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Was verursacht Mutationen in regulatorischen Genen?


Was verursacht im Detail Mutationen in regulatorischen Genen?


nichts verursacht Mutationen in bestimmten Genen. Mutationen entstehen tatsächlich als Ergebnis zufälliger Prozesse und können jeden beliebigen Punkt im Genom mutieren. Mutationen können in einigen Genen oder Regionen des Genoms häufiger gefunden werden, weil sie eine positive Selektionskraft haben, die ihnen im Laufe der Zeit mehr Durchhaltevermögen im Genpool verleiht.

Es ist besser, es so zu sehen: Mutationen passieren überall, aber sie bleiben häufiger im Genpool, wenn sie etwas Nützliches tun. Gene sind die aktiven Teile des Genoms, so dass Mutationen in Genen mit größerer Wahrscheinlichkeit bestehen bleiben.


18.5: Mutation und Evolution

  • Beigetragen von John W. Kimball
  • Professor (im Ruhestand) an der Tufts University und Harvard

Mutationen sind die Rohstoffe der Evolution. Evolution hängt absolut von Mutationen ab, denn nur so entstehen neue Allele und neue Regulationsregionen. Dies erscheint jedoch paradox, da die meisten von uns beobachteten Mutationen schädlich sind (z. B. viele Missense-Mutationen) oder bestenfalls neutral sind, zum Beispiel "stille" Mutationen, die dieselbe Aminosäure kodieren. Auch viele der Mutationen in den riesigen DNA-Mengen, die zwischen den Genen liegen. Darüber hinaus betreffen die meisten Mutationen in Genen ein einzelnes Proteinprodukt (oder einen kleinen Satz verwandter Proteine, die durch alternatives Spleißen eines einzelnen Gentranskripts hergestellt werden), während viele evolutionäre Veränderungen unzählige strukturelle und funktionelle Veränderungen im Phänotyp beinhalten.

Wie können also die kleinen Veränderungen in Genen, die durch Mutationen verursacht werden, insbesondere durch Einzelbasen-Substitutionen ("Punktmutationen"), zu den großen Veränderungen führen, die eine Art von einer anderen unterscheiden? Auf diese Fragen gibt es bisher nur vorläufige Antworten.


Mutationsnachweis im LDLR-Gen | Genetik | Biologie

In diesem Artikel diskutieren wir die Mutationsanalyse von LDLR-Mutationen bei Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie.

Einführung in die Mutationserkennung im LDLR-Gen:

In einigen Familien ist das Risiko einer frühen koronaren Herzkrankheit durch die Vererbung einer bestimmten Mutation in einem von zwei Genen (Apolipoprotein B, ApoB [OMIM #107730] oder Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor, LDLR [OMIM #143890 .) erheblich erhöht ]), die zur familiären Hypercholesterinämie (FH) führt.

FH ist gekennzeichnet durch eine autosomal-dominante Vererbung, schwere Hypercholesterinämie, vorzeitige Atherogenese und Cholesterinablagerungen in Haut, Sehnen (Sehnenxanthom) oder in und um die Augen (Hornhautbogen und Xanthelasma). Bei den meisten FH-Patienten wird die Störung durch eine Mutation im LDLR-Gen verursacht, die seine Funktion zerstört oder erheblich beeinträchtigt.

FH gehört zu den häufigsten metabolischen genetischen Störungen, wobei die Prävalenz für Mutationen bei LDLR auf einen von 400 bis 500 und für ApoB-Mutationen auf einen von 1000 geschätzt wird, häufiger als entweder Mukoviszidose oder Sichelzellanämie. Jüngste Berichte aus dem Vereinigten Königreich und den Niederlanden deuten darauf hin, dass die überwiegende Mehrheit dieser Personen nicht identifiziert und unbehandelt bleibt.

In diesen beiden Ländern gibt es umfangreiche Beweise dafür, dass die Fallfindung in Kombination mit Familienscreening und Mutationserkennung eine sehr effektive Methode ist, um den Prozentsatz der FH-Patienten, die eine wirksame Behandlung erhalten, zu erhöhen.

Mit Ausnahme einiger Populationen, bei denen Gründermutationen gemeldet wurden (französische Kanadier, Finnen, aschkenasische Juden litauischer Abstammung, christliche Libanesen, Niederländer und Afrikaner), verursacht eine relativ große Anzahl verschiedener Mutationen in den meisten Populationen FH, wobei unterschiedliche Mutationen vorherrschen in verschiedenen Populationen.

Über 700 LDLR-Genmutationen wurden weltweit gemeldet, und es werden regelmäßig neue Mutationen gemeldet ( www (dot)ucl(dot)ac(dot)uk/fh/), im Gegensatz zu nur drei Mutationen, die im apoB-Gen beschrieben wurden das verursacht FH.

Da die häufigsten bekannten LDLR-Mutationen nur bei einem kleinen Anteil der Patienten vorhanden sind, ist eine anfängliche Teststrategie auf spezifische Mutationen (wie sie bei Mukoviszidose routinemäßig ist, wo eine einzelne Mutation mehr als 70 % der Mutationen ausmacht) ausgeschlossen, da a ersten Schritt in Ländern mit heterogener Bevölkerung.

Bei einigen heterozygoten FH-Individuen kann aufgrund eines stark erhöhten Cholesterinspiegels und der damit verbundenen klinischen Merkmale eine eindeutige Diagnose gestellt werden. Eines der Probleme bei der Verwendung von Hypercholesterinämie als Hauptkriterium für die Diagnose von FH besteht jedoch darin, dass die Plasmalipidspiegel bei heterozygoten FH-Patienten mit denen in der allgemeinen Population überlappen.

Die Verwendung von DNA-Tests zur Bestätigung der Diagnose von FH bei Familienmitgliedern von identifizierten LDLR-Mutationsträgern legt nahe, dass zwischen 15-20% der erwachsenen Verwandten und 5-10% der Kinder allein durch Cholesterintests fehldiagnostiziert werden können.

Der LDL-Rezeptor wird von einem großen Gen kodiert, das aus 18 Exons besteht, die ungefähr 45 Kilobasen umfassen. Seine Größe zusammen mit der großen Anzahl von Mutationen, die in den Kodierungs- und Kontrollregionen gefunden werden, bedeutet, dass Mutationen durch einfache diagnostische Assays nicht leicht nachgewiesen werden können und die Sequenzierung der gesamten LDLR-Gene des Patienten im klinischen Maßstab aus Kostengründen unerschwinglich ist.

Die bei weitem die Mehrheit der in diesem Gen beschriebenen Mutationen sind Einzelbasensubstitutionen oder Deletionen und Insertionen von nur wenigen Basenpaaren (ungefähr 90%), wobei der Rest Deletionen von mehreren Introns und Exons sind. Darüber hinaus wurden 35 Polymorphismen und eine Reihe von stillen Mutationen durch das LDLR-Gen beschrieben.

Insbesondere komplizieren die LDLR-Polymorphismen den Screening-Prozess, da, obwohl die Allelfrequenzen für diese Polymorphismen innerhalb verschiedener Populationen von 0,5% bis 96% reichen, die Mehrheit mit Allelfrequenzen von 30–70% auftritt.

Daher ist es sinnvoll, ein Pre-Screening-Verfahren zu verwenden, um spezifische kleine Variationsregionen für die weitere Analyse durch Sequenzierung zu identifizieren, wie dies beim BRCA1- und BRCA2-Genmutationsscreen­ing für familiäres Mammakarzinom der Fall war.

Methoden, wie der Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (SSCP), die früher zum Screening auf LDLR-Mutationen verwendet wurden, sind nicht sensitiv und arbeitsintensiv. Die optimale DNA-Länge für die SSCP-Analyse scheint 150 bis 200 Nukleotide mit einer Mutationsdetektionsempfindlichkeit für Fragmente dieser Größe im Bereich von 70-90% zu sein.

Die Sensitivität dieser Technik nimmt mit zunehmender Größe des Fragments ab und es ist oft notwendig, Proben unter verschiedenen experimentellen Bedingungen, einschließlich der Elektrophoresetemperatur, zu untersuchen, um Varianten zuverlässig nachzuweisen.

Es wurde berichtet, dass DHPLC zahlreiche Vorteile gegenüber SSCP hat. Die Analyse ist schnell, kostengünstig und halbautomatisch. Amplikons von 200 bis 500 Nukleotiden liegen im idealen Bereich für den Heteroduplex-Nachweis, wobei Sensitivität und Spezifität mit 96-100 % angegeben werden. Darüber hinaus sind die Elutionsprofile in den meisten Fällen für jede gegebene Sequenzvariante unterschiedlich, was die Differenzierung von Polymorphismen von pathogenen Mutationen ermöglicht.

