Experiment. Wenn das gleiche Protein in mehreren Banden sequenziert wurde, wurde nur die Analyse berichtet, die die höchste Anzahl von übereinstimmenden Peptiden und Spektren ergab.

Proteinidentifikation im S. pombeGenomdatenbank

Wo angegeben, wurden wiedergewonnene tryptische Peptide sequenziert de novo durch Nanoelektrospray-Tandem-Massenspektrometrie auf einem QSTAR Pulsar ich Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer (MDS Sciex, Concord, Kanada) wie beschrieben [97]. MS/MS-Spektren wurden manuell mit der Software BioAnalyst QS v.1.1 interpretiert und Kandidatensequenzen gegen die genomische Sequenz von durchsucht S. pombe bis zum tblastn Programm auf dem NCBI BLAST-Server. Bei der Suche wurde mit mehreren passenden Peptiden ein nicht annotiertes Segment auf Chromosom 1 gefunden. Anschließend wurde die vollständige Sequenz des Gens durch 5'-RACE produziert und an der DNA-Sequenzierungsanlage des MPI CBG, Dresden bestimmt.

Bioinformatische Identifizierung orthologer Gene

Die Suche in Proteinsequenzdatenbanken wurde unter Verwendung einer eigenständigen Version von NCBI-BLAST und der PSI-BLAST-Schnittstelle (positionsspezifischer iterierter BLAST) am NCBI durchgeführt [98]. Um orthologe Gene in zu identifizieren S. cerevisiae und S. pombe, führten wir automatisierte BLAST-Suchen unter Verwendung von Sequenzen aller Untereinheiten aller identifizierten Komplexe durch. Potentielle Orthologe wurden durch reziproke BLAST-Suchen unter Verwendung aller Treffer, deren E-Werte waren weniger als 10-fach höher als die E-Wert des besten Treffers. Die besten Treffer bei der gegenseitigen Suche wurden als Orthologe angesehen. Wenn kein reziprokes bestes Trefferpaar identifiziert wurde, wurden PSI-BLAST-Suchen gegen alle Pilzsequenzen in der nicht redundanten Proteindatenbank durchgeführt. E-Werte und PSI-BLAST-Iterationen für stark divergente Orthologe sind in Abbildung S3 in Zusatzdatendatei 2 gezeigt. Mehrere Sequenz-Alignments, auch in Abbildung S3 in Zusatzdatendatei 2 gezeigt, wurden manuell durchgeführt, indem paarweise Alignments von BLAST als Vorlage verwendet wurden . Reste, die in mindestens 75 % der Sequenzen konserviert waren, sind hervorgehoben. Die Identifizierung von Proteinsequenzdomänen wurde unter Verwendung einer eigenständigen Version der InterproScan-Software [99] gegen die Datenbanken Superfamily und HMM-Pfam unter Verwendung von Standardeinstellungen durchgeführt.

Genetische Interaktionen

Quantitative genetische Interaktionsprofile in S. cerevisiae und S. pombe wurden wie beschrieben erzeugt [51, 100]. Pearson-Korrelationskoeffizienten wurden zwischen allen möglichen Paaren genetischer Profile für einen überlappenden Satz von Genen in beiden Arten berechnet, und die Daten, die Set3 und Hos2 (Hda1) entsprechen, sind in Abbildung 5 als Streudiagramme dargestellt.