Zuvor haben wir über einen Vergleich von SSCP mit DHPLC berichtet, der ihre Wirksamkeit als Vorscreening-Methoden zum Nachweis von LDLR-Mutationen bei neuseeländischen Patienten mit FH in einer Forschungsumgebung bewertete. Im Vergleich zu DHPLC konnten wir durch SSCP nur 64 % der Mutationen nachweisen.

Als Ergebnis haben wir diagnostische Tests durch LDLR-Mutationsscreening durch DHPLC implementiert. Wir haben den ersten LDLR-Gendiagnostik-Assay entwickelt, der DHPLC-Pre­screening mit automatisiertem PCR-Setup und DNA-Sequenzierung von Varianten integriert.

LDLR-Mutationserkennung in einer diagnostischen Einstellung:

Bei der Implementierung eines neuen diagnostischen Assays müssen eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden, um eine rechtzeitige Bereitstellung eines wirksamen Dienstes zu ermöglichen. Dazu gehören: Durchlaufzeiten für die Berichterstellung, Automatisierung für größere Probenzahlen und geringeres Risiko von Handhabungsfehlern, Optimierung auf einen einzigen Satz von PCR-Parametern für reduzierte Handhabungsbedingungen und einfache automatisierte Einrichtung sowie, möglicherweise von größter Bedeutung, Spezifität und Empfindlichkeit gegenüber Vermeiden Sie die Meldung von falsch positiven und falsch negativen Ergebnissen.

Die Analyse des LDLR-Gens erfordert die Amplifikation jeder Patientenprobe in einer Anzahl von Fragmenten oder Amplikons, um die kodierenden und Kontrollregionen zu umfassen. Zuvor wurde das LDLR-Gen unter mehreren PCR-Bedingungen in 21 Fragmenten zur Analyse durch SSCP amplifiziert, die eine Größe von 127 bis 355 Basenpaaren aufweisen.

Da es wichtig war, dass der entwickelte LDLR-Diagnoseassay die oben beschriebenen Anforderungen an die Bearbeitungszeit und die Automatisierung erfüllte, wurde der Screening-Prozess so konzipiert, dass die Analyse von Patientenproben in Chargengrößen, die mit der erhaltenen Probenanzahl übereinstimmen, ermöglicht wird. Daher werden pro Batch in zwei Mikrotiterplatten (insgesamt 168 Wells) in einem weitgehend automatisierten Prozess sieben Patientenproben plus Kontrollen für alle 21 Amplikons gleichzeitig gescreent.

Proben wurden von offensichtlich nicht verwandten Personen mit klinischer und wahrscheinlicher FH erhalten, die Kliniken für Lipidstörungen in den Krankenhäusern von Christchurch oder Dunedin aufsuchten. Diese Patienten hatten ein Plasmacholesterin von >8,0 mmol/l und eine Familienanamnese mit Hypercholesterinämie und/oder klassischen klinischen Stigmata von FH. DNA wurde nach einer etablierten Methode aus den Vollblutproben der Patienten extrahiert.

Die bekannten Mutationen im apoB-Gen (R3500Q, R3531C und R3500W) wurden durch PCR und Restriktionsanalyse ausgeschlossen. Nach dem PCR-Aufbau in zwei Mikrotiterplatten durch eine Tecan-Roboter-Workstation (Tecan AG, Schweiz) wurden alle Exons unter einer Reihe von Bedingungen unter Verwendung von Roche Taq Polymerase (Deutschland) amplifiziert.

Vor der Analyse wurden Heteroduplikate durch Erhitzen der PCR-Produkte auf 95 °C für fünf Minuten und langsames Abkühlen auf Raumtemperatur über eine Stunde gebildet. Die Proben wurden über Nacht durch DHPLC unter Verwendung eines WAVE Nucleic Acid Fragment Analysis Systems analysiert, das eine C18-Umkehrphasensäule basierend auf nicht porösen Poly(styrol-divinylbenzol)-Partikeln (DNASep Cartridge) von Transgenomic (Omaha, NE, USA) umfasste. DNA wurde von der Säule durch einen Acetonitrilgradienten in 0,1 mol/l Triethylammoniumacetatpuffer (TEAA), pH 7, bei einer konstanten Flussrate von 0,9 ml/min eluiert.

Das Schmelzprofil für jedes DNA-Fragment, die jeweiligen Elutionsprofile und Säulentemperaturen wurden mit der WAVEMAKER™-Software von Transgenomic bestimmt und gegen eine Positivkontrolle weiter optimiert.

Jede Sequenzänderung wurde in zwei unabhängig amplifizierten PCR-Produkten durch direkte Zyklussequenzierung von doppelsträngiger DNA mit 33P-markierten Terminatoren und ThermoSequenase gemäß den Anweisungen des Herstellers (Amersham Pharmacia Biotech, NZ) bestätigt.

Während die Verwendung eines einzigen Satzes von Bedingungen die Geschwindigkeit der Probenvorbereitung für die Analyse durch DHPLC stark verbessert hat, gab es einige Nachteile. Es werden akzeptable Produkte hergestellt, die jedoch hinsichtlich Ausbeute oder Produktqualität für die DHPLC nicht unbedingt optimal sind. Einige unspezifische Vorpeaks werden während der DHPLC für bestimmte Amplikons beobachtet, obwohl diese zwischen Proben und Läufen konsistent sind, sodass der Bediener ihr Vorhandensein korrigieren kann.

Obwohl die PCR-Ausbeute zwischen den Amplikons variiert, wird die Variation auch zwischen den Patientenproben (mit einem Faktor zwischen eins und drei) in einem ähnlichen Ausmaß beobachtet und kann durch kleine Änderungen in der Skalierung der Spuren ausgeglichen werden.

Optimierung des DHPLC-Screenings:

Das LDLR-Gen ähnelt vielen anderen Genen hinsichtlich des Ansatzes zum Muta-Screening durch DHPLC. Zu berücksichtigende Faktoren umfassen: Primerauswahl, Größe der Amplikons, Auswahl der positiven Kontrollen, Vorhandensein mehrerer Schmelzdomänen innerhalb der Fragmente und optimale Temperatur für die Analyse.

Das LDLR-Gen ist jedoch größer als die meisten routinemäßig in einem diagnostischen Umfeld gescreenten Gene und weist eine größere Anzahl von Mutationen auf, wobei mehr als 700 beschrieben und regelmäßig über mehr berichtet wird.

Diese Mutationen sind auch über alle Exons und Intron/Exon-Grenzen verteilt, die beide relativ polymorph sind. Daher besteht eine deutliche Chance, dass DHPLC-Profile für verschiedene Mutationen ähnlich sind. Der Einfluss dieser Faktoren auf die Entwicklung des diagnostischen LDLR-Screenings wird im Folgenden diskutiert.

Auswahl an Primern:

Für die LDLR-Mutationsanalyse sowohl durch SSCP als auch durch Denaturierungsgradienten-Gelelektrophorese (DGGE) wurden eine Reihe von Primersets beschrieben, die als sensitiver, aber auch technisch anspruchsvoller und arbeitsintensiver als SSCP gelten (www(dot)ucl( dot)ac(dot)uk/fh/primers(dot)html).

Da wir daran interessiert waren, SSCP und DHPLC zu vergleichen, wurde ein Primer-Set für beide Anwendungen basierend auf den Anforderungen des SSCP-Designs ausgewählt. Während die DHPLC-Schmelz- und -Schiebeprofile für einige der mit diesen Primern erhaltenen Amplikons nicht ideal waren, boten sie einen effektiven Ausgangspunkt für den Screening-Prozess.

In einigen Fällen wurden Primer an Sequenzen innerhalb oder unmittelbar angrenzend an Intron/Exon-Grenzen angelagert und da ungefähr 46 Spleißstellen-Mutationen für das LDLR beschrieben wurden, war es notwendig, einige dieser Primer zu verlagern, um diese Regionen zu umfassen. Zum Beispiel umfasst das Exon 2-Produkt, das mit den von Hobbs und Kollegen entwickelten Primern amplifiziert wurde, einen Abschnitt von sechs Nukleotiden, der 17 berichtete Spleißmutationen enthält, die in der 5′-Donorstelle geclustert sind.

Der stromaufwärts gelegene Primer annealt jedoch an diese Nukleotide, was den Nachweis einer dieser Mutationen unwahrscheinlich macht. Daher wurde ein neues Amplikon entworfen, um die Analyse dieser Region zu ermöglichen, wobei ein neuer Primer ungefähr 50 Nukleotide von der Intron/Exon-Grenze anlagert.

Generierung von Positivkontrollen:

Obwohl verschiedene Softwarepakete die ‘optimale’ Temperatur für das Screening durch DHPLC vorhersagen können, ist die Verwendung von Positivkontrollen, die eine einzelne Basensubstitution oder eine kleine Deletion enthalten, unerlässlich, um die für jedes Amplikon verwendete Temperatur zu überprüfen und zu verfeinern. Diese Kontrollen bieten auch eine gewisse Sicherheit, dass die diskriminierenden Bedingungen zwischen den DHPLC-Läufen aufrechterhalten werden.

Die Nichtidentifizierung von anormalen Spuren für die Positivkontrolle würde auf Variationen der Pufferbedingungen, des Säulenzustands oder der Ofenkalibrierung hinweisen und ist für die Kontrolle falsch-negativer Ergebnisse während des diagnostischen Screenings unerlässlich. Die Kalibrierung von Öfen kann auch zwischen den Geräten variieren, was zu Abweichungen führt, wenn das Screening (bei leicht unterschiedlichen Temperaturen) auf mehreren Geräten durchgeführt wird.

Dies bedeutet auch, dass die von der WAVEMAKER-Software vorhergesagten oder in der Literatur angegebenen Temperaturen einen guten Anhaltspunkt bieten, aber möglicherweise nicht direkt vom Instrument auf das Instrument übertragbar sind. Daher ist die Temperaturoptimierung und -verifizierung durch Positivkontrollen wichtig und wird alle Probleme lösen, die sich aus diesen Unterschieden ergeben.

Positivkontrollen für jedes Amplikon zu erhalten, ist jedoch ein schwieriger Schritt. Hier wurden sie von Professor Steve Humphries (University College London, UK) und Dr. Ros Thiart (Universität Stellenbosch) erhalten, außer in den Fällen der Promotorregion und des Exons 18 (Tabelle 6-1). Positivkontrollen wurden für die letzten beiden Fragmente wie unten beschrieben synthetisiert.

In unserem Labor wurden bereits eine Reihe von Methoden zur Generierung von Positivkontrollen untersucht, darunter: Screening von Amplikons auf polymor­phische Restriktionsenzymstellen, ortsgerichtete Mutagenese (SDM) unter Verwendung des Megaprimer-Protokolls und Ligation während der Amplifikation (LDA) SDM. Da weder in den Promotor- noch in den Exon-18-Amplikons polymorphe Restriktionsstellen identifiziert wurden, war es notwendig, positive Kontrollen für diese Amplikons zu erzeugen.

Die Einführung einer spezifischen Mutation durch SDM durch das Megaprimer-Protokoll umfasst ein mehrstufiges PCR- und Restriktionsverdau-Protokoll, während LDA-SDM eine einzelne Verlängerungs- und Ligations-PCR umfasst, die eine schnellere Synthese ermöglicht. Aufgrund der Schnelligkeit und Einfachheit der Synthese wurde die LDA-SDM-Methode als die am besten geeignete Methode zur Erzeugung von Positivkontrollen ausgewählt und verwendet, um eine einzigartige Restriktionsstelle innerhalb jedes Amplikons zu eliminieren.

Kurz gesagt, wurden eine thermostabile Ligase und ein phosphorylierter mutagener Primer, der eine einzelne Basenfehlpaarung enthielt, in eine Standard-PCR-Reaktionsmischung eingeschlossen und die Zyklusbedingungen modifiziert, um eine siebenminütige Verlängerung bei 65 °C einzuschließen. Der mutagene Primer wurde entwickelt, um eine einzigartige Restriktionsstelle zu eliminieren, was die Verdauung des Wildtyp-Produkts nach der Amplifikation ermöglicht.

Die verdauten Reaktionen wurden dann verdünnt und erneut amplifiziert, um 100% mutiertes Produkt zu erhalten. Das mutierte Produkt wurde sequenziert, um die Mutation zu bestätigen, und wurde im gleichen Verhältnis mit Wildtyp-PCR-Produkt gemischt, um Heteroduplikate für die DHPLC-Analyse zu erhalten. Die synthetisierte Mutante wurde durch DHPLC gegen eine Wildtyp-(nor­mal)-Kontrolle analysiert (Abbildung 6-1). Diese Methode ermöglicht die Generierung mehrerer positiver Kontrollen innerhalb von ein bis zwei Tagen.

Mehrere Schmelzdomänen:

Das LDLR-Gen ist relativ GC-reich, wobei mehrere Exons lange, sich wiederholende Abschnitte von GCs aufweisen (Tabelle 6-1). Aufgrund von Sequenzbeschränkungen ist es möglicherweise nicht immer möglich, Primer zu entwerfen, um Regionen zu amplifizieren, die einen ähnlichen GC-Gehalt enthalten und daher ähnliche Schmelzprofile über das Amplikon für DHPLC aufweisen. In diesen Fällen ist es unter Bezugnahme auf die Vorhersagen der WAVEMAKER-Software für Schmelzdomänen wünschenswert, Proben bei zwei Temperaturen zu screenen, um Sequenzvariationen in verschiedenen Domänen innerhalb eines Amplikons aufzulösen.

Wenn möglich, wurden mehrere positive Kontrollen verwendet, um die partiellen Denaturierungstemperaturen für die DHPLC zu optimieren. Während der DHPLC-Optimierung (Tabelle 6-1) wurden zwei Exon-1-Positivkontrollen verwendet, die lokal und auf verschiedene Regionen des Amplikons verteilt waren, und ein weiteres Patientenscreening wurde sowohl bei 65 °C als auch bei 66 °C durchgeführt.

Dieses Beispiel unterstreicht die Bedeutung der Positivkontrollselektion, denn wenn nur die C>T-Variante verwendet worden wäre, dann wäre die optimale Screening-Temperatur ausgewählt­ed 66°C gewesen. Daher könnten Varianten, die in der unteren Schmelzdomäne lokalisiert sind, möglicherweise übersehen werden, wenn diese Regionen bei 65 °C denaturiert werden (Abbildung 6-2).

Ähnlichkeit von DHPLC-Profilen:

Wie bereits erwähnt, erschweren eine Reihe von Faktoren das Screening des LDLR-Gens auf genetische Variation, die FH verursachen könnte. Von erheblicher Bedeutung sind die große Anzahl von Mutationen und Polymorphismen, die zuvor im Gen beschrieben wurden, und die zunehmende Anzahl neuer Mutationen, die umgetopft werden, was bedeutet, dass jedes LDLR-Screeningverfahren in der Lage sein muss, potenziell auf jede vorhandene Mutation und nicht nur auf bekannte Varianten abzuzielen. Da die DHPLC in der Lage ist, all diese kleinen Variationen auf DNA-Ebene (Substitutionen, Insertionen und Deletionen) diskriminierungsfrei nachzuweisen, ist sie ideal für die LDLR-Mutationsanalyse geeignet.

Im Gegensatz zu anderen Genen, die weniger Mutationen aufweisen könnten, die durch Kodierungs- und Kontrollregionen spärlicher beabstandet sind, ist es jedoch unwahrscheinlich, dass Elutionsprofile für jede LDLR-Sequenzvariante unterschiedlich sind, was die Verwendung dieser Profile bei der Unterscheidung schädlicher Mutationen von gutartigen Polymorphismen weniger effektiv macht.

Diese fehlende Fähigkeit, Variationen allein auf der Grundlage von DHPLC-Profilen zu unterscheiden, ist im klinischen Kontext nicht so wichtig, da alle Mutationen durch eine zweite Methode bestätigt werden müssen, sei es als Prescreening-Methode DHPLC, SSCP oder Didesoxy-Fingerprinting (DDF).

Die Verwendung von DHPLC-Profilen würde jedoch auch in Fällen wirksam bleiben, in denen zuvor eine Mutation bei einem Verwandten identifiziert wurde und das Screening darauf ausgerichtet ist, das Vorhandensein oder Fehlen dieser einzelnen Mutation zu bestätigen.

Alternativ wäre es in hochpolymorphen Regionen (z. B. Exons 12, 15 und 18) besser, das Amplikon direkt und schüchtern zu sequenzieren, anstatt zunächst auf Variationen zu prüfen. Wenn die Sequenzierkapazität jedoch begrenzt ist (d. h. bei Sequenzern mit niedrigem Durchsatz oder wenn die Sequenzierung manuell durchgeführt wird), ist dies möglicherweise keine effektive Ressourcennutzung und DHPLC wäre die beste Option.