Einführung

Aus metabolischer Sicht ist das auffälligste und häufigste Merkmal von Krebszellen die Produktion einer großen Menge Milchsäure trotz der Verfügbarkeit von Sauerstoff, die aus der verbesserten Glykolyse resultiert, die positiv mit der Hochregulation des Glukosetransporters korreliert ist -1 (Glut1) und damit eine Erhöhung der Glukoseaufnahme [1,2,3,4,5]. Obwohl Warburg in den 1920er Jahren der erste war, der dieses Phänomen beobachtete, sind seine molekularen Grundlagen und sein Zusammenhang mit der Krebsgenetik noch immer unvollständig verstanden. Es gibt verschiedene Transkriptionsfaktoren, darunter Myc-Gene/Proto-Onkogene oder die Hypoxie-induzierbaren Faktoren HIF-1 und HIF-2, von denen bekannt ist, dass sie die Glykolyse durch Bindung an ein hochkonserviertes Kohlenhydrat-Response-Element (ChoRE) mit der Konsensussequenz CACGTG oder regulieren Hypoxie-responsive Elemente (HREs), die sich in den Promotoren von Genen befinden, die für glykolytische Enzyme kodieren, wie z LDHA. Diese Faktoren werden als Reaktion auf Veränderungen der Sauerstoffsättigung und Spannung oder des Glukosezugangs aktiviert und stehen nachweislich in engem Zusammenhang mit Krebswachstum und -progression [6,7,8,9,10]. Es ist bekannt, dass die Glykolyse für den Übergang der G1- zur S-Phase im Zellzyklus notwendig ist und die Herunterregulierung der Glykolyse die Zelle in der G1-Phase des Zellzyklus stoppt, was darauf hindeutet, dass der Glukosestoffwechsel eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Zellproliferation spielt [6 , 9, 11]. Es ist auch bekannt, dass in Gegenwart von Sauerstoff die Glykolyse in normalen Zellen gehemmt wird [12]. Der Grund für das Entgehen des „Pasteur-Effekts“ in Krebszellen und die Bevorzugung energieärmerer Prozesse, die auf der Umwandlung von Glukose in Laktat auch in Gegenwart von Sauerstoff basieren, bleibt jedoch ungeklärt.


Wie ein scharfäugiger Wissenschaftler zum Bilddetektiv der Biologie wurde

Allein anhand ihrer Augen und ihres Gedächtnisses hat Elisabeth Bik im Alleingang Tausende von Studien identifiziert, die potenziell gefälschte wissenschaftliche Bilder enthalten.

Im Juni 2013 wurde die Mikrobiologin Elisabeth Bik neugierig auf das Thema Plagiate. Sie hatte gelesen, dass wissenschaftliche Unehrlichkeit ein wachsendes Problem war, und fragte sich beiläufig, ob ihre Arbeit von anderen gestohlen worden sein könnte. Eines Tages fügte sie einen Satz aus einer ihrer wissenschaftlichen Arbeiten in die Suchmaschine Google Scholar ein. Sie stellte fest, dass mehrere ihrer Sätze ohne Erlaubnis in ein obskures Online-Buch kopiert worden waren. Sie fügte ein paar weitere Sätze aus demselben Buchkapitel in das Suchfeld ein und stellte fest, dass einige davon aus den Schriften anderer Wissenschaftler entwendet worden waren.

Bik hat eine methodische, gründliche Veranlagung und hat das Kapitel am Wochenende analysiert. Sie stellte fest, dass es Text enthielt, der aus achtzehn Quellen ohne Abspann kopiert wurde und die sie mit farbcodierten Hervorhebungen kategorisierte. Die Suche nach Plagiaten wurde für Bik zu einer Art Hobby. Sie fing an, in ihrer Freizeit, als sie nicht als Forscherin in Stanford arbeitete, Google Scholar nach weiteren Fällen zu durchsuchen. Sie entdeckte bald dreißig gefälschte biomedizinische Papiere, einige davon in angesehenen Zeitschriften. Sie schickte eine E-Mail an die Herausgeber der Publikationen, und innerhalb weniger Monate wurden einige Artikel zurückgezogen.

Im Januar 2014 scrollte Bik gerade durch eine verdächtige Dissertation, als auch sie anfing, einen Blick auf die Bilder zu werfen. Sie enthielten Fotografien, die als Western Blots bekannt sind und in denen Proteine ​​als dunkle Banden erscheinen. Bik dachte, dass sie eine bestimmte Proteinbande schon einmal gesehen hatte – sie hatte einen dicken kleinen schwarzen Punkt an einem Ende. An anderer Stelle in der Dissertation fand sie das gleiche Band umgedreht und präsentiert, als ob es sich um Daten aus einem anderen Experiment handelte. Sie suchte weiter und entdeckte ein Dutzend weiterer Western Blots, die kopiert oder subtil manipuliert aussahen. Sie erfuhr, dass die Dissertation, die von einem Doktoranden der Case Western Reserve University verfasst wurde, 2010 in zwei Zeitschriftenartikeln veröffentlicht worden war.

Das Vorhandensein eines fehlerhaften Bildes in einer wissenschaftlichen Studie entkräftet nicht unbedingt ihre zentralen Beobachtungen. Aber es kann ein Zeichen dafür sein, dass etwas nicht stimmt. In der Wissenschaft sind Bilder von grundlegender Bedeutung: Jedes Bild und jede Grafik in einer wissenschaftlichen Arbeit soll Daten darstellen, die die Ergebnisse der Autoren unterstützen. Insbesondere fotografische Bilder sind keine Illustrationen, sondern der Beweis selbst. Es schien Bik, dass duplizierte oder manipulierte Bilder für die Wissenschaft schädlicher sein könnten als Plagiate.