Die Bestätigung durch Sequenzierung von Varianten, die in Exon 10a-Fragmenten von neuseeländischen FH-Patienten identifiziert wurden, führte zur Identifizierung von zwei verschiedenen Mutationen mit praktisch identischen Profilen innerhalb desselben Amplikons (Abbildung 6-3). Die am häufigsten in der neuseeländischen Bevölkerung identifizierte LDLR-Mutation ist “FH Nordirisch” oder D461N, und diese Variante ist nicht von einer Spleißstellen-Mutation, 1359-1G>A, zu unterscheiden, die bei mehreren Patienten in Intron 9 identifiziert wurde.

Abschluss:

Auf weltweiter Basis wird geschätzt, dass mehr als 10 Millionen Menschen an FH leiden, von denen jedes Jahr bis zu 200.000 an einer vorzeitigen koronaren Herzkrankheit sterben. Im Gegensatz zu den meisten genetischen Erkrankungen steht für FH eine wirksame Behandlung zur Verfügung. Durch den Einsatz von lipidsenkenden Medikamenten kann eine Reduzierung des LDL-Cholesterins um 50-60% erreicht werden, die bei frühzeitiger Einnahme eine normale Lebenserwartung erwarten lässt.

Jüngste Berichte aus dem Vereinigten Königreich und den Niederlanden deuten darauf hin, dass die überwiegende Mehrheit der Menschen mit FH nicht identifiziert und unbehandelt bleibt. In beiden Ländern gibt es umfangreiche Belege dafür, dass die Fallfindung in Kombination mit Familienscreening und Mutationserkennung eine sehr effektive Methode ist, um den Prozentsatz der FH-Patienten, die eine wirksame Behandlung erhalten, zu erhöhen.

Daher wird ein wirksames Mittel zum Screening auf LDLR-Mutationen benötigt, das erkennt, dass es eine große Vielfalt von LDLR-Mutationen gibt und dass sowohl bekannte als auch neue Mutationen tar­gets sind, insbesondere in heterogenen Populationen.

Wir haben gezeigt, dass DHPLC ein effektives Werkzeug zum Nachweis von Mutationen innerhalb des LDLR ist. Neunundzwanzig verschiedene LDLR-Mutationen wurden bei 55 neuseeländischen FH-Patienten durch DHPLC identifiziert. Diese Mutationen sind im gesamten Gen lokalisiert und treten in den verschiedenen funktionellen Domänen des Rezeptors auf (Tabelle 6-2).

Die Mehrheit der Mutationen wurde innerhalb der EGF-Vorläuferdomäne (67,4%) identifiziert, gefolgt von der Ligandenbindungsdomäne (23,6%) und der Rest ist im Signalpeptid (1,8%) lokalisiert, der zuckermodifizierten Domäne (3,6%). die membranüberspannende Domäne (1,8%) und die zytoplasmatische Domäne (1,8%).

In der Vergangenheit konzentrierten sich Screening-Programme für die LDR-Mutationsanalyse auf “Mutations-Hotspots” B. der Ligandenbindungsdomäne, insbesondere Exons 3 und 4. In jüngerer Zeit wurde jedoch erkannt, dass dieses Tar­geting von “Hot Spots” zu einem Sampling-Bias geführt hat, anstatt die Lokalisierung von Mutationen wahrheitsgetreu widerzuspiegeln. Tatsächlich werden innerhalb der EGF-Vorläuferdomäne mehr neue Mutationen identifiziert als in jeder anderen Region, da nun ein umfassenderes Screening des LDLR-Gens durchgeführt wird.

Dies ist nicht unerwartet, da Mutationen in dieser funktionellen Domäne die Lipoproteindissoziation vom Rezeptor in Endosomen während des Rezeptorrecyclings und der Rezeptorpositionierung an der Zelloberfläche beeinflussen würden. Dieser Effekt des Sampling-Bias unterstreicht die Notwendigkeit eines umfassenden Screening-Ansatzes, der alle Kodierungs- und Kontrollregionen sowie berichtete und neue Mutationen umfasst.

Bei 20,9 % der analysierten Patienten wurden Mutationen festgestellt. Die Mehrheit dieser Patienten wurde nach dem Gesamtcholesterinspiegel >8,0 mmol/l (300 mg/dl) und einer auffälligen Familienanamnese für Herzerkrankungen ausgewählt. Weniger als ein Drittel zeigte auch klinische Stigmata. Diese Patienten können in “wahrscheinliche FH” und “definite FH” kategorisiert werden, je nachdem, ob Stigmata fehlen oder vorhanden sind.

Mutationen wurden bei 45 % der Patienten mit “definite FH” im Vergleich zu 8 % der Patienten mit “wahrscheinlicher FH”. Diese Daten stimmen mit denen überein, die für andere Populationen berichtet wurden, die zwischen 18 und 27 % liegen, was bekräftigt, dass Hypercholesterinämie als primäres Kriterium für die klinische Diagnose von nicht ausreichend ist FH.

Das LDLR-Gen ist aufgrund seiner relativ großen Größe, der im gesamten Gen identifizierten Variationsbreite und auch der Art der FH-Expression ein idealer Kandidat für die Mutationsanalyse durch DHPLC. FH ist eine autosomal-dominant vererbte und vererbte Erkrankung mit variabler phänotypischer Präsentation. Während FH-Heterozygoten anfällig für eine vorzeitige koronare Herzkrankheit sind, sind homozoge Individuen stärker betroffen und können vor Erreichen der Reife sterben.

Allerdings sind homozy und schüchtern betroffene Personen selten, mit einer Prävalenz von einer von einer Million, verglichen mit einer von 400 bis 500 bei Heterozygoten. Daher sind FH-Patienten, die Lipidkliniken besuchen, im Allgemeinen heterozygot. Somit ist im Gegensatz zu jenen Erkrankungen, bei denen einige Proben homozygot sein können und mit Wildtyp-DNA kombiniert werden müssen, das Mischen von LDLR-Amplikons für FH nicht erforderlich.

DHPLC ermöglicht eine schnellere Durchlaufzeit für das LDLR-Mutationsscreening als SSCP, da die Amplifikation von Genfragmenten und das Vorscreening durch DHPLC weitgehend automatisiert, weniger arbeitsaufwendig, billiger und 30% empfindlicher als SSCP sind. Zusammen mit unserer Erkenntnis, dass es einen sensitiven Mutationsnachweis von LDLR-Varianten ermöglicht, ist DHPLC ideal geeignet für die LDLR-Mutationsanalyse sowohl in klinischen als auch in Forschungsumgebungen.


Entschlüsselung der Auswirkungen von nicht-kodierenden Mutationen im menschlichen Genom

Die US-amerikanischen National Institutes of Health (NIH) und andere Finanzierungsorganisationen auf der ganzen Welt haben enorme Ressourcen investiert, um schließlich das vollständige Genom von Millionen von Menschen mit verschiedenen häufigen und seltenen Krankheiten zu sequenzieren, um die zugrunde liegenden genetischen Ursachen zu identifizieren. Diese Arbeit hat jedoch bisher nur bei einer kleinen Anzahl von Patienten die krankheitsverursachenden genetischen Veränderungen identifiziert. Da proteinkodierende Gene weniger als 3% des menschlichen Genoms ausmachen, vermuten Genetiker zunehmend, dass in vielen dieser Fälle Mutationen in nicht-kodierender DNA die Ursache sein könnten.

Die Auswirkungen von Mutationen in proteinkodierenden Genen sind vorhersehbar, weil wir den genetischen Code verstehen, aber es ist schwieriger, die funktionellen Konsequenzen von Mutationen in nicht-kodierenden Sequenzen abzuschätzen. Wissenschaftler wissen, dass nicht-kodierende Sequenzen regulatorische Schalter, sogenannte Enhancer, enthalten, die steuern, wann und wo Gene in einem Organismus ein- oder ausgeschaltet werden. Eine Mutation innerhalb einer dieser Enhancer-Sequenzen kann dazu führen, dass die Aktivität des von ihr kontrollierten Gens zu hoch oder zu niedrig ist oder zu einem Zelltyp oder Gewebe fehlgeleitet wird, wo sie schädliche Auswirkungen auf den Organismus haben kann.