Bik beschloss, einige neu veröffentlichte Studien in . zu durchsuchen Plus eins, eine „Open Access“-Zeitschrift, in der Artikel der Öffentlichkeit kostenlos zur Verfügung gestellt werden. (Der gemeinnützige Herausgeber der Zeitschrift erhebt von den Autoren Bearbeitungsgebühren für die Artikel.) Sie öffnete fünfzehn Artikel, jeder in einem eigenen Browser-Tab, und begann, die Bilder zu betrachten, ohne den Text zu lesen. Innerhalb weniger Stunden hatte sie sich rund hundert Studien angesehen und einige doppelte Bilder entdeckt. „Es hat sehr schnell süchtig gemacht“, erzählte mir Bik mit einem ausgeprägten niederländischen Akzent. Nacht für Nacht sammelte sie problematische Artikel, einige mit doppelten Western-Blots, andere mit kopierten Bildern von Zellen oder Geweben. Alle hatten ein Peer-Review durchlaufen, bevor sie akzeptiert wurden. Ein paar Duplikate hätten harmlos sein können – vielleicht eine Verwechslung eines Wissenschaftlers mit einem Ordner voller Dateien. Aber andere Bilder waren geklont, gestreckt, gezoomt, gedreht oder umgekehrt. Die Formen und Muster in der Biologie sind unendlich einzigartig. Bik wusste, dass diese Duplizierungen nicht zufällig passiert sein konnten. Sie wollte jedoch nicht fälschlicherweise einen Wissenschaftlerkollegen in ein Fehlverhalten verwickeln. Sie schickte höfliche E-Mails an die Zeitschriften, die die beiden Case Western-Studien veröffentlicht hatten. Die Redakteure antworteten schließlich und versprachen, ihre Bedenken zu prüfen. Dann vergingen sechs Monate ohne weiteres Wort. Bik war behindert.

Im Jahr 2012 hatten drei Wissenschaftler eine Website namens PubPeer erstellt, auf der Forscher ihre veröffentlichten Arbeiten diskutieren konnten. Kritiker wandten ein, dass die Seite anonyme Kommentare zulasse. Dennoch wurde PubPeer moderiert, um unbegründete Anschuldigungen zu unterbinden, und in mehreren Fällen hatten nicht namentlich genannte Whistleblower damit auf Bildmanipulationen oder statistische Fehler aufmerksam gemacht, was zu größeren Korrekturen und Rücknahmen führte. Es schien Bik, dass die Veröffentlichung ihrer Ergebnisse im Internet eine Grenze überschreiten würde: Der traditionelle Weg, Fragen zur Integrität einer Arbeit zu stellen, war die private Kommunikation mit den Autoren, Zeitschriften oder Universitäten. Sie hat trotzdem ein anonymes Konto erstellt. „Ich habe Bedenken wegen einiger Zahlen in diesem Papier“, schrieb sie für jede Case Western-Studie. Sie lud Screenshots der Bildduplizierungen hoch, wobei die Schlüsselbereiche klar durch blaue oder rote Kästchen abgegrenzt waren, und klickte auf die Schaltfläche zum Senden.

Wissenschaftliches Publizieren ist eine Multimilliarden-Dollar-Industrie. Allein in der Biomedizin werden jedes Jahr mehr als 1,3 Millionen Artikel in der gesamten Wissenschaft veröffentlicht, es gibt mehr als zwölftausend renommierte Zeitschriften. Tausende anderer webbasierter Zeitschriften veröffentlichen selbst die dünnsten Manuskripte nach Schein-Peer-Review gegen Bearbeitungsgebühren. In China kaufen Forscher, die unter dem Druck stehen, unrealistische Veröffentlichungsquoten einzuhalten, Ghostwriting-Papiere auf einem Schwarzmarkt. Da das Web die Verbreitung von Zeitschriften erleichtert hat, hängt der berufliche Fortschritt in der Wissenschaft zunehmend davon ab, so viele Studien wie möglich zu veröffentlichen.

Vor etwa einem Jahrzehnt begannen Wissenschaftler, mit den Auswirkungen dieses aufgeladenen Publish-or-Perish-Systems zu rechnen. Einige Fälle von direktem Betrug – einschließlich der britischen Studie, die Impfstoffe fälschlicherweise mit Autismus in Verbindung brachte – brachten bestimmte wissenschaftliche Disziplinen in der Psychologie, Krebsforschung und anderen Bereichen in Schwierigkeiten repliziert. Reformen wurden eingeleitet. Watchdog-Websites wie PubPeer und Retraction Watch entstanden, und eine Reihe unabhängiger Detektive für Integritätsforschung begannen, Fälle von Fehlverhalten aufzudecken und sie über Blogs, PubPeer und Twitter zu teilen.

Im März 2019, als sie 53 Jahre alt war, beschloss Bik, ihren Job aufzugeben, um diese Detektivarbeit in Vollzeit zu erledigen, und startete einen Blog namens Science Integrity Digest. In den letzten sechseinhalb Jahren hat sie – während sie ein bisschen Einkommen aus Beratung und Vorträgen verdient und ein wenig Crowdfunding erhält – mehr als 450.000 Artikel identifiziert, die verdächtige Bildduplizierungen enthalten, und diese in einer Master-Tabelle dokumentiert. Auf Twitter folgen mittlerweile mehr als hunderttausend Menschen ihren Exposés.

Bik wuchs mit zwei Geschwistern in Gouda in den Niederlanden auf, wo ihre Mutter und ihr Arztvater in ihrem roten Backsteinhaus an einem von Bäumen gesäumten Kanal eine Arztpraxis führten. Im Alter von acht Jahren wollte Bik Ornithologin werden und verbrachte Stunden mit dem Fernglas, um den Garten nach Vögeln abzusuchen und alle Arten aufzuzeichnen, die sie gesichtet hatte. Sie entdeckte die Wissenschaft, erwarb einen Ph.D. in Mikrobiologie und zog kurz nach 9/11 in die Vereinigten Staaten, als ihr Ehemann Gerard, ein Optiker, einen Job im Silicon Valley bekam. Sie verbrachte fünfzehn Jahre damit, das Mikrobiom in einem Labor in Stanford zu studieren, bevor sie in die Biotech-Industrie wechselte.

Als Bik zum ersten Mal über das Problem der Bildvervielfältigung stolperte, hatten einige Zeitschriftenredakteure darüber geschrieben, aber niemand hatte das Ausmaß des Problems festgestellt. She e-mailed two prominent microbiologists, Ferric Fang and Arturo Casadevall, who had studied retractions in science publishing, introducing herself along with image duplications she’d found in Infektion und Immunität und mBio—journals for which Fang and Casadevall were the editors-in-chief, respectively. The three agreed to a systematic study. Bik would screen papers in forty different journals, and Fang and Casadevall would review her findings.

In 2016, the team published their results in mBio. When journal editors examine questionable images, they typically use Photoshop tools that magnify, invert, stretch, or overlay pictures, but Bik does the same work mostly with her eyes and memory alone. Working at a speed of a few minutes per article, she had screened a jaw-dropping 20,621 studies. The team concluded that she was right ninety per cent of the time the remaining ten per cent of images included some that were too low-resolution to allow for a clear determination. They reported “inappropriate” image duplications in seven hundred and eighty-two, or four per cent, of the papers around a third of the flagged images involved simple copies, which could have been inadvertent errors, but at least half of the cases were sophisticated duplications which had likely been doctored. “Sometimes it seems almost like magic that the brain can do this,” Fang told me, of Bik’s abilities.

The trio estimated that, of the millions of published biomedical studies, tens of thousands ought to be retracted for unreliable or faked images. But adjusting the scientific record can be maddeningly slow, especially when research is lower-profile. In total, it took journal editors more than thirty months to retract the two Case Western papers that Bik had reported. In addition to contacting editors, Bik sometimes reaches out to research institutions, or to the Office of Research Integrity (O.R.I.), a government agency responsible for investigating misconduct in federally funded science. But the O.R.I. and institutions have protocols—they must obtain lab notebooks, conduct interviews, and so on—which take time to unfold.

By 2016, Bik had reported all seven hundred and eighty-two papers in the mBio study to journal editors (including at Plus eins). As of this June, two hundred and twenty-five had been corrected, twelve had been tagged with “expressions of concern,” and eighty-nine had been retracted. (Among them were five discredited studies by a cancer researcher at Pfizer, who was fired.) As far as Bik knows, fifty-eight per cent of the studies remain at large. In the past five years, she has reported problematic images in another 4,132 studies only around fifteen per cent have been addressed so far. (Three hundred and eighty-two have been retracted.) In only five or ten cases has she been told that authors proved her image concerns to be unfounded, she said.