Obwohl es im Prinzip klar ist, dass eine Sequenzänderung in einem Enhancer eine Krankheit verursachen kann, bleibt die Identifizierung einer solchen Mutation eine große Hürde. Die Sequenzierung der Genome vieler Individuen hat gezeigt, dass das Genom jeder Person im Vergleich zu den Genomen ihrer Eltern Dutzende bis Hunderte neuer Mutationen enthält. Die meisten dieser Veränderungen stören jedoch nicht die normale Genregulation. Die Herausforderung besteht darin, die kleine Untergruppe von Mutationen zu identifizieren, die die Sequenz spezifischer Enhancer auf schädliche Weise verändern.

Neue Arbeiten des Mammalian Functional Genomics Laboratory in der Abteilung Environmental Genomics and Systems Biology (EGSB) von Biosciences adressieren diese kritische Herausforderung. Die Gruppe hat einen transgenen Maus-Assay mit höherem Durchsatz entwickelt, um das krankheitsverursachende Potenzial menschlicher Varianten in Enhancern zu bewerten, die die Genexpression während der Entwicklung aktivieren. Der neue Ansatz nutzt die Genome Editing-Technologie CRISPR-Cas9, um transgene Mäuse zu erzeugen, die ein Enhancer-Reporter-Konstrukt an einer bestimmten „sicheren Hafen“-Position im Mausgenom tragen. Eine farberzeugende chemische Reaktion (der „Reporter“) erzeugt eine blaue Färbung in allen Zellen, in denen der Enhancer aktiv ist.

Von links: Diane Dickel, Evgeny Kvon, Len Pennacchio und Axel Visel vom Mammalian Functional Genomics Lab.

"Früher injizierten die Leute diesen Enhancer-Reporter in die Mauszygoten und er wurde zufällig in das Genom integriert", sagte Evgeny Kvon, Projektwissenschaftler in der EGSB-Abteilung und Erstautor des in Cell veröffentlichten Artikels. „Und aufgrund dieser zufälligen Integration waren die Ergebnisse weniger reproduzierbar, da es je nach Integrationsort sogenannte Positionseffekte gab, die die Aktivität dieses Reporters beeinflussten.

„Der größte konzeptionelle Fortschritt unserer Methode besteht darin, dass es keine Positionseffekte gibt, da die Transgene an derselben Stelle im Genom integriert sind, sodass wir weniger Mäuse benötigen, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen“, fuhr er fort. Darüber hinaus hatten die Forscher das Glück, eine Stelle im Mausgenom zu finden, an der die Integrationsfrequenz viermal höher ist als bei der alten Methode, sagte Kvon. „So erhalten wir nicht nur mehr Reproduzierbarkeit, sondern auch eine hohe Effizienz. Und das reduziert die Kosten für die Durchführung dieses Experiments um ein Vielfaches.“

Um den Grundsatznachweis zu demonstrieren, untersuchten die Forscher mit der neuen Methode, die sie enSERT (Enhancer inSERTion) nannten, fast tausend Varianten eines der am besten charakterisierten menschlichen Enhancer, der mit Polydaktylie (zusätzliche Finger oder Zehen) in Verbindung gebracht wird. Der Enhancer, ZRS (Zone of Polarizing Activity Regulatory Sequence) genannt, reguliert die Expression des Sonic-Hedgehog-Gens (Schh), das ein starkes Signalmolekül produziert, das für die korrekte Musterung vieler Körperelemente, einschließlich Gliedmaßen und Finger, erforderlich ist.

Der ZRS-Enhancer ist bei Wirbeltierarten, einschließlich Menschen, Mäusen, Fischen und sogar Schlangen, weit verbreitet. Es ist bekannt, dass Mutationen in diesem Enhancer eine abnormale Musterung der Gliedmaßen beim Menschen sowie bei anderen Wirbeltieren verursachen. Die häufigste Fehlbildungsart, die durch diese Mutationen verursacht wird, wird als „präaxiale Polydaktylie“ bezeichnet, d. h. die Bildung zusätzlicher Finger in der Nähe des Daumens oder der großen Zehe. Zum Beispiel wurden Mutationen im ZRS-Enhancer bei polydaktylen Hemingway-Katzen beobachtet, die nach dem amerikanischen Autor und Ailurophilen Ernest Hemingway benannt wurden, der in seinem Zuhause in Key West, Florida, eine große Kolonie der Faustpfotenkatzen hielt.

Polydaktylkatze im Hemingway House in Key West, Florida.

Mit dem neuen Assay untersuchten die Forscher alle humanen ZRS-Enhancer-Mutationen, die zuvor von anderen Gruppen als potenzielle Ursachen für Polydaktylie gemeldet worden waren, ob der vorgeschlagene fehlbildungsverursachende Mechanismus experimentell bestätigt werden konnte oder nicht. Sie bewerteten auch zusätzliche Sequenzänderungen, die Kliniker und Wissenschaftler, die an dieser Studie zusammenarbeiten, bei Patienten mit Polydaktylie neu identifiziert hatten. Insgesamt konnten die Forscher in etwa 70 Prozent der Fälle bestätigen, dass die Enhancer-Aktivität durch die Mutationen verändert wurde. Überraschenderweise fanden sie in den verbleibenden 30 Prozent der Fälle keine Hinweise auf Aktivitätsänderungen, was darauf hindeutet, dass eine Untergruppe von Mutationen, die in früheren Studien vorgeschlagen wurde, um Polydaktylie zu verursachen, bei diesen Patienten nicht die wahre Ursache der Erkrankung ist.

„Diese Ergebnisse legen nahe, dass bei der Interpretation menschlicher Mutationen ohne experimentelle Tests äußerste Vorsicht geboten ist, da es möglich ist, dass man in die Irre führt, dass sie ursächlich sind, wenn es sich möglicherweise nur um eine der vielen seltenen gutartigen Mutationen in der menschlichen Bevölkerung handelt.“ ,” cautioned Diane Dickel who, along with Mammalian Functional Genomics Lab co-PIs Len Pennacchio and Axel Visel, was a corresponding author on the Cell paper.

The work supports the Berkeley Lab Biosciences Area’s health strategy, which aims to increase understanding of human genome function. “We expect that this method will be very powerful for systematically testing enhancer mutations that are being found by the large number of patient sequencing studies,” Dickel said. The group has some pilot projects in the lab that show the utility of the approach to experimentally validate non-coding mutations associated with a variety of conditions that significantly impact human health, such as developmental delay, autism, or heart disease.

Institutional collaborations on the study included the National Center for Biotechnology Information (NCBI) of the National Library of Medicine branch of the National Institutes of Health (NIH), Washington University School of Medicine in St. Louis, and several teaching hospitals (Centre hospitalier universitaire CHU) in France: CHU Lille, CHU Poitiers, and CHU Dijon Bourgogne.


Identifying a genetic mutation behind sporadic Parkinson’s disease

This proposed model shows the correlation between mutation-dependent transcription factor binding, alpha-synuclein expression, and the risk of Parkinson’s disease. In the top instance, the enhancer efficiently binds the transcription factor, thereby reducing the expression of the alpha-synuclein gene (SNCA). Below, changing one nucleotide from an A to a G prevents the transcription factor from binding well, which increases SNCA expression and the risk of developing Parkinson’s disease.

CAMBRIDGE, Mass. – Using a novel method, Whitehead Institute researchers have determined how a non-coding mutation identified in genome-wide association studies (GWAS) can contribute to sporadic Parkinson’s disease (PD). The approach could be used to analyze GWAS results for other sporadic diseases with genetic causes, such as multiple sclerosis, diabetes, and cancer.

“This is really the first time we’ve gone from risk variants highlighted by GWAS to a mechanistic and molecular understanding—right down to the nucleotide—of how a mutation can contribute to the risk of developing disease,” says Whitehead Founding Member Rudolf Jaenisch, who is also a professor of biology at MIT.

About 90% of PD cases are sporadic that is, caused by complex interactions between environmental and common genetic risk factors. Because scientists have had difficulty analyzing these interactions, most research has focused on rare familial forms of the disease. GWAS, which identify common mutations that increase the risk to develop a particular condition, have been used to study sporadic PD, and other complex conditions, with limited success.

GWAS are akin to genomic treasure maps bearing hundreds or thousands of X’s marking the general locations of mutations that could be risk factors for a given condition. However, GWAS do not reveal the specific locations of potentially pathogenic mutations, nor do they indicate how an X on a genomic map contributes, if at all, to a disease. For example, in sporadic PD, multiple GWAS point to the alpha-synuclein gene (SNCA) as one of the strongest risk loci in patients’ genomes, yet GWAS contain little information regarding the mechanism of how this gene is dysregulated in sporadic PD patients.