Frustrated by these long timetables, Bik has transitioned to sharing more of her findings online, where journal readers can encounter them. On PubPeer, where she is the most prolific poster who uses her real name, her comments are circumspect—she writes that images are “remarkably similar” or “more similar than expected.” On Twitter, she is more performative, and often plays to a live audience. “#ImageForensics Middle of the Night edition. Level: easy to advanced,” Bik tweeted, at 2:41 BIN. one night. She posted an array of colorful photographs that resembled abstract paintings, including a striated vista of pink and white brushstrokes (a slice of heart tissue) and a fine-grained splattering of ruby-red and white flecks (a slice of kidney). Six minutes later, a biologist in the U.K. responded: two kidney photos appeared identical, she wrote. A minute later, another user flagged the same pair, along with three lung images that looked like the same tissue sample, shifted slightly. Answers continued trickling in from others they drew Bik-style color-coded boxes around the cloned image parts. At 3:06 BIN., Bik awarded the second user an emoji trophy for the best reply.

In Silicon Valley, Bik and her husband live in an elegant mid-century-modern ranch house with a cheerful, orange front door and a low-angled pitched roof. In the neighborhood, the residence is one of many duplicate copies sporting varying color schemes. I visited Bik just before the pandemic began. Tall, with stylish blue tortoiseshell eyeglasses and shoulder-length chestnut hair, she wore a blouse with a recurring sky-blue-and-orange floral pattern and had a penetrating, blue-eyed gaze. While Bik made tea, her husband, clad in a red fleece jacket, toasted some frozen stroopwafel cookies, from Gouda.

Playing tour guide, Bik showed off the original features of their kitchen, including its white Formica countertop, flecked with gold and black spots. “It’s random!” she assured me—no duplications. The same could not be said of the textured gray porcelain floor tiles. When workers installed them, Bik explained, she’d asked them to rotate the pieces that were identical, so that repeats would be less noticeable. A few duplicate tiles had ended up side-by-side anyway. I couldn’t see the duplication until she traced an identical wavy ridge in each tile with both of her index fingers. “Sorry—I’m, like, weird,” she said, and laughed.

In her bedroom closet, Bik’s shirts hung in a color gradient progressing from blacks and browns to greens and blues. Not long ago, she helped arrange her sister-in-law’s enormous shoe collection by color on new storage racks when some friends complained about the messy boxes of nuts, screws, and nails that littered their garage, Bik sorted them into little drawers. “Nothing makes me more happy,” she told me. Since childhood, she has collected tortoise figurines and toys around two thousand of them are arranged in four glass cabinets next to a blond-wood dining table. She keeps a spreadsheet tracking her turtle menagerie: there are turtles made from cowrie seashells, brass turtles, Delft blue porcelain turtles, bobble-headed turtles, turtle-shaped wood boxes with lids, and “functional” turtles (key chains, pencil sharpeners). She showed me a small stuffed animal with an eye missing: Turtle No. 1. (She has stopped adding to her collection. “I don’t want it to overtake my house,” she said.)

That afternoon, Bik settled at her dining table, which serves as her desk. Floor-to-ceiling windows offered a tranquil view of backyard foliage. On her curved widescreen monitor, Bik checked her Twitter account—her bio featured a photo of a cactus garden “That’s me—prickly,” she said—and then pulled up her master spreadsheet of problematic papers, which she doesn’t share publicly. Each of its thousands of entries has more than twenty columns of details. She removed her glasses, set them next to a cup of chamomile tea, sat up straight, and began rapidly scanning papers from Plus eins with her face close to the monitor. Starting with the first study—about “leucine zipper transcription factor-like 1”—she peered at an array of Western-blot images. She took screenshots and scrutinized them in Preview, zooming in and adjusting the contrast and brightness. (Occasionally, she uses Forensically and ImageTwin, tools that do some semi-automated photo-forensics analysis.) She moved on to a study with pink and purple cross-sections of mouse-gut tissue, then stopped on a figure with a dozen photos of translucent clumps of cells. She chuckled. “It looks like a flying rabbit,” she said, pointing at one blob.