To see if distant gene regulatory elements on the same chromosome carrying SNCA could affect cellular levels of alpha-synuclein, a team of researchers led by Frank Soldner, a senior researcher in the Jaenisch lab, investigated two GWAS-flagged risk variants located in a putative SNCA Verstärker. Their results are described online this week in the journal Nature.

The team used clustered regularly-interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 to edit the mutations into isogenic human pluripotent stem cells. By altering the genetic variant on only one chromosome, the other chromosome remains unchanged and acts as an internal control. This method allows the scientists to measure very subtle effects with very high confidence, while eliminating the effect of any genetic or epigenetic modifications and cell culture related variations that could occur during the experiment.

“Our method addresses an essential shortcoming of GWAS—using the correlations produced by GWAS, you cannot distinguish the effect between two variants that are very close together in the genome,” says Soldner, who is the lead author of the Nature Papier. “Such physical proximity means that they will always co-segregate during inheritance, which is why we had to do what we did—modify and analyze each variant independently while keeping the rest of the genome completely constant.”

After differentiating the cells into neurons, the scientists noted the changes in SNCA Ausdruck. Although one of the mutations has no effect, the other, which switches one nucleotide from an A to a G, slightly but significantly boosts alpha-synuclein production. When compared to the enhanced alpha-synuclein production in the familial form of the disease, the modest effect created by the A to G mutation would be sufficient over a lifetime to increase the risk of PD, according to Soldner.

To see how the mutation affects alpha-synuclein production, the researchers identified two transcription factors that bind to the enhancer that carries this mutation. When the enhancer is not mutated, the transcription factors bind to it, which suppresses SNCA. If the enhancer has the G mutation, the transcription factors are unable to bind to the enhancer, and SNCA is activated.

Most genetic conditions are sporadic and caused by a combination of mutations. Jaenisch says that the method that identified the single point mutation in SNCA’s enhancer could be used to pinpoint additional pathogenic genes for sporadic PD and sift through the GWAS hits for other diseases, including Alzheimer’s disease, cancer, diabetes, and multiple sclerosis.

This work was supported by the National Institutes of Health (NIH grants 1R01NS088538-01 and 2R01MH104610-15) and by Qatar National Research Fund (grant NPRP 5-531-1-094).

Rudolf Jaenisch's primary affiliation is with Whitehead Institute for Biomedical Research, where his laboratory is located and all his research is conducted. He is also a professor of biology at Massachusetts Institute of Technology.

Soldner, F., Stelzer, Y., Shivalila, C. S., Abraham, B. J., Latourelle, J. C., Barrasa, M. I., . & Jaenisch, R. (2016). Parkinson-associated risk variant in distal enhancer of α-synuclein modulates target gene expression. Nature, 533(7601), 95-99.


Mutation

Any alteration capable of being replicated in the genetic material of an organism. When the alteration is in the nucleotide sequence of a single gene, it is referred to as gene mutation when it involves the structures or number of the chromosomes, it is referred to as chromosome mutation, or rearrangement. Mutations may be recognizable by their effects on the phenotype of the organism (mutant).

Genmutationen

Two classes of gene mutations are recognized: point mutations and intragenic deletions. Two different types of point mutation have been described. In the first of these, one nucleic acid base is substituted for another. The second type of change results from the insertion of a base into, or its deletion from, the polynucleotide sequence. These mutations are all called sign mutations or frame-shift mutations because of their effect on the translation of the information of the gene. Sehen Nukleinsäure

More extensive deletions can occur within the gene which are sometimes difficult to distinguish from mutants which involve only one or two bases. In the most extreme case, all the informational material of the gene is lost.

A single-base alteration, whether a transition or a transversion, affects only the codon or triplet in which it occurs. Because of code redundancy, the altered triplet may still insert the same amino acid as before into the polypeptide chain, which in many cases is the product specified by the gene. Such DNA changes pass undetected. However, many base substitutions do lead to the insertion of a different amino acid, and the effect of this on the function of the gene product depends upon the amino acid and its importance in controlling the folding and shape of the enzyme molecule. Some substitutions have little or no effect, while others destroy the function of the molecule completely.

Single-base substitutions may sometimes lead not to a triplet which codes for a different amino acid but to the creation of a chain termination signal. Premature termination of translation at this point will lead to an incomplete and generally inactive polypeptide.

Sign mutations (adding or subtracting one or two bases to the nucleic acid base sequence of the gene) have a uniformly drastic effect on gene function. Because the bases of each triplet encode the information for each amino acid in the polypeptide product, and because they are read in sequence from one end of the gene to the other without any punctuation between triplets, insertion of an extra base or two bases will lead to translation out of register of the whole sequence distal to the insertion or deletion point. The polypeptide formed is at best drastically modified and usually fails to function at all. This sometimes is hard to distinguish from the effects of intragenic deletions. However, whereas extensive intragenic deletions cannot revert, the deletion of a single base can be compensated for by the insertion of another base at, or near, the site of the original change. Sehen Gene, Genetic code

Chromosomal changes

Some chromosomal changes involve alterations in the quantity of genetic material in the cell nuclei, while others simply lead to the rearrangement of chromosomal material without altering its total amount. Sehen Chromosom

Origins of mutations

Mutations can be induced by various physical and chemical agents or can occur spontaneously without any artificial treatment with known mutagenic agents.

Until the discovery of x-rays as mutagens, all the mutants studied were spontaneous in origin that is, they were obtained without the deliberate application of any mutagen. Spontaneous mutations occur unpredictably, and among the possible factors responsible for them are tautomeric changes occurring in the DNA bases which alter their pairing characteristics, ionizing radiation from various natural sources, naturally occurring chemical mutagens, and errors in the action of the DNA-polymerizing and correcting enzymes.

Spontaneous chromosomal aberrations are also found infrequently. One way in which deficiencies and duplications may be generated is by way of the breakage-fusion-bridge cycle. During a cell division one divided chromosome suffers a break near its tip, and the sticky ends of the daughter chromatids fuse. When the centromere divides and the halves begin to move to opposite poles, a chromosome bridge is formed, and breakage may occur again along this strand. Since new broken ends are produced, this sequence of events can be repeated. Unequal crossing over is sometimes cited as a source of duplications and deficiencies, but it is probably less important than often suggested.

In the absence of mutagenic treatment, mutations are very rare. In 1927 H. J. Muller discovered that x-rays significantly increased the frequency of mutation in Drosophila. Subsequently, other forms of ionizing radiation, for example, gamma rays, beta particles, fast and thermal neutrons, and alpha particles, were also found to be effective. Ultraviolet light is also an effective mutagen. The wavelength most employed experimentally is 253.7 nm, which corresponds to the peak of absorption of nucleic acids.

Some of the chemicals which have been found to be effective as mutagens are the alkylating agents which attack guanine principally although not exclusively. The N7 portion appears to be a major target in the guanine molecule, although the O 6 alkylation product is probably more important mutagenically. Base analogs are incorporated into DNA in place of normal bases and produce mutations probably because there is a higher chance that they will mispair at replication. Nitrous acid, on the other hand, alters DNA bases in place. Adenine becomes hypoxanthine and cytosine becomes uracil. In both cases the deaminated base pairs differently from the parent base. A third deamination product, xanthine, produced by the deamination of guanine, appears to be lethal in its effect and not mutagenic. Chemicals which react with DNA to generate mutations produce a range of chemical reaction products not all of which have significance for mutagenesis.

Significance of mutations

Mutations are the source of genetic variability, upon which natural selection has worked to produce organisms adapted to their present environments. It is likely, therefore, that most new mutations will now be disadvantageous, reducing the degree of adaptation. Harmful mutations will be eliminated after being made homozygous or because the heterozygous effects reduce the fitness of carriers. This may take some generations, depending on the severity of their effects. Chromosome alterations may also have great significance in evolutionary advance. Duplications are, for example, believed to permit the accumulation of new mutational changes, some of which may prove useful at a later stage in an altered environment.

Rarely, mutations may occur which are beneficial: Drug yields may be enhanced in microorganisms the characteristics of cereals can be improved. However, for the few mutations which are beneficial, many deleterious mutations must be discarded. Evidence suggests that the metabolic conditions in the treated cell and the specific activities of repair enzymes may sometimes promote the expression of some types of mutation rather than others. Sehen Desoxyribonukleinsäure (DNA)


New study explains why genetic mutations cause disease in some people but not in others

The hypothesis of the study is illustrated with an example in which an individual is heterozygous for both a regulatory variant and a pathogenic coding variant. The two possible haplotype configurations would result in either decreased penetrance of the coding variant, if it was on the lower-expressed haplotype, or increased penetrance of the coding variant, if it was on the higher-expressed haplotype. Credit: New York Genome Center

Researchers at the New York Genome Center (NYGC) and Columbia University have uncovered a molecular mechanism behind one of biology's long-standing mysteries: why individuals carrying identical gene mutations for a disease end up having varying severity or symptoms of the disease. In this widely acknowledged but not well understood phenomenon, called variable penetrance, the severity of the effect of disease-causing variants differs among individuals who carry them.