Bik found no problems. Plus eins has “cleaned up their act a lot,” she said. The journal’s publisher employs a team of three editors who handle matters of publication ethics, including Bik’s cases. Renee Hoch, one of the editors, told me that the process of investigation, which entails obtaining original, raw images from the authors, and, in some cases, requesting input from external reviewers, usually takes four to six months per case. Hoch said that of the first hundred and ninety or so of Bik’s cases that the team had resolved, forty-six per cent required corrections, around forty-three per cent were retracted, and another nine per cent received “expressions of concern.” In only two of the resolved papers was nothing amiss. “In the vast majority of cases, when she raises an issue and we look into it, we agree with her assessment,” Hoch said.

Could Bik be replaced with a computer? There are arguments for the idea that automated image-scanning could be both faster and more accurate, with fewer false positives and false negatives. Hany Farid, a computer scientist and photo-forensic expert at the University of California, Berkeley, agreed that scientific misconduct is a troubling issue, but was uneasy about individual image detectives using their own judgment to publicly identify suspect images. “One wants to tread fairly lightly” when professional reputations are on the line, he told me. Farid’s reservations spring partly from a general skepticism about the accuracy of the human eye. While our visual systems excel at many tasks, such as recognizing faces, they aren’t always good at other kinds of visual discrimination. Farid sometimes provides court testimony in cases involving doctored images his lab has designed algorithms for detecting faked photographs of everyday scenes, and they are eighty-to-ninety-five-per-cent accurate, with false positives in roughly one in a hundred cases. Judging by courtroom standards, he is unimpressed by Bik’s stats and would prefer a more rigorous assessment of her accuracy. “You can audit the algorithms,” Farid said. “You can’t audit her brain.” He would like to see similar systems designed and validated for identifying faked or altered scientific images.

A few commercial services currently offer specialized software for checking scientific images, but the programs aren’t designed for large-scale, automated use. Ideally, a program would extract images from a scientific paper, then rapidly check them against a huge database, detecting copies or manipulations. Last year, several major scientific publishers, including Elsevier, Springer Nature, and EMBO Press, convened a working group to flesh out how editors might use such systems to pre-screen manuscripts. Efforts are under way—some funded by the O.R.I.—to create powerful machine-learning algorithms to do the job. But it’s harder than one might think. Daniel Acuña, a computer scientist at Syracuse University, told me that such programs need to be trained on and tested against large data sets of published scientific images for which the “ground truth” is known: Doctored or not? A group in Berlin, funded by Elsevier, has been slowly building such a database, using images from retracted papers some algorithm developers have also turned to Bik, who has shared her set of flawed papers with them.

Bik told me that she would welcome effective automated image-scanning systems, because they could find far more cases than she ever could. Still, even if an automated platform could identify problematic images, they would have to be reviewed by people. A computer can’t recognize when research images have been duplicated for appropriate reasons, such as for reference purposes. And, if bad images are already in the published record, someone must hound journal editors or institutions until they take action. Around forty thousand papers have received comments on PubPeer, and, for the vast majority, “there’s absolutely no response,” Boris Barbour, a neuroscientist in Paris who is a volunteer organizer for PubPeer, told me. “Even when somebody is clearly guilty of a career of cheating, it’s quite hard to see any justice done,” he said. “The scales are clearly tilted in the other direction.” Some journals are actively complicit in generating spurious papers a former journal editor I spoke with described working at a highly profitable, low-tier publication that routinely accepted “unbelievably bad” manuscripts, which were riddled with plagiarism and blatantly faked images. Editors asked authors to supply alternative images, then published the studies after heavy editing. “I think what she’s showing is the tip of the iceberg,” the ex-editor said, of Bik.

Some university research-integrity officers point out, with chagrin, that whistle-blowing about research misconduct on social media can tip off the scientists involved, allowing them to destroy evidence ahead of an investigation. But Bik and other watchdogs find that posting to social media creates more pressure for journals and institutions to respond. Some observers worry that the airing of dirty laundry risks undermining public faith in science. Bik believes that most research is trustworthy, and regards her work as a necessary part of science’s self-correcting mechanism universities, she told me, may be loath to investigate faculty members who bring in grant money, and publishers may hesitate to retract bad articles, since every cited paper increases a journal’s citation ranking. (In recent years, some researchers have also sued journals over retractions.) She is appalled at how editors routinely accept weak excuses for image manipulation—it’s like “the dog ate my homework,” she said. Last year, she tweeted about a study in which she’d found more than ten problematic images the researchers supplied substitute images, and the paper received a correction. “Ugh,” she wrote. “It is like finding doping in the urine of an athlete who just won the race, and then accepting a clean urine sample 2 weeks later.”