Reporting in the August 20 issue of Naturgenetik, the researchers provide evidence for modified penetrance, in which genetic variants that regulate gene activity modify the disease risk caused by protein-coding gene variants. The study links modified penetrance to specific diseases at the genome-wide level, which has exciting implications for future prediction of the severity of serious diseases such as cancer and autism spectrum disorder.

NYGC Core Faculty Member and Columbia University Department of Systems Biology Assistant Professor Dr. Tuuli Lappalainen led the study alongside post-doctoral research fellow Dr. Stephane Castel.

"Our findings suggest that a person's disease risk is potentially determined by a combination of their regulatory and coding variants, and not just one or the other," Dr. Lappalainen said. "Most previous studies have focused on either looking for coding variants or regulatory variants that affect disease in these individuals or potentially looking at common variants that could affect disease. We have merged these two fields into one clear hypothesis that uses data from both of them, which was fairly unheard of before."

Variable penetrance has long posed a challenge for predicting the severity of a disease, even for diseases with a strong genetic association. Dr. Lappalainen and colleagues developed the modified penetrance hypothesis from their interest in the idea that gene variants that regulate the activation of genes could also play a role in modifying the penetrance of coding variants for the same gene.

As a first test of the modified penetrance hypothesis, the researchers conducted an analysis of data from the Genotype-Tissue Expression (GTEx) project, a large catalog of genetic variants that affect gene expression in humans, to evaluate the interactions of regulatory and coding variants in a human population without severe genetic diseases. They found an enrichment of combinations of regulatory and coding variants, called haplotypes, that act as protective against disease by decreasing the penetrance of coding variants associated with disease development. This finding was expected in the general population, Dr. Castel explained, as a result of natural selection removing damaging gene variants from the genome over time.

To test their hypothesis in a disease-specific population of patients, the researchers analyzed data from the National Institutes of Health's The Cancer Genome Atlas (TCGA) and the Simons Simplex Collection, a permanent repository of genetic samples from 2,600 families, each of which has one child affected with an autism spectrum disorder, and unaffected parents and siblings. In the cancer patients and individuals with autism, they found an enrichment of haplotypes predicted to increase the penetrance of coding variants associated with cancer and autism spectrum disorder, respectively.

Finally, they designed an experiment using CRISPR/Cas9 genome editing technology to test the modified penetrance hypothesis with a coding variant that is known to be associated with a disease. They chose a coding variant associated with Birt-Hogg-Dubé Syndrome, a rare hereditary disease that increases the risk of certain types of tumors. They edited the SNP into a cell line on different haplotypes with a regulatory variant. The researchers were able to show that the regulatory variant indeed modified the effect of the coding disease-causing variant, consistent with expectations based on the large-scale data collections. This finding provides an important framework for scientists moving forward to experimentally test specific disease SNPs to determine if they could be affected by modified penetrance.

"Now that we have demonstrated a mechanism for modified penetrance, the long-term goal of the research is better prediction of whether an individual is going to have a disease using their genetic data by integrating the regulatory and coding variants," Dr. Lappalainen said.

"In future, studies of the genetic causes of severe diseases should take into account this idea that regulatory variants need to be considered alongside coding variants," Dr. Castel said. "This should eventually lead to a more fine-grained understanding of the risk of coding variants associated with disease."


Allgemeine Übersichten

This section provides recent general overviews that are important for understanding evolutionary genetics as a field. Stern 2010 stresses that the study of evolution of development must integrate a variety of disciplines, and that the field is now tending to reunify population genetics (the study of allele frequencies across space and time) with developmental biology (the study of processes that integrate genotypic and environmental factors into phenotypes). Orr 2005 summarizes the discordance between theoretical predictions and emerging empirical data on the genes and mutations responsible for phenotypic evolution. Carroll, et al. 2004 and Nei 2007 represent one of the first syntheses of such empirical data, while Stern and Orgogozo 2008 Alonso-Blanco, et al. 2009 and O’Bleness, et al. 2012 convey more recent overviews of the field. Rockman 2011 is a necessary paper that condemns rapid generalizations from empirical data due to inescapable experimental biases.

A comprehensive review of the loci of natural and agricultural variation that have been identified in plants.

Carroll, Sean B., Jennifer K. Grenier, and Scott D. Weatherbee. 2004. From DNA to diversity: Molecular genetics and the evolution of animal design. 2d ed. Malden, MA: Blackwell Science.

This edition, along with its first edition (2001), represents a very accessible and beautifully illustrated synthesis of the field of evolutionary developmental biology. Of particular interest is the testable hypothesis that morphological evolution occurs primarily via the regulation of expression of a restricted set of architect genes, the so-called developmental toolkit.

Nei, Masatoshi. 2007. The new mutation theory of phenotypic evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences 104.30: 12235–12242.

Against the view held by most evolutionary biologists, Masatoshi Nei argues that the primary driving force of phenotypic evolution is mutation, rather than natural selection.

O’Bleness, M., V. B. Searles, A. Varki, P. Gagneux, and J. M. Sikela. 2012. Evolution of genetic and genomic features unique to the human lineage. Natur Bewertungen Genetik 13.12: 853–866.

An overview of the emerging genetic data on the changes that have shaped some of the peculiarities of our own species.

Orr, H. Allen. 2005. The genetic theory of adaptation: A brief history. Nature Review Genetics 6.2: 119–127.

An informal description of the literature on theories of adaptation, recommended to understand what past and modern models predict about the number and the effect size of evolutionarily relevant mutations.

Rockman, Matthew V. 2011. The QTN program and the alleles that matter for evolution: All that’s gold does not glitter. Evolution 66.1: 1–17.

Matthew Rockman reminds us with eloquence that only mutations of large-phenotypic effect are accessible to geneticists, and that the lack of information on mutations with infinitesimal effects prevents us from using empirical data to derive quantitative statements about the genetic basis of evolution in general.

Stern, David L. 2010. Evolution, development, and the predictable genome. Greenwood Village, CO: Roberts.

A concise and thoughtful introduction to the genetics of phenotypic evolution and its main concepts, explaining how fields such as evolutionary developmental biology and population genomics illuminate each other.

Stern, David L., and Virginie Orgogozo. 2008. The loci of evolution: How predictable is genetic evolution? Evolution 62.9: 2155–2177.

A meta-analysis of the mutations responsible for phenotypic evolution, which uses the literature for testing various predictions about the relative importance of coding and regulatory changes. Of particular interest is the intriguing possibility that intraspecific and interspecific evolution might involve different kinds of causing mutations.

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Cell Signaling Events

Cell Biology, Diagnosis, and Treatment of HOCM

HOCM, a prevalent form of Hypertrophic Cardiomyopathy (HCM), is a significant cause of sudden death in younger people, including athletes. It occurs at a rate of 1:500 in the general adult population affecting men and women equally across all races. In the United States, HOCM is responsible for fewer than 100 deaths per year primarily due to a rate of 1:220,000 among athletes. HOCM most often is inherited as an autosomal dominant condition and is the most common genetically transmitted cardiomyopathy. HOCM most commonly results from a mutation in genes coding for sarcomere proteins, which cause structural abnormalities in myofibrils and myocytes that lead to abnormal cardiac force generation and conduction abnormalities.

The cardiac sarcomere is the contractile unit of cardiomyocytes. The proteins involved in sarcomere formation are organized into thick and thin filaments, composed primarily of actin filaments, myosin proteins, and titin. Contraction occurs by sliding and interdigitating of the thick and thin filaments of sarcomeres, which require a highly regulated and precise set of interactions between these two sets of filaments.