Last year, Bik’s friend Jon Cousins, a software entrepreneur, made a computer game called Dupesy, inspired by her work. One night, after Thai takeout, we tried a beta version of the game at her computer. Bik’s husband went first, clicking a link titled “Cat Faces.”

A four-by-four panel of feline mugshots filled the screen. Some cats looked bug-eyed, others peeved. Instructions read, “Click the two unexpectedly similar images.” Gerard easily spotted the duplicates in the first few rounds, then hit a more challenging panel and sighed.

“I see it, I see it,” Bik sang quietly.

Finally, Gerard clicked the winning pair. He tried a few more Dupesy puzzle categories: a grid of rock-studded concrete walls, then “Coarse Fur,” “London Map,” and “Tokyo Buildings.”

When my turn came, I started with “Coffee Beans.” On one panel of dark-roasted beans, it took me thirty-one seconds to find the matching pair on the next, six seconds. A few panels later, I was stuck. My eyes felt crossed. A nearby clock ticked loudly.

“Should I say when I see it?” Bik asked. “Or is that annoying?”

“Just tell me when it’s annoying, because I don’t always know,” she said.

“Absolutely. You’re annoying,” he replied.

On her turn, Bik cruised swiftly through several rounds of “Coarse Fur,” then checked out other puzzle links. Some panels were “much harder than my normal work,” she said. The next day, Cousins e-mailed us with results: Bik’s median time for solving the puzzles was twelve seconds, versus about twenty seconds for her husband and me.


Biology: Year 10 Mocks

- It provides medical benefits in the fields of therapeutic cloning and regenerative medicine.
- It provides great potential for discovering treatments and cures to a variety of diseases including Parkinson's disease, schizophrenia, Alzheimer's disease, cancer, spinal cord injuries, diabetes and many more.
- Limbs and organs could be grown in a lab from stem cells and then used in transplants or to help treat illnesses.
- It will help scientists to learn about human growth and cell development.
- Scientists and doctors will be able to test millions of potential drugs and medicine, without the use of animals or human testers. This necessitates a process of simulating the effect the drug has on a specific population of cells. This would tell if the drug is useful or has any problems.
- Stem cell research also benefits the study of development stages that cannot be studied directly in a human embryo, which sometimes are linked with major clinical consequences such as birth defects, pregnancy-loss and infertility. A more comprehensive understanding of normal development will ultimately allow the prevention or treatment of abnormal human development.
- Stem cell research also benefits the study of development stages that cannot be studied directly in a human embryo, which sometimes are linked with major clinical consequences such as birth defects, pregnancy-loss and infertility. A more comprehensive understanding of normal development will ultimately allow the prevention or treatment of abnormal human development.
- An advantage of the usage of adult stem cells to treat disease is that a patient's own cells could be used to treat a patient. Risks would be quite reduced because patients' bodies would not reject their own cells.
- Embryonic stem cells can develop into any cell types of the body, and may then be more versatile than adult stem cells.

- The use of embryonic stem cells for research involves the destruction of blastocysts formed from laboratory-fertilized human eggs. For those people who believe that life begins at conception, the blastocyst is a human life and to destroy it is immoral and unacceptable.
- Like any other new technology, it is also completely unknown what the long-term effects of such an interference with nature could materialize.
- Embryonic stem cells may not be the solution for all ailments.
- According to a new research, stem cell therapy was used on heart disease patients. It was found that it can make their coronary arteries narrower.
- A disadvantage of most adult stem cells is that they are pre-specialized, for instance, blood stem cells make only blood, and brain stem cells make only brain cells.
- These are derived from embryos that are not a patient's own and the patient's body may reject them.

Plasma is the main component of blood and consists mostly of water, with proteins, ions, nutrients, and wastes mixed in.

Red blood cells are responsible for carrying oxygen and carbon dioxide.

Platelets are responsible for blood clotting.

White blood cells are part of the immune system and function in immune response.

Oesophagus (pushed down by peristalsis)

Stomach (churned + mixed with protease and
↓ hydrochloric acid)

Duodenum (continues digestions with proteases,
↓ lipases and carbohydrases)

Ileum (also continues from duodenum, has villi
↓ to allow rapid diffusion)


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