Over 800 mutations in nine primary genes encoding sarcomere proteins have been identified as causing Hypertrophic Cardiomyopathy (HCM) in large family cohorts. Two of these causal genes MYH7 (beta myosin heavy chain) and MYBPC3 (myosin-binding protein C) are the two most common being responsible for half of the HCM cases. The other seven major gene defects are in TNNT2 (cardiac troponin T), TNNI3 (cardiac troponin I), TPM1 (alpha tropomyosin), ACTC1 (cardiac alpha actin), MYL2 (Regulatory myosin light chain), MYL3 (Essential myosin light chain), and CSRP3 (cysteine and glycine rich protein 3). There are another 17 causal genes that been observed in smaller families and sporadic cases. While these are the primary defects, they result in proximal defects in response to the changes in sarcomere protein structure and function. An example of a proximal effect is altered calcium sensitivity. In animal models of HCM abnormal intracellular calcium has been demonstrated, with decreased calcium in the sarcoplasmic reticulum and increased calcium in the cytosol. This then leads to important changes in cell signaling events. The increased intracellular calcium associates with calmodulin which in turn increases the calcineurin phosphatase. Calcineurin dephosphorylates the NFAT transcriptional factor that turns on genes that increase cardiac hypertrophy. This has been demonstrated to be true in HCM animal models and a human clinical trial. Diltazem, an L-type calcium channel inhibitor, was first demonstrated to decrease intracellular calcium and inhibit cardiac hypertrophy in a mouse HCM model. More recently it was demonstrated to do the same in a small randomized human trial involving HCM subjects with a mutation in MYBPC3.

Loss of mechanical force due to molecular impairment of sarcomere function to support myofibril contraction is a major cause of muscle thickening. These phenotypic changes result in a mode of compensation by the heart muscle to be able to generate enough mechanical force to maintain adequate tissue perfusion throughout the body.

Clinical presentations associated with these mutations range from mild to severe, depending on the location and type of mutations present, which dictate the effect on the overall function of the sarcomere unit. However, it is difficult to correlate a particular mutation to a clinical outcome due to multifactorial effects on disease onset and clinical presentation. In many cases there are no symptoms and the disease manifests itself only upon heart function tests or upon strenuous physical activity, as seen in this case. Over time the condition leads to cardiac hypertrophy, most often presenting as LVH. Enlarged heart muscle might obstruct heart valve function resulting in heart murmurs and/or abnormal electrical activity, which can cause arrhythmias and subsequent complications such atrial fibrillation and even heart failure.

Treatment options include beta blockers and selective calcium channel blockers along with avoidance of strenuous exercise and heavy lifting. ACE inhibitors and nitrates should be avoided as they decrease afterload and may worsen the left ventricular outflow track obstruction. Septal myomectomy is reserved for persons whose symptoms are not well managed with medications and lifestyle changes.


Ergebnisse

ADH Activity and Expression Differ Between and Within Species.

The total level of ADH activity, as measured in crude extracts of adult flies, differs among several pairs of Drosophila species as well as within Drosophila melanogaster (Fig. 1) (detailed methods are presented in SI-Anhang). Specifically, flies of D. melanogaster strain Florida-9 (schnell allele) showed 173% (2.7-fold) higher ADH activity than flies of strain Canton-S (langsam allele). Drosophila yakuba flies showed 74% higher activity than those from its sister species Drosophila santomea, Drosophila virilis flies had 510% higher activity than those from its sister species Drosophila americana, und Drosophila erecta had 293% higher activity than those from its sister species Drosophila orena.

ADH activity and protein level differ among pairs of Drosophila alleles and species. (EIN) Cladogram shows relationships between species. Data from ref. 23. ADH activity is in units of ∆Abs340 per minutes per milligram soluble protein (mean ± SD). Percent difference = ([activity(high)/activity(low) − 1] × 100%), mean ± SD. Different assay conditions were used for the D. erecta/D. orena pair and for the D. virilis/D. americana pair (SI-Anhang, Methoden), so the means of, for example, D. santomea und D. orena, should not be compared. These data are also presented in different form in Fig. 2 EIN und B und SI-Anhang, Fig. S1. (B) Differences in ADH protein levels between pairs of strains and species are also apparent in Western blot. Differences in band intensity among pairs (but not within pairs) are potentially affected by sequence divergence in the region to which the antibody was raised (SI-Anhang, Abb. S2). The additional band in D. virilis in the anti-tubulin blot is likely the result of cross-reactivity with the polyclonal antibody.

These large differences in enzyme activity prompted us to determine their underlying mechanistic causes. In principle, higher activity could be the consequence of greater enzyme specific activity, the production of more enzyme, or both. To determine whether the differences observed might be due to the production of different amounts of Adh protein, we used Western blots with an anti-Adh antibody to examine the relative amounts of Adh protein in whole-fly extracts. In three cases, the species or strain with higher ADH activity produced more Adh protein, indicating that differences in protein expression level are at least partly responsible [Fig. 1B Adh protein was not detected in the D. erecta/D. orena pair, likely due to amino acid divergence in the epitopes against which the antibody was raised (SI-Anhang, Fig. S2)].

ADH Activity Evolution Originates Primarily from the Adh Gen.

Differences in ADH activity could be due to substitutions at the Adh locus and/or to trans-acting factors outside of the locus. To determine if ADH activity differences originated from substitutions within the Adh gene, we cloned the Adh alleles from each species or strain and then transformed them back into a specific D. melanogaster attP-PhiC31 genomic landing site in a uniform Adh null genetic background (24). Cloned loci were ∼8 kb with identical boundaries in each pair, containing all known sequences required for adult expression (SI-Anhang, Methoden). In each case, the transgenic Adh alleles largely recapitulated the between- and within-species differences in Adh activity (Fig. 2 EIN und B). A similar pattern of relative differences in protein level was seen in Western blots (Fig. 2C). We could therefore use Adh transgenes to determine the contribution of protein coding versus noncoding substitutions to evolutionary differences in ADH activity.

ADH enzyme activity and protein level differ between and within species. (EIN) ADH enzyme activity of Drosophila strains and species (white box plots) is largely recapitulated when cloned Adh loci are transformed into D. melanogaster (gray box plots). (B) Transformants of D. virilis und D. americana Adh loci also largely recapitulate the species difference and show a major contribution from tandem duplication. Data from ref. 25. (C) Relative differences in levels of ADH protein between pairs of transformants are also apparent in Western blot. Low signal intensity in ere and ore is plausibly due to sequence divergence in the region to which the antibody was raised (SI-Anhang, Abb. S2).

Amino Acid Replacements Account for only a Minor Fraction of Activity Evolution.

To directly determine the relative contribution of protein coding sequences to overall activity differences, we made a set of constructs that substituted the amino acid sequence from one species or strain into the allele from the other species or strain, leaving all noncoding substitutions unchanged. In these experiments, it was critical to be able to reliably detect small increments of differences between transgenic flies. To do so, we scaled up the sensitive ADH activity assay, measuring multiple batches of flies from multiple transgenic lines. We estimate that we could detect activity differences of around 4 to 8% after correcting for multiple testing (SI-Anhang, Methoden).

The number of amino acid replacements between strains or species was small. Just one amino acid difference separates the langsam und fast D. melanogaster alleles (a lysine-to-threonine substitution at position 192 K192T), while three and four amino acid differences distinguish the santomea/yakuba und orena/erecta alleles, respectively (SI-Anhang, Abb. S2). To measure any potential difference between the D. virilis und D. americana coding regions, we first had to consider the tandem duplication of the entire Adh gene and flanking region that occurs in D. virilis. The tandem copies are identical except for three substitutions in the 3′ noncoding region that have been shown to not affect activity (25). This allowed us to delete one duplicate from the construct, resulting in a single copy that had orthologous synteny with D. americana. We could then substitute the one amino acid change (virilis: L51, americana: I51) into this single-copy virilis Adh locus and determine if it contributed significantly to the species difference.

We found that the swapping of amino acid residues had the effect of changing ADH activity by at most 22% (the D. melanogaster K192T substitution) (Fig. 3 and Table 1, percent difference). In the case of D. virilisD. americana, the single amino acid substitution had no significant effect [P = 0.09 (Table 1) after correction for multiple pairwise comparisons, P = 0.26 (Fig. 3D)]. Thus, amino acid replacements within the ADH protein contributed 0 to 25% of the overall difference in ADH activity between the loci we compared (Table 1, percent of total). It follows that 75 to 100% of ADH activity differences are the result of noncoding substitutions.

ADH activity differences are mostly cis-regulatory. (EIND) Activity is shown for transformant lines carrying either unmodified Adh alleles or swap alleles, which have the amino acid sequence of one allele and the noncoding sequence of the other. Noncoding sequence predicts ADH activity substantially better than protein sequence does. Activity data shown in Figs. 3 and 4 were collected simultaneously and are presented in full in SI-Anhang, Fig. S3. P values shown here were adjusted for all pairwise comparisons with DF 18–22. Box plots show the distribution of data, while error bars show 95% confidence intervals of the mean.